WO2024090703A1 - 자연살해세포 증식에 효과적인 배양 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an efficient Natural Killer cell (NK cell) culture method among immune cell therapy, and more specifically, to efficiently amplify and activate immune cells after isolating lymphocytes derived from human peripheral blood.
  • This method effectively increases the content of natural killer cells by promoting cell differentiation by strongly inducing an immune response using a culture medium that specifically contains IL-6.
  • Immunotherapy extracts the most important immune cells in cancer treatment, such as Natural Killer cells (NK cells), dendritic cells (DC), B cells, and T cells, from the patient's blood and uses various types of stimulants to treat cancer. It is a method of growing strong immune cells and then injecting them back into the patient. Because the patient's own blood is used, there are fewer side effects and the administration method is simpler than conventional chemotherapy, so it has been actively researched in recent years.
  • NK cells Natural Killer cells
  • DC dendritic cells
  • B cells B cells
  • NK cells do not attack normal cells expressing MHC class I molecules, but mainly attack cells with reduced or missing expression of MHC class I molecules. Therefore, using allogeneic NK cells in cell therapy for cancer and infectious diseases has the advantage of avoiding the side effects of GVH (Graft-versus-host) disease.
  • GVH Gel-versus-host
  • lymphocyte apheresis there is a limit to the number of cells that can be recovered from a donor by lymphocyte apheresis, so it is necessary to obtain a sufficient number of NK cells to kill target cells such as cancer cells and pathogen-infected cells. This is because it cannot remain in the recipient's body for the period until death.
  • NK cell transplantation needs to be repeated frequently. This places a great burden on the patient. Therefore, the development of technology to obtain sufficient NK cells to kill target cells by culturing and amplifying natural killer cells obtained from donors in vitro is in progress.
  • natural killer cells in particular are large granular lymphocytes (LGL, Large granular lymphocytes), a characteristic type of lymphocyte. They have an excellent ability to kill infected viruses and tumor cells, but do not kill most normal cells. Its anti-tumor action is achieved through necrosis, apoptosis, or both of these mechanisms occurring simultaneously.
  • NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, and interferon, thereby increasing cytotoxicity, secretory, and proliferative functions.
  • the phenotype of NK cells in humans is CD16 (Fc ⁇ RIII) and CD56. CD16 and CD56 do not have TRC (T-cell receptor complex) on the cell surface, so they are used as markers for NK cells.
  • NK cells are known to play an important role in the initial biological defense mechanism and tumor immunity of the human body.
  • NK cells can kill specific autologous cells, allogeneic cells, and even heterogeneous cancer cells without the process of acquiring immunity through the expression of Major Histocompatibility Complex (MHC).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • they express little or no Class 1 MHC. It can kill target cells better. Therefore, NK cells can effectively kill most cancer cells that do not express MHC, and can also kill cells infected with some viruses and bacteria such as salmonella typhi.
  • NK cells which have an excellent effect on killing cancer cells, account for only 5 to 15% of peripheral blood lymphocytes even in normal people, and especially in cancer patients, the ratio drops to less than 1%, so immunotherapy is not recommended. There are limits to effectively attacking cancer cells without a separate amplification process.
  • Cytokines such as IL-2 and antibodies such as CD3 are used to activate and proliferate immune cells, especially NK cells.
  • Current technology uses CD3 antibodies to play a very important role in the proliferation of immune cells, but the problem is that activating immune cells using this antibody is very difficult.
  • the current general technology mainly uses a method of immobilizing CD3 antibodies in a flask and stimulating them for a certain period of time.
  • the sensitivity is different for each individual and also varies greatly depending on cell culture conditions or the level of skill of the operator.
  • the current method that is generally used is to initially stimulate lightly with CD3 antibodies, but depending on the surrounding environment requirements such as individual differences, It is difficult to obtain NK cells that are activated and proliferated in large quantities, depending on the severity of the disease.
  • Interleukin-6 is an interleukin that acts as both a pro-inflammatory cytokine and an anti-inflammatory myokine. It is a cytokine that regulates our body's immune and inflammatory responses and is composed of 212 amino acid residues including 28 signal peptides. IL-6 is secreted from various cells such as T lymphocytes and macrophages and promotes immune responses. In this case, it is known to promote various inflammatory reactions due to tissue damage leading to infection, trauma, burns, or inflammation. It is known that overproduction of IL-6 is closely related not only to inflammatory diseases but also to the development of various immune disorders and lymphatic tumors.
  • IL-6 stimulates CD4 T cells to secrete IL-4 and directs the response to Th2
  • IL-6 affects secretion by CD4 T cells, an essential interferon that promotes Th1 polarization. Decreased IFN ⁇ . A similar effect is produced in Th1 cells, where inhibition of IFN ⁇ secretion affects CD8 T cell activation (Dienz and Rincon, 2009; Green et al., 2013).
  • the culture technology for general immune cells, especially natural killer cells involves adding feeder cells.
  • Most of the cells used as feed cells are cancer cells, and these immune cells and natural killer cells are cancer cells.
  • the problem with this method is that it is difficult to prove whether all of the introduced cancer cells have died, so new techniques for cultivating effective immune cells and natural killer cells are needed.
  • the present invention was devised to solve the above-mentioned problem.
  • the purpose of the present invention is to promote rapid cell proliferation and increase the proportion of natural killer cells when Interleukin-6 stimulates early immune cells in culturing natural killer cells. It was confirmed that continuous stimulation actually inhibits immune cell activity, and by applying this to a culture kit, we provide a natural killer cell culture medium and a natural killer cell culture method that can effectively and stably amplify natural killer cells. .
  • the medium for culturing natural killer cells according to the present invention to solve the above problems includes a BM solution consisting of L-glutamine, IL-2, and a cell culture medium, a basic medium containing IL-6, and cytokines. It is characterized by being composed of a medium containing and a medium containing an antibody.
  • the medium containing cytokines includes a C2 solution containing IL-2 but having a higher IL-2 content than the BM solution, a C6 solution containing IL-6, It consists of at least two of the C12 solution containing IL-12, the C15 solution containing IL-15, the C18 solution containing IL-18, and the C21 solution containing IL-21, and contains the above antibodies.
  • the medium is characterized in that it contains at least two of the following: A3 solution containing anti-CD3, A16 solution containing anti-CD16, and A56 solution containing anti-CD56.
  • the C6 solution is used only for cell stimulation in the initial cultivation stage of natural killer cells, and is not used in stages after the initial culture stage.
  • the BM solution contains 100 to 2000 IU/mL of IL-2
  • the C2 solution contains 250 to 4000 IU/mL of IL-2
  • the C6 solution contains 250 to 4000 IU/mL of IL-2.
  • the solution contains IL-6 at a concentration of 0.01 to 10 IU/mL
  • the C12 solution contains IL-12 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL
  • the C15 solution contains IL-15 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL.
  • the C18 solution contains IL-18 at a concentration of 0.01 ⁇ 10 ug/mL
  • the C21 solution contains IL-21 at a concentration of 0.01 ⁇ 10 ug/mL
  • the A3 solution contains anti-CD3 at a concentration of 0.1 ⁇ 20 ug/mL
  • the A16 solution contains anti-CD16 at a concentration of 0.1 to 20 ug/mL
  • the A56 solution contains anti-CD56 at a concentration of 0.1 to 20 ug/mL.
  • the natural killer cell culture method according to the present invention is a medium containing at least two of the BM solution, A3, A16, A56 solution, C6 solution, C12, C15, C18, and C21 solution, and autologous plasma.
  • autologous plasma is added at less than 10% v/v of the total medium, obtained when separating lymphocytes from blood cells, commercially available FBS, or similar. Do this.
  • the initial lymphocyte cell number is 0.30 to 2.0
  • the ratio of natural killer cells among immune cells is characterized by more than 90%.
  • the pharmacological composition according to the present invention contains natural killer cells cultured by a natural killer cell culture method, and prevents or prevents at least one disease among blood cancer, cancer including solid cancer, viral infection, and autoimmune disease. It is characterized by treatment.
  • the medium for culturing natural killer cells and the method for culturing natural killer cells according to the present invention promote rapid cell proliferation and increase the ratio of natural killer cells when Interleukin-6 stimulates early immune cells in culturing existing natural killer cells. It was confirmed that continuous stimulation actually inhibits immune cell activity, and applying this to a culture kit has the effect of effectively and stably amplifying natural killer cells.
  • Figure 1 is a graph comparing cell growth of natural killer cells according to the present invention.
  • C2 solution was prepared so that IL-2 was 1000 to 3000 IU/mL.
  • C6 solution was prepared so that IL-6 was 0.1 to 5 ug/mL.
  • the C12 solution was prepared so that IL-12 was 0.1 to 5 ug/mL.
  • the C15 solution was prepared so that IL-15 was 0.1 to 5 ug/mL.
  • the C18 solution was prepared so that IL-18 was 0.1 to 5 ug/mL.
  • C21 solution was prepared so that IL-21 was 0.1 to 5 ug/mL.
  • A3 solution was prepared so that anti-CD3 content was 0.5 to 5 ug/mL.
  • A16 solution was prepared so that anti-CD16 was 0.5 to 5 ug/mL.
  • A56 solution was prepared to contain 0.5 to 5 ug/mL of anti-CD56.
  • Lymphocytes and autologous plasma were prepared from the patient's blood, and then natural killer cells were cultured using the cell culture medium addition kit prepared in Example 1 as follows.
  • the culture was cultured in 5% CO 2 ) for 4 days from the 1st day to the 5th day, the day the culture was started.
  • the culture flask was scraped on the 5th day of culture, transferred to a conical tube using PBS, centrifuged (400G 5min), washed once more with PBS, and then transferred to a T75 flask with BM solution and C2 solution medium for stabilization.
  • a solution containing two or more C2, C12, C15, C18, and C21 solutions and a culture medium containing A16 and A56 were added to the cells stabilized in the T75 flask, and cultured in a CO 2 incubator (37 o C 5%) from the 5th to 6th day of culture. Cultivation continued in CO 2 ). As the number of cells proliferates, on the 7th day of culture, transfer to a T150 or T175 flask using a solution containing two or more C2, C12, C15, C18, and C21 solutions and a culture medium containing A16 and A56. Continue adding the culture medium until the 8th day and keep CO 2 The culture continued to grow in an incubator (37 o C, 5% CO 2 ) (total of 4 days).
  • KOHJIN BIO's cell mass culture medium was used and cultured without IL-6 for 14 days.
  • KOHJIN BIO's NK Kit (NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, NKCC-c), known as an NK cell culture kit, was used and cultured without IL-6 for 14 days.
  • NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, NKCC-c known as an NK cell culture kit
  • Test A medium containing IL-6 was able to proliferate natural killer cells more effectively. It is listed in Table 2 below.
  • Example 4 In the evaluation of cultured anti-cancer activity in Example 4, the K562 cancer cell line was stained with Cacein AM, cultured immune cells or natural killer cells were added at a ratio of 1:30, and incubated in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) for 4 hours. When analyzed by fluorescence analysis after reaction, all showed high anticancer activity of more than 90%, and the results are listed in Table 3 below.

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Abstract

본 발명은 면역세포 요법 중 효율적 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 분리한 후 면역세포를 효율적으로 증폭 및 활성화하기 위한 배양방법에 있어 IL-6를 특징적으로 함유한 배양배지를 이용하여 면역반응을 강하게 유도함으로서 세포의 분화촉진을 통한 자연살해세포의 함량을 효과적으로 증가시키는 방법이다.

Description

자연살해세포 증식에 효과적인 배양 방법 및 이의 용도
본 발명은 면역세포 요법 중 효율적 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 분리한 후 면역세포를 효율적으로 증폭 및 활성화하기 위한 배양방법에 있어 IL-6를 특징적으로 함유한 배양배지를 이용하여 면역반응을 강하게 유도함으로서 세포의 분화촉진을 통한 자연살해세포의 함량을 효과적으로 증가시키는 방법이다.
면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
NK 세포는, MHC 클래스 I 분자를 발현하는 정상 세포는 공격하지 않고, MHC 클래스 I 분자의 발현이 저하 및 결손된 세포를 주로 공격한다. 따라서 암 및 감염증의 세포 요법에 동종 NK 세포를 사용하면, GVH(Graft-versushost;이식 편대 숙주)병의 부작용을 회피할 수 있다는 이점이 있다. 실제로 Miller 외 및 Rubnitz 외의 보고에 따르면, 암 환자를 수용자로 하고, 그의 근연인 정상인 공여자의 신선한 말초혈 단핵구로부터 NK 세포를 농축한 후 이식했을 때, 이식된 NK 세포는 수용자에 부작용을 일으키지 않고, 일시적으로 생착하여, 세포 상해 활성을 유지하였다. 그러나, NK 세포의 이식 요법의 유효성을 나타내는 임상치료의 효력의 보고는 아직 없다. 그 이유 중 하나는, 공여자로부터 림프구 성분 채집(apheresis)에 의해 회수할 수 있는 세포수에 한도가 있기 때문에, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시킬 수 없기 때문이다.
따라서, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시키기 위해서는, NK 세포의 이식이 빈번히 반복될 필요가 있고, 이것은 환자에게 큰 부담이 된다. 따라서, 공여자로부터 얻은 자연살해세포를 일단 시험관 내에서 배양 증폭하여, 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 NK세포를 얻는 기술의 개발이 진행되고 있다.
면역요법에서 활성화시키는 면역세포 중에서 특히 자연살해세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory) 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다.
그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이 1 % 미만으로 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
면역세포 특히 NK세포를 활성화하고 증식시키는데 있어서 IL-2 등의 Cytokine 과 CD3 등의 항체가 사용된다. 현행 기술은 면역세포의 증식에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것이 CD3 항체인데, 문제는 이 항체를 이용해서 면역세포를 활성화 시키는 것이 매우 까다롭다는 것이다. 즉, 면역세포 배양 시 현재의 일반적 인 기술은 CD3항체를 플라스크에 고정화 시켜서 일정시간 자극하는 방법을 주로 사용한다. 그러나 면역세포의 경우 각 개인마다 감수성이 다르고 또한 세포배양 조건 또는 작업자의 숙련 정도에 따라서 매우 많은 차이가 난다.
특히, 처음부터 CD3 항체의 강한 자극이 가해지면 미성숙 전구세포들은 T세포로 성숙하게 되므로 일반적으로 행해지고 있는 현행 방법은 처음에 CD3 항체를 살짝 자극하는 방법을 사용하는데, 개인 차 등 주변 환경 요건에 의해 많이 좌우되어 활성화된 많은 양으로 증식된 NK세포를 얻는데 어려움이 있다.
현행 방법에서 반드시 플라스크에 CD3 항체를 고정한 후 일정시간 반응시켜야 하는 까다로움을 제거하면서도 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있는 새로운 배양배지 조성물 및 배양방법에 대한 개발 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
한편 인터루킨-6 (Interleukin-6, IL-6)는 전 염증성 사이토카인(cytokine) 및 항 염증성 미오킨(myokine) 둘 다로서 작용하는 인터루킨이다. 우리 몸의 면역과 염증 반응을 조절하는 사이토카인으로 28개의 신호펩타이드를 포함한 212개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다. IL-6는 T림프구나 대식세포등 다양한 세포에서 분비되어 면역반응을 촉진한다. 이 경우는 감염, 외상, 화상이나 염증으로 이어지는 조직손상으로 여러 염증반응도 촉진하는 것으로 알려져 있다. IL-6의 과잉 생산은 염증성 질환 뿐만 아니라 여러가지 면역 이상증, 림프계 종양의 발증과도 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, IL-6 생산의 생물학적 결과는 염증 촉진 및 항염 효과 모두와 연관되어 있으며(Scheller et al., 2011), 이는 면역 반응의 활성화 및 조절에서 IL-6의 중추적 역할을 강조된다. IL-6 생산에 의해 STAT3 신호 전달 경로의 활성화에 의한 수지상 세포 성숙의 음성 조절(Park et al., 2004) 뿐만 아니라 Th1 분극을 억제하여 Th2 반응의 촉진(Diehl and Rincon , 2002). IL-6에 의한 Th1 분극의 억제를 촉진하는 것으로 알려져 있다. (1) IL-6은 CD4 T 세포를 자극하여 IL-4를 분비하고 Th2에 대한 반응을 지시하고, (2) IL-6은 분비에 영향 Th1 분극화를 촉진하는 필수 인터페론인 CD4 T 세포에 의한 IFNγ의 감소. Th1 세포에서 유사한 효과가 생성되며, 이 세포에서 IFNγ 분비의 억제는 CD8 T 세포 활성화에 영향을 미친다.(Dienz and Rincon, 2009; Green et al., 2013).
한편 현재까지 개발된 일반적인 면역세포 특히 자연살해세포를 배양기술은 먹이세포(Feeder cell)을 넣어주는데 이때 먹이세포로 넣는 세포는 암세포(cancer cell)이 대부분이며, 이들 면역세포, 자연살해세포가 암세포를 인식하여 증식신호를 증대시키는 방법을 활용한다. 이러한 방법의 문제점은 넣어준 암세포가 전부 사멸하였는지 증명하기 어려운 데 있는 문제가 있어 새로운 효과적인 면역세포, 자연살해세포를 배양하는 기술이 필요하다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 자연살해세포를 배양하는데 있어 Interleukin-6가 초기 면역세포를 자극할 경우, 빠른 세포증식과 자연살해 세포비율을 증가시키는 반면, 지속적으로 자극시에는 오히려 면역세포 활성을 저해함을 확인하였고 이를 배양키트에 적용하여 자연살해세포를 효과적이고 안정적으로 증폭시킬 수 있는 자연살해세포 배양용 배지 및 자연살해세포 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 자연살해세포 배양용 배지는 L-글루타민, IL-2 및 세포배양용 배지로 구성되는 BM용액과, IL-6를 포함하는 기본 배지와, 사이토카인을 함유하는 배지와, 그리고 항체를 함유하는 배지로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양용 배지에 있어서, 사이토카인을 함유하는 배지는 IL-2를 함유하되 상기 BM용액보다 IL-2 함량이 높은 C2용액, IL-6가 함유된 C6용액, IL-12가 함유된 C12용액, IL-15가 함유된 C15용액, IL-18이 함유된 C18용액, IL-21이 함유된 C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액을 포함하여 구성되고, 상기 항체를 포함하는 배지는 항CD3가 함유된 A3용액, 항CD16이 함유된 A16용액, 항CD56이 함유된 A56용액 중 적어도 둘 이상의 용액을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양용 배지에 있어서, C6용액은 자연살해세포 초기배양 단계에서 세포 자극을 위해서만 사용되고, 초기배양 단계 이후의 단계에서는 사용되지 않는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양용 배지에 있어서, BM 용액은 IL-2가 100 ~ 2000 IU/mL로 함유되고, C2용액은 IL-2가 250~4000 IU/mL로 함유되며, C6용액은 IL-6가 0.01~10 IU/mL로 함유되고, C12용액은 IL-12가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, C15용액은 IL-15가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C18용액은 IL-18이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C21용액은 IL-21이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, A3용액은 항CD3가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되며, A16용액은 항CD16이 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되고, A56용액은 항CD56이 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양방법은, BM 용액과, A3, A16, A56용액과, C6용액과, C12, C15, C18, C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액과, 자가혈장을 포함하는 배지를 이용하여 자연살해세포를 자극하는 1단계와; 상기 1단계에서 사용한 배지를 분리하여 안정화하는 2단계와; C2, C12, C15, C18, C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액과, 자가혈장을 포함하는 배지를 이용하여 자연살해세포 증식을 가속하는 3단계와; 배양하던 배지를 포함하여 BM용액과 자가혈장이 첨가된 배지에서 대량 증폭배양하는 4단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양방법에 있어서, 자가혈장은 전체 배지의 10% v/v 이하로 첨가되며, 혈구에서 림프구를 분리할 때 얻는 것 또는 상업적으로 이용가능한 FBS 또는 이와 유사한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 자연살해세포 배양방법에 있어서, 자연살해세포가 배양될 때에 초기 림프구 세포수 0.30~2.0x107로부터 배양되고, 최종 배양 후 면역세포 수는 100~2000배 증폭되며, 증폭된 면역세포 중 자연살해세포 수의 비율은 90% 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 약리학적 조성물은 자연살해세포 배양방법에 의해 배양된 자연살해세포를 포함하며, 혈액암, 고형암을 포함하는 암, 바이러스 감염증 및 자가면역질환 중 적어도 어느 하나의 질병을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자연살해세포 배양용 배지 및 자연살해세포 배양방법은 있는 자연살해세포를 배양하는데 있어 Interleukin-6가 초기 면역세포를 자극할 경우, 빠른 세포증식과 자연살해 세포비율을 증가시키는 반면, 지속적으로 자극시에는 오히려 면역세포 활성을 저해함을 확인하였고 이를 배양키트에 적용하여 자연살해세포를 효과적이고 안정적으로 증폭시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 자연살해세포 세포성장 비교 그래프이다.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
[실시예 1] 배양에 사용할 배지(배양키트)의 준비단계
200mM L-glutamine 용액 100mL를 부유세포 배양용 기본 배지에 넣어 녹이고 IL-2를 250 IU/mL가 되도록 첨가한 후 최종 10L를 만들어 BM용액으로 하였다.
C2용액은 IL-2가 1000~3000 IU/mL가 되도록 제조하였다,
C6용액은 IL-6가 0.1 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
C12용액은 IL-12가 0.1 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
C15용액은 IL-15가 0.1 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
C18용액은 IL-18이 0.1 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
C21용액은 IL-21이 0.1 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
A3용액은 항CD3가 0.5 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
A16용액은 항CD16이 0.5 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
A56용액은 항CD56이 0.5 ~ 5 ug/mL가 되도록 제조하였다.
[실시예 2] 단일배양방법
환자로부터 혈액으로부터 림프구 및 자가혈장을 준비한 다음, 실시예 1에서 준비한 세포배양용 배지첨가키트를 이용하여 다음과 같이 자연살해세포를 배양하였다.
1.림프구추출 및 자가혈장 준비단계
환자A의 말초혈액 30㎖을 50㎖ conical tube에 넣은 후 원심분리한 후 상층의 자가혈장을 헤파린튜브에 넣어 처리한 다음 새로운 50㎖ conical tube에 넣고 다시 원심분리한 후 상층부의 혈장성분을 자가혈장으로 준비하였다.
그 후 혈장이 제거된 혈액튜브에 PBS를 넣어 부피를 30㎖로 맞춘 다음 잘 섞어서 준비해둔 Ficoll-Paque Plus가 들어있는 튜브에 옮기고, 800xg에서 15분간 원심분리한 후, 두 번째 층인 림프구가 들어 있는 연막층(buffy coat layer)을 분리하여 50㎖ conical tube에 모으고, PBS로 50㎖까지 부피를 맞춘 다음 섞어주었다. 그 후 2 내지 3번의 원심분리를 통해 상층액을 버리고 림프구를 분리하였다.
2. 1단계 초기배양
분리된 림프구에서 0.3~2.0x107 세포수만큼 취하고 C6용액을 첨가한 BM용액, C12, C18용액, A3, A16, A56용액과, 자가혈장을 넣고 T25 또는 T75플라스크에서 CO2 incubator(37oC 5% CO2)에서 배양을 시작한 당일인 1일차부터 5일차 까지 4일 동안 배양하였다.
3. 2단계 안정화
초기배양 후 배양 5일차에 배양플라스크를 스크래핑 한 후 PBS를 이용하여 conical tube로 옮기고 원심분리(400G 5min)후 PBS로 1회 더 씻어준 후 BM 용액과 C2용액배지로 T75플라스크로 옮겨 안정화하였다.
4. 3단계 증식배양
T75플라스크에서 안정화시킨 세포에 C2, C12, C15, C18, C21용액을 둘 이상 포함시킨 용액과, A16, A56을 포함한 배양액을 첨가하며 배양 5일차부터 6일차까지 CO2 incubator(37oC 5% CO2)에서 계속 배양하였다. 세포수가 증식되어 배양 7일차에는 T150 또는 T175플라스크로 C2, C12, C15, C18, C21용액을 둘 이상 포함시킨 용액과 A16, A56을 포함한 배양액을 이용하여 옮기고 계속 배양액을 8일차까지 첨가하며 CO2 incubator(37oC 5% CO2)에서 계속 증식배양하였다.(총 4일)
5. 4단계 대량배양
3단계 증식배양 후 전체 배양액을 세포배양액이 들어있는 1L CO2 투과성 배양백에 넣고 자가혈장을 5~10mL 더 가해주고 배양액과 잘 섞이도록 마시지해준 후, CO2 incubator(37oC 5% CO2)에서 4~6일 동안 대량배양하였다. 이때 24시간마다 배양액이 잘 섞이도록 마시지를 해주었다.
6. 자연살해 면역세포의 수확
배양이 끝난 최종배양액을 원심분리튜브에 담아 여러 번의 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 수확된 세포를 생리식염수 백에 포장하여 냉장보관하거나 알부민 10~20%를 추가하여 냉장보관 또는 동결하여 보관하였다.
[실시예 3] 단일 배양방법과 일반 배양방법과의 비교
실시예 2를 이용한 배양방법과 KOHJIN BIO社의 세포대량배양용 배지, 그리고 IL-6를 첨가하지 않은배양배지를 이용한 배양 비교를 시행하였다. KOHJIN BIO社의 배양 키트는 NK 세포배양 키트로 알려져있는 KOHJIN BIO사의 NK Kit(NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, NKCC-c)를 이용하였으며, IL-6가 없는 배양배지와 14일간 배양 비교하였을 때 IL-6가 포함된 배지(실시예 2)에서 더 높은 면역세포수 및 살해활성세포 비율을 확인하였다. 특히 이러한 차이는 면역력이 떨어진 환자군의 세포를 이용한 경우 더욱 확실하게 나타났다.
배양방법 대상 배양전 면역세포수 배양후 면역세포수 NK세포비율
KOHJIN BIO KIT Health 0.41 x 107 118 x 107 27%
Patient 0.42 x 107 54 x 107 26%
IL-6 미포함 배지 Health 0.40 x 107 404 x 107 95%
Patient 0.40 x 107 366 x 107 84%
실시예 2 방법
(IL-6 포함)		 Health 0.40 x 107 596 x 107 98%
Patient 0.38 x 107 494 x 107 96%
[실시예 4] 배양 세포수 및 자연살해세포 비율 비교
배양 일자별 배양세포수를 IL-6 미포함 배지와 IL-6를 포함하는 배지를 비교하였을 때 IL-6를 포함하는 Test A 배지가 더욱 효과적으로 자연살해세포를 증식시킬 수 있는 것으로 확인하였으며, 그 결과를 아래 표 2에 기재하였다.
구분 배지 중 IL-6 함유 배양기간 중 세포수 ( x 107 cell)
D1-D5 D5-D9 D9-D15 D1 D3 D5 D6 D7 D8 D9
Control - - - 0.40 0.33 0.31 0.62 1.55 4.03 10.08
Test A O - - 0.42 0.68 1.68 3.73 9.51 22.16 50.52
Test B - O O 0.42 0.34 0.29 0.64 1.54 3.57 7.28
Test C O O O 0.42 0.68 1.59 3.35 7.95 17.17 34.18
구분 D1-D5 D5-D9 D9-D15 D10 D11 D12 D13 D14 D15 NK비율
Control - - - 23.17 50.98 107.06 192.70 289.05 404.68 95%
Test A O - - 99.03 178.25 267.37 385.01 496.67 596.00 98%
Test B - O O 13.82 23.64 36.88 53.40 71.55 90.87 72%
Test C O O O 59.47 96.34 152.21 222.23 306.68 374.15 74%
[실시예 5] 항암활성 비교
실시예 4의 배양된 항암활성 평가에서는 K562암세포주를 Cacein AM으로 염색한 후 배양한 면역세포 또는 자연살해세포를 1:30 비율로 넣고 4시간 동안 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 반응후 형광발색법으로 분석하였을 때 모두 90% 이상의 높은 항암활성을 나타내었으며, 그 결과는 아래 표 3에 기재하였다.
구분 Cytotoxicity (K562)
Control 92%
Test A 98%
Test B 94%
Test C 90%
한편, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않고 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들을 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 자연살해세포 배양용 배지에 있어서,
    L-글루타민, IL-2 및 세포배양용 배지로 구성되는 BM용액과, IL-6를 포함하는 기본 배지와, 사이토카인을 함유하는 배지와, 그리고 항체를 함유하는 배지로 구성되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양용 배지.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인을 함유하는 배지는 IL-2를 함유하되 상기 BM용액보다 IL-2 함량이 높은 C2용액, IL-6가 함유된 C6용액, IL-12가 함유된 C12용액, IL-15가 함유된 C15용액, IL-18이 함유된 C18용액, IL-21이 함유된 C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액을 포함하여 구성되고,
    상기 항체를 포함하는 배지는 항CD3가 함유된 A3용액, 항CD16이 함유된 A16용액, 항CD56이 함유된 A56용액 중 적어도 둘 이상의 용액을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양용 배지.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 C6용액은 자연살해세포 초기배양 단계에서 세포 자극을 위해서만 사용되고, 초기배양 단계 이후의 단계에서는 사용되지 않는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양용 배지.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 BM 용액은 IL-2가 100 ~ 2000 IU/mL로 함유되고, C2용액은 IL-2가 250~4000 IU/mL로 함유되며, C6용액은 IL-6가 0.01~10 IU/mL로 함유되고, C12용액은 IL-12가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, C15용액은 IL-15가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C18용액은 IL-18이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C21용액은 IL-21이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, A3용액은 항CD3가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되며, A16용액은 항CD16이 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되고, A56용액은 항CD56이 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양용 배지.
  5. BM 용액과, A3, A16, A56용액과, C6용액과, C12, C15, C18, C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액과, 자가혈장을 포함하는 배지를 이용하여 자연살해세포를 자극하는 1단계와;
    상기 1단계에서 사용한 배지를 분리하여 안정화하는 2단계와;
    C2, C12, C15, C18, C21용액 중 적어도 둘 이상의 용액과, 자가혈장을 포함하는 배지를 이용하여 자연살해세포 증식을 가속하는 3단계와;
    배양하던 배지를 포함하여 BM용액과 자가혈장이 첨가된 배지에서 대량 증폭배양하는 4단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 자가혈장은 전체 배지의 10% v/v 이하로 첨가되며, 혈구에서 림프구를 분리할 때 얻는 것 또는 상업적으로 이용가능한 FBS 또는 이와 유사한 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양방법.
  7. 제12항에 있어서,
    자연살해세포가 배양될 때에 초기 림프구 세포수 0.30~2.0x107로부터 배양되고, 최종 배양 후 면역세포 수는 100~2000배 증폭되며, 증폭된 면역세포 중 자연살해세포 수의 비율은 90% 이상인 것을 특징으로 하는 자연살해세포 배양방법.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 하나의 배양방법에 의해 배양된 자연살해세포를 포함하며, 혈액암, 고형암을 포함하는 암, 바이러스 감염증 및 자가면역질환 중 적어도 어느 하나의 질병을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.
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