CN102488678A - 信筒子醌在制备治疗自身免疫疾病药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了信筒子醌（Embelin）在制备治疗自身免疫疾病药物方面的应用。本发明的实验结果表明信筒子醌可以抑制人免疫树突状细胞的分化，抑制LPS激活的人免疫树突状细胞的成熟度；可以抑制未成熟树突细胞的抗原摄取能力和成熟树突状细胞的抗原提呈能力，可以抑制树突细胞刺激的T细胞增殖反应，抑制树突状细胞分泌的促进辅助型T细胞1型和17型细胞分化的细胞因子表达。特别是信筒子醌可以减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病程度。因此，本发明涉及制备抑制免疫系统的药物，有望在临床上成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。

Description

信筒子醌在制备治疗自身免疫疾病药物方面的应用

技术领域

本发明属于中药应用技术领域，涉及中药单体信筒子醌（Embelin）在制备作为治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物方面应用。

背景技术

树突状细胞(dendritic cells, DC)是已知的机体内功能最强的抗原呈递细胞( antigen-presenting cells, APC),也是目前发现的能直接激活初始型T细胞的APC^[1]。发生炎症时,DC最先与抗原接触进而捕获抗原, 经加工处理后使抗原肽与MHC分子结合而提呈到其他免疫细胞表面,引起细胞因子分泌,在第一、第二信号共同作用下，激活 T 淋巴细胞，产生特异性的免疫应答反应；另一方面DC可诱导胸腺清除自身反应性细胞、分化调节性细胞,维持自身耐受,成为介导免疫应答与耐受的关键因素^[2]。因此，APC 是免疫反应的首要环节。免疫树突状细胞是免疫系统的前沿“哨兵”，加拿大科学家斯坦曼（Ralph M. Steinman）因发现树突状细胞而获得2011年诺贝尔生理学和医学奖。诺贝尔生理学与医学奖评委会评价他的成就为“发现了免疫应答的‘守门人’，从而彻底革新了我们对于免疫系统的认识”。免疫树突状细胞起始的不同信号决定免疫系统的免疫反应类型和反应程度。自身免疫疾病是由于免疫系统异常或者免疫系统过度激活而导致的自身免疫系统攻击自身组织或细胞而产生的疾病。因此，抑制免疫树突状细胞分化和激活的物质可以抑制免疫系统的激活，有望成为治疗自身免疫性疾病和器官移植后免疫排斥的药物。

一般认为，人体 DC有不同的DC亚群存在，如:郎罕细胞、DC1 和 DC2 。DCl与单核、粒细胞有共同的祖细胞，能分化成为巨噬细胞；DC2与 T 、NK细胞有共同的前体细胞，能分化成为淋巴细胞。若根据其分化发育主要经历的四个阶段即分化程度，DC又可分为 4类：骨髓中起源于 CD34+多能干细胞的远祖细胞，外周血中的前体细胞，定居于外周组织中的未成熟 DC(immature DC, iDC)，定居于次级淋巴组织中的成熟 DC(mature DC,mDC) ^[3]。鉴于DC前体细胞在不同分化阶段,不同的微环境中,发挥着不同的生物学功能。Banchereau将DC的发育分为4个阶段:(1)骨髓中的祖细胞；(2)与病原体相互识别前在血液、淋巴管和淋巴组织中巡逻的DC前体,它们可分泌大量的细胞因子使炎症局限化；(3)驻留组织的不成熟DC,它们拥有强大的吞噬功能便于抗原的摄取；(4)成熟DC,出现于次级淋巴器官中,高表达协同刺激分子进行抗原的提呈^[4]。

DC 的成熟状态决定免疫应答的结局。iDC 就象体内的“卫兵”，起着免疫监视的作用，它分布于几乎所有组织和器官，具有强大的内吞作用，持续地从外周组织摄取抗原迁移至局部次级淋巴组织，但其抗原提呈功能低下。在无感染和无组织损伤的正常生理状态下，存在于外周组织的iDC不断地摄取自身抗原及非感染环境中的蛋白质(如呼吸道和消化道中的蛋白质)，进入引流淋巴结，诱导外周耐受^[5]。 “耐受性DC”可能通过如下机制诱导耐受:（1）诱导 T细胞的无能或低能反应。 耐受性DC低水平表达MHC分子，几乎不表达CD40, CD80,CD86, IFA3,ICAM-1等激活T细胞所必须的第二信号分子；(2)诱导T细胞凋亡。抗原特异性T细胞TCR与表达FasL的DC的MHC结合的同时，其Fas与 DC表面FasL结合，介导这些T细胞凋亡^[6]。(3)诱导调节性 T细胞产生。 耐受性 DC 能够促进初始 T细胞转化为 T-reg，反过来T-reg又可以诱导DC前体转化为耐受性 DC^[7]。这种机制使得机体的免疫系统能够更好地识别和防御炎症和组织损伤时的“危险信号”( danger signal )，而对自身抗原和无害的外源性抗原保持耐受。

DC 是一把双刃剑，既可诱导免疫耐受，也可刺激强烈的免疫应答，其成熟状态在免疫平衡中起决定性作用。不成熟DC具有很强的捕获抗原的能力，但是刺激T细胞的能力很低。只有在出现刺激性的信号(如IL-1β, TNF)或由细菌引起的刺激时，DC 由不成熟阶段转向成熟 DC，高表达细胞表面共刺激分子同时迁移到淋巴结诱导抗原特异性T细胞的增殖。活化了的 T细胞又反过来通过CD 40为信号，释放细胞因子刺激 DC，诱导 DC活化。在癌症病人，发现肿瘤组织的 DC经常处于一种不成熟的状态，不能迁移到淋巴结^[8]。由肿瘤组织释放的因子，如TGF-β.IL-10和VEGF等可以阻碍DC分化并且下调DC刺激T细胞的功能。因此，利用体外发育完善的成熟 DC激活免疫应答可治疗肿瘤患者。

信筒子醌（英文名: Embelin）是从白花酸藤果中提纯出的一种具有抗生育作用的苯醌类化合物，后来研究发现信筒子醌也是具有抗癌和抗关节炎作用的中药提取物，可抑制XIAP(X连锁凋亡抑制蛋白)。信筒子醌最初被发现可以强烈抑制肿瘤细胞的生长；研究发现其可通过PTEN酪氨酸磷酸化发挥抑制STAT3的作用^[9]，而STAT3是TH17细胞分化成熟的关键调控信号通路。Dai Y等人发现信筒子醌在结肠癌中可促进PPARγ，抑制NF-kB信号通路^[10]。NF-kB是产生炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的关键信号通路,而IL-1β和IL-6是TH17细胞分化起始的必需因子；Klotzl^[11]等人发现PPARγ选择性抑制TH17的分化。但是信筒子醌对T细胞介导的自身免疫反应以及对不同T细胞亚群的影响尚不清楚，尤其是对炎症反应的辅助性T细胞TH17亚群及其介导的EAE的调节作用尚无报道。

DCs在先天和适应性免疫反应引发中期重要的作用。虽然DCs的普遍作用是抗原提呈和T淋巴细胞的激活，DCs在分化的不同阶段有不同的表面标志物、迁移模式以及细胞因子产量。这些不同决定了T细胞他们相互作用的命运。最初的T细胞激活依赖于T细胞受体的牵引和通过在APCs（例如DCs）表面上表达的CD28和CD80/86共刺激信号。因此，我们通过监测DC细胞因子产量和表面标记物CD80，CD83，CD86以及HLA-DR的表达来调查信筒子醌是否影响DC分化和激活。

发明内容

本发明的目的是公开一种信筒子醌（Embelin）在制备作为治疗自身免疫性、神经系统炎症性疾病药物方面的应用。其中信筒子醌在治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物中的有效剂量优选为20-50 mg/Kg体重/天。

本发明进一步公开了信筒子醌在制备治疗器官移植抑制免疫排斥药物中的应用。实验结果表明信筒子醌(Embelin)抑制LPS激活的人树突细胞的成熟图(流式细胞仪数据图)；它可以抑制免疫系统的激活，因此可以治疗自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥。

本发明所述的自身免疫性疾病指的是：免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫性疾病。

本发明所述的免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫疾病指的是：多发性硬化症、自身免疫性视网膜炎、视神经脊髓炎、系统性红斑狼疮、糖尿病、甲状腺炎、溶血性贫血、萎缩性睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变、侵袭性慢性肝炎、慢性肾小球炎、溃伤性结肠炎、皮炎、肌炎、系统性硬化症。

本发明所述的神经系统炎症性疾病指的是多发性硬化症、视神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎；其有效剂量优选为25-50 mg/Kg体重/天。

本发明运用免疫细胞分化和激活模型以及实验动物模型进行了大量的药理实验，实验结果表明：信筒子醌可以抑制人免疫树突状细胞的分化，抑制LPS激活的人免疫树突状细胞的成熟度；可以抑制未成熟树突细胞的抗原摄取能力和成熟树突状细胞的抗原提呈能力，可以抑制树突细胞刺激的T细胞增殖反应。特别是信筒子醌可以减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病程度。实验性自身免疫脑脊髓炎是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎的实验动物模型，也是研究自身免疫和炎症性疾病的典型的动物模型。因此，本发明有望在临床上成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。

免疫活性细胞如树突状细胞等具有识别外来抗原或者认为对生物体有害的自身抗原的机制。免疫细胞识别自身抗原而引起自身免疫反应是多种免疫疾病的发病基础。例如多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、自身免疫性视网膜炎、系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus , SLE）、糖尿病、甲状腺炎、溶血性贫血、萎缩性睾丸炎、古德帕斯彻病(Goodpasturee’s disease)、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、侵袭性慢性肝炎、慢性肾小球炎、斯耶格伦综合症(Sjogren syndrome)、溃伤性结肠炎、皮炎、莱特尔综合症(Reiter syndrome)、肌炎(miositis)、系统性硬化症等。而抑制免疫细胞，尤其是抑制免疫系统前沿的具有专业的抗原呈递能力的树突状细胞的物质将具有潜在的治疗自身免疫性疾病的用途。

本发明所述的应用，其中自身免疫性疾病指的是上述所指的自身免疫疾病，尤其是中枢神经系统炎症性疾病，例如人多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等等，典型的是人多发性硬化症。

多发性硬化症是自身免疫性炎症性疾病，特征是中枢神经系统功能障碍的症状和体征的多样化,配合反复的缓解与复发.最常见的发病症状为感觉异常,出现在一个或几个肢体,躯干或一侧的面部；腿或手的无力或笨拙；或视觉障碍,例如单眼的部分性失明与眼球活动时的疼痛,视物模糊或暗点.其他常见的早期症状包括眼肌瘫痪造成的复视,一个或多个肢体的短暂无力,轻微的步态障碍,一个肢体的轻度僵硬与异常的易疲乏,膀胱控制困难,眩晕,以及轻度的情绪障碍。

自身免疫性炎症特别指的是人多发性硬化症、视神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎，通过抑制免疫树突状细胞的分化、成熟、抗原呈递和T细胞增殖等细胞学实验和小鼠疾病动物模型实验证明：可以治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性中枢神经系统炎症性疾病。视神经脊髓炎最早认为是多发性硬化的一种，近些年随着临床诊断和病理研究的发展，才细分为自身免疫性视神经脊髓炎。急性播散性脑脊髓炎，又称感染后脑脊髓炎、预防接种后脑脊髓炎，是指继发于麻诊、风疹、水痘、天花等急性出疹性疾病，或预防接种后，因免疫机能障碍引起中枢神经系统内的脱髓鞘疾病。

实验性自身免疫脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是人多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）和急性播散性脑脊髓炎（Acute disseminated encephalomyelitis,ADEM）等脑脊髓炎症性疾病的动物模型，也是研究自身免疫性和炎症性疾病的典型动物模型。是一种中枢神经系统自身免疫炎症性脱髓鞘疾病。其发病机理是由免疫细胞（辅助性T细胞TH1和TH17细胞）介导的自身免疫性炎症反应。

本发明以研究自身免疫性和炎症性疾病的典型动物模型-小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎为例，发现信筒子醌以有效减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎疾病的发生和发展。因此，本发明在临床上有望成为治疗多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等自身免疫性炎症性疾病的药物。

本发明公开的信筒子醌（Embelin）在制备作为治疗自身免疫性、神经系统炎症性疾病药物方面的应用，通常是以药物组合物的形式服用的，可口服或非口服给药，或者以和药学上可接受的载体、赋形剂及其它添加剂形成的化合物（如片剂、缓释制剂、胶囊剂、注射剂、溶液剂）安全的口服或非口服给药。当口服给药时，组合物可配制成片剂、糖衣剂或胶囊。为制备口服药物组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。本发明的系列化合物可以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。实际服用的信筒子醌（Embelin）化合物的剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态，选者的给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等。

附图说明：

图1为信筒子醌（Embelin）抑制人树突细胞的分化图(流式细胞仪数据图)；

图2为信筒子醌（Embelin）抑制人树突细胞的分化图(对应流式细胞仪数据的柱状图)；

图3为信筒子醌（Embelin）抑制LPS激活的人树突细胞的成熟图(流式细胞仪数据图)；它可以抑制免疫系统的激活，因此可以治疗自身免疫性疾病；

图4为信筒子醌（Embelin）抑制LPS激活的人树突细胞的成熟图(流式细胞仪数据图)；它可以抑制免疫系统的激活，因此可以治疗自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥；

图5为信筒子醌（Embelin）抑制未成熟树突细胞的抗原摄取能力图；它可以抑制免疫系统对抗原的反应能力。在自身免疫疾病中，可以降低自体免疫细胞识别自身抗原的能力。因此可以治疗自身免疫性疾病；

图6为信筒子醌（Embelin）抑制树突细胞刺激的异体T细胞增殖反应（CFSE法）图；它可以治疗多发性硬化症等T细胞介导的自身免疫性疾病；

图7为信筒子醌（Embelin）抑制树突细胞介导的促进T辅助性细胞分化的细胞因子的分泌图；它主要抑制炎症性细胞因子的分泌，可能用于治疗T细胞介导的自身免疫性炎症性疾病；

图8为口服信筒子醌（Embelin,20mg/kg）减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病程度图；说明信筒子醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；

图9为口服信筒子醌（Embelin,50mg/kg）减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病程度图；说明信筒子醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；

图10为信筒子醌（Embelin）减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病临床评分的最高分数图；说明信筒子醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；

图11为信筒子醌（Embelin）减轻小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病临床评分的总分数图。说明信筒子醌可以治疗自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病；

其中图10 图11说明与对照组小鼠相比，口服信筒子醌（Embelin）的小鼠临床病情评分降低（给药组最高只有2分，而未给药组为3分）；给药组的发病高峰峰值较对照组明显降低，证明信筒子醌（Embelin）可明显减缓小鼠EAE发病程度（n=8, p<0.05）。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定，其中信筒子醌（Embelin）有市售，其它所用的试剂，除特别标注外均有市售。其中血液需经过卫生管理部门批准。

实施例1

1. 1 人外周血单核细胞的分离

（1）  去血站取新鲜血液（不超过8小时）。大约为40 mL。

（2）  用3倍体积的PBS稀释（稀释的血样越多，单核细胞的纯化越好）。共160 mL取15 mL的淋巴细胞分离液Ficoll-Paque加入50 mL的离心管，离心管倾斜45o，吸取35 mL稀释的血液，在分离液面1 cm处沿管壁叠加在分离液上,勿破坏分离界面。（分4管，先在每管15 mL的淋巴细胞分离液Ficoll-Paque中加入35 mL血液，再平均剩余的血液）

（3）  室温400g离心30 min，缓慢减速，不可设置刹车档，。

（4）  平稳取出离心管，最下层是红细胞和粒细胞，中间层是淋巴细胞分离液，最上层是血浆和稀释液等。血浆层和分离液交界处为易浑浊到灰白层（白膜），吸出上层，留下单核细胞细胞层（一层白膜），分布在相面上。

（5）  仔细转移白膜（淋巴细胞、单核细胞、血小板）到新的50mL离心管。转移至两管。

（6）  在离心管中加入3倍体积的磷酸缓冲液（PBS），混合，室温300g离心10 min。小心完全除去上清液。

（7）  为了除去血小板，在50 mL的缓冲液中重悬细胞沉淀，室温下200g离心15 min,小心完全除去上清液。在200g离心时，血小板大部分停留在上清液中。

（8）  加入3倍体积的PBS混匀后计数。

（9）  再重复洗1次。

注：外周血单核细胞可能贮存于5%的牛血清白蛋白（BSA）或血清和抗凝剂（肝素、EDTA或柠檬酸磷酸葡萄糖）中过夜。细胞在冰箱中贮存不超过一天。

1.2人类CD14⁺单核细胞的纯化

（1）  取80 μL的细胞悬浮液与20 μL的CD14⁺微珠（购自美天旎公司）混匀后4℃孵育15 min，中间要混合一次(细胞与微珠按4:1加入)。（所有血细胞加300 μL磁珠，再加1200 μL含0.5%BSA的PBS）

（2）  用20 倍体积（2mL）预冷的PBS（含0.5%BSA）200g离心5 min洗涤一次，弃上清，加入500 μL的PBS。

（3）  离心期间，将分离磁铁安装在多用支架上，并将分选柱放在磁体中，分选柱下放一支干净的无菌离心管。用遇冷的磷酸缓冲液冲洗分选柱3次，每次0.5 mL。弃洗脱液，再在分选柱下置一支干净的无菌离心管，将细胞悬液上样到分选柱上。

（4）  用PBS缓冲液冲洗分离柱，每次0.5mL，洗3次(第一个0.5 mL慢加入以免扰动分选柱中的细胞)。

（5）  待细胞悬液全通过柱后,从磁体上取下分选柱，放在一个无菌15 mL心管上。在分选柱中加入1 mL全RPMI1640培养基，将活塞塞入分离柱并洗脱CD14⁺单核细胞，计数。将CD14^-细胞冻存用于T细胞增殖实验。

（6）  流式细胞分选仪确认纯度（95%）

（7）  用含有1000 U/mL GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子），1000 U/mL IL-4（白介素4）的完全1640培养基（含10 mM的丙酮酸钠，10 mM的谷氨酰胺，100 μg/mL那霉素）调整细胞浓度为1X10⁶个/mL并加入药物。将细胞悬浮液2 mL/孔接种于十二孔板。

1.3.  信筒子醌（Embelin）处理时间和浓度确定

将得到的DC分成三组，根据查阅文献，每组进行了不同浓度的处理：

第一组（分化）：第一天加药，第五天进行流式细胞术检测。Embelin处理不同的浓度：                                                

正常对照组；

10μM/L Embelin处理五天组；30μM/L Embelin处理五天组；

60μM/L Embelin处理五天组。

第二组（分化）：第五天加药，第七天进行流式细胞术检测。Embelin处理不同的浓度：

正常对照组；10μM/L Embelin处理两天组；

30μM/L Embelin处理两天组；60μM/L Embelin处理两天组。

第三组（成熟）：第五天加药以及LPS（脂多糖，lipopolysaccharide）（1μg/ml），第七天进行流式细胞术检测。Embelin处理不同的浓度：

阴性对照组（Embelin和LPS都不加）；

对照组（只加LPS）；

10μM/L 信筒子醌（Embelin）+LPS处理两天组；

30μM/L Embelin+LPS处理两天组；

60μM/L Embelin+LPS处理两天组。

在培养的第三天，吸取50%的上清，加入等量的含有1000 U/ml的GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子），1000 U/ml的IL-4的1640培养基并加入药(按2ml加)。注：在第五天，在未加药的孔中分别加入LPS及药物，并在含有等量的1000 U/mL的GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子），1000 U/mL的IL-4的1640培养基中继续培养两天。

结论：信筒子醌（Embelin）可抑制人树突细胞的分化（图1、2）、抑制LPS激活的人树突细胞的成熟（图3、4），图中表明随着信筒子醌的浓度增加，抑制程度加大；抑制树突细胞的分化可以减少免疫细胞的数量，从而降低免疫反应；它同时可以抑制免疫系统的激活。在自身免疫疾病中，抑制免疫反应可以减轻自身免疫系统攻击自体细胞或组织的能力。因此可以治疗自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥；

1.4流式分析

（1）在细胞分化成熟的第五天、第七天末收集细胞至1.5mL离心管，两管。2000 转离心10 min，再转移上清至1.5mL离心管，保留上清；

（2）用含有2 mLPBS洗涤细胞，按照每10⁵ cell/2 μL的量加入DC表面标记CD80，CD86，CD83，HLA-DR，4℃下避光孵育30 min；

（3）弃去染料，用2 mL PBS洗涤细胞一次；

（4）用2 mL PBS重悬细胞，再加入1mL 2%的多聚甲醛固定，300目滤网过滤，流式分析备用。

（5）用流式细胞仪进行检测。FACS数据用CELLQuest软件分析。

1.5 FITC-dextran摄取检测

收集第五天的分化未成熟细胞按10⁵ cells/ml悬于RPMI1640完全培养基中，再加入FITC-dextran（0.1 mg/mL）（荧光标记的葡聚糖）,37℃培养箱孵育30 min, 1000 r/min离心10 min，收集细胞，用PBS清洗2次，最后重悬于流式管，分别检测细胞的荧光强度，以4℃条件为基准，判断细胞的抗原摄取能力。

结论：图5中横轴为细胞吞噬荧光标记的葡聚糖（抗原）后的荧光强度，吞噬越多荧光强度越强，峰值越靠右侧。右侧37°C峰值为阳性对照，左侧4°C峰值为阴性对照。结果显示随着信筒子醌的浓度增加，峰值左移，说明荧光强度减弱，即吞噬抗原能力减弱。信筒子醌Embelin抑制未成熟树突细胞的抗原摄取能力（图5）；不能有效识别和摄取抗原会降低针对抗原的免疫激活效果。说明它可以抑制免疫系统对抗原的反应能力，在自身免疫疾病中，可以降低自体免疫细胞识别自身抗原的能力。因此可以治疗自身免疫性疾病；

1.6 Embelin抑制成熟DC引起的异体T细胞增殖（治疗T细胞介导的相关疾病）

利用CD4+磁珠分选异体CD4+细胞，PBS洗两遍，37℃标记CFSE（羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）染料10 min，2×10⁵ cell/200 μl植于圆底96孔板，再按1∶10、1∶20、1∶40（DC/CD4+）加入丝裂霉素C和Embelin处理过的成熟DC，共同培养4天后，收集细胞，做流式分析，以 CFSE荧光强度的衰减次数显示细胞增殖变化。

结论：在免疫系统反应中，树突细胞根据来源于不同抗原的信号刺激初始T细胞向不同的效应T细胞分化和增值，进而介导不同的免疫反应。图6横轴为树突状细胞和T细胞混合比（DC:T）,纵轴为T细胞增值指数。信筒子醌（Embelin）抑制树突细胞刺激的异体T细胞增殖反应（CFSE法），T细胞数目减少会抑制T细胞介导的相关疾病；它可以治疗多发性硬化症等T细胞介导的自身免疫性疾病；

1.7 信筒子醌抑制成熟DC产生促进辅助T细胞Th1和Th17细胞分化的细胞因子

为了研究不同浓度的信筒子醌（Embelin）对成熟DC产生细胞因子的影响，我们在DC分化到第6天时，加入不同浓度（0,10，30，60 μM/L）的Embelin预处理3h，然后用100ng/ml的LPS（脂多糖）刺激其成熟，分别于LPS加入的0h、1h、2h、4h、8h、16h收集细胞，荧光定量PCR检测IL-12p35、IL-12/23p40、IL-23p19、IL-6、TNF-α、IFN-γ基因的表达。

在免疫系统反应中，树突细胞根据来源于不同抗原的信号刺激初始T细胞向不同的效应T细胞分化和增值，进而介导不同的免疫反应。图7结果说明30 μM/L信筒子醌可以抑制树突状细胞产生促进辅助T细胞Th1细胞分化的细胞因子IL-12p35和IFN-γ表达，同时抑制促进Th17细胞分化的细胞因子IL-12/23p40和IL-6以及炎症因子TNF-α的表达。而Th17细胞可介导自身免疫疾病和炎症。实验性自身免疫脑脊髓炎也是Th1和Th17细胞介导的疾病。此结果证明信筒子醌可治疗T细胞介导的自身免疫性和炎症性疾病。

1.8 EAE小鼠模型的构建方法

小鼠EAE的诱导参考Stromnes 等方法和临床评分标准 （Stromnes IM， et al. Nature Protocols,2006,1(4):1810-19）。应用MOG35-55多肽片段： MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK作为免疫抗原诱导野生型小鼠EAE发生。

小鼠EAE动物模型神经功能评分具体标准如下：0分，无明显异常；0.5分，部分尾巴无力松弛；1分，完全尾巴瘫痪；2分，后肢无力, 行动迟缓，轻度共济失调；2.5分，一条后肢瘫痪；3分，两条后肢瘫痪；3.5分，后肢瘫痪,前肢无力；4分，前肢瘫痪；5分，濒临死亡。小鼠在 9-14天时发生EAE，每天检查并记录疾病临床神经功能分级。

实验方法：8-10周大的性别、年龄和体重相同的雌性C57BL/6 野生型小鼠用来分组诱导EAE，每组n=8只小鼠。100μgMOG35-55多肽和500μg灭活的分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，结核杆菌，购自Difco公司）与100μl生理盐水和100μl Freund’s佐剂（购自SIGMA公司）完全混合，乳化，小鼠后背皮下分四个点注射（50 μl/点）。同时在当天和免疫48小时后每只小鼠分别腹腔注射200ng百日咳毒素（pertussis toxin，购自List Biological Laboratories）。给药组从第7天开始每天每公斤体重喂食20、50mg的Embelin。9-14 天后小鼠开始发生EAE。每天检查记录疾病临床神经功能分级。

结果：实验性自身免疫脑脊髓炎是人多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等脑脊髓炎症性疾病的疾病动物模型，也是研究自身免疫性和炎症性疾病的典型动物模型。本发明每天每公斤体重喂食20、50mg的Embelin可以显著抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎的发病程度（图8、9），抑制小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎发病的最高分和临床评分总和（图10、11），对小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎具有明显的治疗作用。综合上述结果，说明信筒子醌可以抑制免疫系统激活，可以治疗自身免疫性炎症性疾病，特别是多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎等神经系统炎症性疾病。

 

参考文献

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Claims (5)

1. 信筒子醌在制备作为治疗自身免疫性疾病、神经系统炎症性疾病药物方面的应用。

2.信筒子醌在制备治疗器官移植抑制免疫排斥药物中的应用。

3.权利要求1所述的应用，其中所述的自身免疫性疾病指的是：免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫性疾病。

4.权利要求3所述的应用，其中免疫树突状细胞或T细胞相关的自身免疫疾病指的是：多发性硬化症、自身免疫性视网膜炎、视神经脊髓炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、溶血性贫血、萎缩性睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变、侵袭性慢性肝炎、慢性肾小球炎、溃伤性结肠炎、皮炎、肌炎、系统性硬化症。

5.权利要求1所述的应用，其中神经系统炎症性疾病指的是多发性硬化症、视神经脊髓炎和急性播散性脑脊髓炎。

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