WO2013168978A1 - 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법 - Google Patents

말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법 Download PDF

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WO2013168978A1
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natural killer
peripheral blood
killer cells
irradiated
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이경미
임선아
이캐시안
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고려대학교 산학협력단
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    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Definitions

  • the present invention relates to a method of inducing and proliferating peripheral blood monocyte-derived natural killer cells.
  • the human body is protected from pathogens by an immune response, and the immune system is composed of many immune-related cells, cytokines and the like.
  • An important role in this immune system is leukocytes, especially lymphocytes.
  • the cells that make up lymphocytes are typically the innate immune system and the acquired immune system.
  • Natural Killer Cells are one of the representative innate immune cells, which can kill cancer nonspecifically and kill them by recognizing viruses, bacteria, etc., perforin and granzyme. Is known to kill pathogens by enzymes or Fas-FasL interactions.
  • NK cells natural killer cells
  • a large amount of natural killer cells are required to achieve the effects of cancer cell killing, but it is not easy to obtain a large amount of blood from cancer patients, and the ratio of natural killer cells in the blood is only about 5 to 20%. As it is difficult to use, it is important to effectively expand and proliferate natural killer cells.
  • Conventional methods for propagating natural killer cells are using MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), cliniMACS or FACs Sorter to separate or induce natural killer cells from monocytes or bone marrow in the blood. This method is preceded by the following steps.
  • An object of the present invention is to provide a novel method of inducing and proliferating peripheral blood-derived natural killer cells for efficiently obtaining activated peripheral blood-derived natural killer cells without using expensive equipment or high concentration of cytokines.
  • the present invention provides a method for the treatment of peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells comprising co-culturing irradiated Jurkat cells and irradiated EBV-LCL cells with peripheral blood monocytes as feeder cells in the presence of cytokines. It provides a method of induction and propagation.
  • the present inventors studied to obtain a large amount of natural killer cells even from a small amount of blood. As a result, when culturing monocytes isolated from peripheral blood by using the irradiated Jurkat cells as feeder cells, the proliferated natural killer cells were cultured. It has been found that it can be obtained (Domestic Patent Application No. 10-2010-007877).
  • the present invention is directed to the induction of peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells comprising co-culturing irradiated Jurkat cells and irradiated EBV-LCL cells with peripheral blood monocytes as feeder cells in the presence of cytokines. And a proliferation method.
  • PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell
  • PBMC peripheral blood
  • Mononuclear Cell Peripheral Blood monocytes
  • Peripheral blood monocytes can be obtained by using known methods such as Ficoll-Hypaque density gradient method.
  • the "peripheral blood monocytes" may be from a patient with cancer risk or a cancer patient who is normal.
  • the peripheral blood mononuclear cells used in the present invention are not necessarily self-derived, and if the peripheral blood mononuclear cells derived from the same species can be used for the induction and proliferation of natural killer cells for anticancer immunotherapy according to the present invention.
  • proliferated monocytes and proliferated natural killer cells when co-cultured peripheral blood monocytes with irradiated Jurkat cells and irradiated EBV-LCL cells, proliferated monocytes and proliferated natural killer cells can be obtained.
  • the natural killer cells thus obtained can be treated in normal, patient at risk of cancer, or cancer patients for the prevention and treatment of cancer.
  • Jurkat cell or “Jurkat cell line” is an immortalized acute T cell leukemia cell line. It is a cell line developed by Arthur Weiss. Cells expressing various chemokine receptors and capable of producing IL-2, which express MHC class I, a natural killer cell inhibitor, on the cell surface, are candidates for feeder cells for anticancer immunotherapy. It was a cell line with no potential. However, the present inventors have screened and found a number of hematologic cancer cell lines for differentiation and proliferation from peripheral blood monocytes to natural killer cells. As a result, they have found that Jurkat cells can be used as feeder cells (Domestic Patent Application No. 10-2010). -0078777). Jurkat cells used in the present invention can be obtained from ATCC (ATCC TIB-152).
  • EBV-LCL cells or “EBV-LCL cell lines” are lymphocyte continuous cell lines transformed with Epstein-Barr virus (EBV-LCL, Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line, DM Koelle et al., 1993 , supra,). EBV-LCL cells have been used for the study of carcinogenic processes, but have not been used as feeders for proliferating monocytes and natural killer cells from peripheral blood. EBV-LCL cells of the present invention can be prepared and used directly in the laboratory. In the embodiment of the present invention, EBV-LCL was manufactured and used directly.
  • EBV-LCL is a B cell line made by infecting human B cells with Epstein-Barr Virus in vitro, and the cyclosporin A was added to suppress T cells responding to EBV during the process of making EBV from PBMC. .
  • 30 X 10 6 PBMC was added to 9 ml of culture medium, which was placed in a T 25 culture flask, and 9 ml of EBV supernatant was added thereto.
  • 80 ul of cyclosporin A was added thereto and then incubated at 37 ° C. After 7 days of incubation, the supernatant was removed and then, a new culture medium was added, and 40ul of cyclosporin A was added thereto.
  • the same procedure was repeated once every 7 days until the 28th culture. After 28 days of culture, the cell line was usable, and from this time it was cultured without putting cyclosporin A in the culture medium.
  • the Jurkat cells and EBV-LCL cells can be used as feeder cells only through irradiation to inhibit the proliferation of cancer cells.
  • irradiated Jurkat cells or irradiated EBV-LCL cells can be obtained by treating 100 to 500 Gy radiation, respectively.
  • cytokine refers to an immune activated cytokine usable for inducing peripheral blood monocytes into natural killer cells.
  • cytokines include, for example, IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 or a mixture of two or more thereof.
  • IL-2, IL-15, or IL-21 is known as a cytokine having an excellent effect on differentiation and proliferation into natural killer cells, it is preferable to use these cytokines.
  • IL-2 but is not limited thereto.
  • cytokine receptors with ⁇ c play an important role in NK differentiation because B and T cells are found in mice deficient in ⁇ c expression of cytokine receptors, but not in NK cells (Singer, B). et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 377-381, 1995).
  • ⁇ c forms of the receptor are receptors of IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and IL-21, of which IL-2 functions to promote proliferation and activation of mature NK cells has been reported (Shibuya, A. et al., Blood 85, 3538-3546, 1995).
  • IL-2 and IL-2Ra deficiency indirectly affects the number and activation of NK cells.
  • the IL-2R chain is known to be involved in forming receptors for IL-15.
  • the IL-15 is involved in NK cell differentiation, which is deficient in NK cells in mice lacking the transcription factor interferon (IFN) -regulatory factor 1 required for IL-15 production (Kouetsu et al., Nature 391,700-703, 1998), NK cells were not found in mice lacking IL-15 or IL-15R ⁇ . It has been reported that IL-15 directly promotes the growth and differentiation of NK cells through IL-15 receptors expressed in NK cells (MrozekE et al., Blood 87, 2632-2640,1996).
  • IFN transcription factor interferon
  • IL-21 is a cytokine secreted by activated CD4 + T cells (Nature, 5: 688-697, 2005), and the receptor of IL-21 (IL-21R) is dendritic cells, NK cells, T cells and B It is expressed in lymphocytes such as cells (Rayna Takaki, et al., J. Immonol 175: 2167-2173, 2005).
  • IL-21 is structurally very similar to IL-2 and IL-15, and IL-21R shares a chain with IL-2R, IL-15, IL-7R and IL-4R (Asao et al., J Immunol, 167: 1-5, 2001).
  • IL-21 has been reported to induce the maturation of NK cell precursors from the bone marrow (Parrish-Novak, et al., Nature, 408: 57-63, 2000), in particular with cytokine production and apoptosis of NK cells
  • the same effector functions have been reported to increase (M. Strengell, et al., J Immunol, 170, 5464-5469, 2003; J. Brady, et al., J Immunol, 172, 2048-2058, 2004), it has also been reported to promote anticancer responses of the intrinsic, adaptive immune system by increasing the effector function of CD8 + T cells (Rayna Takaki, et al., J Immunol 175, 2167-2173, 2005; A.
  • the cytokine may be used at a concentration of 50 U / ml to 1,000 U / ml, such as 200 U / ml to 800 U / ml, 400 U / ml to 600 U / ml and the like.
  • Conventional natural killer cell proliferation method requires a high concentration of various cytokines, the natural killer cell proliferation method according to the present invention, even when using a single cytokine at a low concentration due to the use of two feeder cells and high yield and Purity can multiply natural killer cells.
  • the medium usable in the culture of peripheral blood mononuclear cells can be used without limitation any conventional medium used for induction and proliferation of peripheral blood mononuclear cells into natural killer cells.
  • a medium for example, RPMI, DMEM, x-vivo10, x-vivo20, cellgro SCGM medium can be used.
  • the culture conditions such as temperature may follow the culture conditions of ordinary peripheral blood monocytes.
  • coculture of peripheral blood monocytes with irradiated Jurkat cells and irradiated EBV-LCL cells can be performed for 7 days to 30 days, for example 10 days to 20 days. . Preferably it is efficient to carry out coculture for 10 to 14 days.
  • the mixing ratio of the peripheral blood monocytes and feeder cells may be 1: 5 to 2: 1.
  • monocytes were cultured in the presence of IL-2 (control group 1), monocytes A group cultured in the presence of IL-2 with irradiated Jurkat cells (control 2), a group cultured monocytes in the presence of IL-2 with irradiated EBV-LCL cells (control 3), Monocytes were co-cultured with Jurkat cells irradiated with EBV-LCL cells irradiated in the presence of IL-2 as experimental groups and cultured for a certain period of time, followed by measuring the number of PBMC and NK cells (Example 2, FIG. 2, FIG. 3).
  • the experimental group co-cultured with Jurkat cells and EBV-LCL cells in the presence of IL-2 confirmed that the number of PBMCs increased by about 147 times compared with other controls (FIG. 2).
  • the experimental group cocultured with Jurkat cells and EBV-LCL cells in the presence of IL-2 after 14 days of culture showed that CD56 + and CD3- cells, which are phenotypes of NK cells, were observed. It was confirmed that the ratio of to increase to more than 70% (Fig. 4a).
  • the natural killer cell proliferation method of the present invention is irradiated Jurkat cells, irradiated EBV at 1 to 15 days of culture during the post-culture for maintenance of NK cells after induction and proliferation of the peripheral blood monocyte-derived natural killer cells
  • the method may further comprise adding LCL cells and cytokines. Since activated natural killer cells have a short survival time, there is a problem in immunotherapy using activated natural killer cells. Therefore, the survival time of activated natural killer cells can be extended by adding irradiated Jurkat cells, irradiated EBV-LCL and cytokines on the 1st to 15th day of culture after proliferating natural killer cells according to the present invention. More natural killer cells can be obtained.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of cancer comprising the peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells obtained according to the method, for the manufacture of a medicament for the prevention and treatment of cancer of the peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells obtained according to the method
  • a method of preventing and treating cancer comprising administering to a subject an effective amount of peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells obtained according to the use or the above method.
  • the monocytes are cultured in the presence of IL-2 with irradiated Jurkat cells (control 2), the monocytes are cultured in the presence of IL-2 with EBV-LCL cells irradiated with radiation.
  • Control 3 cancer cell killing ability of natural killer cells obtained from each group against monocytes co-cultured with IL-2 irradiated Jurkat cells and irradiated EBV-LCL cells in the presence of IL-2 (experimental group) was evaluated. As a result, it was confirmed that the natural killer cells of the experimental group propagated about 800 times compared to the control group showed strong killing ability without weakening in terms of cancer cell killing ability.
  • natural killer cells obtained according to the method of the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of cancer.
  • the subject may be a human in need of preventing and / or treating cancer.
  • Subjects include cancer patients as well as patients or normal persons with cancer risk.
  • composition for the prevention and treatment of cancer comprising peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells according to the present invention may be used at an appropriate concentration in an aqueous solution (for example, a phosphate buffer solution or a conventional injectable aqueous solution, etc.) containing appropriate components as necessary.
  • aqueous solution for example, a phosphate buffer solution or a conventional injectable aqueous solution, etc.
  • Peripheral blood monocyte-derived natural killer cells may be formulated in a suspended form.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention can be administered in a conventional manner through intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, etc. routes.
  • An effective amount of peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells included in the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required to achieve a prophylactic or therapeutic effect of cancer.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of other components contained in the composition, and the age, weight, general state of health, sex and diet of the patient, time of administration, route of administration, duration of treatment, drugs used concurrently It can be adjusted according to various factors including.
  • the peripheral blood mononuclear cell-derived natural killer cells of the present invention are 1X10 6 cells / kg to 1X10 11 cells / kg, such as 1X10 6 cells / kg. To 1 ⁇ 10 8 cells / kg.
  • the present invention it is possible to induce and proliferate a large amount of natural killer cells from a small amount of peripheral blood monocytes without using expensive equipment or expensive various cytokines, thereby effectively preventing and treating cancer using natural killer cells. And can dramatically enhance efficacy.
  • Figure 1a is a mononuclear cell (PBMC) isolated from peripheral blood co-culture with Jurkat cell line (PBMC), removing only T cells from PBMC co-culture with Jurkat cell line (PBMC-T), removing only B cells from PBMC Jurkat After co-culture with the cell line (PBMC-B), the degree of induction into natural killer cells was observed.
  • PBMC peripheral blood co-culture with Jurkat cell line
  • FIG. 1B shows that in culturing PBMC and Jurkat cell lines to propagate natural killer cells, when B cells are not in monocytes, natural killer cells do not selectively proliferate.
  • FIG. 2 shows a group treated with IL-2 only in PBMC (peripheral blood monocytes) isolated from humans ( ⁇ , PBMC), a group in which PBMC was co-cultured with irradiated Jurkat cell line and IL-2 ( ⁇ , PBMC + Jurkat ), Co-culture of PBMC with irradiated EBV-LCL cell line and IL-2 ( ⁇ , PBMC + LCL), and PBMC irradiated Jurkat cell line, irradiated EBV-LCL cell line and IL- It is a graph which measured and measured the number of PBMCs of the group (x, PBMC + Jurkat + LCL) co-cultured with 2.
  • PBMC peripheral blood monocytes
  • PBMC + PBMC + Jurkat + LCL EBV irradiated with PBMC Group co-cultured with -LCL cell line and IL-2
  • irradiated Jurkat cell line, irradiated EBV-LCL cell line and IL-2 ⁇ , PBMC + Jurkat + LCL
  • 4A shows a group treated only with IL-2 in PBMC (PBMC), a Jurkat cell line irradiated with PBMC and a group co-cultured with IL-2 (PBMC + Jurkat), an EBV-LCL cell line irradiated with PBMC and Of the group co-cultured with IL-2 (PBMC + LCL), and the group co-cultured with radiation-irradiated Jurkat cell line, the irradiated EBV-LCL cell line and IL-2 (PBMC + Jurkat + LCL)
  • the distribution of natural killer cells was analyzed by flow cytometry.
  • 4B shows a group treated with IL-2 only in PBMC ( ⁇ , PBMC), a Jurkat cell line irradiated with PBMC and a group incubated with IL-2 ( ⁇ , PBMC + Jurkat), EBV irradiated with PBMC Group co-cultured with -LCL cell line and IL-2 ( ⁇ , PBMC + LCL), and group co-cultured with PBMC with irradiated Jurkat cell line, irradiated EBV-LCL cell line and IL-2 ( ⁇ , PBMC + Jurkat + LCL) is a graph showing the distribution of natural killer cells (NK cells).
  • NK cells natural killer cells
  • FIG. 5 is a group co-cultured PBMC with IL-2 and irradiated Jurkat cell line ( ⁇ ), PBMC group co-cultured with IL-2 and irradiated EBV-LCL cell line ( ⁇ ) and PBMC IL-2
  • the graph shows the evaluation of cancer cell killing ability in the co-culture group (*) using both the irradiated Jurkat cell line and the EBV-LCL cell line.
  • Figure 6 shows the results of analyzing the activation of NK cells prepared according to the present invention.
  • the cells were centrifuged at 2500 rpm for 30 minutes using Ficoll (Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare), and mononuclear cells (PBMC) were separated from the buffy coat. Thereafter, the cells were stained with Tryphan Blue to remove damaged cells, and only unstained cells were counted using a hematocytometer.
  • Ficoll Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare
  • PBMC mononuclear cells
  • Jurkat and EBV-LCL cell lines used as feeder cells were cultured in 75T flask at 37 ° C and 5% CO 2 in human RPMI medium containing 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin in RPMI1640 medium. . Once every 2-3 days, hRPMI medium added with 500 U / ml of IL-2 was added. After harvesting all cells at 5 day intervals, fresh hRPMI medium added with IL-2 was added.
  • the number of cells was measured using a hematocytometer, and 100 Gy radiation was irradiated to the Jurkat cell line and the EBV-LCL cell line at a concentration of 1 ⁇ 10 6 / ml, respectively, at an intensity of 2.22 Gy / min.
  • each irradiated Jurkat cell line, EBV-LCL cell line, and the previously isolated monocytes were 37 in a ratio of 1: 0.5: 0.5, respectively.
  • C cultured in an incubator fed with 5% CO 2 (experimental group).
  • NK cells CD56 +, CD3-
  • NK cell number was then calculated using the distribution of total PBMC and NK cells.
  • PBMC cells were co-cultured with Jurkat cells and EBV-LCL cells (x, PBMC + Jurkat + LCL), the control group 1 ( ⁇ , PBMC), on the 14th day of culture, Compared with the control group 2 ( ⁇ , PBMC + Jurkat), control group 3 ( ⁇ , PBMC + LCL) it was confirmed that about 147 times increased.
  • the increase in NK cells was increased by about 800-fold on the 14th day in the experimental group compared to the other control group when put together Jurkat cells and EBV-LCL cells compared to the other control group.
  • Example 3 Determination of enrichment level of NK cells
  • NK cells prepared using the irradiated Jurkat cell line and the irradiated EBV-LCL cell line according to Example 1 as feeders 51Cr tumor cells (K562, Jurkat) were used as target cells. A release assay was performed.
  • the isotope 51Cr was labeled on the cancer cells and reacted in the cell incubator for 1 hour. Isotope-labeled cancer cells were washed 3 times with isotope with hRPMI medium. Cells obtained according to the experimental group, control group 2 and control group 3 of Example 1 were counted using a hematocytometer and co-cultured with isotopically labeled cancer cells at a ratio of 10: 1, 3: 1, 1: 1 for 4 hours. . After 4 hours, centrifugation was performed at 2500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was put into a tube and measured by a gamma counter.
  • Example 4 since the cancer cell killing ability of the NK cells prepared using the irradiated Jurkat cell line and the irradiated EBV-LCL cell line according to Example 1 as the feeder cells was high for 11 days to evaluate the activation marker accordingly. Expression of various NK cell-related activation and inhibitory receptors in cultured NK cells was examined using flow cytometry.
  • cell adhesion molecules such as ICAM-1, CD11a, CD48, CD2, CD49d, CD58, activation receptors such as NKp30, NKp44, 2B4, DNAM-1, NKG2D, and activation markers such as CD69, CD25
  • chemokine receptors such as CD183, CD184, CCR7 slightly increased
  • inhibitory receptors such as CD158a, CD158b, CD94, NKB1, KIRNKAT2.

Abstract

본 발명은 사이토카인의 존재 하에서 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포(Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line)를 영양세포로서 말초혈액단핵구와 공배양하는 것을 포함하는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고가의 장비나 고가의 다양한 사이토카인을 사용하지 않으면서도 적은 양의 말초혈액단핵구으로부터 다량의 자연 살해세포를 유도 및 증식시킬 수 있으므로 자연 살해세포를 이용한 암의 예방 및 치료의 효율 및 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.

Description

말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법
본 발명은 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법에 관한 것이다.
인체는 면역 반응에 의해 병원체로부터 보호되고 있고, 면역 시스템은 많은 면역관련 세포와 사이토카인 등에 의해 구성되어 있다. 이러한 면역시스템에서 중요한 역할을 하는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 림프구를 구성하는 세포로는 대표적으로 선천성 면역계와 후천성 면역계가 있다. 자연 살해세포(Natural Killer Cell, NK cell)는 대표적인 선천면역세포 중 하나로, 비특이적으로 암을 살상할 수 있고 바이러스, 박테리아 등을 인식하여 이들을 살상하며, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) 등의 효소나 Fas-FasL 상호작용으로 병원체를 살상하는 세포로 알려져 있다. 암환자의 경우, 이러한 자연 살해세포 (NK 세포)의 암세포 살상능의 감소가 폐암(Carrega P, et al., Cancer, 2008: 112: 863-875), 간암(Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013-1020), 유방암(Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119-124), 자궁암(Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 1999: 79: 244-250), 혈액암(Tajima F., et al, Lekemia 1996: 10: 478-482) 등의 질환의 발생과 깊은 연관이 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 암의 치료를 위해서 암환자에게서 자연 살해세포의 암세포 살상능 및 활성증가가 필수적이며, 현재 이러한 자연 살해세포의 살상능을 이용하여 고형암이나 혈액 암의 치료가 시도되고 있는 실정이다.
암 세포 살상의 효과를 얻기 위해서는 다량의 자연 살해세포가 요구되나 암 환자의 혈액을 대량으로 확보하는 것이 쉽지 않으며 혈액 내에서 자연 살해세포가 차지하는 비율도 약 5~20% 정도에 불과하므로 이를 면역치료제로 사용하기 어려우므로 자연 살해세포를 효과적으로 확장 및 증식시키는 것이 중요하다. 기존의 자연 살해세포의 증식 방법은 대표적으로 MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), cliniMACS 나 FACs Sorter 등의 장비를 사용하여 혈액에 있는 단핵구나 골수로부터 자연 살해세포를 분리 또는 유도하고 있다. 이러한 방법에는 다음의 단계가 선행된다. 1) 단핵구로부터 초기에 자연 살해세포를 분리하여 사이토카인을 사용하여 확장배양, 2) 단핵구에 공존하는 T 세포를 제거한 후 사이토카인을 사용하여 자연 살해세포를 확장배양, 3) 골수에 있는 줄기세포(stem cell)로부터 자연 살해세포로 유도하는 방법. 그 외, 영양세포(feeder cell)를 이용하여 말초혈액 내 단핵구(PBMC)를 자연 살해세포로 유도하는 방법으로는 이탈리아 Torelli 그룹의 B세포 leukemia인 RPMI8866 세포주를 이용하는 방법과 일본의 Ishikawa 그룹의 Wilms 종양세포인 HFWT 세포주를 이용하는 방법이 보고되어 있다.
그러나 기존에 보고된 자연 살해세포의 증식 방법은 고가의 장비를 사용하여야 하며, 고가의 다양한 사이토카인을 고농도로 이용하여야 하는바 경제적으로 안정된 일부 환자에게만 해당 치료가 가능한 실정이다.
본 발명의 목적은 고가의 장비나 고농도의 사이토카인을 사용하지 않고, 활성화된 말초혈액 유래 자연 살해세포를 효율적으로 수득하기 위한 말초혈액 유래 자연 살해세포의 새로운 유도 및 증식 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이토카인의 존재 하에서 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포를 영양세포로서 말초혈액단핵구와 공배양하는 것을 포함하는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자는 적은 양의 혈액으로부터도 다량의 자연 살해세포를 수득하기 위하여 연구한 결과, 방사선이 조사된 Jurkat 세포를 영양세포로 이용하여 말초혈액으로부터 분리한 단핵구를 배양하는 경우 증식된 자연 살해세포를 얻을 수 있음을 발견한 바 있다 (국내 특허출원 제10-2010-007877호).
상기 출원된 특허의 방법으로 자연 살해 세포를 선택적으로 증식시키는 기작을 연구한 결과 단핵구내에 B 세포를 제거하고 방사선 조사한 Jurkat 세포와 공배양시 자연살해 세포의 선택적 증식이 현저히 저하되었음을 알 수 있었으며 이를 통하여 자연 살해 세포의 증식에 있어서 B 세포가 중요한 역할을 한다는 사실을 발견하였다(도 1a, 도 1b).
이러한 결과를 통하여 Jurkat 세포에 의한 NK 세포의 선택적 증식이 B 세포에 의존적으로 일어난다는 사실을 알게 되었으며 이러한 사실로부터 B 세포 유래 immortalized 세포인 EBV-LCL을 영양 세포로 사용하게 되면 더 많은 NK 세포의 증식을 가능하게 할 것으로 예상되었다. 그러나, 말초혈액으로부터 분리한 단핵구를 EBV-LCL과 공배양을 한 경우 NK 세포는 증식을 하나 NK 세포의 순도는 현저히 저하된 것을 알 수 있었다. 이에, 방사선을 조사한 Jurkat 세포와 함께 방사선을 조사한 EBV-LCL 세포를 영양세포로 이용한 결과, Jurkat 세포 또는 EBV-LCL 세포를 단독으로 이용하는 경우에 발생되는 문제점을 모두 해결 가능하여 훨씬 높은 수율로 증식된 단핵구와 자연 살해세포를 수득하는 것이 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 사이토카인의 존재 하에서 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포를 영양세포로서 말초혈액단핵구와 공배양하는 것을 포함하는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법을 제공한다.
본 발명에서, “말초혈액단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)”, “PBMC" 또는 “단핵구(Mononuclear Cell)”는 항암면역치료를 위하여 통상적으로 사용되는 말초혈액(Peripheral Blood)으로부터 분리된 단핵구(Mononuclear Cell)를 의미한다. 말초혈액단핵구는 채혈한 사람의 혈액을 피콜-하이팩 밀도구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method)과 같은 공지의 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 “말초혈액단핵구”는 정상인, 암의 위험성을 갖는 환자 또는 암 환자로부터 얻은 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 말초혈액단핵구는 반드시 자가 유래일 필요는 없으며, 동종 유래의 말초혈액단핵구라면 본 발명에 따른 항암면역치료를 위한 자연 살해세포의 유도 및 증식을 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 말초혈액단핵구를 방사선을 조사한 Jurkat 세포, 그리고 방사선을 조사한 EBV-LCL 세포와 함께 공배양하면 증식된 단핵구와 증식된 자연 살해세포를 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 자연 살해세포는 암의 예방과 치료를 위해 정상인, 암의 위험성을 갖는 환자, 또는 암 환자에 처치할 수 있다.
본 발명에서 “Jurkat 세포” 또는 “Jurkat 세포주”는 혈액암(immortalized acute T cell leukemia) 세포주로 University of California at San Francisco의 Dr. Arthur Weiss가 개발한 세포주이다. 다양한 케모카인 수용체가 발현하고 있으며 IL-2를 생산할 수 있는 세포로서, 이는 세포 표면에 자연 살해세포 활성억제 인자인 MHC class I을 높이 발현하기 때문에 항암면역치료를 위한 영양세포(feeder cells)의 후보로 가능성이 전혀 대두되지 못했던 세포주였다. 그러나, 본 발명자들이 말초혈액 단핵구로부터 자연 살해세포로의 분화 및 증식을 위해 다수의 혈액암 세포주를 스크리닝하여 찾아낸 결과 Jurkat 세포를 영양세포로서 사용할 수 있음은 밝힌바 있다 (국내 특허출원 제10-2010-0078777호 참조). 본 발명에 사용되는 Jurkat 세포는 ATCC로부터 입수할 수 있다(ATCC TIB-152).
본 발명에서, “EBV-LCL 세포” 또는 “EBV-LCL 세포주”는 엡스테인 바르 바이러스가 형질전환된 임파구 연속 세포주(EBV-LCL, Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line, D.M. Koelle et al., 1993,supra,)이다. EBV-LCL 세포는 발암 과정 연구용 등에 사용된 바는 있으나 말초혈액으로부터 단핵구와 자연 살해세포를 증식시키기 위한 영양세포로 사용된 바는 없다. 본 발명의 EBV-LCL 세포는 통상 실험실에서 직접 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 EBV-LCL을 직접 제조하여 사용하였다. EBV-LCL은 시험관 내에서 사람의 B 세포에 Epstein-Barr Virus를 감염시켜서 만든 B 세포주로서 PBMC에서 EBV를 감염시켜서 만드는 세포주로 만드는 과정 중 EBV에 반응하는 T 세포를 억제하기 위하여 사이클로스포린 A를 넣어주었다. 구체적으로, 30 X 106의 PBMC를 배양 배지 9 ml에 넣고, 이를 T 25 배양 플라스크에 넣고 EBV 상층액을 9ml 넣었다. 80 ul의 사이클로스포린 A를 넣은 후 37℃에서 배양하였다. 배양 7일 후 상층액을 1/2 제거한 후 새로운 배양배지를 넣어주고 40ul의 사이클로스포린 A를 넣어주었다. 배양 28일까지 매 7일에 한번 7일째와 같은 과정을 반복하였다. 배양 28일 후부터 세포주는 사용 가능하며 이때부터 배양 배지에 사이클로스포린 A를 넣지 않고 배양하였다.
상기 Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포는 암세포의 증식을 억제하기 위한 방사선 조사를 통해 비로소 영양세포로서 사용할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, 방사선 조사된 Jurkat 세포 또는 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 각각 100 내지 500 Gy 방사선을 처리하여 수득할 수 있다.
본 발명에서, “사이토카인”은 말초혈액 단핵구를 자연 살해세포로 유도하는데 사용가능한 면역 활성화 사이토카인을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 이러한 사이토카인으로는 예를 들어 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는 이들을 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 특히 IL-2, IL-15 또는 IL-21이 자연 살해세포로의 분화 및 증식에 탁월한 효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있으므로, 이들 사이토카인을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 IL-2를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사이토카인들이 NK 세포로의 유도에 관여한다는 사실은 여러 문헌에서 찾을 수 있다. 사이토카인(Cytokine) 수용체의 γc의 발현이 결핍된 쥐에서 B세포와 T세포는 발견이 되지만 NK 세포는 발견되지 않는 점에서 γc를 지닌 수용체들이 NK 분화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Singer, B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 377-381, 1995). 수용체의 γc 형태는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21의 수용체이며, 이 중 IL-2는 성숙된 NK 세포의 증식과 활성화를 증진시키는 기능을 지니고 있음이 보고되고 있다 (Shibuya, A. et al.,Blood 85, 3538-3546, 1995). IL-2가 결핍된 인간과 마우스에서는 NK 세포의 수가 현저히 감소한다는 보고가 전해지고 있으나 (DiSanto, J. P. et al., J. Exp. Med. 171, 1697-1704, 1990), 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은 간접적으로 NK 세포의 수와 활성화에 영향을 미친다는 연구 결과도 있다. 게다가, IL-2R 사슬은 IL-15의 수용체를 형성하는데 관여한다고 알려져 있다.
상기 IL-15는 NK 세포 분화에 관여하고, 이것은 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론(transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍되며 (Kouetsu et al., Nature 391,700-703, 1998), IL-15 또는 IL-15Rα가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 것에 의해 알게 되었다. 이로써 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 보고되었다 (MrozekE et al., Blood 87, 2632-2640,1996).
상기 IL-21은 활성화된 CD4+ T세포에 의해 분비되는 사이토카인이며 (Nature, 5:688-697, 2005), IL-21의 수용체(IL-21R)는 수지상세포, NK 세포, T 세포 및 B 세포와 같은 림프구에서 발현되어 있다 (Rayna Takaki, et al., J. Immonol 175: 2167- 2173, 2005). IL-21은 구조적으로 IL-2 및 IL-15와 매우 유사하며, IL-21R은 IL-2R, IL-15, IL-7R 및 IL-4R 등과 사슬을 공유하고 있다 (Asao et al., J. Immunol, 167: 1-5, 2001). IL-21은 골수로부터의 NK 세포 전구체의 성숙을 유도하는 것으로 보고되었고 (Parrish-Novak, et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 특히 NK 세포의 사이토카인 생성능 및 세포사멸능과 같은 효과기 기능(effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었으며 (M. Strengell, et al., J Immunol, 170, 5464-5469, 2003; J. Brady, et al., J Immunol, 172, 2048-2058, 2004), CD8+ T 세포의 효과기 기능도 증가시킴으로써 내재, 적응면역계의 항암반응을 촉진시키는 것으로 보고되었다 (Rayna Takaki, et al., J Immunol 175, 2167-2173, 2005; A. Moroz, et al., J Immunol, 173, 900-909, 2004). 또한, 인간의 말초혈액에서 분리한 NK 세포를 활성화 시키며 (Parrish-Novak, et al., Nature, 408, 57, 2000), 제대혈에서 분리한 조혈줄기세포로부터 성숙한 NK 세포를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다(J. Brady, et al., J Immunol, 172, 2048, 2004).
본 발명의 한 구체에에서, 상기 사이토카인은 50U/ml 내지 1,000 U/ml, 예컨대 200 U/ml 내지 800 U/ml, 400 U/ml 내지 600 U/ml 등의 농도로 사용될 수 있다. 종래의 자연 살해세포 증식 방법은 고농도의 다양한 사이토카인을 필요로 하였으나, 본 발명에 따른 자연 살해세포 증식 방법은 2종의 영양세포의 사용으로 인해 하나의 사이토카인을 낮은 농도로 사용하더라도 높은 수율과 순도로 자연 살해세포를 증식할 수 있다.
본 발명에 있어서, 말초혈액단핵구의 배양시 사용가능한 배지는 말초혈액단핵구의 자연 살해세포로의 유도 및 증식에 사용하고 있는 통상의 배지를 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 배지로는 예를 들어, RPMI, DMEM, x-vivo10, x-vivo20, cellgro SCGM 배지를 사용할 수 있다. 그 외 온도 등의 배양 조건은 통상의 말초혈액단핵구의 배양 조건을 따를 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 말초혈액단핵구와 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포의 공배양은 7일 내지 30일, 예를 들어, 10일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는 10일 내지 14일 동안 공배양을 수행하는 것이 효율적이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 말초혈액단핵구와 영양세포의 공배양시 혼합 비율은 1:5 내지 2:1일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 영양세포로서 Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포가 자연 살해세포의 유도 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해, 단핵구를 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 1), 단핵구를 방사선이 조사된 Jurkat 세포와 함께 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 2), 단핵구를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포와 함께 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 3)을 대조군으로 하고, 단핵구를 방사선이 조사된 Jurkat 세포 및 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포와 함께 IL-2 존재하에 공동 배양한 군을 실험군으로 하여 이들을 일정 기간 배양한 후 PBMC와 NK 세포의 수를 측정하였다 (실시예 2, 도 2, 도 3 참조). 그 결과, IL-2존재 하에 Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포와 공동 배양한 실험군은 다른 대조군과 비교하여 PBMC의 수가 약 147배 증가함을 확인하였다(도 2). 또한 NK 세포의 증식뿐만 아니라 분포(enrichment)의 정도를 확인한 결과, 배양 14일 경과 후 IL-2존재 하에 Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포와 공동 배양한 실험군에서는 NK 세포의 표현형인 CD56+, CD3-세포의 비율이 70% 이상까지 증가함을 확인하였다 (도 4a).
한편, 본 발명의 자연 살해세포 증식 방법은 상기 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 후 NK 세포의 유지를 위한 후배양시 배양 1일 내지 15일째에 방사선 조사된 Jurkat 세포, 방사선 조사된 EBV-LCL 세포 및 사이토카인을 추가하는 것을 더 포함할 수 있다. 활성화된 자연 살해세포는 생존시간이 짧기 때문에 활성화된 자연 살해세포를 이용한 면역 치료에 있어서 문제점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 자연 살해세포 증식 후 배양 1일 내지 15일째에 방사선 조사된 Jurkat 세포, 방사선 조사된 EBV-LCL과 사이토카인을 추가함으로써 활성화된 자연 살해세포의 생존기간을 연장시킬 수 있으며, 더 많은 수의 자연 살해세포를 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 얻어진 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포를 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물, 상기 방법에 따라 얻어진 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 암 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 용도 또는 상기 방법에 따라 얻어진 유효량의 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 단핵구를 방사선이 조사된 Jurkat 세포와 함께 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 2), 단핵구를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포와 함께 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 3)과, 단핵구를 방사선이 조사된 Jurkat 세포 및 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포와 함께 IL-2 존재하에 공동 배양한 군(실험군)에 대하여 각 군에서 얻어진 자연 살해세포의 암세포 살상능을 평가하였다. 그 결과, 대조군에 비해 약 800배로 증식된 실험군의 자연 살해세포가 암세포 살상능 측면에서도 약화됨 없이 강력한 살상능을 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 자연 살해세포는 암의 예방 및 치료를 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 대상체는 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간일 수 있다. 대상체에는 암 환자뿐만 아니라 암의 위험성을 갖는 환자 또는 정상인도 포함된다.
본 발명에 따른 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포를 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물은 필요에 따라 적절한 성분을 함유하는 수용액(예를 들면, 인산염 완충액, 통상의 주사제용 수용액 등)에 적절한 농도로 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포가 현탁되어 있는 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명에 의한 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유효량은 암의 예방 또는 치료 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포는 1X106 cells/kg 내지 1X1011 cells/kg, 예컨대 1X106 cells/kg 내지 1X108 cells/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명에 따르면, 고가의 장비나 고가의 다양한 사이토카인을 사용하지 않으면서도 적은 양의 말초혈액단핵구으로부터 다량의 자연 살해세포를 유도 및 증식시킬 수 있으므로 자연 살해세포를 이용한 암의 예방 및 치료의 효율 및 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.
도 1a는 말초혈액에서 분리한 단핵구 (PBMC)를 Jurkat 세포주와 함께 공동 배양 (PBMC), PBMC에서 T 세포만을 제거하여 Jurkat 세포주와 함께 공동 배양 (PBMC-T), PBMC에서 B 세포만을 제거하여 Jurkat 세포주와 함께 공동 배양 (PBMC-B)한 뒤 자연살해세포로의 유도 정도를 관찰하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 PBMC와 Jurkat 세포주를 공동 배양하여 자연 살해세포를 증식함에 있어서, B 세포가 단핵구 내에 없는 경우에는 자연살해세포가 선택적으로 증식되지 않음을 나타낸 것이다.
도 2는 사람에게서 분리한 PBMC (말초혈액 단핵구)에 IL-2만 처리한 군 (◇, PBMC), PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (■, PBMC + Jurkat), PBMC를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (▲, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주, 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 함께 공동 배양한 군 (× , PBMC + Jurkat + LCL)의 PBMC의 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3는 PBMC에 IL-2만 처리한 군 (◇, PBMC), PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (■, PBMC + Jurkat), PBMC를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (▲, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주, 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 함께 공동 배양한 군 (× , PBMC + Jurkat + LCL)의 자연 살해세포 (NK)의 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 PBMC에 IL-2만 처리한 군 (PBMC), PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (PBMC + Jurkat), PBMC를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (PBMC + LCL), 그리고 PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주, 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 함께 공동 배양한 군 (PBMC + Jurkat + LCL)의 자연 살해세포의 분포를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4b는 PBMC에 IL-2만 처리한 군 (◇, PBMC), PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (■, PBMC + Jurkat), PBMC를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 공동 배양한 군 (▲, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를 방사선이 조사된 Jurkat 세포주, 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포주 및 IL-2와 함께 공동 배양한 군 (× , PBMC + Jurkat + LCL)의 자연 살해세포 (NK 세포)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PBMC를 IL-2와 방사선 조사된 Jurkat 세포주와 공동 배양한 군 (◆), PBMC를 IL-2와 방사선 조사된 EBV-LCL 세포주와 공동 배양한 군(×)과 PBMC를 IL-2와 방사선 조사된 Jurkat 세포주 및 EBV-LCL 세포주를 모두 이용하여 공동배양한 군(*)에서의 암세포 살상능이 평가한 그래프를 보여준다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 NK 세포의 활성화를 분석한 결과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
실시예 1 : 말초혈액 단핵구로부터 NK 세포의 제조
사람의 혈액을 채혈한 후, Ficoll(Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare)을 이용하여 2500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 연막층(buffy coat)에서 단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 그 후 트립판 블루(Tryphan Blue)로 염색하여 손상된 세포를 제거하고, 염색되지 않은 세포만을 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 계수하였다.
영양세포(feeder cell)로 사용되는 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주는 RPMI1640 배지에 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 넣은 human RPMI 배지에 75T 플라스크에 37℃, 5% CO2 의 조건에서 배양 하였다. 2-3일 마다 한번씩 IL-2가 500 U/ml로 첨가된 hRPMI 배지를 넣어주었으며, 5일 간격으로 세포를 모두 수확한 후 IL-2가 첨가된 새로운 hRPMI 배지를 넣어주었다.
세포수를 헤마토사이토미터를 이용하여 측정한 후 각각 1×106/ml의 농도의 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주에 2.22 Gy/min의 세기로 100 Gy 방사선을 조사하였다.
IL-2가 500 U/ml 농도로 첨가된 hRPMI 배지를 24웰 플레이트에 넣은 후, 방사선이 조사된 각각의 Jurkat 세포주, EBV-LCL 세포주와 앞서 분리한 단핵구를 각각 1:0.5:0.5 비율로 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 배양하였다(실험군).
또한 상기와 동일한 방법을 이용하여 영양세포주를 첨가하지 않고 단핵구를 IL-2 존재 하에서 배양한 군 (대조군 1), 단핵구를 방사선이 조사된 Jurkat 세포를 첨가하고 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 2), 단핵구를 방사선이 조사된 EBV-LCL 세포를 첨가하고 IL-2 존재하에서 배양한 군 (대조군 3)을 대조군으로 하였다.
실시예 2: NK 세포의 증식능 측정
영양세포가 자연 살해세포의 증식에 미치는 영향을 보기 위하여, 실시예 1에 따른 실험군과, 대조군 1, 대조군 2 및 대조군 3에 대해 배양 0일, 5일, 11일, 14일에 각각 세포수를 측정하고 형광이 부착된 CD56과 CD3에 대한 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하여 NK 세포(CD56+, CD3-)군을 분석하였다. 그 후 NK 세포수를 총 PBMC와 NK 세포의 분포를 이용하여 계산하였다.
그 결과 도 2에서 볼 수 있듯이, PBMC 세포는 Jurkat 세포와 EBV-LCL 세포를 함께 넣고 공동 배양한 실험군 (× , PBMC + Jurkat + LCL)의 경우, 배양 14일째에 대조군 1 (◇, PBMC), 대조군 2 (■, PBMC + Jurkat), 대조군 3 (▲, PBMC + LCL)에 비하여 약 147배 증가하였음을 확인하였다. 또한 도 3에서 볼 수 있듯이 NK 세포의 증가는 다른 대조군에 비해 Jurkat 세포와 EBV-LCL 세포를 함께 넣고 공동 배양시 다른 대조군에 비해 실험군에서 14일째에는 약 800배 증가함을 확인하였다.
실시예 3: NK 세포의 enrichment 정도 측정
영양세포와 사이토카인이 NK 세포로의 enrichment 에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 실시예 1에 따른 실험군과, 대조군 1, 대조군 2 및 대조군 3에 대해 배양 0일, 5일, 11일, 14일에 각각 형광이 부착된 CD56, CD3 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과, 14일 경과 후 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주와 단핵구를 공동배양한 경우 자연 살해세포의 표현형인 CD56+, CD3- 세포의 비율이 70% 이상까지 증가함을 확인하였다 (도 4a). 도 4b는 배양 14일째 유세포 분석기를 이용하여 NK 세포의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
실시예 4 : 본 발명에 따라 제조된 NK 세포의 암세포 살상능 측정
실시예 1에 따라 방사선 조사된 Jurkat 세포주 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포주를 영양세포로 이용하여 제조된 NK 세포의 암세포 살상능을 평가하기 위하여, 종양세포(K562, Jurkat)를 표적세포로 하여 51Cr release assay를 수행하였다.
먼저, 암세포인 K562와 Jurkat 세포의 세포수를 측정한 후 동위원소인 51Cr을 각각 암세포에 표지하여 1시간 동안 세포배양기에서 반응시켰다. 동위원소로 표지된 암세포를 hRPMI 배지로 동위원소를 3회 씻어주었다. 실시예 1의 실험군, 대조군 2 및 대조군 3에 따라 얻어진 세포들을 hematocytometer를 이용하여 계수한 후 동위원소가 표지된 암세포와 10:1, 3:1, 1:1의 비율로 4시간 동안 공동 배양하였다. 4시간 후 2500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 튜브에 넣어 감마 카운터(gamma counter)로 측정하였다.
도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-2와 방사선 조사된 EBV-LCL 세포주를 사용한 대조군 3 (×)과 방사선 조사된 Jurkat 세포주 및 EBV-LCL 세포주를 모두 이용하여 공동배양한 실험군(*)에서 암세포 살상능이 IL-2와 방사선 조사된 Jurkat 세포주를 이용한 대조군 2(◆)와 비슷한 것을 확인하였다. 또한, E:T(효력세포:표적세포)의 비율이 1:1 임에도 불구하고 상당한 살상능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명에 따른 IL-2와 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포를 처리한 말초혈액 단핵구의 경우 자연 살해세포로의 높은 enrichment 뿐만 아니라 높은 암세포 살상능을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : 본 발명에 따라 제조된 NK 세포의 활성화 측정
실시예 4에서 실시예 1에 따라 방사선 조사된 Jurkat 세포주 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포주를 영양세포로 이용하여 제조된 NK 세포의 암세포 살상능이 높았기 때문에 이에 따른 활성화 마커를 평가하기 위하여 11일 동안 배양한 NK세포에서 다양한 NK세포 관련 활성화 및 억제 수용체의 발현을 유세포 분석기를 사용하여 조사하였다.
도 6에서 보는 바와 같이 ICAM-1, CD11a, CD48, CD2, CD49d, CD58과 같은 세포 부착 분자, NKp30, NKp44, 2B4, DNAM-1, NKG2D와 같은 활성화 수용체, CD69, CD25와 같은 활성화 마커의 발현이 증가되어 있고 CD183, CD184, CCR7과 같은 케모카인 수용체의 발현이 약간 증가되어 있고 CD158a, CD158b, CD94, NKB1, KIRNKAT2와 같은 억제 수용체의 발현이 증가되어 있는 것을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 사이토카인의 존재 하에서 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포(Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line)를 영양세포로서 말초혈액단핵구와 공배양하는 것을 포함하는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    말초혈액단핵구는 정상인, 암의 위험성을 갖는 환자 또는 암 환자로부터 얻은 것인 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    방사선 조사된 Jurkat 세포 또는 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 각각 100 내지 500 Gy 방사선을 처리하여 수득된 것인 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는 이들 중 2종 이상인 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사이토카인은 50U/ml 내지 1,000 U/ml의 농도로 사용되는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공배양은 7일 내지 30일 동안 수행되는 것인 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 말초혈액단핵구와 영양세포의 공배양시 혼합 비율은 1:5 내지 2:1인 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 후 NK 세포의 유지를 위한 후배양시 배양 1일 내지 15일째에 방사선 조사된 Jurkat 세포, 방사선 조사된 EBV-LCL 세포 및 사이토카인을 추가하는 것을 더 포함하는 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포를 포함하는 암의 예방 및 치료용 의약 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 암 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 용도.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 유효량의 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법.
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