JP2012532624A - 細胞、組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Table 2(表2) LAKおよびITNKの細胞表面受容体レパートリーの比較。
Table 3(表3) マイクロアレイ分析におけるBcl11bの欠失の24時間および48時間後の胸腺細胞における遺伝子発現プロファイルの変化。
Table 4(表4) PCRプライマー
(a)たとえば図2D、図2E、および図2eにおいて示されるようにT細胞と比較してナチュラルキラー細胞と類似する形態。下記に示されるように、再プログラムされた胸腺細胞は、NK細胞表面受容体を発現しただけでなく、形態学的にT細胞のように見えず、むしろ、それらは、サイズが大きく、細胞質が大きく、顆粒および豊富な小胞体(ER)において高度なタンパク質合成活性を有する通常のNK細胞に非常に類似していた(図2D、2E、および2e)。
(b)たとえば図2Cにおいて示されるようなTCRβ特異的ゲノムDNA再編成;下記に示されるように、ある種のITNK細胞は、T細胞としてのそれらの起源を示す再編成されたTCRβ座を有する。
(c)たとえば図1Eおよび1Gにおいて示されるように、ITNK細胞を発生させた親細胞よりも、LAK細胞などのようなNK細胞の遺伝子発現プロファイルにより類似する遺伝子発現プロファイル。親DN3胸腺細胞およびそれらのBcl11b欠損誘導体の間で発現差異を示した遺伝子をTable 1(表1)中に列挙する。遺伝子のこの表を考慮すると、ITNK細胞は、LAK細胞と同じ方向(増加または減少)で異なって発現される(2倍以上の差異)、適切には少なくとも50%、適切には少なくとも60%、適切には少なくとも70%の遺伝子を有する。
(d)ZFP105、IL2Rβ、Id2、JAK1、NKG2D、NKG2A/C/E、B220、Rog (Zbtb32)、Tnfrsf9、Cdkn1c、Trail、パーフォリン、インターフェロン-γ、NK1.1、NKp46、E4bp4、NKG7、KLRD1、LTA、PLCG2、Ly49C/I、およびLy49G2などのような、非エフェクター細胞またはナイーブT細胞上で見つけられないまたは高レベルで発現されない1つまたは複数のNK特異的遺伝子の細胞発現。
(e)ITNK細胞が由来する親細胞と比較して、Notch1、Est1、Hes1、Gata3、Deltax1、TCRβ、CD3、Tcf1、IL7Ra、T-bet、CD8の発現の減少または無発現などのような、1つまたは複数のT系列遺伝子の発現の減少または無発現。一態様では、ITNK細胞は、CD8+細胞に由来し、IL7Rおよび/またはT-betを発現せず、低レベルのCD8aを発現する。
(f)細胞死滅能力、たとえば、適切には、使用される前駆細胞(親T細胞またはプロT細胞)と比較して、腫瘍の形成または成長を予防するまたは改善する能力、間質細胞、腫瘍細胞、または感染細胞を死滅させる能力。細胞死滅は、本明細書における実施例の部において記載される方法によってin vitroまたはin vivoで評価されてもよい。さらに、ITNKは、MHC-I分子を認識することができる。さらに、in vivoで作製されたITNK細胞は、MHC-Iに制限されず、MHC-Iポジティブ細胞またはネガティブ細胞を死滅させることができる。in vitroまたはin vivoで作製されたかにかかわらずITNK細胞は、MHC-I低細胞またはネガティブ細胞を死滅させる。
(g)転写または翻訳もしくはタンパク質配列に影響を与えるまたは他の場合にはBcl11b活性もしくは効果に影響を与える、適切にはITNK作製を促進する、Bcl11b遺伝子または制御配列における突然変異。
T細胞発生は、前駆体ホーミング、系列特異化、およびコミットメントを含み、重要な転写因子(1、2)の間で複雑な相互作用を必要とする。T細胞受容体(TCR)コレセプターCD4およびCD8を欠く、胸腺細胞のうちで最も初期の集団(ダブルネガティブ細胞またはDN細胞)(28)は、DN1〜4として細胞表面マーカーによってさらに細分化することができる(29)。DN1(CD44+CD25-)胸腺細胞集団は、多能性前駆体を含有する(30、31)のに対して、DN2胸腺細胞(CD44+CD25+)は、NKおよび骨髄の素質を有する(30、31)。これらの非T細胞の発生の素質は、DN3(CD44-CD25+)胸腺細胞において失われている。DN4胸腺細胞(CD44-CD25-)は、Tcrβ遺伝子再編成の成功の後に、β選択を受け(32)、CD4+ CD8+ダブルポジティブ(DP)ステージに分化するプロセスを既に開始している(33、34)。
マイクロアレイ研究は、Bcl11bを含む、T細胞コミットメントにおいて重要な多くの遺伝子の発現が、DN2胸腺細胞において増加し始めることを示す。転写因子の中で、Bcl11bは、DN1からDN2への遷移において最も大きくアップレギュレートされる(Rothenberg, 2007)。単一細胞レベルで初期T細胞におけるBcl11b発現を決定するために、発明者らは、SA-lacZカセットがその発現を追跡するためにイントロン3に挿入されたBcl11bのlacZノックイン対立遺伝子を作製した(Song-Choon Lee, et al、非公開)。そのため、Bcl11b発現は、フローサイトメトリーにおいて、β-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるフルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド(FDG)を使用することによって、間接的に追跡することができる。造血系列において、Bcl11bの発現は、T細胞において検出可能であるのみであった(データ示さず)。胸腺において、DN2〜DN4胸腺細胞はほとんどすべて、Bcl11bを発現した(図13aおよび図14a)。対照的に、DN1胸腺細胞のわずか約80%が、Bcl11bを発現した。さらに、CD117抗体を使用する分析は、最も初期のT細胞前駆体であると考えられるDN1aおよびDN1b胸腺細胞の60%が(Porritt et al., 2004)、既にBcl11bを発現していたことを同定し(図13Bおよび14a)、最も初期のT系列特異化工程におけるBcl11bの予想される役割を示唆する。
上記の発現および機能のデータは、Bcl11bが、T細胞前駆型において発現され、T細胞系列への分化に必要とされたことを示した。Bcl11bの生殖系列欠失は、胎児の胸腺においてDN3胸腺細胞におけるアポトーシスを引き起こし、DN1/2細胞に明らかに影響を与えなかった(Wakabayashi et al., 2003)。T細胞においてBcl11b機能をさらに決定するために、発明者らは、エクソン4にloxPが導入されたコンディショナルノックアウトマウス(Bcl11bflox/flox)を生成し(図8A)、これらを、Rosa26Cre-ERT2マウスに交雑させた(9)。CreERT2;Bcl11bflox/floxマウスからの胸腺細胞はすべて、タモキシフェン(OHT)誘発性Creレコンビナーゼを発現する。結果的に、CreERT2;Bcl11bflox/floxマウス(PLBD系。原稿においてflox/floxとも呼ばれる)において、Bcl11bは、タモキシフェン(OHT)で、培養細胞またはマウスを処理することによって欠失させることができた。これらのおよびコントロール(CreERT2;Bcl11bflox/+、flox/+と呼ばれる)マウスからのOHT処理全胸腺細胞から、発明者らは、T細胞培地(Flt3リガンドおよびII-7)中のDN1およびDN2細胞をソートし、続いて、T細胞発生を支援するが、前駆体からのNK細胞発生を抑制する(11)OP9-DL1間質細胞上で(図8B)(10)、2週間の間(図14b)、培養した。OP9-DL1間質細胞は、Delta-Like-1 Notchリガンドを発現し、強いT細胞発生を支援するが(Schmitt and Zuniga-Pflucker, 2002)、通常、NK細胞発生を抑制する(Rolink et al., 2006; van den Brandt et al., 2004)。間質細胞はすべて、OHT処理flox/flox DN1胸腺細胞培養物において死滅した。
再プログラム(Bcl11b欠失に際してのTからNKへの変換)効率を評価するために、発明者らは、T細胞培地中のOP9-DL1間質細胞をあらかじめ接種した96ウェルプレートの個々のウェルに、OHT処理flox/flox胸腺細胞から単一のDN3胸腺細胞をソートした(図9A)。成長している細胞を有した79のウェルのうち、36ウェルは、CD3およびTcrβを含むT細胞表面マーカーを発現した、多くの急速に増殖しているT細胞を有した(図2A)。PCR遺伝子型同定により、これらのウェル中の細胞は、完全なBcl11b欠失を有しなかったが、一方のみのflox Bcl11b対立遺伝子を欠失させたことを確認した(図2B、レーンT1およびT2)。これらの細胞(flox/-)は、それにもかかわらず、それらが活性化Creレコンビナーゼを有したので、Cre毒性について優れたコントロールとして役立った。他の43のウェルにおいて、胸腺細胞は、NKp46+間質細胞死滅ITNKに再プログラムされた(図2A)。これらの43のウェルにおいて、細胞は、比較的遅く成長したが、間質細胞を死滅させた。なお、1つのDN3胸腺細胞から、50万までの間質死滅細胞が、OHT処理の14日後に直ちに得られた。フローサイトメトリー分析は、これらのウェル中の細胞はほとんどすべて、NK特異的マーカーNKp46を発現し、したがって、ITNKであったことを示した(図2A)。1つのDN3胸腺細胞から、50万までのITNKがIL-2ありで得られたが、IL-2なしではわずか約50,000の細胞しか得られなかったので、IL-2は、明らかに、ITNKの増殖を大幅に促進することができた。ITNK細胞はすべて、両方のBcl11b対立遺伝子を失い(図2b、レーンl1およびl2)、個々のウェルのITNKは、特有の再編成TCRβ座を有し、したがって、それらの独立した起源を確認した(図2C)。そのため、一度Bcl11bが欠失したら、ITNKへのDN3胸腺細胞の再プログラム効率は、100%に達することができた。DN3胸腺細胞からのITNKは、NK細胞表面受容体を発現し、類似する細胞障害性機能を有しただけではなく、T細胞よりも大きく、顆粒を有し、豊富な小胞体による高度なタンパク質合成活性を有するLAK細胞に形態学的に類似していた(図2、D〜E)。
ITNKがin vitro人工産物である可能性を排除するために、発明者らは、in vivoでBcl11bを欠失させた(図10A)。OHT処理の2〜3週間後に、ITNKは、flox/+コントロールではなくflox/floxマウスからの脾臓(NKp46+CD3+)および胸腺(NKp46+)の両方において検出された(図3A)。Bcl11bは、これらのin vivo再プログラムITNKにおいて欠失していたことが分かった(図10B)。重要なことには、CD4+およびCD8+ITNK(NKp46+)の両方が見つけれらた(図10C)。いくつかの野生型γδ-T細胞は、NKp46を発現したが、Bcl11b欠失は、NKp46+γδ-T細胞の3倍の増加を引き起こし(図3B)、これは、T細胞集団がすべて、再プログラムの素質を有することを示唆した。in vivo再プログラムITNKは、NK培養条件において直ちに増殖することができたが(図10D)、それらはNKT細胞ではなかった(図10E〜F)。発現NK細胞関連遺伝子の他に、in vivo再プログラムITNKはまた、ll7ra、Tbx21(T-bet)、Cd8などのようないくつかの重要なT細胞遺伝子を失ったまたは減少させた(図10G)。結果的に、ITNKにおけるTCRシグナル伝達は、損なわれるように見えた(図10H)。
ウェスタンブロットは、CreERT2;Bcl11bflox/floxからの胸腺細胞において、Bcl11bタンパク質レベルが、OHT処理の24時間後に大きく減少したことを示した。また、48時間後に、Bcl11bタンパク質は、検出不可能になった。よって、Bcl11bの欠失は、Bcl11bタンパク質の急速な消失を引き起こした(図4A)。T細胞におけるBcl11b欠失直後の遺伝子発現変化をプローブするために、発明者らは、OHT処理の24および48時間後に発現アレイ分析を実行した。マイクロアレイ分析は、OHT処理flox/flox胸腺細胞において、TCRβおよびCD3などのようなT細胞遺伝子の発現が、24時間以内に早くもダウンレギュレートされたことを示した(Table 3(表3))。さらに24時間で、NK細胞と関連する多くの遺伝子が発現した(Table 3(表3))。Table 3(表3)は、Bcl11b損失がそれらの発現に著しく影響を与えた(2倍)遺伝子を列挙する。NKG7、KLRD1(CD94)、PLCG、およびIFNGなどのようなNK細胞機能にとって重要であるいくつかの遺伝子の発現は、OHT処理の48時間後に早くも増加した。
図1. Bcl11bは、T細胞発生およびT細胞の同一性を維持するのに不可欠である。flox/floxまたはflox/+コントロールマウスからの胸腺細胞は、OHTを用いて処理しまたは処理せず、次いで、DN1またはDN2の亜集団にソートし、OP9-DL1間質細胞上で培養した。(A)IL-2の非存在下における培養DN1およびDN2胸腺細胞(+OHT)のフローサイトメトリープロファイル。数字は、ゲート中の細胞の百分率を表す。データは、3回の実験を表す。(B)IL-2を補足した培養flox/flox DN3胸腺細胞(±OHT)のフローサイトメトリープロファイル。データは、3回の実験を表す。Bcl11b欠損DN3胸腺細胞は、T細胞の同一性を失い、NKp46発現細胞に変換された。-OHT:非処理細胞;+OHT:処理細胞。(C)OHT処理flox/flox DN3胸腺細胞によるOP9-DLI間質細胞の死滅。スケールバー:40μm。Bcl11b欠損DN3胸腺細胞(+OHT)からのNKp46+細胞は、OP9-DL1間質細胞を有効に死滅させた。(D)精製NKp46+細胞からのDNAを調製し、TCRβ座でのDJ(上)およびVDJ(下)組換えを検出するためにPCRにかけた。T:未処理DN3胸腺細胞から成長するT細胞;N1およびN2:OHT処理flox/flox DN3胸腺細胞から成長する、ソートされたNKp46+細胞;Thy:野生型全胸腺細胞;B:B細胞;GL:生殖系列バンド;H2O:PCRにおけるDNA鋳型なし。数字は、DJ組換え産物を示す。Bcl11b欠損DN3胸腺細胞からのNKp46+細胞は、Tcrβを発現しなかったが、なお、Tcrβ座にV(D)J組換えを保持した。(E〜G)DN3胸腺細胞からのNKp46+CD3+ITNK細胞(l1〜l4)、IL-2増殖NK細胞(LAK;L1〜L4)、およびソートしたDN3 flox/flox胸腺細胞(DN3;D1〜D4)における遺伝子発現のマイクロアレイ分析を発現にかけた。(E)アレイデータの2方向階層的クラスターマップ。カラムの数字(たとえばl1〜l4)は、それぞれの細胞型についての4つの独立したRNA試料を表し、列は、個々の転写物である。スケールは、正規化したシグナルレベルのlog2値を示す。親のDN3胸腺細胞、DN3胸腺細胞に由来するiTNK細胞、および通常のNK細胞(LAK)の発現プロファイルの比較。RNA試料は、それぞれの細胞型について4匹のマウスから得た。(F)ITNK、LAK、およびDN3細胞の中で選択された遺伝子の遺伝子発現のqRT-PCR検証。バーは、3つの試料の平均値±SDである。図1(F)におけるそれぞれのヒストグラムにおいて、第1のバーはDN3細胞を表し、第2のバーはITNKを表し、第3のバーはLAKを表す。DN3、iTNK、およびLAK細胞の間の遺伝子発現差異のqRT-PCR検証(G)。T細胞特異的遺伝子の発現は全般的に減少し、NK特異的遺伝子の発現は、NK様細胞において大幅に増加した。Zbtb23(Rog)およびCdkn1c(p57Kip)は、DN3胸腺細胞において通常発現されなかった。図1(G)におけるそれぞれのヒストグラムにおいて、第1のバーはLAK細胞を表し、第2のバーはITNKを表し、第3のバーはDN3細胞を表す。
図2. T細胞のITNKへの、効果のある再プログラム。(A)単一のflox/flox DN3細胞から再プログラムされたITNKの代表的なフローサイトメトリープロファイル。数字は、全細胞における百分率を表す。T:完全なBcl11b欠失を有しなかったT細胞。データは、3回の実験を表す。OP9-DL1間質細胞と同時培養された、個々のウェル(96ウェルプレート)における、単一のBcl11b欠損DN3胸腺細胞に由来するNKp46+iTNK。T:T細胞遺伝子を発現した細胞、Bcl11bは完全には欠失されなかった;iTNK:Bcl11bの両方のコピーを欠失しており、NKp46を発現した細胞。
(B)2つの代表的なT細胞(T1、T2)およびITNK(I1、I2)ウェルにおけるBcl11b欠失のPCR遺伝子型同定。flox:loxPが導入された対立遺伝子;del;欠失対立遺伝子。-OHT:OHT処理なし;H2O:鋳型なしコントロール。PCR遺伝子型同定は、いくつかのウェルにおける細胞が完全なCre-loxP組換えを有していないことを示した(T1およびT2)。これらの細胞は、Bcl11b座に1つの欠失対立遺伝子および1つのcko対立遺伝子を有していた。他方では、NKp46+細胞はすべて、Bcl11bを完全に欠失させた(I1およびI2)。欠失は、OHT処理なしでは(-OHT)細胞において検出されなかった。
(C)特有のDJ組換えを示す5つのITNKウェル(I1〜I5)のTCRβ座でのDJ組換え。L:DNAラダー;Thy:野生型胸腺細胞。(D)親のDN3胸腺細胞(T)およびITNK細胞のギムザ染色。スケールバー:20μm。(E)ITNK細胞の透過電子顕微鏡写真。1:核;2.ゴルジ体;3.顆粒;4.ER。スケールバー:2μm。(e)ITNK細胞の電子透過顕微鏡画像は、顕著なゴルジおよびERならびに顆粒を示す。矢印:1=核;2=ER;3=顆粒;4=ゴルジ。(F)示すエフェクター対標的比(E:T)でB16F10、RMA、およびRMA-S腫瘍細胞標的を用いて標準の51Cr放出アッセイにおいて測定されたITNK(「+OHT」と標識)およびLAKの細胞毒性。-OHT:flox/flox T細胞。データは、三つ組のウェルの平均値である。DN3胸腺細胞からのin vitro誘導ITNK細胞は、腫瘍細胞を有効に死滅させた。LAKおよびITNK細胞の両方は、MHC-IネガティブB16F10メラノーマおよびRMA-Sリンパ腫細胞を死滅させた。
図3. in vivoで再プログラムされたITNKは、強力な腫瘍細胞キラーであった。(A)OHT処理flox/floxおよびflox/+マウスからの胸腺細胞および脾細胞のフローサイトメトリー分析。数字は、リンパ球ゲートにおける百分率を表す。データは、4匹のマウスを表す。(B)OHT処理flox/floxマウスにおける胸腺γδT細胞からのITNKの分析。データは、2匹のマウスを表す。(C)flox/flox DP胸腺細胞を注射したRag2-/-Il2rg-/-レシピエントにおけるITNK産生。注射の2週間後に、ドナー(CD45.2+)および宿主(CD45.1+)脾細胞を分析した。数字は、リンパ球ゲートの百分率を表す。プロットは、3回の独立した実験からの15匹のマウスを表す。ドナー細胞は、CD45.2染色によって同定した。脾細胞の約5%はドナー由来であり、これらのドナー由来細胞のおおよそ半分は、NKp46+iTNKであった。(D)レシピエントマウスの脾細胞からのIL-2におけるITNKのex vivo増殖。生細胞は、示す時点でカウントし、分析した(下パネル)。数字は、百分率を表す。培養物中のほとんどの細胞は、それらがNKp46、TCRβ、NK1.1、およびNKG2Dを発現したので、ITNKであった。バーは、4つの試料の平均値±SDである。データは、3回の実験を表す。(d)4つのRag2-/-Il2γc-/-レシピエントマウスの脾臓型(splenotype)から始める、in vivo再プログラムiTNK細胞のex vivo増殖。これらの細胞は、3〜4週間までの間、培養物中で広範囲に増殖することができた。下パネル:iTNK細胞(NK1.1+および/またはNKp46+)は、1週間の培養後に培養物において大多数の細胞を占めた。(E)ex vivo増殖ITNK(「+OHT」と標識)は、示すエフェクター対標的比(E:T)でB16F10、RMA、およびRMA-S腫瘍細胞標的を用いる51Cr放出死滅アッセイにおいて使用した。-OHT:flox/flox T細胞。データは、三つ組のウェルの平均値である。結果は、3つの実験を表す。ex vivo増殖iTNKは、LAKよりも腫瘍細胞に対して強力なキラーであった。iTNKは、MHC-Iポジティブまたはネガティブの腫瘍細胞を有効に死滅させた。
(F)ITNKは、腫瘍転移を予防した。処理(+OHT)もしくは未処理(-OHT)flox/flox DP胸腺細胞またはPBSを最初に移植したRag2-/-Il2rg-/-レシピエント。レシピエントに、50,000のB16F10メラノーマ細胞を続いて静脈内注射した。肺腫瘍コロニーは、腫瘍攻撃の2週間後に数えた。データは個々のマウスからのものであり、バーは平均値を表す。(G)in vivo iTNKは、マウスにおいてB16F10メラノーマ細胞を有効に排除した。多くの転移性のコロニーは、PBS(細胞なし)または未処理DP胸腺細胞(-OHT)のいずれかを注射したコントロールマウスの肺において可視的であった。OHT処理DP胸腺細胞が注射され、よって、iTNKが産生された(+OHT)場合、転移性のコロニーはほとんど存在しなかった。
図4. Bcl11bは、Notchシグナル伝達の直接的な下流標的遺伝子である。(A).ウェスタンブロットによって検出されるOHT処理後のT細胞におけるBcl11bタンパク質。(B)推定上のCSL結合部位(BS)を示すBcl11b座の概略図および関連性がないコントロール結合部位(CTL)の概略図。(C)ゲノムDNAは、CSLまたはコントロールIgG抗体を使用して、胸腺細胞の免疫沈降から調製し、Bcl11b座の推定上のCSLまたはコントロール結合部位の側面に位置するプライマーを使用して増幅した。3つのBcl11b結合領域:領域1、転写の開始点から約1.8kb;領域2、エクソン1の5.4kb下流;領域3、エクソン2の約600bp下流。CSL:CSL抗体;IgG:コントロールIgG。濃縮倍数は、IgGコントロール(1に設定)と比較して計算した。バーは、三つ組の平均値±SDである。図4(c)におけるヒストグラムにおいて、第1のバーはCSLを表し、第2のバーはIgGを表す。
図5. Bcl11b-tdTomatoレポーターマウスの生成。(A)tdTomatoカセットは、Bcl11b座の3'UTRを標的にした。(B)Bcl11b 3'UTRでのtdTomatoカセットの挿入は、T細胞発生に影響を与えなかった。数字は、リンパ球ゲートの百分率を表す。データは、3匹のマウスを表す。
図6. Bcl11b-tdTomatoレポーターマウスを使用する造血系列におけるBcl11b発現の検出。Bcl11btd/+マウスの胸腺、脾臓、および骨髄からの白血球は、フローサイトメトリー分析のために抗体を用いて標識した。Bcl11b発現細胞は、赤色の蛍光を有した。実線はBcl11btd/+マウスを表し、点線は野生型マウスを表す。(A)CD4-CD8-ダブルネガティブ(DN;DN1〜DN4)胸腺細胞亜集団。DN1:CD44+CD25-;DN2:CD44+CD25+;DN3:CD44-CD25+;DN4:CD44-CD25-。(B)ダブルポジティブ(DP)胸腺細胞(CD4+CD8+)、脾臓CD4+およびCD8+T細胞、胸腺γδT細胞、ならびに脾臓NKT細胞(CD3+CD1d+)。(C)骨髄B細胞(CD19+B220+)および骨髄細胞(CD11b+Gr-1+)。(D)脾臓(CD3-)および胸腺(CD3-CD4-CD8-)NK細胞。NKP:NK細胞前駆型;未成熟:NK1.1+CD27+CD11b+およびNK1.1+CD27+CD11b+。(E)ソートされた脾臓ナイーブ(CD44-CD62L+)および活性化(CD44+CD62L-)T細胞集団におけるBcl11b発現のqRT-PCR。Bcl11b発現は、CD8+CD44+CD62L-(1に設定した)と比較して計算した。バーは、3つの試料の平均値±SEMである。(F)Bcl11btd/+マウスにおけるナイーブおよび活性化T細胞におけるBcl11b発現の定量。百分率は、Bcl11btd/+マウスにおいて示される細胞亜集団を表す。この図におけるFACSデータはすべて、3つの実験を表す。
図7. フローソーティングおよび分析のための細胞集団の同定のための戦略。(A)Lin-ならびにCD25およびCD44の発現によって定義されるダブルネガティブ(DN)胸腺細胞(DN1〜DN4)集団の同定。DN1サブ集団は、CD117(c-Kit)の発現によって定義した。数字は、百分率を表す。(B)γδT細胞の同定。(C)B細胞を最初にゲートアウトする(またはFACSソーティングに先立って磁気的に除外する)ことによる脾臓中のNKT細胞の同定。INKTは、CD3+であり、CD1d二量体によってポジティブに染色された。(D)NK前駆型(CD3-CD122+NK1.1-)およびNK細胞亜集団(NK1.1+CD27+CD11b-、NK1.1+CD27+CD11b+、NK1.1+CD27-CD11b+)細胞の同定。(E)胸腺NK細胞はNK1.1+CD127+胸腺細胞として定義した。(F)ナイーブ(CD44-CD62L+)および活性化(CD44+CD62L-)T細胞の同定。
図8. Bcl11b欠損T細胞のin vitro分析。(A)Bcl11bコンディショナルノックアウト対立遺伝子の模式図。Bcl11bエクソン4は、loxP部位が側面に位置した。示すDNA断片は、標的ES細胞のサザンブロット分析において5'プローブによって検出した。27kb野生型BamHIバンドを検出した5'プローブを使用する、標的ES細胞クローンのサザンブロット分析。同じプローブを、コンディショナルノックアウトクローン(cko/+)における12.6kb断片および5'loxP部位を有しなかったクローン(+/-)における17.5kb断片にハイブリダイズさせた。(B)Bcl11b欠損DN胸腺細胞の分析のための実験計画。CreERT2;Bcl11bflox/flox(flox/flox)またはCreERT2;Bcl11bflox/+(flox/+)マウスからの全胸腺細胞は、48時間、OHTを用いて処理し(+OHT)または未処理のままとし(-OHT)、次いで、示す亜集団にソートし、2週間の間、OP9-DL1間質細胞上で培養した。(C)DN1およびDN2 OHT処理flox/flox胸腺細胞からのNKp46+CD3-細胞は、TCRβを発現しなかった。数字は、細胞の百分率を表す。データは、2回の実験を表す。(D)DN1およびDN2の培養物からの、T(NKp46-CD3+)細胞集団ではなくITNK(NKp46+CD3-)におけるホモ接合型Bcl11b欠失。flox:コンディショナルノックアウト対立遺伝子;del:欠失対立遺伝子。H2O:DNA鋳型なしコントロール。(E)NKp46+細胞ではなくT細胞が、未処理flox/flox胸腺細胞から得られた。(F)OP9間質細胞上で培養した、IL-2またはIL-15の非存在下における、OHT処理DN1およびDN2 flox/flox胸腺細胞からのNKp46+TCRβ-細胞。(G)NKp46+TCRβ-細胞は、T細胞培地において、flox/+ではなくOHT処理DN3 flox/flox胸腺細胞において検出された。(H)骨髄細胞培養条件におけるBcl11b欠損DN3胸腺細胞のNKp46+細胞への再プログラム。(I)B細胞培養条件における、Bcl11b欠損DN3胸腺細胞のNKp46+CD19-細胞への再プログラム。(J)LAK対DN3(緑色)およびITNK対DN3(紫色)の間のアップレギュレート(>2倍)遺伝子のベン図比較は、2つの遺伝子リストの間で著しく重なることを示す。(K)DP flox/flox胸腺細胞からのITNKは、OHTを用いて処理し、IL-2の存在下においてOP9-DL1上で培養した。未処理細胞は、この条件下で急速に死んだ。(L)脾臓flox/flox CD8+T細胞からのITNKは、OHTを用いて処理し、IL-2の存在下においてOP9-DL1上で培養した。この図におけるFACSデータはすべて、2〜4の実験を表す。
図9. in vitro再プログラムITNK表現型の特徴づけ。(A)単一のDN3胸腺細胞のITNKへの再プログラムのための実験計画。flox/floxマウスからの全胸腺細胞は、OHTを用いて処理し(+OHT)または未処理のままとし(-OHT)、48時間後、単一のDN3細胞は、ソートし、96ウェルプレート中のOP9-DL1間質細胞上に接種し、10〜14日間の間、IL-2を補足した。(a)単一のDN3胸腺細胞のiTNKへの変換を分析するための実験計画。DN3胸腺細胞(OHTを用いて処理または未処理)は、OP9-DL1間質細胞をあらかじめ接種した96ウェルプレートの個々のウェルにソートした。2週間(Il2あり)または3週間(Il2なし)後に、iTNKに変換したOHT処理DN3細胞(Bcl11b欠損)は、FACS分析およびゲノムDNA PCRによって確認した。(B〜C)in vitroでDN3胸腺細胞から再プログラムされたITNKによる、細胞内(TRAIL、パーフォリン、IFNγ)およびNK細胞表面マーカーの発現。(D)in vitroでBcl11b欠損DP胸腺細胞から再プログラムされたITNKによるNK細胞マーカーの発現。(E)ITNKはCD127を発現せず、したがって胸腺NK細胞ではなかった。(F)DN3胸腺細胞から再プログラムされた、大量培養ITNKにおけるCD27およびCD11bの分析。FACSデータはすべて、3回の実験を表す。
図10. flox/floxマウスにおけるin vivo再プログラムITNK細胞の分析。(A)in vivo再プログラムITNK細胞の分析のための実験計画。flox/floxまたはflox/+マウスに、3日間連続で経口強制飼養によってタモキシフェンを用いて治療し、胸腺および脾臓を2〜3週間後に分析した。発明者らは、治療flox/+コントロールマウスと比較して、治療flox/floxマウスにおいて全胸腺細胞における5〜10倍の低下および脾細胞における約2倍の低下を観察した。(B)flox/floxマウスにおけるITNK(NKp46+CD3+およびNKp46+CD3-)細胞集団におけるBcl11b欠失のPCR。flox:コンディショナルノックアウト対立遺伝子;del:欠失対立遺伝子。H2O:DNA鋳型なしコントロール。胸腺におけるNKp46+CD3+およびNKp46+CD3-細胞はすべて、ITNKであった。脾臓におけるITNKの分析は、多くのNKp46+在来型NK細胞の存在によりより複雑であった。しかしながら、脾臓におけるほとんどのNKp46+CD3+細胞は、Bcl11b欠損を有し、したがって、ITNKであった。PCRデータは、3つの実験を表す。(C)NKp46+ITNKにおけるCD4およびCD8発現のフローサイトメトリー分析。CD4およびCD8の両方の発現が、CD4+NKp46-またはCD8+NKp46-T細胞と比較して、ITNK(CD4+NKp46+またはCD8+NKp46+)において下がっていたことに注目されたい。(D)OHT処理マウスからの全胸腺細胞または脾細胞のex vivo増殖後の細胞のフローサイトメトリー分析。(E)胸腺および脾臓におけるCD1d制限NKT細胞のフローサイトメトリー分析。全リンパ球およびCD19-脾細胞は、胸腺および脾臓においてそれぞれゲート制御した。OHT処理flox/floxマウスにおけるNKT細胞の低下に注目されたい。(F)ex vivo増殖ITNK培養物におけるCD1d制限細胞の分析。数字は、リンパ球ゲートにおける百分率を表す。この図におけるFACSデータはすべて、3〜4匹の個々のマウスを表す。(G)CD8+T細胞、CD8+ITNK、およびLAKにおける、いくつかの重要なTまたはNK細胞関連遺伝子のqRT-PCR分析。バーは、3つの試料の平均値±SEMである。それぞれの遺伝子の最も高度な発現レベルを1に選んだ。(H)タモキシフェンを用いて治療したflox/floxまたはflox/+マウスからの脾細胞は、ITNK上のCD3の発現を確認するために、NKp46、NK1.1、CD8、およびCD3を用いて染色した。別々の一定分量をIndo-1と共に装填し、NKp46、NK1.1、およびCD8に対する抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーによってカルシウムフラックスについて分析した。上位のパネル:ゲート制御されたT細胞(CD3+NKp46-)およびITNK(CD3+NKp46+)細胞を示すflox/floxまたはflox/+マウスからの脾細胞の表現型。数字は、全リンパ球のゲートにおける百分率を表す。下位のパネル:示す細胞サブセットからのカルシウムフラックスプロット。ベースラインは、獲得を中断する前にアッセイの開始時に確立し、抗CD3(145-2C11)を追加した(第1の矢印)。次いで、CD3は、抗ハムスター二次抗体の追加によって架橋し(第2の矢印)、イオノマイシンは、ポジティブコントロールとして追加した(第3の矢印)。ゲート中の数字は、抗ハムスター抗体の追加後のレスポンダー(上部のゲート)および非レスポンダー(下位のゲート)を表す。下記のデータ、カルシウムプロットは、非レスポンダーに対するレスポンダーの比を示す。データは、2匹のマウスを表す。
図11. DP胸腺細胞からのin vivo再プログラムITNKは、腫瘍転移を予防した。(A)DP胸腺細胞のITNKへのin vivo再プログラムの分析のための実験計画。flox/floxマウスからの全胸腺細胞は、OHTを用いて処理し(+OHT)または未処理のままとし(-OHT)、48時間後、DP細胞は、ソートし、Rag2-/-Il2rg-/-マウスに静脈内注射した。2週間後に、脾細胞、骨髄(BM)、および末梢血細胞(PB)は、ITNKについてフローサイトメトリーによって分析した。(B)脾臓中のほとんどのITNKは、CD8+であった。ゲート中の数字は、百分率を表す。データは、3回の実験を表す。(C)ITNKは、完全なBcl11b欠失を有したが、ドナー由来NKp46-細胞は、なお、loxPが導入された対立遺伝子の少なくとも1つのコピーを保持した。PCRデータは、2回の個々の実験を表す。(D)ITNKはまた、骨髄および末梢血においても見つけられた。骨髄の約1.0%および末梢血白血球の6〜7%は、NKp46を発現し、したがって、Bcl11b欠損DP胸腺細胞を注射したレシピエントにおいてITNKであった。(E)in vivo再プログラムITNK上のさらなるNK細胞表面マーカーの発現。in vivo iTNKは、Ly49C/IおよびLy49G2などのようなよりNK特異的受容体を発現した。(F)ITNKは、腫瘍転移を予防した。Rag2-/-Il2rg-/-レシピエントに処理(+OHT)もしくは未処理(-OHT)flox/flox DP胸腺細胞またはPBSを移植した。レシピエントに、5×104 B16F10メラノーマ細胞を続いて静脈内注射した。肺腫瘍コロニーは、腫瘍攻撃の2週間後に数えた。実験は、2度実行した。(G)プロットは、in vivo再プログラムおよび腫瘍攻撃後にレシピエントマウスから得られたITNK細胞(正方形)の百分率および観察された肺コロニー(円形)の数字の間の逆相関を示す。データは、個々のマウスであり、2回の独立した実験を表し、それぞれ、群当たり5匹のマウスを用いた。チャートは、in vivoで、脾臓におけるITNKの百分率(正方形)が、OHT処理DP胸腺細胞の注射後のRag2-/-Il2rg-/-マウスにおいて転移性部位(+OHT円形)の低下と相関したことを示す。-OHTの正方形および円形は、OHT未処理DP胸腺細胞を注射したレシピエントマウスにおけるiTNKおよび転移性部位をそれぞれ表す。OHT処理DP胸腺細胞を注射したマウスにおいて、脾細胞の約4%は、iTNKであった。
図12. Bcl11bは、Notchシグナル伝達の下流に作用し、T細胞発生を促進し、T細胞の同一性を維持することを示す作動モデル。
図13. Bcl11bは、初期T細胞前駆型において発現され、T細胞分化にとって不可欠である。
a.蛍光基質FDGを使用するBcl11b-lacZノックインマウスからの胸腺細胞におけるBcl11bの発現。DN2〜DN4胸腺細胞はほとんどすべて、FDGについてポジティブに染色された。しかしながら、かなりのDN1集団は、Bcl11bを発現しなかった。
b.5つのDN1サブ集団におけるBcl11b発現の検出。CD117+であり、真のT細胞前駆体を含有すると考えられたDN1aおよびDN1b胸腺細胞の約半分は、Bcl11bを発現した。
c.上、Bcl11bの急性の損失は、OP9-DL1間質細胞上でDN1胸腺細胞にNK特異的遺伝子NK1.1およびNKp46を発現させた。下、DN2胸腺細胞におけるBcl11bの欠失は、T細胞分化の素質を失い、NK様細胞に変換する同じ表現型のもとになった。
図14.
a.左のパネル:CD25およびCD44の発現によって定義される異なるダブルネガティブ(DN)胸腺細胞集団。右のパネル:CD24およびCD117(c-Kit)の発現に基づくDN1胸腺細胞の5つのサブ集団。
b.Bcl11b欠損DN1胸腺細胞を分析するフローチャート。Bcl11b欠損細胞(+OHT)は、NK特性を獲得したが、未処理のもの(-OHT)は、増殖し、OP9-DL1間質細胞上でT細胞に分化した。
図15.
a.ダブルポジティブ(DP)胸腺細胞はBcl11b欠失後にNKp46を発現した。未処理DP細胞は、OP9-DL1間質細胞上で平板培養した約1週間後にT細胞培地中で死んだ(データ示さず)。
b.精製CD8シングルポジティブ細胞(-OHT)は、OP9-DL1間質細胞上で増殖した。それらは、NKp46を発現しなかった。一度Bcl11bが欠失したら、それから、細胞の38%は、NKp46を発現し、間質細胞を死滅させた。これらのiTNKが、なお、TcrβおよびCD8を発現したことに注目されたい。
c.T細胞培地中で成長する精製CD4シングルポジティブ細胞(-OHT)(左)。Bcl11b欠失(+OHT)は、これらのCD4 T細胞にNKp46を発現させた。それからほとんどの細胞がもはやCD4を発現しなかったことに注目されたい。
1.1.1 マウス
Bcl11bコンディショナルノックアウト標的ベクターは、リコンビニアリング(recombineering)を使用して構築し(Liu et al., 2003)、マウス(Bcl11bflox/flox)はES細胞における標準の遺伝子標的アプローチに従って得られた。Bcl11bflox/floxマウスは、Cre-ERT2マウスと交雑し、Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxマウスを生成した。Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxマウスは、混合性のC57BL/6Jおよび129S5の遺伝的背景をしていた。SA-lacZカセットは、Bcl11b-lacZレポーターマウスにおけるBcl11b遺伝子のイントロン3を標的にした(Song-Choon Lee and Pentao Liu、非公開)。マウスはすべて、フローサイトメトリーによってNK1.1+であり、それらが、NK遺伝子複合体にC57BL/6ハプロタイプを受け継いだことを示唆した。Bcl11b tdTomatoレポーターマウスは、Bcl11bの3'UTRにtdTomatoカセットを挿入することによって構築した。Bcl11b tdTomatoマウスは、C57BL/6を背景に持つ。Rag2-/-Il2rg-/-は、C57BL/6を背景に持つ。C57BL/6および129S5の両方は、MHCにH-2bハプロタイプを有する。動物実験はすべて、UK 1986 Animals Scientific Procedure Actおよび地方協会倫理委員会規則に従って実行した。
内因性T細胞のITNKへのin vivo再プログラムについて試験するために、Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxおよびCre-ERT2;Bcl11bflox/+マウスに、3日間連続、経口強制飼養によって、サンフラワーオイル中に溶解した3用量の1mgタモキシフェン(OHTとして本文中に示す)(Sigma)を与えた。in vitro処理胸腺細胞のin vivo再プログラムについては、Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxからの胸腺細胞は、48時間、4-ヒドロキシタモキシフェン(OHTとして本文中に示す)(Sigma)を用いて処理したまたは未処理のままとした。次いで、2〜4×106 DP胸腺細胞は、ソートし、照射なしでRag2-/-Il2rg-/-レシピエントマウスに静脈内注射した。その後、様々な時点で、血液、骨髄、および/または脾細胞を分析のために調製した。
ゲノムDNAを抽出するために、ソートした細胞は、2時間、65℃で、400μlの溶解バッファー(pH8.0を有する50mM Tris、100mM NaCl、pH8.0を有する25mM EDTA、0.5%SDS、および0.5mg/mlプロテイナーゼK)中でインキュベートした。ゲノムDNAは、500μlのイソプロパノールを細胞溶解バッファーに追加することによって沈殿させた。遠心分離後に、DNAは、500μl 70%エタノールを用いて一度洗浄し、PCRのための鋳型として再懸濁する前に風乾した。Bcl11b cko対立遺伝子およびCre-loxP組換え後の欠失は、Table 4(表4)中に記載されるプライマーを用いてPCRによって検出した。TCRβ D-JおよびV-DJを検出するためのPCRプライマーもまた、Table 4(表4)中に列挙する。qRT-PCRについては、RNAは、FACSソート細胞からRNAqueous Micro Kit(Ambion)を使用して単離した。DNase I処理後に、RNAは、Super Script II(Invitrogen)を用いてcDNAを得るために逆転写した。qRT-PCRは、SYBR(Invitrogen)またはTaqman Master Mix(ABgene)を用いて実行した。cDNA投入量を正規化し、PCRを40サイクル実行した。qRT-PCRのためのプライマーをTable 4(表4)中に列挙する。
FDG染色については、細胞は、最初に、上記のように表面染色した。次いで、細胞は、20μlのあらかじめ温めたFDG(Sigma)を追加する前に、5分間温め、さらに1分間温めた。反応は、2.0ml氷冷PBSおよび1%BSAの追加によって止め、細胞は、さらに30分間、氷上でインキュベートした。細胞は、遠心分離し、分析前にPBS中に再懸濁した。
脾臓、胸腺、および骨髄からの細胞は、機械的に破壊し、赤血球は、ACK溶解バッファー(Lonza)を用いて除去した。血液は、EDTAチューブ(Sarstedt)に収集した。in vitro培養細胞は、収集し、抗体標識前にPBS/1%BSAを用いて洗浄した。すべての細胞について、Fc受容体は、抗体標識前に抗CD16(2.4G2)を用いてブロックした。以下の抗原に対する抗体を使用した:CD3ε(145-2C11)、CD4(L3T4)、CD8α(53-6.7)、CD25(PC61)、CD44(IM7)、CD122(TM-β1)、CD27(LG.3A10)、CD11b(M1/70)、CD45.2(104)、TCRβ(H57-597)、CD117(2B8)、NK1.1(PK136)、CD49b(DX5)、NKp46(29A1.4)、Ly49C/I(5E6)、Ly49G2(4D11)、Ly49D(4E5)。抗体はすべて、BD BiosciencesまたはeBioscienceからのものとした。細胞は、洗浄する前に4℃で30分間、抗体と共にインキュベートした。いくつかの場合では、ビオチン化抗体は、4℃での、さらに20分間の蛍光色素コンジュゲートストレプトアビジンとのインキュベーションによって明らかにした。CD1d制限NKTは、α-ガラクトシルセラミド(Kirin)をロードしたCD1d-マウスIgG1 Fc融合タンパク質(BD Biosciences)、その後に蛍光色素コンジュゲート抗マウスIgG1(BD Biosciences)を用いて、細胞を標識することによって検出した。データ獲得は、FACSCalibur(BD Biosciences)、LSR II(BD Biosciences)、またはFC 500(Beckman Coulter)を使用して実行し、死細胞は、散乱プロファイルまたはDAPI包含に基づいて排除した。分析は、FlowJo(Tree Star)ソフトウェアを使用して実行した。ソーティングは、MoFloまたはFACS Aria(DAKO)(BD Biosciences)を使用して実行した。
OP9間質細胞は、10%FCS(30分間、56℃で熱不活性化)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン(Life Technologies)を有するアルファ-MEM(Sigma)中で培養した。OP9-DL1間質細胞は、20%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン(Life Technologies)を有するアルファ-MEM(Sigma)中で培養した。細胞は、トリプシン処理(Invitrogen)によって2〜3日間ごとに継代した。単層(70%〜80%コンフルエント)のOP9またはOP9-DL1細胞を同時培養の24時間前に調製した。
Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxマウスからの胸腺細胞または脾細胞は、48時間、37℃で、1μM 4-ヒドロキシタモキシフェン(OHTとして本文中に示す)を用いてT細胞培地中で培養した。この後に、細胞は、洗浄し、新鮮な培地を用いて再懸濁した。T細胞培地:RPMI-1640、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、5ng/ml muFlt-3L、5ng/ml huIL-7。この研究中で使用したサイトカインはすべて、PeproTechから購入した。
OHT処理後に、胸腺細胞は、FACSによってソートし、T細胞培養基中でOP9-DL1と同時培養した(24ウェルプレート中ウェル当たり3,000の細胞)。ITNK増殖を促進するために、20ng/ml muIL-15または100ng/ml huIL-2を、示すように、T細胞培地中に補足した。3日ごとに、培地の半分を、本文中に示されるように、IL-15またはIL-2を有する新鮮なT細胞培地と交換した。7日ごとに、細胞は、勢いよくピペット操作することによって収集し、細胞ストレーナーでろ過し、新鮮なOP9-DL1間質細胞をあらかじめ接種した新しい組織培養プレートに移動させた。OHT処理の14日間後に、細胞は、収集し、FACSによって分析した。骨髄細胞分化条件におけるITNK産生の分析については、IMDMは、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1ng/ml huIL-7、5ng/ml muFlt-3L、10ng/ml huIL-3、huIL-6、幹細胞因子(muSCF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(muGM-CSF)を補足して使用した。細胞は、OP9間質細胞上で培養した。B細胞分化条件におけるITNK産生の分析については、IMDMは、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、5ng/ml huIL-7、5ng/ml muFlt-3Lを補足して使用した。細胞は、OP9間質細胞上で培養した。
Cre-ERT2;Bcl11bflox/floxの胸腺細胞を、上記のようにOHTを用いて処理した。単一DN3胸腺細胞は、100ng/ml huIL-2を補足したT細胞培地中のOP9-DL1間質細胞をあらかじめ接種した96ウェルプレートの個々のウェルに直接ソートした。培地は、3日ごとに交換した。10〜14日後に、細胞は、フローサイトメトリーで分析した。ゲノムDNAは、Bcl11b座の遺伝子型同定のためにおよびPCRを用いるβTCR再編成の増幅のために抽出した。
B16F10メラノーマ(H-2b)、RMAリンパ腫、およびRMA-Sリンパ腫(H-2b TAP-1-欠損変異体)は、RPMI-1640、5%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン中で維持した。致死アッセイのために、標的細胞は、37℃で、45分間、0.1μCi Na2 51CrO4(Perkin Elmer)を用いて洗浄し、インキュベートした。次いで、細胞は、洗浄し、示すE:T比でエフェクター細胞に3度追加した。上清をシンチレーションカウンターにおいてクロム放出について試験する前に、プレートは37℃で4時間インキュベートした。特異的溶解パーセントは、(実験による放出-自発的な放出)/(最大の放出-自発的な放出)×100として計算した。
Cre-ERT2からの胸腺細胞;Bcl11bflox/floxは、上記のようにOHTを用いて処理した。2〜4×106 DP胸腺細胞は、ソートし、照射なしでRag2-/-Il2γc-/-レシピエントマウスに静脈内注射した。その後、様々な時点で、血液および/または脾細胞を分析のために調製した。
ex vivo増殖のために、脾臓ITNK細胞は、NK単離キット(Miltenyi)を使用して濃縮し、10% FCS/50μM 2-メルカプトエタノール/2.0mM L-グルタミン、および1000U/ml hIL-2(Chiron)を含有するRPMI 1640培地中で1×106細胞/mlで6〜9日間、培養した。細胞は、2日ごとに分割し、新鮮なIL-2を補足した。純度は、常に>90%とした。ex vivoで再プログラムITNK細胞を培養するために、全脾細胞は、あらかじめ濃縮することなく培養した。
OHT処理後に、2〜4×106 DP T細胞をCre-ERT2;Bcl11bflox/flox胸腺細胞からソートし、照射なしでそれぞれのRag2-/-Il2rg-/-レシピエントマウスに静脈内注射した。2週間後に、5×104 B16F10メラノーマ細胞を静脈内注射し、肺コロニーを腫瘍接種の14日後に数えた。
flox/floxまたはflox/+マウスを、タモキシフェンを用いて処理し、上記に記載されるようにin vivo再プログラムITNKを誘導し、脾細胞を4〜5週間後に分析した。脾細胞は、表現型を同定するためにNKp46、NK1.1、CD8、およびCD3に対する抗体を用いて直接染色したまたは2μM Indo-1(Invitrogen)をロードし、洗浄し、NKp46、NK1.1、およびCD8に対する抗体を用いて染色した。次いで、データは、リンパ球をゲート制御するLSR IIフローサイトメーターを使用して獲得し、時間に対するIndo-1(紫色)/Indo-1(青)比を測定した。非刺激細胞は、獲得を中断する前に、ベースラインIndo-1(紫色)/Indo-1(青)蛍光を確立するために流し、抗CD3(145-2C11;10μg/ml)を追加し、獲得を継続した。獲得をさらに中断し、架橋抗ハムスターIgG二次抗体を継続前に追加し、イオノマイシン(1μg/ml)は、ポジティブコントロールとして提供するために獲得の終了時に追加した。
RNAは、FACSソート細胞からRNAqueous Micro Kit(Ambion)を使用して抽出した。RNA試料の品質および量は、バイオアナライザーを用いて試験した。全RNAは、メーカーの指示に従って、Illumina Total Prep RNA Amplification Kit(Ambion)を使用して増幅した。ビオチン化cRNA(試料当たり1500ng)は、Illumina Mouse-6 Expression BeadChipsにかけ、一晩、58℃でハイブリダイズした。チップは、洗浄し、検出し、メーカーの指示に従ってスキャンし、スキャナ出力は、BeadStudioソフトウェア(Illumina)にインポートした。
クロマチン免疫沈降は、以前に記載されたように実行した。コントロールIgGおよびCSL抗体は、Abeamから購入した。ゲノムDNAは、Qiaquick PCR精製キット(QIAGEN)を用いて精製し、特異的なゲノムDNA領域は、Taqman(ABI)またはSYBR Green(Invitrogen)を用いてリアルタイム定量PCRによって定量した。IP後に回収されたDNAの濃度を定量するために、投入量DNAは標準曲線として使用した。それぞれのChIP試料から回収したDNAの量はコントロールIgGと比較して示した。このアッセイ中で使用したプライマーは、Table 4(表4)中に列挙する。
Claims (45)
- T細胞および/またはプロT細胞由来の、T細胞から誘導されたナチュラルキラー細胞(ITNK)細胞を作製するための方法であって、T細胞および/またはプロT細胞中に存在する少なくとも1つのBcl11b遺伝子および/またはタンパク質の活性および/または効果を調整する工程ならびに前記T細胞および/またはプロT細胞をITNK細胞に変換する工程を含む方法。
- 標的T細胞および/または標的プロT細胞を作製するための方法であって、T細胞および/またはプロT細胞中に存在する少なくとも1つのBcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の活性および/または効果を調整する工程、ならびに前記T細胞および/またはプロT細胞を前記標的T細胞および/または標的プロT細胞に変換する工程を含む方法。
- 前記Bcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の活性および/または効果の前記調整が、前記活性および/または効果を阻害することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Bcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の活性および/または効果の前記阻害が、エクソン4などのような前記Bcl11b遺伝子の少なくとも一部分の欠失を含む、請求項3に記載の方法。
- Bcl11b遺伝子の全体または実質的に全体が、欠失している、請求項4に記載の方法。
- 前記Bcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の活性および/または効果の前記調整が、前記Bcl11b遺伝子の遺伝子発現の調整を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Bcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の活性および/または効果の前記調整が、前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果を直接または間接的に調整することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果を直接または間接的に阻害することを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果の前記調整または阻害が、前記Bcl11bタンパク質が関与する生物学的経路における下流の調整をもたらす、請求項7または8に記載の方法。
- 前記下流の調整が、前記生物学的経路における下流標的の存在および/または活性および/または効果を調節する、請求項9に記載の方法。
- 前記前駆型または標的T細胞またはプロT細胞が、以下の細胞型:幹細胞、IPS細胞、CLP、DN1、DN2、DN3、DN4、CD4、またはCD8細胞の1つまたは複数を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞またはプロT細胞から取得可能であるまたは取得されるITNK細胞。
- T細胞またはプロT細胞が前記ITNK細胞に変換することができるように、活性および/または効果が調整されている、少なくとも1つのBcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物を含む、請求項12に記載のITNK細胞。
- 請求項1または請求項3〜11のいずれか一項に記載の方法を実行することによって取得可能であるまたは取得されるITNK細胞。
- 宿主からのその排除を少なくとも容易にするために、自殺遺伝子または他のメカニズムをさらに含む、請求項12〜14に記載のITNK細胞。
- 標的T細胞または標的プロT細胞がITNK細胞に変換することができるように、活性および/または効果が、前駆T細胞または前駆プロT細胞における対応する遺伝子および/またはタンパク質産物と比較して調整されている、少なくとも1つのBcl11b遺伝子産物および/またはタンパク質産物を含む標的T細胞または標的プロT細胞。
- 前記Bcl11b遺伝子および/またはタンパク質産物の前記活性および/または効果が、前記前駆T細胞または前駆プロT細胞における対応する活性と比較して阻害されている、請求項16に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- エクソン4などのような、前記Bcl11b遺伝子の少なくとも一部分が欠失している、請求項17に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- Bcl11b遺伝子全体または実質的に全体が、欠失している、請求項18に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記Bcl11b遺伝子の遺伝子発現が、前記前駆T細胞または前駆プロT細胞における遺伝子発現と比較して調整されている、請求項16に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果が、前記前駆T細胞または前駆プロT細胞における前記Bcl11bタンパク質の対応する活性および/または効果と比較して調整されている、請求項16に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果が、前記前駆T細胞または前駆プロT細胞における前記Bcl11bタンパク質の対応する活性および/または効果と比較して、直接または間接的に阻害されている、請求項21に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記Bcl11bタンパク質の活性および/または効果が、前記Bcl11bタンパク質が関与する生物学的経路における下流の調整をもたらすように調整されている、請求項21に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記下流の調整が、前記生物学的経路における下流標的の存在および/または活性および/または効果を調節する、請求項23に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 請求項2〜10のいずれか一項に記載の方法を実行することによって取得可能であるまたは取得される標的T細胞またはプロT細胞。
- 前記前駆型または標的T細胞またはプロT細胞が、以下の細胞型:幹細胞、IPS細胞、CLP、DN1、DN2、DN3、DN4、CD4、またはCD8細胞の1つまたは複数を含む、請求項16〜25のいずれか一項に記載の標的T細胞またはプロT細胞。
- 以下の特性:
(a)T細胞と比較してナチュラルキラー細胞と類似する形態、
(b)TCRβ特異的ゲノムDNA再編成、
(c)ITNK細胞を発生させた親細胞よりも、LAK細胞などのようなNK細胞の遺伝子発現プロファイルにより類似する遺伝子発現プロファイル、
(d)ZFP105、IL2Rβ、Id2、JAK1、NKG2D、NKG2A/C/E、B220、Rog(Zbtb32)、Tnfrsf9、Cdkn1c、Trail、パーフォリン、インターフェロン-γ、NK1.1、NKp46、E4bp4、NKG7、KLRD1、LTA、PLCG2、Ly49C/I、およびLy49G2などのような1つまたは複数のNK特異的遺伝子の細胞発現、
(e)ITNK細胞が由来する親細胞と比較して、Notch1、Est1、Hes1、Gata3、Deltax1、TCRβ、CD3、Tcf1、IL7R、T-bet、および/またはCD8aの発現の減少または無発現などのような、1つまたは複数のT系列遺伝子の発現の減少または無発現、
(f)細胞死滅能力、たとえば、使用される前駆細胞(親T細胞またはプロT細胞)と適切に比較して、腫瘍の形成または成長を予防するまたは改善する能力、間質細胞、腫瘍細胞、または感染細胞を死滅させる能力、
(g)MHC-I分子を認識することができ、in vivoで作製された場合にMHC-Iポジティブ細胞またはネガティブ細胞を死滅させることができること
の1つもしくは複数またはすべてを示すことを特徴とするITNK細胞。 - 請求項12〜14もしくは請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞または請求項16〜26のいずれか一項に記載の標的T細胞もしくは標的プロT細胞を、そのための薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
- 疾患の予防または治療などのような医療における使用のための、請求項12〜15もしくは請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞または請求項16〜26のいずれか一項に記載の標的T細胞もしくは標的プロT細胞。
- 癌療法における使用またはウイルス感染症などのような感染症の予防のための、請求項12〜15もしくは請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞または請求項16〜26のいずれか一項に記載の標的T細胞もしくは標的プロT細胞。
- 癌またはウイルス感染症の治療または予防のための医薬の製造における、請求項12〜15もしくは請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞または請求項16〜26のいずれか一項に記載の標的T細胞もしくは標的プロT細胞の使用。
- 疾患の予防または治療などのような医療における使用のための、Bcl11b発現がダウンレギュレートされたまたは不在である成熟活性化T細胞。
- 癌療法における使用またはウイルス感染症などのような感染症の予防のための、Bcl11b発現がダウンレギュレートされたまたは不在である成熟活性化T細胞。
- 癌またはウイルス感染症の治療または予防のための医薬の製造における、Bcl11b発現がダウンレギュレートされたまたは不在である成熟活性化T細胞の使用。
- 癌またはウイルス感染症などのような疾患に罹患しているまたはそれに対して感受性のヒトまたは非ヒト哺乳動物の対象を治療するための方法であって、治療有効量の、請求項12〜15もしくは27のいずれか一項に記載のITNK細胞、または請求項32〜34のいずれか一項に記載の細胞、または請求項28に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
- 癌またはウイルス感染症などのような疾患に罹患しているまたはそれに対して感受性のヒトまたは非ヒト哺乳動物の対象を治療するための方法であって、T細胞またはプロT細胞におけるBcl11b遺伝子またはタンパク質の発現、活性、および/または効果を調整または阻害し、かつこれらのT細胞またはプロT細胞のITNK細胞への変換を引き起こす、治療有効量の化合物を対象に投与する工程を含む方法。
- Bcl11bの発現、活性、および/または効果を調整または阻害する化合物は、アンチセンスRNAまたは低分子干渉RNA(siRNA)またはmiRNAである、請求項3に記載の方法。
- 1つまたは複数の抗癌剤、抗ウイルス剤、または治療計画と組み合わせた、請求項12〜15または請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞。
- 抗癌療法における同時、別々、または連続的使用のための複合調製物としての、請求項12〜15または請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞および1つまたは複数の抗癌剤を含有する産物。
- 抗ウイルス療法における同時、別々、または連続的使用のための複合調製物としての、請求項12〜15または請求項27のいずれか一項に記載のITNK細胞および1つまたは複数の抗ウイルス剤を含有する産物。
- 前記Bcl11b遺伝子産物および/またはタンパク質産物が相互作用する、またはそれに関して効果を有する、下流標的を同定するためのアッセイであって、潜在的な下流標的に対する、Bcl11b遺伝子またはタンパク質の調整の効果をモニターする工程および発現がBcl11b調整によって影響を与えられる標的を選択する工程を含むアッセイ。
- T細胞のITNK細胞への変換をモニターすることをさらに含む、請求項41に記載のアッセイ。
- (i)前記Bcl11b遺伝子産物の活性および/もしくは効果を調整するように、前記Bcl11b遺伝子産物および/もしくはタンパク質産物と相互作用する、または(ii)前記下流標的の活性および/もしくは効果を調整するように、前記下流標的と相互作用する、調整因子を同定する工程をさらに含み、それによって、(i)または(ii)に従ってそのように調整されるT細胞またはプロT細胞が、1つまたは複数のITNK細胞に変換される、請求項41または42に記載のアッセイ方法。
- 請求項12〜15もしくは27のいずれか一項に記載のITNK細胞および/または請求項16〜26のいずれか一項に記載の標的T細胞もしくはプロT細胞を有するヒトもしくは非ヒト動物。
- ヒトまたは胚性幹細胞などのようなプロT細胞中に存在する、少なくとも1つのBcl11b遺伝子および/またはタンパク質の活性および/または効果を刺激する工程を含む、T細胞産生を刺激するための方法。
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