CN109182249B - 一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原得到纤维蛋白原溶液，浓度30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解凝冻干血酶，得到凝血酶的细胞混悬液，浓度200～800IU/ml，将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，使凝胶形状与损伤缺口相契合。本发明，能固定种子细胞，促进种子细胞的生长发育增殖；医生在清创空间内可自由塑形；在种子细胞完成与病变部位的融合修复后完全降解，安全可靠；适用于软骨细胞或者干细胞的移植。
Description
技术领域
本发明涉及种子细胞移植技术领域，具体涉及一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法。
背景技术
目前临床上进行种子细胞移植修复手术所采用的细胞固定方式主要包括生物胶原膜固定或者壳聚糖水凝胶等细胞支架材料固定。处于实验室研究过程中的细胞支架材料品种繁多，目前主要的天然生物支架材料有胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白等。
但是这些材料存在各种各样的问题：例如，部分支架材料具有诱导种子细胞的去分化作用；降解过快或过慢,从而影响细胞的迁移和修复效果；有的支架材料需要体外先进行塑形，然后再吸附细胞进行移植，操作过程复杂，临床应用过程中的可能性差。
有鉴于此，急需对现有的支架进行改进，以方便操作，延长降解时间，提高修复效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的种子细胞支架材料操作不便，降解时间短，修复效果差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：
采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；
采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；
将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；
采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。
在另一个优选的实施例中，纤维蛋白原溶解液采用浓度为0.9％的氯化钠。
在另一个优选的实施例中，凝血酶溶解液采用浓度为1～3mg/ml的氯化钙。
在另一个优选的实施例中，所述种子细胞包括但不限于：软骨细胞、干细胞。
在另一个优选的实施例中，纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液注射入损伤部位后2～5min内凝固。
在另一个优选的实施例中，注射凝固后，形成孔径为100～200μm的纤维蛋白胶孔径。
与现有技术相比，利用纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液形成纤维蛋白凝胶，并采用纤维蛋白凝胶作为种子细胞的支架结构，不仅能很好地固定种子细胞，给种子细胞提供良好的生长空间，方便营养成分渗入，还能促进种子细胞的生长发育增殖；在手术操作的过程中，操作简便，医生可在清创空间内自由塑形；并能够在种子细胞完成与病变部位的融合修复后完全降解，安全可靠；特别适合临床上医生对于损伤部位进行清创后，通过种子细胞的移植进行再生修复，特别适用于软骨细胞或者干细胞的移植。
附图说明
图1为本发明的操作流程图；
图2为本发明中纤维蛋白胶的降解速度及所支持的移植细胞的活力情况；
图3为软骨细胞在本发明制备的纤维蛋白凝胶中的细胞活力情况的长时间观察的实验图；
图4为软骨细胞在本发明制备的纤维蛋白凝胶中的细胞长期培养后在显微镜明场条件下的状态实验图；
图5为实验用家兔在移植前的软骨损伤情况；
图6为本发明制备的纤维蛋白凝胶为支架材料在家兔的软骨修复的情况；
图7为未受损伤的家兔正常软骨组织切片的HE染色结果；
图8为采用本发明方法配制的纤维蛋白凝胶作为支架进行家兔软骨细胞移植修复后的在体的HE染色结果；
图9为膝关节损伤病人在移植前的软骨情况；
图10为采用本发明的方法进行软骨细胞移植对于膝关节损伤病人产生的修复结果。
具体实施方式
本发明提供了一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，给种子细胞提供良好的生长空间，方便营养成分渗入，并能保证种子细胞自由迁移，对损伤处进行修复；降解时间长，能够进行有效修复；在种子细胞进行修复后能够完全降解，在病人体内没有残留。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。
如图1所示，本发明提供的一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：
采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；
采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；
将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；
采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。
其中，纤维蛋白原溶解液采用浓度为0.9％的氯化钠。
其中，凝血酶溶解液采用浓度为1～3mg/ml的氯化钙。
其中纤维蛋白原溶解液和凝血酶溶解液可采用市面上的安可晶套盒。
纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液注射入损伤部位后 2～5min内凝固，凝固时间既能为医生塑形提供足够的时间，又能保证尽快凝固提高手术效果。
注射凝固后，形成孔径为100～200μm的纤维蛋白胶孔径，大小适中，可以给种子细胞提供充足的营养成分渗入的空间，并能保证种子细胞自由进行迁移，对损伤处进行修复留。
本发明中的种子细胞包括但不限于：软骨细胞、干细胞，适用于可进行移植修复的各类种子细胞，现以软骨细胞为例来进行详细阐述。采用本发明的步骤来制备支架材料，用于自体同源的软骨细胞移植手术 (autologous chondrocyte implantation，ACI)，并对本发明进行如下的检测和观察：
一、本发明中纤维蛋白胶的降解速度及所支持的移植细胞的活力情况。
如图2所示，观察血清条件下纤维蛋白胶降解时间，与采用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit方法检测细胞活力；由上至下依次为1天、5 天、7天的检测结果，凝胶降解时间超过10天，细胞活力均大于80％。
二、软骨细胞在本发明制备的纤维蛋白凝胶中的存活情况。
如图3和图4所示，软骨细胞在本发明所推荐的浓度配比下配制的纤维蛋白三维凝胶中体外生长12天，图2为细胞活力实验图，图3为显微镜明场条件下的观测图像，图2和图3的放大倍数为100倍，可清楚看到细胞生长状态良好，活力大于80％。
三、本发明制备的纤维蛋白凝胶为支架材料在家兔的软骨修复的情况。
如图5和图6所示，采用本发明的纤维蛋白凝胶作为支架进行软骨细胞移植手术，在家兔的动物模型中，由左至右依次为移植手术前后，从两个图的标注圆圈内，可看到软骨得到明显修复。
四、采用本发明方法配制的纤维蛋白凝胶作为支架进行家兔软骨损伤修复的HE染色结果。
采用本发明的纤维蛋白凝胶作为软骨细胞移植支架，进行家兔软骨损伤模型的移植修复手术,所修复形成的软骨成份主要为透明胶原。如图6 所示，HE染色显示(×200)：正常未受损伤的软骨组织切片显示，软骨细胞位于软骨陷窝内，成柱状排列；如图7所示，HE染色显示(×200)，采用纤维蛋白原凝胶支架材料进行细胞移植修复手术后3个月，所修复产生的软骨细胞主要为透明软骨，并与正常组织类似。图7和图8的标尺为2μm。
五、采用本发明的方法进行软骨细胞移植对于膝关节损伤病人产生的修复结果。
采用哈尔滨翰邦医疗科技有限公司的安可晶猪源纤维蛋白粘合剂，采用本发明提供的步骤来进行纤维蛋白凝胶制备以及完成细胞移植，将凝胶细胞混合物注射入外科医生清理后的损伤创面凹陷内。保持关节腔干燥情况下等待2-5分钟，确认纤维蛋白胶彻底凝固后，缝合创口。采用本发明制备的纤维蛋白凝胶进行的ACI软骨细胞移植手术对股骨软骨损伤的病人进行治疗，移植手术三个月后，MRI(Magnetic Resonance Imaging，即磁共振)检查结果如图10所示，图9和图10分别为移植手术前后的软骨情况，病人损伤的关节软骨面得到很好的修复(红色箭头之间标软骨损伤区域)，病人主观感觉良好，疼痛消失。
本发明，具有区别于其他使用纤维蛋白凝胶作为支架材料的独特优点：
1.纤维蛋白凝胶为三维立体状，具有与种子细胞具有很好的亲和性，利于种子细胞的募集与黏附；高亲水性的化学结构能够促进种子细胞的表型的维持，能很好地固定种子细胞；并且孔径为100～200μm，大小适中，为种子细胞的生长和迁移提供了足够的空间和营养成分的供应，方便营养成分渗入，促进种子细胞的生长繁殖；
2.相对于现有技术中添加致孔剂或其他材料提高支架的塑形功能，本发明的支架材料简单，仅为纤维蛋白原凝胶，没有添加其他支架材料，不存在其他支架材料降解不充分的可能性，并能够在细胞完成与病变部位的融合修复后完全降解，安全可靠；
3.在手术操作的过程中，医生能够在清创空间内将纤维蛋白凝胶自由塑形，适用于多种形状和面积的损伤修复；
4.种子细胞与纤维蛋白凝胶在病人体内进行凝固，降解时间较长，如软骨细胞可以达到14天以上，凝固时间合理，使得种子细胞充分增殖、迁移并对损伤部位进行修复，既充分保证了医生对修复凝胶的塑形时间，又确保手术效果的时间效率；
5.以软骨细胞为例，在病人的实践过程中证明，具有非常好的修复透明软骨的作用，在实际应用中具有优良的修复效果；
6.纤维蛋白凝胶的配制方法和移植方法简单易行，没有严格的技术设备要求，各家医院都可以操作，具有极大的临床应用前景。
本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；纤维蛋白原溶解液采用浓度为0.9％的氯化钠；
采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，凝血酶溶解液采用浓度为1～3mg/ml的氯化钙，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；所述种子细胞为软骨细胞；
采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合；纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液注射入损伤部位后2～5min内凝固；注射凝固后，形成孔径为100～200μm的纤维蛋白胶孔径。
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