KR102234394B1 - 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제 - Google Patents

타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역세포치료제가 투여될 환자가 아니라 건강한 공여자의 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 대한 것이다.

Description

타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제{A method culturing allogeneic immune cells, immune cell conditioned media obtained by the method, and immune cell therapeutic agents containing the same}
본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역세포치료제가 투여될 환자가 아니라 건강한 공여자의 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 대한 것이다.
NK 세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다. 그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이나 Cytotoxicity가 많이 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
이러한 면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
하지만, 항암 면역세포치료제의 경우 자기 혈액에서 면역세포를 분리 배양하여 치료를 받는 자가 면역세포 치료제도 의미가 있으나 중증 말기 암환자의 경우 세포수가 적고 그 활성도가 매우 작아 세포배양이 어려운 경우가 있고 배양기간 동안 기다려야 하는 등 어려움이 많다. 그러나 건강한 다른 사람의 면역세포를 배양하여 치료를 할 수 있다면 세포 배양이 쉽지 않은 중증 말기 암환자에게도 효과적으로 사용할 수 있다.
즉, 이러한 타가 면역세포치료제가 개발될 경우 건강한 사람의 면역세포를 다량으로 미리 배양하여 동결보관하고 있다가 환자가 원할 때 빠른 시간 안에 환자에게 바로 투여하여 효과를 높일 수도 있기 때문이다. 다른 사람의 면역세포를 사용하기 위해서는 순수한 NK세포를 사용하여야만 하는데 그 이유는 다른 사람의 Tc 세포가 환자의 몸을 공격하기 때문이다. 기존의 순수한 NK세포를 만드는 방법은 암세포화된 세포주 등 feeder cell을 사용하고 또는 감마선 처리를 하는 등의 배양하는 과정이 매우 복잡하고 비용이 많이 들어간다.
따라서, 이러한 단점들이 제거된 타가 면역세포치료제 개발기술에 대한 필요성이 존재한다.
대한민국특허공개번호 제10-2018-0057359호
본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 건강한 공여자의 T세포를 투여 받을 환자에 대해 면역관용을 일으켜 공격하지 않는 세포로 변화시키는 면역세포배양방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 건강한 사람의 T 세포가 투여 받을 환자에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변하고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명도 길어지는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 림프구말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 면역세포 배양시 항CD3 항체를 사용하지 않아도 면역세포를 자극하여 배양이 잘되고 또한 면역관용을 유도하여 T세포가 혼합되어 있는 타인의 면역세포를 면역요법에 사용할 수 있는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 특정 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 9일 내지 12일 배양된 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 건강한 공여자의 PBMC 및 상기 환자유래 PBMC가 포함된 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는데, 상기 제1공여자세포배양액을 얻는 단계는 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3 항체를, IL-12가 0.5∼5ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 상기 제6단계가 수행된 배지에 항체2용액으로 구성된 A2유닛 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계; 상기 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 및 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛을 첨가하여 배양하는 제13단계를 포함하여 수행되고, 상기 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 대상으로 상기 제1단계 및 제13단계를 수행하여 환자유래 PBMC배양액을 얻도록 수행되며, 상기 제1혼합배양액을 얻는 단계는 상기 제1공여자세포배양액 또는 환자유래 PBMC배양액을 각각 세포와 배양액으로 분리하는 제14단계를 수행하지 않고, 상기 제1공여자세포배양액과 환자유래 PBMC배양액을 혼합하여 수행되고, 상기 혼합배양단계는 상기 제1혼합배양액에 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계를 포함하여 수행되며, 상기 혼합배양단계를 통해 면역관용이 일어난 T세포를 포함하는 증식된 면역세포가 얻어지는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1일 내지 2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 특정 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 1일 내지 2일 동안 배양된 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 건강한 공여자의 PBMC 및 상기 환자유래 PBMC가 포함된 제2혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는데, 상기 제2공여자세포배양액을 얻는 단계는 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 및 상기 제1단계가 수행된 배지에 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계;를 포함하여 수행되고, 상기 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자 혈액으로부터 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3 항체를, IL-12가 0.5∼5ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 상기 제6단계가 수행된 배지에 항체2용액으로 구성된 A2유닛 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계; 상기 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛을 첨가하여 배양하는 제13단계; 상기 제13단계가 수행된 배지를 세포와 배양액으로 분리하는 제14단계; 및 상기 제14단계에서 분리된 세포에 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계;를 포함하여 환자유래 PBMC배양액을 얻도록 수행되며, 상기 제2혼합배양액을 얻는 단계는 상기 제2공여자세포배양액에 상기 제3단계의 D유닛을 대신하여 상기 환자유래 PBMC배양액을 첨가하여 수행되고, 상기 제2혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계는 상기 제3단계는 수행하지 않고 상기 제4단계 내지 제15단계를 포함하여 수행되며, 상기 혼합배양단계를 통해 면역관용이 일어난 T세포를 포함하는 증식된 면역세포가 얻어지는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법을 제공한다.
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바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1혼합배양액 또는 제2혼합배양액은 상기 제1공여자세포배양액 또는 제2공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 상기 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포 수가 30개 내지 200개가 되도록 포함된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 혼합배양단계는 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 수행된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계는 3 내지 4일 간격으로 Cytokine의 농도를 변화시키면서 수행된다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 배양방법으로 배양되어 얻어진 배지조성물과 증식된 면역세포를 포함하는 타가면역세포배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양물로부터 증식된 면역세포가 제거된 배양배지조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양물에서 배지조성물을 제거한 후 얻어진 면역세포를 유효성분으로 포함하는 면역세포치료제를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역세포는 NK세포 및 상기 면역세포치료제가 투여될 특정 환자에 대한 면역관용이 일어난 T세포를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역관용이 일어난 T세포는 NKT세포, 도움 T세포(Th), 세포독성 T세포(Tc) 및 감마델타 T세포를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역관용은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 배양하면서 일정 시기에 상기 특정 환자유래 PBMC를 함께 배양하여 얻어진다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양방법으로 배양되어 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계에서 얻어진 배지조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상술된 본 발명의 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 의하면, 건강한 사람의 T 세포가 투여 받을 환자에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변하고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명도 길어지는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제는 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 림프구말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 면역세포 배양시 항CD3 항체를 사용하지 않아도 면역세포를 자극하여 배양이 잘되고 또한 면역관용을 유도하여 T세포가 혼합되어 있는 타인의 면역세포를 면역요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1은 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하는 실험에 사용된 effector 세포의 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 2는 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하기 위해 통상적인 방법으로 수행된 면역세포의 역가시험 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 시간에 따른 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 다른 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 각각 20일, 31일 및 54일에 측정된 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 시간에 따른 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 도 5에서 배양 14일에 측정된 FACS data를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 "면역세포"는 NK세포 및 T세포만을 포함하는 의미로 사용되었다. 또한,"NK세포"는 NK cell과 NKT cell을 모두 포함하는 의미로 사용되지만, 경우에 따라서는 NK cell만을 의미하는 것으로 해석될 수도 있다.
시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간 적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 유래가 다른 2종의 면역세포 즉 건강한 공여자의 혈액에서 유래한 면역세포와 환자의 혈액에서 유래한 면역세포를 혼합하여 배양하더라도 배양된 T 세포에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변화시키고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명까지도 길어지는 효과가 있는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 있다.
따라서, 본 발명의 타가면역세포배양방법은 유래가 다른 2종의 면역세포를 혼합하는시점 및 항CD3항체 사용여부에 따라 다음과 같이 두 가지로 분류할 수 있다.
먼저, 본 발명의 제1 타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제1타가면역세포배양방법은 유래가 다른 2종의 면역세포 중 건강한 공여자의 면역세포를 항CD3항체를 사용하여 어느 정도 적어도 7일 이상 배양한 다음 환자유래 PBMC를 혼합하게 되므로 2중으로 자극이 가해져 면역세포의 증식속도 및 수명이 약은 길어지는 장점이 있을 뿐만 아니라, 공여자 중 암 병기가 깊어서 NK 세포가 매우 부족하거나 환자 특이적으로 NK 세포의 배양 증식이 잘 안 되는 환자이거나 환자가 다수일 때 유효한 방법이다. 이러한 환자들의 경우 NK 세포는 배양이 잘 안 되나 T세포는 비교적 배양이 잘 되어 세포수를 많이 늘릴 수 있는데, 유래가 다른 세포를 혼합할 때 자극을 주기 위해 필요한 세포는 T 세포로만 이루어져 있어도 충분하기 때문이다.
다음으로, 본 발명의 제2 타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1~2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제2혼합배양액을 배양하는 단계;를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC) 배양 초기에 적어도 배양시작일로부터 3일 이전에 환자유래 PBMC를 혼합함으로써 항CD3 항체를 사용하지 않아도 공여자의 면역세포를 자극하여 배양단계가 더 간단하면서도 면역세포의 배양이 잘 이루어질 뿐만 아니라, 배양초기 이므로 공여자의 면역세포 수가 적어 면역관용을 유도하기 위해 필요한 환자의 면역세포수도 적게 필요한 장점이 있다.
여기서, 제1혼합배양액 및 제2혼합배양액은 모두 공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포가 30 내지 200개 비율로 포함되도록 준비되는데, 이러한 혼합비율은 실험적으로 결정된 것으로 적어도 환자유래 면역세포가 공여자 면역세포 수 대비 30% 이상이어야 면역관용을 유도하는 동시에 면역세포를 효과적으로 자극하여 배양이 잘되기 때문이다. 한편, 공여자 면역세포 수 대비 환자유래 면역세포가 많을수록 완벽한 면역관용을 유도하기 용이하지만 그 비율이 1:2를 초과하는 것은 중환자의 경우 환자에게 부담이 될 수 있어 1:2를 최대치로 설정하였다.
또한, 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자의 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 PBMC 또는 분리한 PBMC를 1~2일 동안 배양한 환자세포배양액 또는 분리한 PBMC를 7 내지 14일 동안 배양한 환자세포배양액 중 어느 하나를 준비하여 수행될 수 있다. 특히, 환자가 중환자인 경우 환자유래 PBMC로 7 ~ 14일 배양하여 얻어진 환자세포배양액을 사용하면 적은 양을 채혈하여도 세포수가 많이 증식되어 있으므로 여러 번 사용할 수 있어 보다 유리하다. 한편, 환자유래 PBMC는 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 상태에서는 면역세포 외에 B세포 같은 다른 단핵구가 포함되어 있을 수 있으나 이후 배양과정에서 면역세포만 생존하게 되므로, 환자세포배양액에는 실질적으로 면연세포만 포함된 상태일 수 있다.
한편, 본 발명의 제1 및 제2 타가면역세포배양방법은 모두 유래가 다른 2종의 면역세포가 혼합되어 배양되므로 면역세포의 수명이 연장되는 효과가 있어, 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 혼합배양단계가 수행될 수 있다. 이 때, 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계는 3 내지 4일 간격으로 Cytokine의 농도를 변화시키면서 수행될 수 있다. 한편, 이와 같이 세포의 수명이 연장되면 사이토카인 등 유용성분이 다량 포함된 면역세포가 제거된 배양액 즉 배지조성물 다량 확보할 수 있는데, 주지된 바와 같이 유용성분이 다량 포함된 배지조성물은 화장품이나 의약품의 원료가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 타가면역세포배양방법에 의하면 매우 경제적으로 유용성분이 다량 함유될 뿐만 아니라 혈청이 포함되지 않은 배지조성물을 얻을 수 있게 된다. 특히, 화장품이나 의약품의 원료가 되는 배지조성물을 얻기 위해 본 발명의 타가면역세포배양방법을 실행하는 경우에는 유래가 다른 2종의 면역세포를 1종은 건강한 공여자 유래의 것이고, 1종은 환자유래의 것이 아니라 모두 건강한 공여자들의 혈액으로부터 유래된 PBMC를 사용하여 배양을 수행하게 되면 보다 다량의 배지조성물을 얻는데 유용할 수 있다.
이와 같이 얻어진 배지조성물은 화장료조성물 및 약학조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명자의 배지조성물은 본 발명자의 선행특허인 특허공개번호 제10-2018-0057359호에 기재된 바와 같이 피부 미백, 색소 침착 제거, 주름 개선 중 하나 이상에 유효하며, 알러지 비염, 알러지 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 벌레 물려 생긴 염증 등에 염증 개선 효과가 좋았으며 특히 가려움을 신속히 없애 주는 효과가 있고, 화상, 창상 등의 치료를 통한 피부재생효과와 침착 색소의 제거에 효과가 매우 좋았으며 또한 피부미백에도 효과가 있음을 확인하였다.
다음으로, 본 발명의 타가면역세포배양물은 제1 및 제2 타가면역세포배양방법이 수행되어 얻어진 배지조성물과 증식된 면역세포를 포함하는데, 타가면역세포배양물을 배지조성물과 증식된 면역세포로 분리하여, 증식된 면역세포가 제거된 배양배지조성물은 화장료조성물이나 약학조성물의 유효성분으로 사용하여 분리된 면역세포는 면역세포치료제의 유효성분으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 면역세포치료제는 타가면역세포배양물에서 분리된 면역세포를 유효성분으로 포함하는데, 면역세포는 NK세포 및 면역세포치료제가 투여될 특정 환자에 대한 면역관용이 일어난 T세포를 포함한다. 여기서, 면역관용이 일어난 T세포는 NKT세포, 도움 T세포(Th), 세포독성 T세포(Tc) 및 감마델타 T세포를 포함하는데, 상술된 바와 같이 면역관용은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 배양하면서 일정 시기에 특정 환자유래 PBMC를 함께 배양하여 얻어지는 것이다. 본 발명의 면역세포치료제는 대체로 면역세포를 생리식염수 등 담체에 포함시켜 링거형식으로 환자의 몸속에 투여될 수 있는데, 면역세포에 영향을 주지 않지만 환자의 치료에 유효한 공지된 성분을 더 포함할 수 있음은 물론이다.
상술된 본 발명의 제1 및 제2 타가면역세포배양방법에서 사용되는 면역세포배양용 배지첨가키트(NKTM)는 림프구배양의 각 단계에서 배지에 첨가될 수 있도록 각각 개별적으로 포장되고 내용물 즉 구성성분이 다른 B유닛, C1-1유닛, C1-2유닛, C2유닛, A1유닛, A2유닛 및 D유닛을 포함하여 구성되는데, 각 유닛에 대한 상세한 설명 및 상기 유닛을 이용하여 면역세포를 배양하는 배양과정(NKTM 배양과정)에 대한 구체적인 조건에 대한 상세한 설명은 선행특허인 특허공개번호 제10-2018-0057359호(이하 "선행특허")에 개시된 바 있으므로, 하기 실시예에서는 선행특허에 기재된 부분과 다른 부분만을 중점적으로 설명하기로 한다.
실시예 1
제1 타가면역세포배양방법을 하기와 같이 수행하였다.
1.제1공여자세포배양액을 얻는 단계
먼저, 인간의 림프구 또는 단핵구 등의 단핵세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 건강한 공여자의 혈액을 1.077 비중의 Ficoll-Paque Plus용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시킴으로써, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 PBMC를 얻었다. 필요한 경우 PBMC로부터 림프구만을 추출하여 사용할 수 있으나, PBMC 그대로 배양하더라도 이후 배양조건에서 면역세포(NK세포 및 T세포)를 제외한 나머지 세포가 사라지게 되므로 동일한 결과를 얻을 수 있으므로, PBMC와 림프구를 동일하게 해석하여 사용할 수 있다.
그 후, 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 선행특허의 실시예3에 기재된 방법 즉 NKTM배양방법에 따라 하기와 같이 Day 0부터 Day 10까지 수행함으로써 제1공여자세포배양액을 얻었다. 보다 구체적으로 NKTM배양방법을 살펴보면 다음과 같다.
- Day 0: 분리된 림프구에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 및 C2유닛의 사이토카인2용액 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계를 다음과 같이 수행하였다. 분리된 림프구 세포를 C1-1 유닛 solution 1 바이알(4.5mL)과 혈청 0.5㎖을 처리하여 T25 Flask에 넣고 CO₂Incubator(배양기)에서 배양하였다. 여기서, C1-1유닛은 사이토카인1-1용액으로 구성되는데, 사이토카인1-1용액은 IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 기본용액에 용해시켜 형성된다. C2 유닛은 사이토카인2용액으로 구성되는데, 사이토카인2용액은 IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된다. 기본용액은 B유닛을 구성하는데 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함한다.
- Day 1: 제1단계가 수행된 배지에 A1유닛의 항체1용액을 첨가하는 제2단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 A1유닛 solution 1 바이알(1mL)을 추가하고 가볍게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 계속하였다.여기서, A1유닛은 항체1용액으로 구성되는데, 항체1용액은 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 기본용액에 용해시켜 형성된다.
- Day 2: 제2단계가 수행된 배지에 D유닛의 항체-사이토카인혼합용액을 첨가하는 제3단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 D유닛 solution 1 바이알(1mL)을 추가하고 가볍게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 계속하였다. 여기서, D유닛은 항체-사이토카인혼합용액으로 구성되는데, 항체-사이토카인혼합용액은 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 항CD3 항체를 사이토카인1-1용액에 용해시켜 형성된다.
-Day 3: 제3단계가 수행된 배지에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 C1-1유닛 solution(day3) 1바이알(4.5mL)을 추가하고 0.5mL의 자가 혈장을 첨가한 후 조심스럽게 흔들어 준 후 배양기에서 배양을 지속하였다.
-Day 4: 제4단계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크의 바닥을 scraper로 잘 긁어모아 모든 세포를 T75 플라스크로 옮긴다. 여기에 A2 유닛 solution(day4) 1바이알(9mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 1mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다. 여기서, A2유닛은 항체2용액으로 구성되는데, 항체2용액은 항체1용액: 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함한다.
-Day 5: 제5단계가 수행된 배지에 C2유닛의 사이토카인2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T75 플라스크에 C2유닛 solution 1 바이알(9mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 1mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
-Day 6: 제6계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T75 플라스크의 바닥을 scraper로 잘 긁어 모아 모든 세포를 T150 플라스크에 옮긴다. 여기에 A2유닛 solution 1 바이알(27mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 3mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
-Day 7: 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T150 플라스크의 배양액을 면역세포와 혈청배양액으로 분리하기 위해 원심분리하였다.
-Day 7: 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계를 다음과 같이 수행하였다.
원심분리된 면역세포를 PBS로 3회 이상 세척하였다.
-Day 7: 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계를 다음과 같이 수행하였다.
세척된 면역세포를 T150 플라스크에 넣고 여기에 B유닛 solution 100㎖를 첨가한 후 CO₂ Incubator에서 배양하였다.
<>Day 8 ~ Day 11: 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제13단계를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 8: 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 T150 플라스크의 배양 중인 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액 50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양하였다.
- Day 9 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
- Day 10 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
<>Day 11 ~ Day 14 : 제13단계가 수행된 배지를 세포와 무혈청1차배양액으로 분리하는 제14단계 및 제14단계에서 분리된 세포를 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 11 : 세포를 포함한 1차 배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 무혈청1차배양액으로 분리하여 무혈청1차배양액을 수거하여 냉장 보관한다.
2차 세포배양 : 1차 배양액에서 수확된 면역세포를 B유닛 solution 100㎖에 풀어 넣는다. 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양한다.
-Day 12 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
-Day 13 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
-Day 14 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
<> Day 15 ~ Day18 : 2차 세포 수확 후 3차 배양 및 무혈청 면역세포 배양액 수거
- Day 15 : 제15단계가 수행된 세포를 포함한 2차배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 배양액으로 분리한다. 분리한 배양액은 무혈청 면역세포 배양액으로서 냉장 보관한다.
3차 세포배양 : 2차 배양액에서 수확된 면역세포를 B유닛 solution 100㎖에 풀어 넣는다. 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액 50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양한다.
-Day 16 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
-Day 17 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
-Day 18 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
2. 환자유래 PBMC를 준비하는 단계
면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 상술된 방법을 그대로 수행하여 분리된 PBMC를 또한 NKTM배양방법에 따라 Day 0부터 Day 10까지 배양하여 환자세포배양액을 얻었다.
3. 제1혼합배양액을 얻는 단계
선행특허에서 Day11에 세포를 포함한 1차 배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 무혈청1차배양액으로 분리하여 무혈청1차배양액을 수거하는 것과는 달리, 본 발명에서는 준비된 제1공여자세포배양액과 환자세포배양액을 1:1의 부피비로 혼합하여 제1혼합배양액을 얻었다.
4. 혼합배양단계
제1혼합배양액을 대상으로 NKTM배양방법에 따라 Day 12 내지 Day 18을 수행함으로써 배지조성물과 증식된 면역세포가 포함된 타가면역세포배양물1을 얻었다.
실시예 2
공여자의 혈액과 환자의 혈액을 달리한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 제1혼합배양액을 얻은 후 하기 표 1과 같은 방법으로 배지조성물교체 및 배지조성물수확을 수행하면서 60일 동안 배양하여 다량의 배지조성물을 얻었다.
이 때, day11에 2개의 bag에 들어있는 세포를 서로 혼합 후 다시 2개의 bag으로 나누어 배양하였다. 또한, 3~4일 간격으로 배양액 중 Cytokine의 농도를 변화시키며 자극의 변화를 주고 배지를 교체해 주며 배양하였는데, Cytokine의 농도 변화는 NKTM 배양과정 중 day8 ~ day14의 과정을 반복해 주는 방식으로 구현할 수 있다. 즉, 고농도의 C1용액 하에서 배양 후 점차 Cytokine이 없는 culture bag을 사용하여 배양하며 culture bag을 조금씩 풀어주는 방법으로 Cytokine의 농도를 변화시켜줄 수 있다. 이러한 방법으로 배양을 하면 적은 양의 면역세포를 이용하여 Cytokine이 풍부한 면역세포 배양액을 많이 얻을 수 있다.
배양일(day) 배양방법 배양일(day) 배양방법
11 배지조성물교체, 세포 혼합 32 배지조성물교체 (배지조성물수확)
13 34
15 배지조성물교체 (배지조성물수확) 37 배지조성물교체 (배지조성물수확)
18 배지조성물교체 (배지조성물수확) 39
20 배지조성물교체 (배지조성물수확) 42 배지조성물교체 (배지조성물수확)
22 배지조성물교체 (배지조성물수확) 44
24 49 배지조성물교체 (배지조성물수확)
24 배지조성물교체 (배지조성물수확) 53 배지조성물교체 (배지조성물수확)
29 54
31 60
실시예 3
제2 타가면역세포배양방법을 하기와 같이 수행하였다.
1. 제2공여자세포배양액을 얻는 단계
다른 공여자의 혈액으로부터 실시예1과 동일한 방법으로 분리된 PBMC를 NKTM배양방법에 따라 Day 0 및 Day 1을 수행함으로써 제2공여자세포배양액을 얻었다. 이 때 면역세포수는 1.2×107개였다.
2. 환자유래 PBMC를 준비하는 단계
면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 NKTM배양방법에 따라 Day 0부터 Day 14까지 배양하여 환자세포배양액을 얻었다.
3. 제2혼합배양액을 얻는 단계
NKTM배양방법에 따라 Day2에 제2공여자세포배양액에 첨가되어야 하는 D유닛 대신에 환자세포배양액을 면역세포수가 0.8×107개가 되도록 첨가하여 제2혼합배양액을 얻었다.
4. 혼합배양단계
제2혼합배양액을 대상으로 NKTM배양방법에 따라 Day 2 내지 Day 14를 수행함으로써 배지조성물과 증식된 면역세포가 포함된 타가면역세포배양물2를 얻었다.
실험예 1
다음과 같이 기저 줄기세포를 사용하여 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하는 실험을 수행하였는데 즉 어느 특정인의 줄기세포를 이용하여 T 세포의 면역관용을 유도하고 이 줄기세포에 대한 T 세포의 살상력을 비교함으로써 면역관용을 확인하였다. 줄기세포는 세포 표면에 MHC class I 분자를 다른 세포들보다 적게 발현하는 것으로 알려져 있다. 실험에 사용된 줄기세포는 제대에서 얻은 passage8 줄기세포를 사용하였다. 세포배양 day14에 수확한 면역세포(NK 세포 순도 : 69%)를 사용하였고 이 면역세포에 줄기세포가 약 30%되게 섞어서 하루 배양한 후 면역세포의 역가실험을 하였다. 즉 effector cell로서 면역세포를 사용하였고 target cell로서 전날 함께 배양했던 줄기세포와 같은 사람의 줄기세포를 사용하여 시험하였으며 다음의 통상적인 방법으로 면역세포의 역가시험을 하였다.
[역가시험]
In vitro상에서 Target cell을 형광염색하여 Effector cell과 함께 반응시켜 Effector cell에 의해 공격 받아 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정하여 Effector cell의 살해능력을 평가하였다. 세포상해활성이 높을수록 형광 강도의 측정치는 높아진다.
형광발색시약인 Calcein AM은 lipid-soluble diester fluorogenic esterase substrate이며 세포막을 통과할 수 있다. 살아있는 세포에서 손상되지 않은 세포막의 세포내 esterase에 의하여 가수분해되어 Calcein AM(non-fluorescence)이 Calcein (fluorescence)으로 전환되어 형광을 띠게 된다. 살아있는 세포의 손상되지 않은 막에 의하여 esterase activity가 유지되어 형광을 띤다. 그러나 죽은 세포의 손상된 세포막의 경우 esterase activity가 상실되어 형광을 방출하여 형광을 띠지 못하게 된다(죽은 세포의 경우 형광유지가 불가능하다).
Target cell에 Calcein AM으로 형광염색하여 Effector cell과 반응시키면 Effector cell에 의해 공격을 받은 Target cell은 파괴되어 형광을 방출시키고 살아있는 Target Cell에만 형광을 띠게 된다. Effector cell에 의하여 손상을 많이 받을수록 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광 강도는 높아진다. 형광강도를 측정할 수 있는 기기로 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정할 수 있다.
다음의 순서로 실험을 수행하였다.
1) Target Cell을 15㎖ tube에 모아 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 1㎖의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)으로 pellet을 풀어준 후 Cell counting 한다.
2) 1.5㎖ tube에 세포수가 1ⅹ10^6/㎖이 되도록 한 후 Calcein AM(1㎎/DMSO 1㎖)염색액을 10㎕을 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 30분 동안 Incubation한다.
3) Incubation 후 상층액을 제거하고 1㎖ 의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)로 Cell을 Washing한다. (2번 반복한다.)
4) Effector cell을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리 후 배양액 (RPMI1640 + 10% FBS)으로 1번 Washing하여 준다. 도 1에 실험에 사용된 Effector cell의 FACS데이터를 나타내었다.
5) 상층액을 버린 후 1㎖의 배양액을 첨가한 후 Hemocytometer로 cell counting하여 세포농도를 Target cell의 10배와 5배의 농도로 준비한다.
6) 96 well plate에 control 과 Target cell / Effector cell을 제작하여 well에 분주한다.
7) 자연유리 Well(Negative control) : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 100㎕ + Target cell 50㎕
8) 최대유리 Well(Positive control) : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 70㎕ + Target cell 50㎕ +1% Triton X-100 30㎕
9) 배양액 Well : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 150㎕
10) 검체 Well : Target cell 50㎕ + Effector cell 100㎕
11) 반응이 잘되도록 배양액과 시료를 섞어준다.
12) 5% CO2, 37℃에서 4시간 Incubation한다.
13) 반응 후 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다.
14) 원심분리 후 120㎕를 black plate로 옮겨 Fluoroskan ascent plate reader로 형광값을 측정한다.
15) 다음의 계산식을 이용하여 Cytotoxicity를 계산한다.
Effector cell의 Cytotoxicity(%) = (검체의 형광값-자연유리 형광값)/(최대유리형광값-자연유리형광값)X100
상기와 같은 실험을 통해 얻어진 공 배양된 면역 세포(effector : 표적 세포)의 세포 독성을 비교하고 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
Control
(not co-cultured)		 1 day
Co-cultured		 Control
(not co-cultured)		 1 day
Co-cultured
Effector/target cell (10:1) (10:1) (5:1) (5:1)
Cytotoxicity 49.7% 33.8% 35.5% 24.3%
표 2 및 도 2의 결과로부터 면역관용이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 줄기세포의 경우 그 표면에 MHC class I 분자가 많이 표현되지 않는 것으로 알려져 있으며 이 경우 NK세포의 공격을 받기가 쉬워지고 MHC class I 분자가 많이 표현된 줄기세포는 서로 다름으로 인한 다른 사람의 Tc(CD8+T세포)에 의해 공격을 받아 죽게 되는데, 표 2 및 도 2에서 보는 바와 같이 줄기세포를 혼합 배양하여 면역관용을 유도한 면역세포의 활성도는 그렇지 않은 면역세포보다 활성이 많이 떨어져 있음을 확인할 수 있었기 때문이다. 다만, 여전히 어느 정도 활성이 있는 것은 NK세포에 의한 것으로 생각되며 이렇듯 동종의 세포를 함께 배양하여 대상 세포에 대한 면역관용이 유도되는 것을 확인하였고 이를 이용하여 T 세포를 제거하지 않고도 보다 쉽게 동종 면역세포치료제를 만들 수가 있음을 알 수 있다.
실험예 2
실시예1에서 Day 0부터 Day 18까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.
배양일 0 4 6 8 12 13 14 15 17 19
제1공여자세포배양액세포수(×107) 0.5 0.6 2.3 8.5 71.5 　 　 　 　 　
환자세포배양액세포수(×107) 0.55 0.5 2.1 8.1 68.3 　 　 　 　 　
세포수합계
(×107)		 1.05 1.1 4.4 16.6 139.8 135 235 360 420 450
표 3 및 도 3의 결과는 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 또한 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포는 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되게 된다. 또한, 세포 수명도 길어져 day14 ~ day 21 사이에 cell harvest가 가능함을 알 수 있다.
실험예 3
실시예 2에서 Day 0부터 Day 60까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 4 및 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.
배양일
(Day)		 세포 수 (x10^7) 기타
제2공여자세포배양액 환자세포배양액
0 1.1 0.9
4 0.7 0.5
6 3.96 2.1
8 14.1 8.5
11 51.2 40.5
13
15
18
20 305.2 NK : 35.16, NKT:29.3, gdT:35.12
22 303.5
24 350
24
29
31 389 NK : 29.13, NKT:50.7, gdT:34
32
34 420
37
39 363
42
44 303
49
53
54 215 NK : 35.88, NKT : 16.2, gdT : 18.52
역가(10:1) : 41.2%
60 120
표 4 및 도 4a 내지 도 4c로부터 알 수 있듯이, 실험예 2와 동일하게 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 또한 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포는 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되게 된다. NK세포 또한 K562 cell line에 대한 세포독성이 매우 크게 나타나는 것으로 보아 면역관용과 상관없이 NK면역세포는 그 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 또한 세포 수명이 매우 길어짐을 확인할 수 있었다. 기존의 배양방법으로는 약 17일에서 20일 정도 지나면 세포수가 급격히 줄어들었으나 다른 사람의 세포를 혼합하고 3~4일 간격으로 배양액 중 Cytokine의 농도를 변화시키며 자극의 변화를 주고 배지를 교체해 주며 배양하였을 경우 그 수명이 60일 이상이 되어도 많은 수의 면역세포가 생존할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4
실시예 3에서 Day 0부터 Day 14까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 5, 도 5 및 도 6에 나타내었다.
배양일 0 4 6 8 11 14
세포수(X10^7) 1.2 1.0 3.6 13.1 115 325
표 5, 도 5 및 도 6의 또한 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 본 발명의 제2타가면역세포배양방법에 따라 배양 초기에 항CD3항체를 사용하여 자극을 하지 않더라도 유래가 다른 환자의 면역세포로 인한 즉 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포가 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되는 것을 알 수 있다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (15)

  1. 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 특정 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 9일 내지 12일 배양된 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 건강한 공여자의 PBMC 및 상기 환자유래 PBMC가 포함된 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는데,
    상기 제1공여자세포배양액을 얻는 단계는 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3 항체를, IL-12가 0.5∼5ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 상기 제6단계가 수행된 배지에 항체2용액으로 구성된 A2유닛 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계; 상기 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 및 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛을 첨가하여 배양하는 제13단계를 포함하여 수행되고,
    상기 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 대상으로 상기 제1단계 및 제13단계를 수행하여 환자유래 PBMC배양액을 얻도록 수행되며,
    상기 제1혼합배양액을 얻는 단계는 상기 제1공여자세포배양액 또는 환자유래 PBMC배양액을 각각 세포와 배양액으로 분리하는 제14단계를 수행하지 않고, 상기 제1공여자세포배양액과 환자유래 PBMC배양액을 혼합하여 수행되고,
    상기 혼합배양단계는 상기 제1혼합배양액에 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계를 포함하여 수행되며,
    상기 혼합배양단계를 통해 면역관용이 일어난 T세포를 포함하는 증식된 면역세포가 얻어지는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  2. 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1일 내지 2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 특정 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 1일 내지 2일 동안 배양된 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 건강한 공여자의 PBMC 및 상기 환자유래 PBMC가 포함된 제2혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는데,
    상기 제2공여자세포배양액을 얻는 단계는 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 및 상기 제1단계가 수행된 배지에 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계;를 포함하여 수행되고,
    상기 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자 혈액으로부터 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛 및 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 항체1용액으로 구성된 A1유닛을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3 항체를, IL-12가 0.5∼5ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 상기 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 상기 제6단계가 수행된 배지에 항체2용액으로 구성된 A2유닛 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계; 상기 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛을 첨가하여 배양하는 제13단계; 상기 제13단계가 수행된 배지를 세포와 배양액으로 분리하는 제14단계; 및 상기 제14단계에서 분리된 세포에 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계;를 포함하여 환자유래 PBMC배양액을 얻도록 수행되며,
    상기 제2혼합배양액을 얻는 단계는 상기 제2공여자세포배양액에 상기 제3단계의 D유닛을 대신하여 상기 환자유래 PBMC배양액을 첨가하여 수행되고,
    상기 제2혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계는 상기 제3단계는 수행하지 않고 상기 제4단계 내지 제15단계를 포함하여 수행되며,
    상기 혼합배양단계를 통해 면역관용이 일어난 T세포를 포함하는 증식된 면역세포가 얻어지는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제1혼합배양액 또는 제2혼합배양액은 상기 제1공여자세포배양액 또는 제2공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 상기 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포 수가 30개 내지 200개가 되도록 포함하는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 혼합배양단계는 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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US17/437,140 US20220168348A1 (en) 2019-03-08 2020-03-05 Method for culturing allogeneic immune cell, immune cell culture obtained thereby, and immune cell therapeutic agent comprising same
EP20769957.0A EP3967753A4 (en) 2019-03-08 2020-03-05 PROCESS FOR CULTIVATION OF ALLOGOUS IMMUNITY CELLS, IMMUNITY CELL CULTURE OBTAINED THEREBY AND IMMUNITY CELL THERAPEUTIC THEREFORE
CN202080033852.4A CN113795573A (zh) 2019-03-08 2020-03-05 培养同种异体免疫细胞的方法、用该方法获得的免疫细胞培养物和包含其的免疫细胞治疗剂

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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6977969B2 (ja) * 2019-03-22 2021-12-08 株式会社ガイアバイオメディシン 免疫細胞提供システム
CN116370619B (zh) * 2022-04-02 2024-04-12 北京达尔文细胞生物科技有限公司 一种安全有效的同种异体免疫细胞组合物及其制备方法和其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101683614B1 (ko) * 2016-02-15 2016-12-07 신동혁 Nk세포배양용 배지첨가키트 및 상기 키트를 이용한 nk세포배양방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0815204B1 (en) * 1995-03-17 2006-09-06 The Regents Of The University Of California Method for treating tumors by alloactivated human donor lymphocytes
US7435592B2 (en) * 2003-05-13 2008-10-14 Immunovative Therapies, Ltd. Compositions for allogeneic cell therapy
KR20090127973A (ko) * 2008-06-10 2009-12-15 주식회사 엔케이바이오 자기활성화 림프구 배양 방법
KR20120093978A (ko) * 2009-10-27 2012-08-23 이뮤니쿰 에이비 항원 특이적 ｔ 세포의 증식 방법
EP2696894B1 (en) * 2011-04-13 2017-11-01 Immunicum AB Method for priming of t cells
JP5572863B2 (ja) * 2011-06-24 2014-08-20 国立大学法人九州大学 Ｎｋ細胞の増幅方法
KR101344201B1 (ko) * 2011-10-31 2013-12-20 이동욱 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법
WO2014186193A1 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Abwiz Bio, Inc. T regulatory cells and uses thereof
JP6073417B2 (ja) * 2015-06-26 2017-02-01 チャ バイオテック カンパニー リミテッド 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
WO2018044809A1 (en) * 2016-08-29 2018-03-08 Hackensack University Medical Center Compositions and methods for reprogramming adult cells through the stemness of a platelet rich fraction of blood containing platelet-like cells in humans
KR101969045B1 (ko) 2016-11-22 2019-04-19 신동혁 면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
JP2019031470A (ja) * 2017-08-09 2019-02-28 株式会社再生医学研究所 Ｎｋ細胞培養上清を含む抗腫瘍組成物およびその製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101683614B1 (ko) * 2016-02-15 2016-12-07 신동혁 Nk세포배양용 배지첨가키트 및 상기 키트를 이용한 nk세포배양방법

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