WO2024071671A1 - 면역세포 및 자연살해세포 배양을 위한 신규한 이중배양 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

면역세포 및 자연살해세포 배양을 위한 신규한 이중배양 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024071671A1
WO2024071671A1 PCT/KR2023/012028 KR2023012028W WO2024071671A1 WO 2024071671 A1 WO2024071671 A1 WO 2024071671A1 KR 2023012028 W KR2023012028 W KR 2023012028W WO 2024071671 A1 WO2024071671 A1 WO 2024071671A1
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solution
cells
culture
natural killer
immune cells
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PCT/KR2023/012028
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Inventor
오정훈
백영일
Original Assignee
(주)포에버엔케이
오정훈
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to an immune cell dual culture method applied to immunotherapy, and more specifically, to culture lymphocytes derived from human peripheral blood to produce immune cells that are effective in treating malignant tumors, such as immune cells ( It is a culture method that selectively and efficiently amplifies and activates natural killer cells (PBMC), natural killer cells, or gamma delta T cells, etc., and when immune cells are combined and cultured after applying different stimuli for a certain period of time, the culture efficiency and activity can be significantly increased. This is about cell dual culture method.
  • PBMC natural killer cells
  • gamma delta T cells gamma delta T cells
  • Immunotherapy extracts the most important immune cells in cancer treatment, such as Natural Killer cells (NK cells), dendritic cells (DC), B cells, and T cells, from the patient's blood and uses various types of stimulants to treat cancer. It is a method of growing strong immune cells and then injecting them back into the patient. Because the patient's own blood is used, there are fewer side effects and the administration method is simpler than conventional chemotherapy, so it has been actively researched in recent years.
  • NK cells Natural Killer cells
  • DC dendritic cells
  • B cells B cells
  • NK cells do not attack normal cells expressing MHC class I molecules, but mainly attack cells with reduced or missing expression of MHC class I molecules. Therefore, using allogeneic NK cells in cell therapy for cancer and infectious diseases has the advantage of avoiding the side effects of GVH (Graft-versus-host) disease.
  • GVH Gel-versus-host
  • NK cell transplantation therapy there are still no reports of clinical therapeutic effects indicating the effectiveness of NK cell transplantation therapy.
  • One of the reasons is that there is a limit to the number of cells that can be recovered from a donor by lymphocyte apheresis, so it is necessary to obtain a sufficient number of NK cells to kill target cells such as cancer cells and pathogen-infected cells. This is because it cannot remain in the recipient's body for the period until death.
  • NK cell transplantation needs to be frequently repeated, This places a great burden on the patient. Therefore, the development of technology to obtain sufficient NK cells to kill target cells by culturing and amplifying natural killer cells obtained from donors in vitro is in progress.
  • natural killer cells in particular are large granular lymphocytes (LGL, Large granular lymphocytes), a characteristic type of lymphocyte. They have an excellent ability to kill infected viruses and tumor cells, but do not kill most normal cells. Its anti-tumor action is achieved through necrosis, apoptosis, or both of these mechanisms occurring simultaneously.
  • NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, and interferon, thereby increasing cytotoxicity, secretory, and proliferative functions.
  • the phenotype of NK cells in humans is CD16 antibody (Fc ⁇ RIII) and CD56 antibody. CD16 antibody and CD56 antibody do not have TRC (T-cell receptor complex) on the cell surface, so they are used as markers for NK cells.
  • NK cells are known to play an important role in the initial biological defense mechanism and tumor immunity of the human body.
  • NK cells can kill specific autologous cells, allogeneic cells, and even heterogeneous cancer cells without the process of acquiring immunity through the expression of Major Histocompatibility Complex (MHC).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • they express little or no Class 1 MHC. It can kill target cells better. Therefore, NK cells can effectively kill most cancer cells that do not express MHC, and can also kill cells infected with some viruses and bacteria such as salmonella typhi.
  • NK cells which have an excellent effect on killing cancer cells, account for only 5 to 15% of peripheral blood lymphocytes even in normal people, and especially in cancer patients, the ratio drops to less than 1%, so immunotherapy is not recommended. There are limits to effectively attacking cancer cells without a separate amplification process.
  • Cytokines such as IL-2 and antibodies such as CD3 antibodies are used to activate and proliferate immune cells, especially NK cells.
  • Current technology uses CD3 antibodies to play a very important role in the proliferation of immune cells, but the problem is that activating immune cells using these antibodies is very difficult.
  • the current general technology mainly uses a method of immobilizing CD3 antibodies in a flask and stimulating them for a certain period of time.
  • the sensitivity is different for each individual and also varies greatly depending on cell culture conditions or the level of skill of the operator.
  • the current method that is generally used is to initially stimulate lightly with CD3 antibodies, but environmental requirements such as individual differences are used. It is difficult to obtain NK cells that have been activated and proliferated in large quantities.
  • the culture technology for general immune cells, especially natural killer cells, that has been developed to date involves adding feeder cells. Most of the cells used as feed cells are cancer cells, and these immune cells and natural killer cells kill cancer cells. Use a method to recognize and increase the proliferation signal. The problem with this method is that it is difficult to prove whether all of the introduced cancer cells have died, so new techniques for cultivating effective immune cells and natural killer cells are needed.
  • the present invention was devised to solve the above-described problem.
  • immune cells for example, natural killer cells
  • natural killer cells when natural killer cells cultured under different stimulation conditions are combined after culturing for a certain period of time, the interaction of these natural killer cells
  • the purpose is to provide a dual culture method that further increases the effect and amplifies the number of cells more effectively and stably.
  • the dual culture method of immune cells according to the present invention to solve the above problems is to divide immune cells (PBMC) or natural killer cells (NK cells) isolated from the blood and combine them after applying different stimuli for a certain period of time during the culture period.
  • a dual culture method for culturing was developed. That is, in the initial stage of culture, the immune cells to be cultured are divided into two or more groups, each is stimulated with a different antibody or cytokine for a certain period of time at the beginning of the culture, and then they are combined and cultured, and the immune cells to be cultured in the middle stage of the culture are cultured in two or more groups.
  • the dual culture method of immune cells involves sequentially performing initial culture, proliferation culture, and mass culture of lymphocytes isolated from blood or natural killer cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC). It is characterized by dividing the immune cells and stimulating them with a combination of different antibodies or cytokines for a certain period of time during the immune cell culture period, and then combining them and culturing them.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the immune cells to be cultured in the initial culture stage are divided into two or more groups, each is stimulated with a different antibody or cytokine during the initial culture period, and then combined and cultured. It is characterized by culturing.
  • the immune cells to be cultured in the proliferation culture step are divided into two or more groups, each is stimulated with a different antibody or cytokine during the proliferation culture period, and then combined and cultured. It is characterized by culturing.
  • the initial culture step is performed for 4 to 6 days
  • the proliferation culture step is performed for 4 to 6 days.
  • the medium used for dual culture includes a BM solution containing L-glutamine, IL-2, and a cell culture medium, a medium containing cytokines, and It consists of a medium containing antibodies, and the medium containing the cytokine contains IL-2 and contains a C2 solution with a higher IL-2 content than the BM solution, a C12 solution containing IL-12, and a C12 solution containing IL-15.
  • A3 solution containing anti-CD3 antibody anti- It is characterized by being composed of A16 solution containing CD16 antibody and A56 solution containing anti-CD56 antibody.
  • NK cells natural killer cells isolated from lymphocytes isolated from blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells natural killer cells isolated from lymphocytes isolated from blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells natural killer cells isolated from lymphocytes isolated from blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells natural killer cells isolated from lymphocytes or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from blood in culture ( After dividing NK cells equally into at least two groups, add A16 solution to one group and add A16 solution to the culture solution containing two or more of BM solution, C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution. is characterized by adding A56 solution, stimulating it with different antibodies, and then culturing it.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a method of providing different cytokine stimulation in the proliferation and culture stage includes dividing lymphocytes or natural killer cells (NK cells) in culture equally into at least two groups, Different combinations of C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution were added to the medium containing one or more of BM solution, C2 solution, A16 solution, and A56 solution to produce different cytokines. It is characterized by combining and culturing after stimulation.
  • NK cells natural killer cells
  • the BM solution contains 100 to 2000 IU/mL of IL-2
  • the C2 solution contains 250 to 4000 IU/mL of IL-2
  • the C12 solution contains 250 to 4000 IU/mL of IL-2.
  • the solution contains IL-12 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL
  • the C15 solution contains IL-15 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL
  • the C17 solution contains IL-17 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL.
  • the C18 solution contains IL-18 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL
  • the C21 solution contains IL-21 at a concentration of 0.01 to 10 ug/mL
  • the A3 solution contains 0.1 to 20 ug of anti-CD3 antibody. It is contained at a concentration of /mL
  • the A16 solution contains anti-CD16 antibodies at a concentration of 0.1 to 20 ug/mL
  • the A56 solution contains anti-CD56 antibodies at a concentration of 0.1 to 20 ug/mL.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the first step is to stimulate (NK cells)
  • the second step is to separate and stabilize the medium used in step 1, and it contains at least two solutions: C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution, and autologous plasma is added. It is characterized by three stages of accelerating the proliferation of lymphocytes or natural killer cells, and four stages of mass amplification and culture of lymphocytes or natural killer cells in a culture medium containing BM solution and autologous plasma.
  • autologous plasma is added at less than 10% v/v of the total medium, and either obtained when separating lymphocytes from blood cells or commercially available FBS or similar It is characterized by
  • the number of immune cells is amplified 100-1000 times from the initial lymphocyte cell number of 0.30-2.0x107. do.
  • the pharmacological composition according to the present invention is characterized by containing immune cells cultured by a dual culture method.
  • the pharmacological composition according to the present invention is characterized in that it prevents or treats at least one disease among blood cancer, cancer including solid cancer, viral infection, and autoimmune disease.
  • immune cells for example, natural killer cells
  • natural killer cells cultured under different stimulation conditions are combined after culturing for a certain period of time, the interaction of these natural killer cells is further enhanced. This has the effect of amplifying the number of cells more effectively and stably.
  • Figure 1 is a diagram showing the protocol for dual culture of immune cells included in the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the natural killer cell ratio results according to the immune cell dual culture method A included in the present invention.
  • C2 solution was prepared by dissolving IL-2 in BM solution to 1,000 IU/mL.
  • C12 solution was prepared by dissolving IL-12 in BM solution to 1ug/mL.
  • C15 solution was prepared by dissolving IL-15 in BM solution to 1ug/mL.
  • C17 solution was prepared by dissolving IL-17 in BM solution to 1ug/mL.
  • C18 solution was prepared by dissolving IL-18 in BM solution to 1ug/mL.
  • C21 solution was prepared by dissolving IL-21 in BM solution to 1ug/mL.
  • A3 solution was prepared by dissolving anti-CD3 antibody in BM solution to 1ug/mL.
  • A16 solution was prepared by dissolving anti-CD16 antibody in BM solution to 1ug/mL.
  • A56 solution was prepared by dissolving anti-CD56 antibody in BM solution to 1ug/mL.
  • Lymphocytes and autologous plasma were prepared from the patient's blood, and then lymphocytes containing natural killer cells were cultured using the cell culture medium addition kit prepared in Example 1 as follows.
  • the culture flask was scraped, transferred to a conical tube using PBS, centrifuged (400G 5min), washed once more with PBS, and then transferred to a T75 flask using culture medium containing BM solution and C2 solution. It was moved and stabilized.
  • a solution containing C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, C21 solution, and a culture solution containing A16 solution and A56 solution were added, and CO 2 was maintained from the 5th to 6th day of culture. Culture was continued in an incubator (37°C, 5% CO 2 ). As the number of cells proliferates, on the 7th day of culture, transfer to a T150 or T175 flask using a solution containing the C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution, and a culture solution containing the A16 solution and A56 solution, and continue the culture. was added until the 8th day and continued to grow and culture in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) (total of 4 days).
  • the final culture medium is placed in a centrifuge tube and the cells are harvested through several centrifugations.
  • the harvested cells can then be packaged in a physiological saline bag and stored in the refrigerator or frozen.
  • the prepared cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the media used in common were BM solution, C12 solution, and C18 solution, A3 solution was added to one flask, A16 solution and A56 solution were added to the other flask, cultured, and then a two-step stabilization step was performed to obtain 3
  • the cultures were combined starting from the stage of proliferation culture.
  • the prepared cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the medium used was BM solution, C12 solution, and C18 solution.
  • A3 solution and A16 solution were added to one flask, A3 solution and A56 solution were added to the other flask, cultured, and then a two-step stabilization step was performed. Therefore, they were combined and cultured starting from the 3rd stage of proliferation culture.
  • the two-stage stabilized cultured cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the medium is a common solution containing BM solution, C2 solution, C12 solution, C15 solution, C18 solution, and C21 solution, and the A16 solution is added to one flask and the A56 solution is added to the other flask, and then cultured. , were combined and cultured in the 4th mass culture stage.
  • Example 2 A comparison was made between the culture method using Example 2 and the culture using KOHJIN BIO's cell mass culture medium.
  • KOHJIN BIO's NK Kit (NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, When comparing cultures for 14 days using NKCC-c), higher immune cell numbers and natural killer cell ratios were confirmed in Example 2, and the results are listed in Table 1 below.
  • Example 4 When comparing the single culture method of Example 2 with the dual culture method of Example 3, Example 4, and Example 5, it was confirmed that the cell number of the dual culture method was higher than that of the single culture method. Meanwhile, in the evaluation of anticancer activity, the K562 cancer cell line was stained with Cacein AM, cultured immune cells or natural killer cells were added at a ratio of 1:30, and reacted in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) for 4 hours, followed by fluorescence color development. When analyzed, all showed high anticancer activity of over 90%, and the results are listed in Table 2 below.
  • Example 8 Analysis of immune cell composition ratio of single culture method and dual culture method from PBMC
  • PBMCs When cultured using PBMCs isolated from blood, the magnification of proliferated immune cell subtypes may vary. After collecting blood from multiple donors who agreed to participate in the study, PBMCs were isolated and cultured using different culture methods including single culture method, dual culture method A, dual culture method B, and dual culture method C. The cultured cells were then subjected to FACS analysis. analyzed through. In this case, the proportion of natural killer cells is higher when using the dual culture method. In particular, when using dual culture methods A and B, that is, when proceeding from the first stage initial culture to double culture, the NK content was shown to be higher than that of the single culture method. The results are listed in Table 3 below.
  • Natural killer cells were cultured using the cell culture medium addition kit prepared in Example 1 as follows.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated from blood were used to isolate only natural killer cells (NK cells) with a purity of 99.9% using an NK isolation kit (STEM Cell).
  • the culture flask was scraped, transferred to a conical tube using PBS, centrifuged (400G 5min), washed once more with PBS, and then transferred to a T75 flask using culture medium containing BM solution and C2 solution. It was moved and stabilized.
  • a solution containing the C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution, and a culture solution containing the A16 solution and A56 solution were added, and CO 2 was maintained from the 5th to the 6th day of culture. Culture was continued in an incubator (37°C, 5% CO 2 ). As the number of cells proliferates, on the 7th day of culture, transfer to a T150 or T175 flask using a solution containing the C2 solution, C12 solution, C15 solution, C17 solution, C18 solution, and C21 solution, and a culture solution containing the A16 solution and A56 solution, and continue the culture. was added until the 8th day and continued to grow and culture in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) (total of 4 days).
  • the final culture medium is placed in a centrifuge tube and the cells are harvested through several centrifugations.
  • the harvested cells can then be packaged in a physiological saline bag and stored in the refrigerator or frozen.
  • the prepared cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the media used in common were BM solution, C12 solution, and C18 solution, A3 solution was added to one flask, A16 solution and A56 solution were added to the other flask, cultured, and then a two-step stabilization step was performed to obtain 3
  • the cultures were combined starting from the stage of proliferation culture.
  • the prepared cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the medium used was BM solution, C12 solution, and C18 solution.
  • A3 solution and A16 solution were added to one flask, A3 solution and A56 solution were added to the other flask, cultured, and then a two-step stabilization step was performed. Therefore, they were combined and cultured starting from the 3rd stage of proliferation culture.
  • the two-stage stabilized cultured cells were equally divided into two halves with the same number of cells and cultured in two flasks.
  • the medium is a common solution containing BM solution, C2 solution, C12 solution, C15 solution, C18 solution, and C21 solution, and the A16 solution is added to one flask and the A56 solution is added to the other flask, and then cultured. , were combined and cultured in the 4th mass culture stage.
  • novel dual culture manufacturing method for culturing immune cells and natural killer cells of the present invention and its use have industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 면역요법에 적용되는 면역세포 이중배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 등의 치료에 효과가 뛰어난 면역세포, 예를 들어 면역세포(PBMC), 자연살해세포 또는 감마델타T세포 등을 선택적 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 배양방법으로서, 면역세포를 일정기간 다른 자극을 준 후 합쳐서 배양할 경우 현저하게 배양효율 및 활성을 증가시킬 수 있는 이중배양방법에 대한 것이다.

Description

면역세포 및 자연살해세포 배양을 위한 신규한 이중배양 제조방법 및 이의 용도
본 발명은 면역요법에 적용되는 면역세포 이중배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 등의 치료에 효과가 뛰어난 면역세포, 예를 들어 면역세포(PBMC), 자연살해세포 또는 감마델타T세포 등을 선택적 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 배양방법으로서, 면역세포를 일정기간 다른 자극을 준 후 합쳐서 배양할 경우 현저하게 배양효율 및 활성을 증가시킬 수 있는 면역세포 이중배양방법에 대한 것이다.
면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
NK 세포는, MHC 클래스 I 분자를 발현하는 정상 세포는 공격하지 않고, MHC 클래스 I 분자의 발현이 저하 및 결손된 세포를 주로 공격한다. 따라서 암 및 감염증의 세포 요법에 동종 NK 세포를 사용하면, GVH(Graft-versushost;이식 편대 숙주)병의 부작용을 회피할 수 있다는 이점이 있다. 실제로 Miller 외 및 Rubnitz 외의 보고에 따르면, 암 환자를 수용자로 하고, 그의 근연(vicinty)인 정상인 공여자의 신선한 말초혈 단핵구로부터 NK 세포를 농축한 후 이식했을 때, 이식된 NK 세포는 수용자에 부작용을 일으키지 않고, 일시적으로 생착하여, 세포 상해 활성을 유지하였다. 그러나, NK 세포의 이식 요법의 유효성을 나타내는 임상치료의 효력의 보고는 아직 없다. 그 이유 중 하나는, 공여자로부터 림프구 성분 채집(apheresis)에 의해 회수할 수 있는 세포수에 한도가 있기 때문에, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시킬 수 없기 때문이다.
따라서, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시키기 위해서는, NK 세포의 이식이 빈번히 반복될 필요가 있고, 이것은 환자에게 큰 부담이 된다. 따라서, 공여자로부터 얻은 자연살해세포를 일단 시험관 내에서 배양 증폭하여, 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 NK세포를 얻는 기술의 개발이 진행되고 있다.
면역요법에서 활성화시키는 면역세포 중에서 특히 자연살해세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory) 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16 항체(FcγRIII), CD56 항체가며, CD16 항체과 CD56 항체은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다.
그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이 1 % 미만으로 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
면역세포 특히 NK세포를 활성화하고 증식시키는데 있어서 IL-2 등의 Cytokine 과 CD3 항체 등의 항체가 사용된다. 현행 기술은 면역세포의 증식에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것이 CD3 항체 항체인데, 문제는 이 항체를 이용해서 면역세포를 활성화 시키는 것이 매우 까다롭다는 것이다. 즉, 면역세포 배양 시 현재의 일반적 인 기술은 CD3 항체항체를 플라스크에 고정화 시켜서 일정시간 자극하는 방법을 주로 사용한다. 그러나 면역세포의 경우 각 개인마다 감수성이 다르고 또한 세포배양 조건 또는 작업자의 숙련 정도에 따라서 매우 많은 차이가 난다.
특히, 처음부터 CD3 항체 항체의 강한 자극이 가해지면 미성숙 전구세포들은 T세포로 성숙하게 되므로 일반적으로 행해지고 있는 현행 방법은 처음에 CD3 항체 항체를 살짝 자극하는 방법을 사용하는데, 개인 차 등 주변 환경 요건에 의해 많이 좌우되어 활성화된 많은 양으로 증식된 NK세포를 얻는데 어려움이 있다.
현행 방법에서 반드시 플라스크에 CD3 항체 항체를 고정한 후 일정시간 반응시켜야 하는 까다로움을 제거하면서도 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있는 새로운 배양배지 조성물 및 배양방법에 대한 개발 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
현재까지 개발된 일반적인 면역세포 특히 자연살해세포를 배양기술은 먹이세포(Feeder cell)을 넣어주는데 이때 먹이세포로 넣는 세포는 암세포(cancer cell)이 대부분이며, 이들 면역세포, 자연살해세포가 암세포를 인식하여 증식신호를 증대시키는 방법을 활용한다. 이러한 방법의 문제점은 넣어준 암세포가 전부 사멸하였는지 증명하기 어려운 데 있는 문제가 있어 새로운 효과적인 면역세포, 자연살해세포를 배양하는 기술이 필요하다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로서, 면역세포, 예를 들어 자연살해세포를 배양하는데 있어 서로 다른 자극조건으로 배양된 자연살해세포를 일정기간 배양 후 합칠 경우 이들 자연살해세포들의 상호작용이 더욱 증가되며, 보다 효과적이고 안정적으로 세포 수를 증폭시킬 수 있는 이중배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법은 혈액에서 분리된 면역세포(PBMC) 또는 자연살해세포(NK cell)를 나누어 배양기간 중 일정기간 각기 다른 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 이중배양 방법을 개발하였다. 즉 배양 초기 단계에서 배양하고자 하는 면역세포를 두 군 이상으로 나누고, 배양초기 일정기간동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인으로 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 방법과 배양 중간 단계에서 배양하는 면역세포를 두 군 이상으로 나누고, 배양 중간 일정기간동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인으로 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 방법을 특징으로 하는 이중배양방법으로, 이렇게 배양하는 경우 일반적인 배양단계보다 더 높은 면역세포 증식과 자연살해세포 비율 증식을 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법은 혈액으로부터 분리한 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포를 초기배양과, 증식배양과, 대량배양을 순차로 수행하는 것으로서, 배양하고자 하는 면역세포를 나누어 면역세포 배양기간 중 일정기간 동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인의 조합으로 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 것을 특징으로 한다
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 초기배양 단계에서 배양하고자 하는 면역세포를 두 군 이상으로 나누고, 초기배양 기간 동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인으로 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 이중배양이 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 증식배양 단계에서 배양하고자 하는 면역세포를 두 군 이상으로 나누고, 증식배양 기간 동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인으로 자극을 준 후 합쳐서 배양하는 이중배양이 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 초기배양 단계는 4~6일 동안 이루어지고, 상기 증식배양 단계는 4~6일 동안 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 이중배양에 사용하는 배지는 L-글루타민, IL-2 및 세포배양용 배지를 포함하는 BM용액과, 사이토카인을 함유하는 배지와, 그리고 항체를 함유하는 배지로 구성되며, 상기 사이토카인을 함유하는 배지는 IL-2를 함유하며 BM용액보다 IL-2 함량이 높은 C2용액, IL-12가 함유된 C12용액, IL-15가 함유된 C15용액, IL-17이 함유된 C17용액, IL-18이 함유된 C18용액, IL-21이 함유된 C21용액으로 구성되고, 상기 항체를 포함하는 배지는 항CD3 항체가 함유된 A3용액, 항CD16 항체가 함유된 A16용액, 항CD56 항체가 함유된 A56용액으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 초기배양 단계에서 항체 자극을 다르게 주는 방법으로서, 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후, BM용액과 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액 중 둘 이상 함유된 배양액에서 한쪽은 A3용액을 추가하고, 다른 한쪽은 A16용액, A56용액을 추가하여 서로 다른 항체로 자극하여 배양한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 초기배양 단계에서 항체 자극을 다르게 주는 방법으로서, 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후, BM용액과 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액 중 둘 이상 함유된 배양액에서 한쪽은 A3용액와 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽은 A3용액와 A56용액을 추가하여 서로 다른 항체로 자극하여 배양한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 초기배양 단계에서 사이토카인 자극을 다르게 주는 방법으로서, 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후, BM용액과 A3용액, A16용액, A56용액이 하나 이상 함유된 배양액에 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 서로 다른 조합으로 두 그룹에 추가하여 서로 다른 사이토카인으로 자극한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 증식배양 단계에서 항체 자극을 다르게 주는 방법으로서, 배양 진행 중인 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후, BM용액과 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액 중 둘 이상 함유된 배양액에서 한쪽은 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽은 A56용액을 추가하여 서로 다른 항체로 자극한 후 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 증식배양 단계에서 사이토카인 자극을 다르게 주는 방법으로서, 배양 진행 중인 림프구 또는 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후, BM용액과, C2용액, A16용액, A56용액을 하나 이상 함유한 배지에 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 서로 다른 조합으로 두 그룹에 추가하여 서로 다른 사이토카인으로 자극한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, BM 용액은 IL-2가 100 ~ 2000 IU/mL로 함유되고, C2용액은 IL-2가 250 ~ 4000 IU/mL로 함유되며, C12용액은 IL-12가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, C15용액은 IL-15가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C17용액은 IL-17이 0.01 ∼ 10 ug/mL농도로 함유되고, C18용액은 IL-18이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C21용액은 IL-21이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, A3용액은 항CD3 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되며, A16용액은 항CD16 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되고, A56용액은 항CD56 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 혈액에서 분리된 면역세포(PBMC) 또는 혈액에서 분리된 자연살해세포를 배양할 때 사용하는 배지첨가키트로서, BM용액과 A3용액, A16용액, A56용액이 포함되며 C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액이 둘 이상 포함되고 자가혈장을 첨가하여 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 자극하는 1단계, 1단계에서 사용한 배지를 분리하여 안정화하는 2단계, C2용액과 C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액이 둘 이상 포함되고 자가혈장이 첨가된 림프구 또는 자연살해세포 증식을 가속하는 3단계, 그리고 배양하던 배지를 포함하여 BM용액과 자가혈장이 첨가된 배지에서 림프구 또는 자연살해세포를 대량 증폭배양하는 4단계로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 자가혈장은 전체 배지의 10% v/v 이하로 첨가되며, 혈구에서 림프구를 분리할 때 얻는 것 또는 상업적으로 이용가능한 FBS 또는 이와 유사한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법에 있어서, 면역세포(PBMC) 또는 자연살해세포가 배양될 때에 초기 림프구 세포수 0.30~2.0x107로부터 면역세포 수가 100~1000배 증폭되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 약리학적 조성물은 이중배양 방법에 의해 배양된 면역세포를 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 약리학적 조성물은 혈액암, 고형암을 포함하는 암, 바이러스 감염증 및 자가면역질환 중 적어도 어느 하나의 질병을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 면역세포의 이중배양 방법은 면역세포, 예를 들어 자연살해세포를 배양하는데 있어 서로 다른 자극조건으로 배양된 자연살해세포를 일정기간 배양 후 합칠 경우 이들 자연살해세포들의 상호작용이 더욱 증가되며, 보다 효과적이고 안정적으로 세포 수를 증폭시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 포함하는 면역세포 이중배양의 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 포함하는 면역세포 이중배양방법A에 따른 자연살해세포 비율 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
[실시예 1] 배양에 사용할 배지(배양키트)의 준비단계
200mM L-glutamine 용액 100mL를 부유세포 배양용 기본 배지에 넣어 녹이고 IL-2를 250 IU/mL가 되도록 첨가한 후 최종 10L를 만들어 BM용액으로 하였다.
C2용액은 IL-2가 1,000 IU/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
C12용액은 IL-12가 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
C15용액은 IL-15가 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
C17용액은 IL-17이 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
C18용액은 IL-18이 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
C21용액은 IL-21이 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
A3용액은 항CD3 항체 항체가 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
A16용액은 항CD16 항체 항체가 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
A56용액은 항CD56 항체 항체가 1ug/mL가 되도록 BM용액에 녹여 제조하였다.
[실시예 2] 단일배양방법
환자로부터 혈액으로부터 림프구 및 자가혈장을 준비한 다음, 실시예 1에서 준비한 세포배양용 배지첨가키트를 이용하여 다음과 같이 자연살해세포를 함유한 림프구를 배양하였다.
1. 림프구 추출 및 자가혈장 준비단계
환자A의 말초혈액 30㎖을 50㎖ conical tube에 넣은 후 원심분리한 후 상층의 자가혈장을 헤파린튜브에 넣어 처리한 다음 새로운 50㎖ conical tube에 넣고 다시 원심분리한 후 상층부의 혈장성분을 자가혈장으로 준비하였다.
그 후 혈장이 제거된 혈액튜브에 PBS를 넣어 부피를 30㎖로 맞춘 다음 잘 섞어서 준비해둔 Ficoll-Paque Plus가 들어있는 튜브에 옮기고, 800xg에서 15분간 원심분리한 후, 두 번째 층인 림프구가 들어 있는 연막층(buffy coat layer)을 분리하여 50㎖ conical tube에 모으고, PBS로 50㎖까지 부피를 맞춘 다음 섞어주었다. 그 후 2번 내지 3번의 원심분리를 통해 상층액을 버리고 림프구를 분리하였다.
2. 1단계 초기배양
분리된 림프구에서 0.30~2.0x107 세포수만큼 취하고, BM용액, C12용액, C18용액, A3용액, A16용액, A56용액과, 자가혈장을 넣고 T25 또는 T75플라스크에서 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 배양을 시작한 당일인 1일차부터 5일차 까지 4일 동안 초기배양하였다.
3. 2단계 안정화
초기배양 후 배양 5일차에 배양플라스크를 스크래핑 한 후 PBS를 이용하여 conical tube로 옮기고 원심분리(400G 5min)후 PBS로 1회 더 씻어준 후 BM 용액과 C2용액을 포함한 배양액을 이용하여 T75플라스크로 옮겨 안정화하였다.
4. 3단계 증식배양
T75플라스크에서 안정화시킨 세포에 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 포함시킨 용액과, A16용액, A56용액을 포함한 배양액을 첨가하며 배양 5일차부터 6일차까지 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 계속 배양하였다. 세포수가 증식되어 배양 7일차에는 T150 또는 T175플라스크로 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 포함시킨 용액과, A16용액, A56용액을 포함한 배양액을 이용하여 옮기고 계속 배양액을 8일차까지 첨가하며 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 계속 증식배양하였다.(총 4일)
5. 4단계 대량배양
3단계 증식배양 후 전체 배양액을 세포배양액이 들어있는 1L CO2 투과성 배양백에 넣고 자가혈장을 5~10mL 더 가해주고 배양액과 잘 섞이도록 마시지해준 후, CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 5일 동안 대량배양하였다. 이때 24시간마다 배양액이 잘 섞이도록 마시지를 해주었다.
6. 자연살해 면역세포의 수확
배양이 끝난 최종배양액을 원심분리튜브에 담아 여러 번의 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 수확된 세포를 생리식염수 백에 포장하여 냉장보관하거나 동결하여 보관이 가능하다.
[실시예 3] 이중배양방법 (A) 초기단계 이중배양
실시예 2의 단일배양방법에서 1단계 초기배양에 있어, 준비된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C12용액, C18용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A3용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A16용액과, A56용액을 첨가하여 배양한 후, 2단계 안정화 단계를 수행하여 3단계 증식배양부터 합쳐서 배양하였다.
[실시예 4] 이중배양방법 (B) 초기단계 이중배양
실시예 2의 단일배양방법에서 1단계 초기배양에 있어, 준비된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C12용액, C18용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A3용액과 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A3용액과 A56용액을 첨가하여 배양한 후, 2단계 안정화 단계를 수행하여 3단계 증식배양부터 합쳐서 배양하였다.
[실시예 5] 이중배양방법 (C) 중간단계 이중배양
실시예 2의 단일배양방법에서 3단계 증식배양에 있어, 2단계 안정화 배양된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C2용액, C12용액, C15용액, C18용액, C21용액을 포함하는 용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A56용액을 첨가하여 배양한 후, 4단계 대량배양단계에서 합쳐서 배양하였다.
[실시예 6] 단일 배양방법과 일반 배양방법과의 비교
실시예 2를 이용한 배양방법과 KOHJIN BIO社의 세포대량배양용 배지를 이용한 배양 비교를 시행하였다, NK 세포배양 키트로 알려져있는 KOHJIN BIO사의 NK Kit (NKCC-1, NKCC-2, NKCC-b, NKCC-c)를 이용하여 14일간 배양 비교하였을 때 실시예 2에서 더 높은 면역세포수 및 자연살해세포 비율을 확인하였고, 그 결과를 아래 표 1에 기재하였다.
배양방법 대상 배양전 면역세포수 배양후 면역세포수 NK세포비율
KOHJIN BIO KIT Health 0.41 x 107 126 x 107 32%
Patient 0.42 x 107 88 x 107 24%
실시예 2 방법 Health 0.40 x 107 448 x 107 98%
Patient 0.38 x 107 413 x 107 92%
[실시예 7] 단일배양방법과 이중배양방법의 배양 세포수 및 항암활성 비교
실시예 2의 단일배양방법과 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5의 이중 배양방법을 비교하였을 때 이중배양방법에서 단일배양보다 이중배양 방법의 세포수가 더 높은 것을 확인하였다. 한편 항암활성 평가에서는 K562암세포주를 Cacein AM으로 염색한 후 배양한 면역세포 또는 자연살해세포를 1:30비율로 넣고 4시간동안 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 반응후 형광발색법으로 분석하였을 때 모두 90% 이상의 높은 항암활성을 나타내었고, 그 결과를 아래 표 2에 기재하였다.
구분 초기 면역세포수 배양후 면역세포수 Cytotoxicity (K562)
단일배양방법 0.44 x 107 460 x 107 94%
이중배양방법 A 0.46 x 107 476 x 107 98%
이중배양방법 B 0.45 x 107 478 x 107 95%
이중배양방법 C 0.45 x 107 522 x 107 96%
[실시예 8] PBMC로부터 단일배양방법과 이중배양방법의 면역세포 구성비율 분석
혈액으로부터 분리한 PBMC를 이용하여 배양할 경우 증식된 면역세포 아형의 배율이 다양하게 나올 수 있다. 연구 참여 동의를 한 여러 기증자로부터 혈액을 채혈 후 PBMC를 분리하여 단일배양방법, 이중배양방법 A, 이중배양방법 B, 이중배양방법 C의 각가 다른 배양 방법으로 배양 후, 배양된 세포를 FACS분석법을 통해 분석하였다. 이 경우 자연살해세포 비율이 이중배양방법으로 진행할 경우 더 높으며, 특히 이중배양방법 A와 B, 즉 1단계 초기배양에서 이중배양으로 진행할 경우 단일배양방법보다 더 높은 NK함량을 나타내는 특성을 보였고, 그 결과를 아래 표 3에 기재하였다.
구분 배양방법 배양전 NK세포비율 배양후 NK세포비율
피험자 1 단일배양방법 11.0% 88%
이중배양방법 A 98%
이중배양방법 B 95%
이중배양방법 C 90%
피험자 2 단일배양방법 7.8% 76%
이중배양방법 A 94%
이중배양방법 B 91%
이중배양방법 C 82%
[실시예 9] PBMC로부터 isolation 된 NK cell을 이용한 단일배양방법과 이중배양방법의 배양 세포수 변화
실시예 1에서 준비한 세포배양용 배지첨가키트를 이용하여 다음과 같이 자연살해세포를 배양하였다.
1. 림프구 추출 및 자가혈장 준비단계
환자A의 말초혈액 30㎖을 50㎖ conical tube에 넣은 후 원심분리한 후 상층의 자가혈장을 헤파린튜브에 넣어 처리한 다음 새로운 50㎖ conical tube에 넣고 다시 원심분리한 후 상층부의 혈장성분을 자가혈장으로 준비하였다.
혈액으로부터 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)를 NK isolation Kit(STEM Cell 社)을 이용하여 순도 99.9%의 자연살해세포(NK세포)만을 분리하였다.
2. 1단계 초기배양
자연살해세포에서 0.30~2.0x107 세포수만큼 취하고, BM용액, C12용액, C18용액, A3용액, A16용액, A56용액과, 자가혈장을 넣고 T25 또는 T75플라스크에서 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 배양을 시작한 당일인 1일차부터 5일차 까지 4일 동안 초기배양하였다.
3. 2단계 안정화
초기배양 후 배양 5일차에 배양플라스크를 스크래핑 한 후 PBS를 이용하여 conical tube로 옮기고 원심분리(400G 5min)후 PBS로 1회 더 씻어준 후 BM 용액과 C2용액을 포함한 배양액을 이용하여 T75플라스크로 옮겨 안정화하였다.
4. 3단계 증식배양
T75플라스크에서 안정화시킨 세포에 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 포함시킨 용액과, A16용액, A56용액을 포함한 배양액을 첨가하며 배양 5일차부터 6일차까지 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 계속 배양하였다. 세포수가 증식되어 배양 7일차에는 T150 또는 T175플라스크로 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 포함시킨 용액과, A16용액, A56용액을 포함한 배양액을 이용하여 옮기고 계속 배양액을 8일차까지 첨가하며 CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 계속 증식배양하였다.(총 4일)
5. 4단계 대량배양
3단계 증식배양 후 전체 배양액을 세포배양액이 들어있는 1L CO2 투과성 배양백에 넣고 자가혈장을 5~10mL 더 가해주고 배양액과 잘 섞이도록 마시지해준 후, CO2 incubator(37℃ 5% CO2)에서 5일 동안 대량배양하였다. 이때 24시간마다 배양액이 잘 섞이도록 마시지를 해주었다.
6. 자연살해세포의 수확
배양이 끝난 최종배양액을 원심분리튜브에 담아 여러 번의 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 수확된 세포를 생리식염수 백에 포장하여 냉장보관하거나 동결하여 보관이 가능하다.
[실시예 10] 이중배양방법 (A) 초기단계 이중배양
실시예 9의 단일배양방법에서 1단계 초기배양에 있어, 준비된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C12용액, C18용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A3용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A16용액과, A56용액을 첨가하여 배양한 후, 2단계 안정화 단계를 수행하여 3단계 증식배양부터 합쳐서 배양하였다.
[실시예 11] 이중배양방법 (B) 초기단계 이중배양
실시예 9의 단일배양방법에서 1단계 초기배양에 있어, 준비된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C12용액, C18용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A3용액과 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A3용액과 A56용액을 첨가하여 배양한 후, 2단계 안정화 단계를 수행하여 3단계 증식배양부터 합쳐서 배양하였다.
[실시예 12] 이중배양방법 (C) 중간단계 이중배양
실시예 2의 단일배양방법에서 3단계 증식배양에 있어, 2단계 안정화 배양된 세포를 각각 반으로 동일세포수로 균등하게 이분할하여 두 플라스크에서 배양하였다. 이때 배지는 BM용액, C2용액, C12용액, C15용액, C18용액, C21용액을 포함하는 용액을 공통으로 하고, 한 플라스크에는 A16용액을 추가하고, 다른 한쪽 플라스크에는 A56용액을 첨가하여 배양한 후, 4단계 대량배양단계에서 합쳐서 배양하였다.
자연살해세포에 대한 실시예 9의 단일배양방법과, 실시예 10 내지 12의 이중배양방법으로 각각 배양하였을 때, 이중배양방법 A의 경우 더 높은 배양효율을 확인하였고, 그 결과는 아래 표 4에 기재하였다.
구분 초기 NK세포수 배양후 NK세포수
단일배양방법 0.041 x 107 5.14 x 107
이중배양방법 A 0.040 x 107 8.88 x 107
이중배양방법 B 0.040 x 107 8.68 x 107
이중배양방법 C 0.040 x 107 9.24 x 107
한편, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않고 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들을 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명의 면역세포 및 자연살해세포 배양을 위한 신규한 이중배양 제조방법 및 이의 용도는 산업상 이용가능성이 있음

Claims (6)

  1. 림프구 또는 자연살해세포를 이중배양하는 방법에 있어서,
    배양하고자 하는 면역세포를 나누어 면역세포 배양기간 중 일정기간 동안 각각 다른 항체 또는 사이토카인의 조합으로 자극을 준 후, 그 다음 배양기간에 합쳐서 배양하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    이중배양에 사용하는 배지는 L-글루타민, IL-2 및 세포배양용 배지를 포함하는 BM용액과, 사이토카인을 함유하는 배지와, 항체를 함유하는 배지로 구성되며,
    상기 사이토카인을 함유하는 배지는 IL-2를 함유하며 BM용액보다 IL-2 함량이 높은 C2용액, IL-12가 함유된 C12용액, IL-15가 함유된 C15용액, IL-17이 함유된 C17용액, IL-18이 함유된 C18용액, IL-21이 함유된 C21용액으로 구성되고,
    상기 항체를 포함하는 배지는 항CD3 항체가 함유된 A3용액, 항CD16 항체가 함유된 A16용액, 항CD56 항체가 함유된 A56용액으로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    림프구 또는 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후,
    BM용액과 A3용액, A16용액, A56용액이 하나 이상 함유된 배지에 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액을 서로 다른 조합으로 두 그룹에 추가하여 서로 다른 사이토카인으로 자극한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    림프구 또는 자연살해세포(NK cell)를 적어도 두 그룹으로 균등 분할한 후,
    BM용액과 C2용액, C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액 중 둘 이상 함유된 배양액에서 한쪽은 A3용액과, A16용액, A56용액 중 적어도 하나를 추가하고, 다른 한쪽은 A3용액과, A16용액, A56용액 중 적어도 하나를 추가하되, 두 그룹에 추가되는 용액은 서로 다른 항체를 함유한 용액의 조합으로 자극하여 배양한 후 합쳐 배양하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    BM 용액은 IL-2가 100 ~ 2000 IU/mL로 함유되고, C2용액은 IL-2가 250 ~ 4000 IU/mL로 함유되며, C12용액은 IL-12가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, C15용액은 IL-15가 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C17용액은 IL-17이 0.01 ∼ 10 ug/mL농도로 함유되고, C18용액은 IL-18이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되며, C21용액은 IL-21이 0.01∼10 ug/mL농도로 함유되고, A3용액은 항CD3 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되며, A16용액은 항CD16 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되고, A56용액은 항CD56 항체가 0.1∼20 ug/mL농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    혈액에서 분리된 면역세포(PBMC) 또는 혈액에서 분리된 자연살해세포를 배양할 때 사용하는 배지첨가키트로서, BM용액과 A3용액, A16용액, A56용액이 포함되며 C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액이 둘 이상 포함되고 자가혈장을 첨가하여 혈액에서 분리된 림프구 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리한 자연살해세포(NK cell)를 자극하는 1단계,
    1단계에서 사용한 배지를 분리하여 안정화하는 2단계,
    C2용액과 C12용액, C15용액, C17용액, C18용액, C21용액
    이 둘 이상 포함되고 자가혈장이 첨가된 림프구 또는 자연살해세포 증식을 가속하는 3단계,
    그리고 배양하던 배지를 포함하여 BM용액과 자가혈장이 첨가된 배지에서 림프구 또는 자연살해세포를 대량 증폭배양하는 4단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이중배양 방법.
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