WO2012030057A2 - 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법 - Google Patents

자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법 Download PDF

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    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for culturing self-activated lymphocytes and a method of culturing self-activated lymphocytes using the same, and more particularly, to interleukin 2 (IL-2) and interleukin 12 (IL-12) in a medium.
  • interleukin 2 IL-2
  • IL-12 interleukin 12
  • anti-CD3 and anti-CD16 antibodies are added together to efficiently amplify and activate Natural Killer (NK) cells, T cells, and NKT cells, and at the same time, the relative proportion of NK cells in lymphocyte cells.
  • the present invention relates to a medium composition for culturing self-activated lymphocytes and a method for culturing self-activated lymphocytes using the same, which are capable of culturing immune cells having excellent efficacy in treating various types of malignancies by dramatically increasing the amount of cellulose.
  • adoptive immunotherapy which can replace conventional surgery, radiation therapy, and chemotherapy, has attracted attention.
  • Quantum immunotherapy involves the extraction of immune cells, which are most important for cancer treatment, from natural killer cells (NK cells), dendritic cells (DCs), B cells, and T cells.
  • NK cells natural killer cells
  • DCs dendritic cells
  • B cells B cells
  • T cells T cells
  • NK cells are a kind of lymphocytes. They are excellent in killing infected viruses and tumor cells, and most normal cells do not kill.
  • NK cells are known to play an important role in early biodefense mechanisms and tumor immunity of the human body.
  • NK cells can kill specific magnetic cells, allogeneic cells, or even heterologous cancer cells without the immunization process according to the expression of the major histocompatibility complex (MHC), and in particular, express or less express Class1 MHC. Do not kill target cells better.
  • MHC major histocompatibility complex
  • NK cells can effectively kill most cancer cells that do not express MHC, as well as kill some virus-infected cells and bacteria such as salmonella typhi.
  • NK cells which have an excellent effect on killing cancer cells, occupy only 5 to 15% of peripheral blood lymphocytes even in normal humans, and especially in cancer patients, the ratio decreases to less than 1%. There is a limit to effectively attack cancer cells without a separate amplification process through.
  • CD4 T cell activation method Such conventional immune cell culture medium has been disclosed in Korean Patent No. 0735081 (name of the invention: CD4 T cell activation method).
  • CD4 T cells are isolated from biological samples such as blood, and the isolated CD4 T cells are cytokine containing GM-CSF, IFN-gamma, TNF-alpha, Lectin, and IL-4.
  • a composition for preventing or treating bacterial infectious diseases can be obtained.
  • the medium composition used in the CD4 T cell activation method selectively activates only T cells involved in acquired immunity among immune cells, when applied to tumor treatment, T cells activated in large quantities for cancer cells memorized beforehand Effective attack and killing through cells is possible, but there is a problem in that there is a limit in treating malignant tumors by attacking various kinds of cancer cells which are not remembered.
  • Korean Patent Publication No. 2008-0053929 name of the invention: self-activating lymphocyte culture method filed by the present applicant in order to solve this problem, lymphocytes isolated from human peripheral blood interleukin 2 (IL-2) And cultured in the presence of anti-CD3, anti-CD16 and anti-CD56 antibodies to increase the proportion of NK cells in lymphocyte cells, thereby activating the NK cells, T cells and NKT cells evenly to effectively remove various types of cancer cells. It is disclosed how to.
  • IL-2 human peripheral blood interleukin 2
  • FIG. 1 and 2 are graphs showing the phenotypic changes of activated lymphocytes obtained through the self-activating lymphocyte culture method, wherein the H1 region is NK cells, the H4 region is T cells, the H2 region is NKT cells, and the H3 region is a cell of other immune cells. The distribution is shown.
  • the expansion of the NK cell weight and the increase in the titer thereof through the activation of immune cells can increase the killing ability against cancer cells, thereby improving the effective anticancer effect.
  • the medium composition for culturing lymphocytes and the method of culturing activated lymphocytes using the same are constantly being studied.
  • anti-CD3 and anti-CD16 antibodies are added together with interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), and interleukin 18 (IL-18) in a medium.
  • IL-2 interleukin 2
  • IL-12 interleukin 12
  • IL-18 interleukin 18
  • Amplifying and activating NK cells, T cells, and NKT cells efficiently, and dramatically increasing the relative proportion of NK cells in lymphocyte cells, thereby cultivating immune cells that are effective in treating various types of malignancies. It is an object of the present invention to provide a medium composition for activating lymphocyte culture and a method for culturing self-activated lymphocyte using the same.
  • a medium composition for culturing self-activated lymphocytes according to the present invention is composed of a cell culture medium and an additive added to the cell culture medium, and the medium composition for mass culturing self-activated lymphocytes, wherein the additive is Interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), interleukin 18 (IL-18), and anti-CD3 and anti-CD16 antibodies.
  • IL-2 Interleukin 2
  • IL-12 interleukin 12
  • IL-18 interleukin 18
  • anti-CD3 and anti-CD16 antibodies anti-CD3 and anti-CD16 antibodies.
  • Self-activating lymphocyte culture method comprises the steps of extracting lymphocytes from human peripheral blood;
  • the extracted lymphocytes were interleukin 12 (IL-12), interleukin 18 (IL-18), and antileukin in culture medium to which interleukin 2 (IL-2), L-glutamine, and autologous plasma were added.
  • the medium composition for self-activating lymphocyte culture and the method for culturing self-activated lymphocytes using the same according to the present invention efficiently amplify and activate NK cells, T cells, and NKT cells, and at the same time, the relative proportion of NK cells in the lymphocyte cells is better.
  • the prognosis of cancer patients suffering from various types of malignant tumors by increasing the number of cancer cells that do not express MHC through mass activated NK cells can be applied to quantum immunotherapy with less side effects and less administration. The effect is to maximize the improvement.
  • FIG. 1 is a graph showing a phenotypic change of activated lymphocytes obtained through a culture method according to the prior art.
  • Figure 2 is a graph showing the phenotype change of activated lymphocytes obtained through the culture method according to the prior art.
  • Figure 3 is a graph showing the phenotype change of activated lymphocytes obtained through the self-activating lymphocyte culture method according to the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the phenotype change of activated lymphocytes obtained through the self-activating lymphocyte culture method according to the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing a comparison of the change in NK cell number obtained through the self-activated lymphocyte culture method according to the present invention and the change in NK cell number obtained through the self-activated lymphocyte culture method according to the prior art.
  • Figure 6 is a graph showing the result of comparing the results of titer analysis for activated lymphocytes cultured through the self-activated lymphocyte culture method according to the present invention and the activated lymphocytes cultured through the conventional method for activating lymphocyte culture method.
  • interleukin 12 IL-12
  • interleukin 18 IL-
  • Anti-CD3 and anti-CD16 antibodies are used as additives to efficiently amplify and activate NK cells, T cells, and NKT cells, while increasing the relative proportion of NK cells, thereby increasing self-activating lymphocytes excellent for treating malignancies. How to create.
  • NK cells are a type of lymphocyte that is characterized by large granular lymphocytes (LGL), and its antitumor activity occurs in necrosis, apoptosis, or both mechanisms. It is done by NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, Interferon, and the like, thereby raising cytotoxicity, secretory, and proliferative functions.
  • Phenotypes of NK cells are CD16 (Fc ⁇ RIII) and CD56 in humans. CD16 and CD56 do not have a T-cell receptor complex (TRC) on the cell surface and are used as markers for NK cells.
  • TRC T-cell receptor complex
  • IL-2 is a glycoprotein with a molecular weight of 14 to 17 kDa, which is produced when T cells recognize and activate an antigen, secreted out of T cells, and then reacted with the T cells that produced IL-2 itself. Promotes cell growth. IL-2 also acts on NK cells to promote growth, enhances NK cell killing capacity, and acts on B cells to promote their growth.
  • IL-12 is produced by dendritic cells (DCs), macrophages and B cells.
  • DCs dendritic cells
  • IL-12 induces the production of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in NK cells and T lymphocytes, and reduces the production of IL-4 that inhibits IFN- ⁇ . It also increases the cytotoxicity of NK cells and CD8 + cytotoxic T lymphocytes.
  • IL-12 is closely related to IL-2 signaling in NK cells.
  • IL-2 induces expression of IL-12 receptor ⁇ 1 and IL-12 receptor ⁇ 2 in NK cells to express and activate proteins related to IL-12 signaling system. This mechanism is well demonstrated in the ability of NK cells to produce IFN- ⁇ and target cell killing.
  • the IL-12 receptor ⁇ 2 appears to play an important role in IL-12 function, which has been reported to inhibit the development of Th2 and to advance the development of Th1.
  • IL-12 signaling in T cells and NK cells is involved in the JAK-STAT signaling system, and the activity of IL-12 receptor ⁇ 2 plays an important role in inducing and activating phosphorylation of the transcription factor STAT4.
  • IL-18 is produced from macrophages and is a proinflamatory cytokine gene. IL-18 binds to the IL-18 receptor and, together with IL-12, produces an immune response to bacteria or virus-infected cells and increases the production of IFN- ⁇ in NK and T cells.
  • IL-12 is added to the culture medium to induce the expression of INF- ⁇ , and NK cells are activated by inducing the expression of the receptor IL-18 which is an essential factor for the production of INF- ⁇ .
  • NK cells express CD16, a receptor for Fc of immunoglobulin G (IgG), through which other forms of MHC non-limiting killing can be performed.
  • the ADCC of NK cells depends on the presence of an antibody that recognizes the target cell.
  • the Fc region of the antibody is exposed, and when the exposed Fc region binds to the receptor of the NK cell to form a bridge, Signaling caused by receptor binding releases cytotoxic substances from NK cells, causing target cells to be injured.
  • CD16 antigen When lymphocytes are cultured in the presence of an anti-CD16 antibody or an antigen-antibody complex, CD16 antigen is added to NK cells and signal transduction occurs. Expression or tumor necrosis factor (TNF) or IFN- ⁇ can be produced.
  • TNF tumor necrosis factor
  • a T cell refers to a cell having an T cell receptor (TCR) on its cell surface.
  • TCR forms a heterodimer with the CD3 antigen of the di- and ⁇ -chain dimers. Some of the T cells (around 5% of peripheral blood T cells) are dimers of ⁇ and ⁇ chains, not ⁇ .
  • TCR forms a complex with the CD3 antigen ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ or ⁇ ), which plays a role in delivering the signal into the cell when TCR recognizes the antigen.
  • helper T cells that promote an immune response to cancer cells release various cytokines to activate killer T cells, B cells, macrophages, and NK cells.
  • the types of cytokines transfer information between cells.
  • There are various substances such as IL-1, IL-2, IL-3, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ .
  • a high concentration of IL-2 is added to the culture medium to activate immune cells such as T cells, NK cells, and NKT cells.
  • NKT cells are a type of T cell whose function is being revealed relatively recently as an attendant of endogenous immunity. As the name suggests, it expresses T-cell receptors and NK cell-specific surface markers.
  • One surprising feature of NKT cells is the rapid release of several cytokines such as IL-4, IL-10, IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ after activation. This feature suggests that NKT cells can have a significant effect on the adaptive immune response.
  • T cells and NKT cells from lymphocytes of human peripheral blood IL-2, IL-12 and IL-18 cytokines, and anti-CD3 and anti-CD16 monoantibodies in culture was used as a medium additive, IL-2, IL-12 and IL-18 in the addition of T cells and NK cells, and each single antibody plays the role of antigens that express CD3, CD16 in immune cells .
  • Self-activating lymphocyte culture process is largely composed of lymphocyte extraction step, the first culture step, the second culture step and the third culture step.
  • the first medium composition is used in the first culture step, and consists of a medium for cell culture and various additives added to the cell culture medium, based on 39 ml of cell culture medium, for immune cell culture. 17 ⁇ 10 6 to 19 ⁇ 10 6 for activation of immune cells, with 350 to 430 ⁇ l of L-glutamine and 2 to 5 mL of autologous plasma of 190-210 mM L-glutamine 3-10 ⁇ l of IU / ml IL-2, 3-10 ⁇ l of 90-12 g / ml IL-12 and 10-30 ⁇ l of 90-110 ⁇ g / ml IL-18, and finally cultured immune cells (NK Cells, NKT cells, T cells) by adding 2 ⁇ 30ul of 0.9 ⁇ 1.1mg / ml anti-CD3 and anti-CD16 antibody to control the relative composition ratio of each.
  • 3 to 4 Medium cultured with lymphocytes daily may be incorporated into a second medium composition having the following composition to further culture for 1-2 days.
  • the second medium composition is used for subculture, and 190-210 mM L-glutamine (L-) acts as a nutrient for immune cell culture based on the cell culture medium based on 67 ml of the cell culture medium.
  • L- L-glutamine
  • glutamine 650 to 740 ⁇ l and 2 to 5 ml of autologous plasma, 17 ⁇ 10 6 to 19 ⁇ 10 6 IU / ml IL-2 3.5 to 7.8 ⁇ l
  • Cell culture medium used in the first and second medium composition is 800 to 1200 IU (International Unit) / in a conventional medium containing nutrients essential for the growth and survival of cells, such as amino acids, vitamins, organic-inorganic compounds, proteins, etc.
  • a medium containing ml of IL-2 NKB6040 (NKBIO, KOREA) is mentioned as an example.
  • the self-activating lymphocyte culture process consists of a lymphocyte extraction step, a first culture step, a second culture step and a third culture step.
  • mononuclear cells such as human lymphocytes or monocytes, having a specific gravity lower than 1.077
  • the blood of the patient to be treated is superimposed on 1.077 specific gravity Ficoll-Paque Plus solution and centrifugally precipitated at a constant centrifugal force.
  • the red blood cells and granulocyte layers larger than 1.077 are separated, and the mononuclear cell layer and platelets, which are 1.077 or less, are separated upward to obtain a mononuclear cell layer containing lymphocytes, and only lymphocytes are extracted from the separated mononuclear cell layers.
  • Lymphocytes harvested through the lymphocyte extraction step were prepared in the presence of IL-12, IL-18, anti-CD3 and anti-CD16 antibodies in culture medium to which IL-2, L-glutamine, and autologous plasma were added. Incubate for 3-4 days.
  • lymphocytes are first cultured in the presence of anti-CD3 antibody in a culture medium to which IL-2, L-glutamine and autologous plasma are added, followed by the presence of IL-12 and anti-CD16 antibody and IL-18. It is preferable to sequentially culture in the environment, the specific process is as follows.
  • the harvested lymphocytes were suspended in 5 ml of culture medium, and then 2-10 ⁇ l of diluent containing 17 ⁇ 10 6 to 19 ⁇ 10 6 IU / ml of IL-2, and 190-210 mM L-glutamine (L -glutamine) was incorporated into a 25 cm 2 first culture vessel in which an anti-CD3 antibody containing 29 to 32 ml of a culture medium containing 350 to 430 ⁇ l and 2 to 5 ml of autologous plasma was added. Incubate for 30 minutes to 2 hours in 2 incubators.
  • lymphocytes are first suspended in a small amount of the culture medium, and then mixed with the culture medium to which IL-2, L-glutamine and autologous plasma are added, thereby reducing the loss of lymphocyte cells and adding a small amount of IL-2, Loss of L-glutamine and autologous plasma can be prevented.
  • lymphocytes are cultured in a state in which a monoclonal anti-CD3 antibody is solidified in a culture vessel, which induces the expression and secretion of factors that proliferate NK cells by inducing T cell activity at the beginning of culture by the anti-CD3 antibody.
  • a monoclonal anti-CD3 antibody is solidified in a culture vessel, which induces the expression and secretion of factors that proliferate NK cells by inducing T cell activity at the beginning of culture by the anti-CD3 antibody.
  • culturing for an appropriate time is very important for raising the proportion of NK cells.
  • the culture mixture in the first culture vessel in which the anti-CD3 antibody was solidified was transferred to a second culture vessel in 25 cm 2 in which the anti-CD3 antibody was solidified, and 3 to 10 ⁇ l of 90-12 to 110 ⁇ g / ml IL-12 and 0.9 to 1.1.
  • 2-30 ⁇ l of the anti-CD16 antibody of mg / ml was added and incubated for 1 hour to 3 hours in a 37 ° C. CO 2 incubator, followed by 10-30 ⁇ l of 90-18 to 110 ⁇ g / ml of IL-18. It is added to a second culture vessel of 25 cm 2 and incubated for 48 to 78 hours. In this case, 2 to 30 ⁇ l of 0.9 to 1.1 mg / ml of anti-CD3 antibody is solidified in the first culture vessel and the second culture vessel.
  • IL-12 and anti-CD16 antibody are added to the second culture vessel at the same time, which increases the activity of transcription factor and increases the expression of INF- ⁇ than the IL-12 and anti-CD16 antibody. Induction can promote the proliferation and activity of NK cells.
  • IL-18 is an essential factor for the production of INF- ⁇ , and since IL-12 receptor expression is induced by IL-12, it is preferably added to the second culture vessel after IL-12 addition.
  • the culture mixture prepared in the first culture step is mixed with a culture medium to which IL-2, L-glutamine, and autologous plasma are added, and then cultured in the presence of IL-12 and anti-CD16 antibody, and then IL-18 is added thereto.
  • the specific process is as follows.
  • various culture mediums containing nutrients essential for cell growth and survival such as amino acids, vitamins, organic-inorganic compounds, and proteins, may be used as in the previous two steps. It is preferable to contain 200 IU / ml.
  • the number of NK cells, T cells and NKT cells increases in a large amount and the size of each cell also increases. in that finally the total number of cells that was 2.0x10 6 ⁇ 4.0x10 7 it was found that it increased to 1.0x10 9 ⁇ 3.0x10 9.
  • Lymphocytes 1 ⁇ 10 7 cells obtained from 60 cc of peripheral blood of the patient were suspended in 1 ml of culture medium, and then incorporated into 9 ml of culture medium containing IL-2, L-glutamine and autologous plasma.
  • a first culture step of 4 days culture in the presence of IL-18, anti-CD3 and anti-CD16 antibodies was performed.
  • the first culture step based on the culture medium of 39ml, 400 ⁇ l of 200mM L-glutamine and 4ml of autologous plasma, which acts as a nutrient for immune cell culture, and 18 ⁇ for activation of immune cells. 1 mg to control the relative composition of the final cultured immune cells with 4 ⁇ l of 10 6 IU / ml IL-2, 4 ⁇ l of 100 ⁇ g / ml IL-12 and 20 ⁇ l of 100 ⁇ g / ml IL-18 A culture medium in which 2.5 ⁇ l of anti-CD3 and anti-CD16 antibody was added was added.
  • the culture mixture obtained through the first culture step was incorporated into 30 ml of the culture solution containing IL-2, L-glutamine and autologous plasma, and added for 2 days in the presence of IL-12, IL-18 and anti-CD16 antibodies.
  • a second culture step of culturing was performed.
  • the second culture step based on 67 ml of the culture medium, 670 ⁇ l and 5 ml of autologous plasma of 200 mM L-glutamine, which acts as a nutrient for immune cell culture, and 18 ⁇ for activation of immune cells. 1 mg to control the relative composition of the final cultured immune cells with 6.5 ⁇ l of 10 6 IU / ml IL-2, 8 ⁇ l of 100 ⁇ g / ml IL-12 and 40 ⁇ l of 100 ⁇ g / ml IL-18 A culture solution with 5 ⁇ l / mL of antiCD16 antibody was used.
  • 3 and 4 are graphs showing phenotypic changes of lymphocytes before and after culture, where the H1 region shows NK cells, the H4 region shows T cells, the H2 region shows NKT cells, and the H3 region shows the distribution of other immune cells. It is a graph showing the change of NK cell number obtained through the self-activated lymphocyte culture method according to the present invention and the change of NK cell number obtained through the self-activated lymphocyte culture method according to the prior art.
  • the activated lymphocytes cultured by the present invention are extracted from human peripheral blood by the ratio of NK cells due to the action of additives such as IL-12 and IL-18 added to promote the activation of NK cells.
  • Ratio of NK cells in activated lymphocytes cultured by the applicant's conventional culture method (Korean Patent Laid-Open No. 2008-0053929), wherein the lymphocytes were cultured in the presence of IL-2 and anti-CD3, anti-CD16 and anti-CD56 antibodies.
  • the percentage of NK cells in the activated lymphocytes was increased by about 20 to 30%, and the increase in the percentage of such NK cells was shown to express a more improved therapeutic effect through the titer analysis described below. It can be confirmed that the direct connection.
  • FIG. 6 is a graph showing a result of comparing the results of titer analysis for activated lymphocytes cultured through the self-activated lymphocyte culture method according to the present invention and the results of titer analysis for activated lymphocytes cultured through the conventional method. .
  • activated lymphocytes cultured by the method of Example 1 are used as effector cells, and blood cancer cell line K562 is used as target cells, and the ratio of activated lymphocytes to cancer cells is 10. Titer analysis was performed to determine the killing capacity of activated lymphocytes against hematologic cancer cell lines by setting to 1: 1.
  • titer analysis was performed using activated lymphocytes cultured by the applicant's conventional culture method as effector cells under the same conditions as the above titer assay, and the results of each titer analysis are shown in FIG. 6.
  • the average titer of activated lymphocytes cultured by the conventional culture method is 47%, whereas the average titer of activated lymphocytes cultured by the present invention is 93%, the activated lymphocytes cultured by the present invention It can be seen that the cancer cell killing ability showed about 2 times more than the activated lymphocytes cultured by the conventional culture method.
  • the lymphocytes before the culture applied in this Example has a titer of 5% or less on average, it can be seen that the improvement in the titer of activated lymphocytes cultured by the present invention is at least 20 times higher than before the culture.
  • the medium composition for self-activating lymphocyte culture and the method for culturing self-activated lymphocytes using the same according to the present invention efficiently amplify and activate NK cells, T cells, and NKT cells, and at the same time, the relative proportion of NK cells in the lymphocyte cells is better.
  • the prognosis of cancer patients suffering from various types of malignant tumors by increasing the number of cancer cells that do not express MHC through mass activated NK cells can be applied to quantum immunotherapy with less side effects and less administration. Can be used to maximize improvement.

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Abstract

본 발명은 악성종양 치료에 적용되는 자기활성화 림프구 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 배지 내에 인터루킨2(IL-2), 인터루킨12(IL-12) 및 인터루킨18(IL-18) 외에 항CD3 및 항CD16 항체가 함께 첨가되어 NK(Natural Killer) 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 비약적으로 증가시킴으로써 다양한 종류의 악성종양 치료에 효능이 뛰어난 면역세포를 배양할 수 있는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법은, 인간의 말초혈액으로부터 림프구를 추출하는 단계와; 상기 추출된 림프구를 인터루킨2(IL-2), L-글루타민(L-glutamine) 및 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 인터루킨12(IL-12), 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체의 존재하에 배양하는 제1배양단계; 및 상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양혼합액을 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 혼입하여 IL-12, 항 CD16 항체 및 IL-18의 존재하에 배양하는 제2배양단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.

Description

자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법
본 발명은 악성종양 치료에 적용되는 자기활성화 림프구 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 배지 내에 인터루킨2(IL-2), 인터루킨12(IL-12) 및 인터루킨18(IL-18) 외에 항CD3 및 항CD16 항체가 함께 첨가되어 NK(Natural Killer) 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 비약적으로 증가시킴으로써 다양한 종류의 악성종양 치료에 효능이 뛰어난 면역세포를 배양할 수 있는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법에 관한 것이다.
최근 암 치료에 있어서 기존의 수술이나 방사선 요법, 화학요법을 대체할 수 있는 양자면역요법(adoptive immunotherapy)이라는 새로운 암 치료요법이 주목받고 있다.
양자면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
양자면역요법에서 활성화시키는 면역세포 중에서 특히 NK 세포는 림프구의 일종으로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있다. 이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요 조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다.
그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이 1 % 미만으로 저하되기 때문에, 양자면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
따라서, 암치료를 위한 양자면역요법을 적용하기 위해서는 NK 세포를 비롯한 면역세포들을 환자의 암 진행 상태에 맞게 대량 배양하여 활성화시키기 위한 배지에 대한 연구가 필수적으로 요구되는데, 종래의 양자면역요법에 적용되는 면역세포 배양을 위한 배지들은 주로 면역세포 중 T 세포를 대량 증폭하는 데에 초점이 맞춰져 있다.
이러한 종래의 면역세포 배양용 배지가 한국등록특허 제0735081호(발명의 명칭: CD4 T 세포 활성화 방법)에 개시된 바 있다. 상기 CD4 T 세포 활성화 방법에서는, 혈액 등의 생물학적 시료로부터 CD4 T 세포를 분리하고, 분리된 CD4 T 세포를 GM-CSF, IFN-gamma, TNF-alpha, Lectin 및 IL-4을 포함하는 사이토카인을 첨가한 배지에서 배양하여 시험관내에서 CD4 T 세포를 활성화시킴으로써, 박테리아 감염 질환을 예방 또는 치료하는 조성물을 획득할 수 있다.
그러나, 상기 CD4 T 세포 활성화 방법에서 사용되는 배지 조성물은 면역세포 중 획득 면역에 관여하는 T 세포만을 선별적으로 활성화시키기 때문에, 이를 종양 치료에 적용하였을 경우 미리 기억된 암세포에 대해서는 대량으로 활성화된 T 세포를 통한 효과적인 공격 및 살상이 가능하나, 기억되지 않은 다양한 종류의 암세포를 공격하여 악성종양을 치료하는 데에는 한계를 가지고 있다는 문제점이 있다.
한편, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 출원인에 의해 선출원된 한국공개특허 제2008-0053929호(발명의 명칭 : 자기활성화 림프구 배양방법)에는 인간의 말초혈액에서 분리한 림프구를 인터루킨2(IL-2)와, 항CD3, 항CD16 및 항CD56 항체의 존재하에 배양하여 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 비율을 상승시켜, NK 세포, T 세포 및 NKT 세포가 고르게 활성화시킴으로써 다양한 종류의 암세포를 효과적으로 제거할 수 있도록 하는 방법에 대하여 개시되어 있다.
도 1 및 도 2는 상기 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 활성화 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프로서, H1 영역은 NK 세포, H4 영역은 T 세포, H2 영역은 NKT 세포, H3 영역은 기타 면역 세포의 분포를 나타내고 있다.
상기 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 배양된 활성화 림프구를 유세포 분석기(flowcytometry)를 이용하여 표면 항원을 분석한 결과를 살펴보면, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 배양 전에는 도 1의 그래프에서와 같이 표면 항원 분포가 H4 영역에 가장 많이 분포되어 있는 반면, 배양 후에는 도 2의 그래프에서와 같이 H1 영역에 가장 많이 분포되어 있음을 알 수 있다. 그리고 이렇게 배양된 림프구에 포함되는 CD16+CD56 positive NK 세포의 비율은 실제 배양 전 12.74%에서 배양 후 63.42%로 변화되어 NK 세포의 비율이 상승한 것으로 파악되었다.
그리고 이렇게 배양된 활성화 림프구의 혈액암 세포주에 대한 살해능력을 측정하는 역가(cytotoxicity) 분석을 수행한 결과, 일반 혈액에서 추출된 림프구에 비하여 활성화 림프구의 역가가 6 ~ 32배 증가하는 것을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이 면역세포의 활성화를 통해 NK 세포 비중의 확대와 그에 따른 역가의 향상은 암세포에 대한 살해능력을 증가시켜 효과적인 항암 효과를 향상시킬 수 있음을 예측할 수 있다.
따라서 림프구 세포들 중 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포에 대한 살해능력이 뛰어난 NK 세포를 대량으로 증폭 및 활성화시킴과 동시에, 이러한 NK 세포의 살해능력을 더욱 향상시켜 보다 효과적인 항암작용을 구현할 수 있는 활성화 림프구를 배양하기 위한 배지 조성물과 이를 이용한 활성화 림프구 배양방법이 꾸준히 연구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 배지 내에 인터루킨2(IL-2), 인터루킨12(IL-12) 및 인터루킨18(IL-18) 외에 항CD3 및 항CD16 항체가 함께 첨가되어 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 비약적으로 증가시킴으로써 다양한 종류의 악성종양 치료에 효능이 뛰어난 면역세포를 배양할 수 있는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물은, 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제로 구성되어 자기 활성화 림프구를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서, 상기 첨가제는, 인터루킨2(IL-2), 인터루킨12(IL-12), 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법은, 인간의 말초혈액으로부터 림프구를 추출하는 단계와; 상기 추출된 림프구를 인터루킨2(IL-2), L-글루타민(L-glutamine) 및 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 인터루킨12(IL-12), 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체의 존재하에 배양하는 제1배양단계; 및 상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양혼합액을 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 혼입하여 IL-12, 항 CD16 항체 및 IL-18의 존재하에 배양하는 제2배양단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법은, NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 보다 증가시킴으로써 대량으로 활성화된 NK 세포를 통해 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포에 대한 살상을 가능하게 함으로써 부작용이 적고 투여법이 적은 양자면역요법에 적용하여 다양한 종류의 악성종양으로 고통받는 암환자들의 예후 향상을 극대화할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종래기술에 따른 배양방법을 통해 얻어지는 활성화 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프.
도 2는 종래기술에 따른 배양방법을 통해 얻어지는 활성화 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 활성화 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 활성화 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 NK 세포수의 변화와 종래기술에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 NK 세포수의 변화를 비교하여 보여주는 그래프.
도 6은 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 배양된 활성화 림프구에 대한 역가 분석 결과와 종래기술에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 배양된 활성화 림프구에 대한 역가 분석 결과를 비교하여 보여주는 그래프.
본 발명은 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 면역 세포 조성비를 가지는 자기활성화 림프구를 생성하기 위하여, 배지 내에 인터루킨12(IL-12)와, 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체를 첨가물로 사용하여 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 보다 증가시킴으로써 악성종양 치료에 뛰어난 자기활성화 림프구를 생성하는 방법이다.
본 발명에 대한 구체적인 설명에 앞서, 먼저 각 면역세포의 특징과 함께 면역세포 증폭 및 활성화에 이용되는 상기 각 첨가물들의 작용기전을 살펴보기로 한다.
NK 세포는 림프구의 일종으로 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK 세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
IL-2는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하게 된다. IL-2는 또한 NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 한다.
IL-12는 수지상세포(DC)와 매크로파지, B세포에서 생산된다. IL-12는 NK세포와 T 림프구에서 IFN-γ와 TNF-α의 생산을 유도하며, IFN-γ를 저해하는 IL-4의 생산을 감소시키는 역할을 한다. 또한 NK 세포와 CD8+ cytotoxic T 림프구의 세포독성을 증가시킨다. IL-12는 NK세포 내에 IL-2 신호전달체계와 밀접한 관계를 갖고 있다. 또한, IL-2는 NK세포 내에 IL-12 수용체 β1과 IL-12 수용체 β2의 발현을 유도하여 IL-12 신호전달체계에 관련된 단백질들을 발현시키고 활성시킨다. 이러한 기전은 NK세포의 IFN-γ 생산 능력과 타겟세포 살해능력에서 잘 증명되었다. IL-12 수용체 β2는 IL-12 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 보이는데, 이것은 Th2의 발생을 저해하는 동시에 Th1의 발생을 진행시키는 것으로 보고되었다. T세포와 NK세포에서 IL-12의 신호전달은 JAK-STAT 신호전달체계에 포함되며 IL-12 수용체 β2의 활성은 전사인자인 STAT4의 인산화를 유도하여 활성화시키는데 중요한 역할을 한다.
IL-18은 매크로파지에서 생산되며 proinflamatory 사이토카인 유전자이다. IL-18은 IL-18 수용체에 결합하여 IL-12와 함께 박테리아나 바이러스에 감염된 세포에 면역반응을 일으키며 NK세포와 T세포에서 IFN-γ의 생산을 증가시킨다. 본 발명에서는 배양액에 IL-12를 첨가하여 INF-γ의 발현을 유도하는 동시에, INF-γ의 생성에 필수적인 인자인 IL-18의 수용체 발현을 유도함으로써 NK 세포를 활성화시키게 된다.
NK 세포의 암세포 작용기전은 일반적으로 항체의존성 세포매개형 세포독성 (Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity; ADCC)이다. NK 세포는 면역글로불린G(IgG)의 Fc에 대한 수용체인 CD16을 발현하며, 이 수용체를 통하여 다른 형태의 MHC 비제한성 살해를 수행할 수가 있다. 즉, NK 세포의 ADCC는 표적 세포를 인식하는 항체의 존재에 의존하는데, 항체가 항원과 결합하면 항체의 Fc 부위가 노출되며, 노출된 Fc 부위가 NK 세포의 수용체와 결합하여 다리를 형성하면, 수용체 결합으로 인해 발생하는 신호전달에 의해 NK 세포로부터 세포상해물질이 방출되어 표적 세포가 상해를 받는다.
항CD16 항체 또는 항원항체복합체의 존재하에 림프구를 배양하게 되면 NK 세포에 CD16 항원이 첨가되어 신호전달이 일어나는데, 이들의 자극에 의해서 NK 세포에 IL-2 수용체의 α 사슬 등 트랜스페린(transferrin) 수용체가 발현하거나, 또는 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF)나 IFN-γ가 생산될 수 있게 된다.
한편, T 세포는 세포 표면에 항원 수용체(T cell receptor; TCR)를 가지는 세포를 말한다. TCR은 α사슬과 β사슬의 이합체 CD3 항원과 이형 이합체를 형성하고 있다. T세포의 일부(말초혈 T세포의 5% 전후)는 αβ가 아닌, γ사슬과 δ사슬의 이합체로 되어있다. TCR은 CD3 항원 (γ, δ, ε, ζ, ζ또는η)과 복합체를 형성하고 있는데, CD3 항원은 TCR이 항원을 인식하면 그 신호를 세포 내에 전달하는 역할을 맡는다.
일반적으로 암세포에 대한 면역반응을 촉진하는 헬퍼T세포는 다양한 사이토카인을 방출해 킬러T세포, B세포 및 매크로파지, NK세포 등을 활성화시키게 되는데, 사이토카인의 종류로는 세포와 세포 사이의 정보전달물질인 IL-1, IL-2, IL-3, TNF-α 및 IFN-γ 등 다양한 물질이 있다. 본 발명에서는 배양액에 고농도의 IL-2를 첨가하여 T세포, NK세포, NKT세포등의 면역세포를 활성화시키게 된다.
NKT 세포는 내재면역의 한 수행원으로서 비교적 근래에 그 기능들이 밝혀지고 있는 T 세포의 한 종류이다. 이름에서도 알 수 있듯이 T 세포의 수용체와 NK 세포 특이적인 세포표면마커(surface marker)를 발현하고 있다. NKT 세포의 한가지 놀라운 특징은 활성 후 IL-4, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α등과 같은 여러 사이토카인을 매우 빠른 시간 안에 분비한다는 점이다. 이러한 특징은 NKT 세포가 적응면역반응에 커다란 영향을 끼칠 수 있음을 암시한다.
따라서, 본 발명에서는 인간의 말초 혈액의 림프구로부터 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 골고루 활성화시키기 위하여, 배양시 IL-2, IL-12 및 IL-18 사이토카인과, 항CD3 및 항CD16 단일항체를 배지 첨가물로 사용하였으며, 첨가물 중에서 IL-2, IL-12 및 IL-18은 T 세포와 NK 세포의 증식에, 각 단일항체는 면역세포에 CD3, CD16을 발현시키는 항원의 역할을 수행하게 된다.
이하, 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법에 대하여 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양 과정은 크게 림프구 추출단계, 제1배양단계, 제2배양단계 및 제3배양단계로 구성된다.
먼저, 각 배양단계에서 사용되는 배지 조성물에 대하여 설명하면 다음과 같다.
제1배지 조성물
제1배지 조성물은 제1배양단계에서 사용되며, 세포 배양용 배지와, 세포 배양용 배지에 첨가되는 각종 첨가제로 구성되는데, 39 ㎖의 세포 배양용 배지를 기준으로 하였을 때, 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 190~210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 350 ~ 430 ㎕ 및 2 ~ 5 ㎖의 자가 유래 혈장(plasma)과 함께, 면역세포의 활성화를 위한 17×106~19×106 IU/㎖의 IL-2 3 ~ 10㎕, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 3 ~ 10㎕ 및 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 10 ~ 30㎕와, 최종 배양된 면역세포(NK 세포, NKT 세포, T 세포)의 상대적인 조성비를 조절하기 위한 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD3 및 항CD16 항체를 각각 2 ~ 30㎕씩 첨가하여 이루어진다.
이와 같은 배지 조성물을 이용하여 림프구를 배양하는 과정에서, 배양 효율을 높이기 위해 계대배양 방식을 적용하는 것이 바람직한데, 먼저 위와 같은 조성의 배지 조성물을 이용하여 3~4일간 배양한 후, 3~4일간 림프구가 배양된 배지 조성물을 다음과 같은 조성의 제2배지 조성물에 혼입하여 1~2일 추가적으로 배양하는 것이 좋다.
제2배지 조성물
제2배지 조성물은 계대배양을 위해 사용되며, 세포 배양용 배지에, 67 ㎖의 세포 배양용 배지를 기준으로 하였을 때, 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 190~210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 650 ~ 740 ㎕ 및 2~5 ㎖의 자가 유래 혈장(plasma)과 함께, 면역세포의 활성화를 위한 17×106~19×106 IU/㎖의 IL-2 3.5 ~ 7.8㎕, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 2 ~ 10㎕ 및 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 20 ~ 50㎕와, 최종 배양된 면역세포(NK 세포, NKT 세포, T 세포)의 상대적인 조성비를 조절하기 위한 0.9~1.1㎎/㎖의 항CD16 항체를 4 ~ 80㎕ 첨가하여 이루어진다.
상기 제1 및 제2배지 조성물에 사용된 세포 배양용 배지는 아미노산, 비타민, 유무기 화합물, 단백질 등 세포의 성장과 생존에 필수적인 영양소를 함유한 통상적인 배지에 800 내지 1200 IU(International Unit)/㎖의 IL-2가 함유되어 있는 배지로서, 그 예로 NKB6040(NKBIO, KOREA)을 들 수 있다.
이하에서는 상술한 배지 조성물을 이용하여 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양 방법을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양 과정은 크게 림프구 추출 단계, 제1배양단계, 제2배양단계 및 제3배양단계로 구성된다.
림프구 추출 단계
인간의 림프구 또는 단핵구 등의 단핵세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 치료 대상 환자의 혈액을 1.077 비중의 Ficoll-Paque Plus용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시킴으로써, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 단핵세포층을 얻고, 분리된 단핵세포층으로부터 림프구만을 추출한다.
제1배양단계
상기 림프구 추출 단계를 통해 수확한 림프구를 IL-2, L-글루타민(L-glutamine), 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 IL-12, IL-18, 항CD3 및항CD16 항체의 존재하에 3~4일간 배양한다. 여기서, 림프구를 IL-2, L-글루타민(L-glutamine) 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에서 항CD3 항체의 존재 하에 먼저 배양시키고, 이후 IL-12와 항CD16 항체 및 IL-18이 존재하는 환경에서 순차적으로 배양시키는 것이 바람직한데, 그 구체적인 과정은 다음과 같다.
먼저, 수확한 림프구를 5㎖의 배양액에 현탁한 후, 17×106~19×106 IU/㎖의 IL-2가 포함된 희석액 2 ~ 10㎕과, 190~210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 350 ~ 430 ㎕ 및 2 ~ 5 ㎖의 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액 29 ~ 32㎖이 담겨있는 항CD3 항체가 고형화된 25㎠의 제1배양용기에 혼입하고, 37℃ CO2 배양기에서 30분 내지 2시간 배양한다. 이와 같이, 먼저 소량의 배양액에 림프구를 현탁한 이후, IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 혼입시켜 배양함으로써, 림프구 세포의 손실을 줄이는 동시에, 소량 첨가되는 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장의 손실을 방지할 수 있다.
여기에서 단일항체인 항CD3 항체를 배양용기에 고형화시킨 상태로 림프구를 배양하는데, 이는 항CD3 항체에 의하여 배양 초기에 T 세포의 활성을 유도하여 NK 세포를 증식시키는 인자들의 발현 및 분비를 유도하기 위함이다. 이때, 항CD3 항체의 존재하에 지나치게 긴 시간 동안 배양하게 되면, 대부분의 세포 분포가 T 세포로 증식하는 경향이 있으므로 적절한 시간 동안 배양하는 것이 NK 세포의 비율을 상승시키는데 매우 중요하다.
다음, 항CD3 항체가 고형화된 제1배양용기 내의 배양혼합액을 항CD3 항체가 고형화된 25㎠의 제2배양용기로 옮기고, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 3 ~ 10㎕와 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD16 항체 2 ~ 30㎕를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 1시간 내지 3시간 배양하고, 이어서 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 10 ~ 30㎕을 항CD3 항체가 고형화된 25㎠의 제2배양용기에 첨가하고 48 내지 78시간 배양한다. 이때 제1배양용기 및 제2배양용기에는 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD3 항체 2 ~ 30㎕가 고형화되어 있다.
여기에서는 IL-12와 항CD16 항체를 제2배양용기에 동시에 첨가하고 있는데, 이는 IL-12와 항CD16 항체를 개별적으로 첨가하는 경우보다, 전사인자의 활성을 더욱 증가시켜 INF-γ의 발현을 유도하여 NK 세포의 증식과 활성을 촉진시킬 수 있다. 또한, IL-18은 INF-γ의 생성에 필수적인 인자로서, IL-12에 의해 IL-18 수용체의 발현이 유도되기 때문에 IL-12 첨가 후 제2배양용기에 첨가되는 것이 바람직하다.
이후, IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 5㎖의 배양액을 추가하여 12 내지 18시간 배양한 다음, 또 75㎠의 제3배양용기로 옮기고 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 30㎖의 배양액을 추가하여 2 내지 3일간 배양한다.
제2 배양 단계
상기 제1배양단계에서 배양 완료된 배양혼합액을 IL-2, L-글루타민, 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 혼입하여 IL-12와 항CD16 항체의 존재하에 먼저 배양시키고, 이후 IL-18을 첨가하여 배양시키는데, 그 구체적인 과정은 다음과 같다.
먼저, 17×106~19×106 IU/㎖의 IL-2가 포함된 희석액 3.5 ~ 7.8㎕과, 190~210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 650 ~ 740 ㎕ 및 2 ~ 5㎖의 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액 2 ~ 7㎖가 담겨있는 150㎠의 제4배양용기에 전술한 제1배양단계를 거친 배양혼합액을 옮기고, 제4배양용기에 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액을 20㎖ 추가하는 동시에, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 2 ~ 10㎕와 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD16 항체 2 ~ 40㎕를 첨가하여 1 내지 3시간 배양한다. 이 단계에서도 상술한 제1배양단계와 마찬가지로 IL-12와 항CD16 항체를 동시에 첨가함으로써 전사인자의 활성을 더욱 증가시켜 INF-γ의 발현을 유도하여 NK 세포의 증식과 활성을 촉진시키고, 이후 IL-18을 추가로 첨가함으로써 IL-12에 의해 IL-18 수용체의 발현이 유도되도록 하였다.
다음, 상기 제4배양용기에 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 20 ~ 50㎕를 첨가하여 12 내지 18시간 동안 배양하고, 이후, IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액을 40㎖ 추가하면서 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD16 항체 2 ~ 40㎕를 첨가하여 12 내지 18시간 추가 배양한다.
제3 배양 단계
상기 제2 배양 단계를 거친 배양혼합액(86~119㎖)에 자가유래혈장(5~10㎖)을 첨가하고, 자가유래혈장이 새로 첨가된 배양혼합액을 1ℓ의 배양액이 수용된 가스투과성 배양백에 주입한 후, 6~9 일간 더 배양함으로써 세포를 다량으로 증식시킨다.
제3 배양 단계에서 사용되는 배양액 역시 앞의 두 단계에서와 같이 아미노산, 비타민, 유무기 화합물, 단백질 등 세포의 성장과 생존에 필수적인 영양소를 함유한 다양한 배양액이 사용될 수 있는데, IL-2를 100~200 IU/㎖ 포함하고 있는 것이 바람직하다.
이상에서와 같은 제1, 제2 및 제3 배양 단계를 거치면서 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포의 수가 대량으로 증가하며 각 세포의 크기 역시 증가하게 되는데, 실제 배양 실험 결과 60cc 혈액에서 림프구 분리시 전체 세포수가 2.0x106~4.0x107이던 것이 최종적으로 1.0x109~3.0x109까지 증가하게 됨을 알 수 있었다.
이하, 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 이용하여 자기활성화 림프구를 배양하고, 배양된 자기활성화 림프구로부터 관찰되는 림프구의 표현형 및 세포수의 변화와, 배양된 자기활성화 림프구에 대한 역가 분석 결과를 구체적인 실시예를 통해 살펴보기로 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
먼저, 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 이용하여 자기활성화 림프구를 배양하는 과정에 대하여 실시예1을 통해 살펴보기로 한다.
실시예1 : 자기 활성화 림프구 제조
환자의 말초혈액 60cc에서 수확한 림프구 1x107개의 세포수를 1㎖의 배양액에 현탁한 후, IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 9㎖의 배양액에 혼입하여, IL-12, IL-18, 항CD3 및 항CD16 항체의 존재하에 4일간 배양하는 제1배양단계를 수행하였다.
이때, 제1배양단계에서는 39㎖의 배양액을 기준으로 하였을 때, 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 200mM의 L-글루타민 400㎕ 및 4㎖의 자가 유래 혈장과, 면역세포의 활성화를 위한 18×106 IU/㎖의 IL-2 4㎕, 100㎍/㎖의 IL-12 4㎕와 100㎍/㎖의 IL-18 20㎕와 함께, 최종 배양된 면역세포의 상대적인 조성비를 조절하기 위한 1㎎/㎖의 항CD3 및 항CD16 항체가 각각 2.5㎕씩 첨가된 배양액이 사용되었다.
이어서, 제1배양단계를 통해 얻어진 배양 혼합액을 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액 30㎖에 혼입하여, IL-12, IL-18 및 항CD16 항체의 존재하에 2일간 추가 배양하는 제2배양단계를 수행하였다.
이때, 제2배양단계에서는 67㎖의 배양액을 기준으로 하였을 때, 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 200mM의 L-글루타민 670㎕ 및 5㎖의 자가 유래 혈장과, 면역세포의 활성화를 위한 18×106 IU/㎖의 IL-2 6.5㎕, 100㎍/㎖의 IL-12 8㎕ 및 100㎍/㎖의 IL-18 40㎕와 함께, 최종 배양된 면역세포의 상대적인 조성비를 조절하기 위한 1㎎/㎖의 항CD16 항체 5㎕가 첨가된 배양액이 사용되었다.
이후, 제2배양단계를 거친 배양 혼합액에 자가 유래 혈장 10㎖를 첨가하고, 자가 유래 혈장이 새로 첨가된 배양 혼합액을 1ℓ의 배양액이 수용된 가스투과성 배양백에 주입한 후, 7일간 더 배양하는 제3배양단계를 수행하였다.
이와 같이 배양된 활성화 림프구로부터 관찰되는 배양 전후 표현형 및 세포수의 변화와 각종 암세포에 대한 역가 분석 결과를 실시예2 및 실시예3을 통해 살펴보기로 한다.
실시예2 : 배양 전후 표현형 및 세포수 변화 관찰
도 3 및 도 4는 배양 전후 림프구의 표현형 변화를 나타내는 그래프로서, H1 영역은 NK 세포, H4 영역은 T 세포, H2 영역은 NKT 세포, H3 영역은 기타 면역 세포의 분포를 나타내고 있으며, 도 5는 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 NK 세포수의 변화와 종래기술에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 얻어지는 NK 세포수의 변화를 비교하여 보여주는 그래프이다.
실시예1과 같은 방법으로 배양된 활성화 림프구를 유세포 분석기(floweytometry)를 이용하여 표면 항원을 분석한 결과를 도 3 및 도 4를 통해 살펴보면, 배양 전에는 도 3의 그래프에서와 같이 표면 항원 분포가 H4 영역에 가장 많이 분포되어 있는 반면, 배양 후에는 도 4의 그래프에서와 같이 H1 영역에 가장 많이 분포되어 있음을 알 수 있었다.
실제 CD16+CD56 positive NK 세포의 비율을 계산한 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 배양된 활성화 림프구 중 CD16+CD56 positive NK 세포의 비율은 평균 86.7%의 높은 비중을 차지하고 있음을 확인할 수 있었다.
다시 말해서, 본 발명에 의해 배양된 활성화 림프구는 NK 세포의 활성화를 촉진하기 위해 첨가되는 IL-12 및 IL-18 등의 첨가제의 작용으로 인하여 NK 세포가 차지하고 있는 비율이, 인간의 말초혈액으로부터 추출된 림프구를 IL-2와, 항CD3, 항CD16 및 항CD56 항체의 존재하에 배양하였던 본원 출원인의 종래 배양법(한국공개특허 제2008-0053929호)에 의해 배양된 활성화 림프구에서의 NK 세포의 평균 비율(63.42%)에 비하여, 활성화 림프구 중 NK 세포가 차지하는 비율이 약 20 ~ 30% 증가된 것을 확인할 수 있으며, 이와 같은 NK 세포 비율의 증가는 후술하는 역가 분석을 통해 보다 향상된 치료 효과를 발현하는 것으로 직결됨을 확인할 수 있다.
실시예3 : 각종 암세포에 대한 역가(cytotoxicity) 분석
도 6은 본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 배양된 활성화 림프구에 대한 역가 분석 결과와 종래기술에 따른 자기활성화 림프구 배양방법을 통해 배양된 활성화 림프구에 대한 역가 분석 결과를 비교하여 보여주는 그래프이다.
본 역가 분석에서는, 실시예1의 방법으로 배양된 활성화 림프구를 효과기세포(effector cell)로, 혈액암 세포주(K562)를 표적세포(target cell)로 각각 사용하고, 암세포 대비 활성화 림프구의 비율을 10:1로 설정하여 혈액암 세포주에 대한 활성화 림프구의 살해능력을 측정하는 역가 분석을 수행하였다.
또한, 상술한 역가 분석과 동일한 조건 하에서 본원 출원인의 종래 배양법에 의해 배양된 활성화 림프구를 효과기세포로 적용한 역가 분석을 수행하였으며, 각각의 역가 분석 결과는 도 6에 나타난 바와 같다.
도 6에 도시된 바와 같이, 종래 배양법에 의해 배양된 활성화 림프구의 평균 역가는 47%인데 비하여, 본 발명에 의해 배양된 활성화 림프구의 평균 역가는 93%로 나타나, 본원 발명에 의해 배양된 활성화 림프구가 종래 배양법에 의해 배양된 활성화 림프구보다 약 2배 이상 증가한 암세포 살해능력을 보여주고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 실시예에 적용된 배양전의 림프구가 평균 5% 이하의 역가를 갖고 있음을 감안한다면, 본 발명에 의해 배양된 활성화 림프구의 역가 향상은 적어도 배양 전보다 20배 이상 향상된 것임을 알 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
본 발명에 따른 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기활성화 림프구 배양방법은, NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에, 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 보다 증가시킴으로써 대량으로 활성화된 NK 세포를 통해 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포에 대한 살상을 가능하게 함으로써 부작용이 적고 투여법이 적은 양자면역요법에 적용하여 다양한 종류의 악성종양으로 고통받는 암환자들의 예후 향상을 극대화하는데 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제로 구성되어 자기 활성화 림프구를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서,
    상기 첨가제는, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨12(IL-12), 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에는,
    800 ~ 1200 IU(International Unit)/㎖의 IL-2가 함유된 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제는,
    상기 세포 배양용 배지 39㎖를 기준으로 하였을 때,
    17×106 ~ 19×106 IU/㎖의 IL-2 3 ~ 10㎕와, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 3 ~ 10㎕와, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 10 ~ 30㎕와, 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD3 항체 2 ~ 40㎕ 및 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD16 항체 2 ~ 40㎕로 구성되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 첨가제에는,
    상기 세포 배양용 배지 39㎖를 기준으로 하였을 때,
    190 ~ 210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 350 ~ 430㎕ 및 2 ~ 5㎖의 자가 유래 혈장(plasma)이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제는,
    상기 세포 배양용 배지 67㎖를 기준으로 하였을 때,
    17×106 ~ 19×106 IU/㎖의 IL-2 3.5 ~ 7.8㎕와, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-12 2 ~ 10㎕와, 90 ~ 110㎍/㎖의 IL-18 20 ~ 50㎕ 및 0.9 ~ 1.1㎎/㎖의 항CD16 항체 4 ~ 80㎕로 구성되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 첨가제에는,
    상기 세포 배양용 배지 67 ㎖를 기준으로 하였을 때,
    190 ~ 210mM의 L-글루타민(L-glutamine) 650 ~ 740 ㎕ 및 2 ~ 5 ㎖의 자가 유래 혈장(plasma)이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  7. 인간의 말초혈액으로부터 림프구를 추출하는 단계와;
    상기 추출된 림프구를 인터루킨2(IL-2), L-글루타민(L-glutamine) 및 자가 유래 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 인터루킨12(IL-12), 인터루킨18(IL-18), 항CD3 및 항CD16 항체의 존재하에 배양하는 제1배양단계; 및
    상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양혼합액을 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 혼입하여 IL-12/항CD16 항체와 IL-18의 존재하에 배양하는 제2배양단계;
    를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1배양단계는,
    상기 추출된 림프구를 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에서 항CD3 항체가 고형화된 제1배양용기 내에서 먼저 배양시키고, 상기 제1배양용기 내의 배양혼합액을 제2배양용기로 옮겨 IL-12와 항CD16 항체를 첨가하여 다시 배양시킨 다음, 상기 제2배양용기 내에 IL-18을 첨가하여 추가로 배양시키는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1배양단계는,
    상기 추출된 림프구를 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액이 담겨있는 항CD3 항체가 고형화된 제1배양용기 내에서 30분 내지 2시간 배양하고, 상기 제1배양용기 내의 배양혼합액을 제2배양용기로 옮겨 IL-12와 항CD16 항체를 첨가하여 1시간 내지 3시간 배양한 다음, 상기 제2배양용기 내에 IL-18을 첨가하여 48시간 내지 72시간 배양하고, 이후, 상기 제2배양용기 내에 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액을 추가하면서 12시간 내지 18시간 배양한 다음, 상기 제2배양용기 내의 배양혼합액을 제3배양용기로 옮겨 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장을 추가하여 2일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 제2배양단계는,
    상기 제1배양단계를 거친 배양혼합액을 IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액에 IL-12 및 항CD16 항체를 첨가하여 먼저 배양시킨 다음, 상기 배양된 배양 혼합액에 IL-18을 첨가하여 추가로 배양시키는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 제2배양단계는,
    IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액이 담겨 있는 제4배양용기에 상기 제1배양단계를 거친 배양혼합액을 혼입하여 1시간 내지 3시간 배양하고, 이후 상기 제4배양용기에 IL-18을 첨가하여 12시간 내지 18시간 배양한 후, IL-2, L-글루타민 및 자가 유래 혈장이 첨가된 배양액을 추가하면서 항CD16 항체를 첨가하여 12시간 내지 18시간 배양하는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2배양단계에서 사용되는 배양액은,
    IL-2를 800 ~ 1200 IU(International Uint)/㎖ 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 자기활성화 림프구 배양방법은,
    상기 제2배양단계를 거친 배양혼합액에 자가 유래 혈장을 첨가하고, 상기 자가 유래 혈장이 첨가된 배양혼합액을 배양액이 들어 있는 가스투과성 배양백에 주입한 후 배양시키는 제3배양단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 제3배양단계에서 사용되는 배양백은,
    IL-2를 100 ~ 200 IU/㎖ 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 자기활성화 림프구 배양방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2947144A4 (en) * 2013-01-15 2016-06-08 Hiroyuki Abe METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNOZYTIC COMPOSITION AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN115044549A (zh) * 2022-08-12 2022-09-13 北京科途医学科技有限公司 用于保持免疫细胞多样性的培养基和细胞组合物的培养方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5572863B2 (ja) * 2011-06-24 2014-08-20 国立大学法人九州大学 Ｎｋ細胞の増幅方法
KR101415039B1 (ko) 2013-09-30 2014-08-13 지엔에스바이오(주) 자기유래 활성화 림프구의 대량 증식을 위한 배지 조성물 및 배양방법
JP6405690B2 (ja) * 2014-05-09 2018-10-17 東洋製罐グループホールディングス株式会社 複室培養容器、及び細胞培養方法
CN105462923B (zh) * 2014-12-17 2018-11-02 山东大学第二医院 一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法
KR101909879B1 (ko) * 2015-06-24 2018-10-19 주식회사 차바이오텍 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물
CN105462924B (zh) * 2015-12-04 2019-01-18 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 Nk细胞的培养方法及无血清培养基组合
KR101683614B1 (ko) * 2016-02-15 2016-12-07 신동혁 Nk세포배양용 배지첨가키트 및 상기 키트를 이용한 nk세포배양방법
KR101969045B1 (ko) * 2016-11-22 2019-04-19 신동혁 면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
CN106434556B (zh) * 2016-11-22 2019-10-11 上海新长安生物科技有限公司 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法
WO2018110892A2 (ko) * 2016-12-12 2018-06-21 주식회사 이뮤니스바이오 대식세포와 염증성물질을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법
KR102419960B1 (ko) * 2019-03-15 2022-07-13 (주) 테라베스트 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR102216710B1 (ko) * 2019-03-27 2021-02-17 신지섭 Nk세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 nk세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물
KR20220036287A (ko) * 2020-09-15 2022-03-22 주식회사 티에스바이오 고순도 및 고효율의 자연살해세포 제조방법 및 이의 용도
EP4230728A1 (en) * 2020-09-15 2023-08-23 Shin, Ji-Seop Immune cell proliferation/activation kit and immune cell culture method using same proliferation/activation kit
CN112746056A (zh) * 2021-03-17 2021-05-04 辽宁盛京干细胞科技有限公司 一种增强nk细胞毒作用的培养液及其制备方法
KR102504039B1 (ko) * 2022-10-25 2023-03-02 오정훈 자연살해세포 증식에 효과적인 배양 방법 및 이의 용도
CN115651903B (zh) * 2022-11-14 2023-03-17 四川新生命干细胞科技股份有限公司 高杀伤力的免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090127974A (ko) * 2008-06-10 2009-12-15 주식회사 엔케이바이오 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물
KR20090127973A (ko) * 2008-06-10 2009-12-15 주식회사 엔케이바이오 자기활성화 림프구 배양 방법
KR101133185B1 (ko) * 2008-07-29 2012-04-06 서울대학교병원 자연살해세포의 증식방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGAUGUE, S. ET AL.: 'Human natural killer cells exposed to IL-2, IL-12, IL-18, or IL-4 differently modulate priming of naive T cells by monocyte-derived dendritic cells' BLOOD vol. 112, no. 5, 01 September 2008, pages 1776 - 1783 *
HONG, S-M. ET AL.: 'Human activated lymphocyte treated with anti-CD3, CD16, CD56 monoclonal antibody and IL-2' IMMUNE NETWORK vol. 5, no. 1, 2005, pages 11 - 15 *
PINTARIC, M. ET AL.: 'Synergistic effects of IL-2, IL-12 and IL-18 on cytolytic activity perform expression and IFN-g production of porcine natural killer cells' VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY vol. 121, 2008, pages 68 - 82 *
RODRIGUEZ-GALAN, M.C. ET AL.: 'Synergistic Effect of IL-2, IL-12, and IL-18 on Thymocyte Apoptosis and Thl/Th2 Cytokine Expression' THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY vol. 174, 2005, pages 2796 - 2804 *
SATWANI, P. ET AL.: 'Enhanced expansion, activation and cytolytic activity of umbilical cord blood (UCB) cytolytic T lymphocytes cultured in interleukin (IL)-18, IL-2, IL12 and anti-CD3: A functional analysis' PROC AMER AS COC CANCER RES vol. 45, 2004, page 4712 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2947144A4 (en) * 2013-01-15 2016-06-08 Hiroyuki Abe METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNOZYTIC COMPOSITION AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CANCER
TWI612137B (zh) * 2013-01-15 2018-01-21 Hiroyuki Abe 含免疫細胞之組成物的製造方法及癌症治療用組成物
KR101923848B1 (ko) 2013-01-15 2018-11-29 히로유키 아베 면역세포 함유 조성물의 제조방법 및 암 치료용 조성물
US10160952B2 (en) 2013-01-15 2018-12-25 Hiroyuki Abe Method for manufacturing an immune cell-containing composition, and a cancer-treating composition
CN115044549A (zh) * 2022-08-12 2022-09-13 北京科途医学科技有限公司 用于保持免疫细胞多样性的培养基和细胞组合物的培养方法

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