CN111849919A - 一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。所述工程化免疫细胞提高基因编辑方法重编程得到，是一种同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞，其具有较好的抗病毒活性，能够分泌IFNγ，实现对病毒包括冠状病毒在内的抑制和杀伤效果；同时，所述工程化免疫细胞能够在体外大量繁殖，解决了NK细胞在体外难以扩增的问题。

Description

一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。
背景技术
细胞重编程(cell reprogramming)指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。在疾病的免疫治疗领域，已有通过细胞重编程来实现免疫细胞的类型转化的相关报道。例如，格拉斯通研究所(Gladstone Institutes)曾报道，通过特定的重编程方法，将促炎的效应T细胞重编程为抗炎的调节性T细胞；这种重编程对于自身免疫性疾病的治疗意义重大，具体地，在自身免疫性疾病中，被过度激发的效应T细胞会对机体造成损害，将这些细胞转化为调节性T细胞有助于减少免疫系统的过度活跃，使其恢复平衡，从而根本上治疗疾病。
目前，尚未见细胞重编程在人类感染疾病治疗中的应用。
冠状病毒(COV)是迄今为止已知的一类具有广泛自然宿主的RNA病毒，其中，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)对公众健康构成了威胁。在许多病毒感染患者体内淋巴细胞，特别是自然杀伤细胞(NK细胞)水平下降。而NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，通过NKp46等NCR受体识别病毒及被病毒感染的细胞，参与多种病毒的免疫应答反应。NK细胞占外周血淋巴细胞约10～15％，是在天然免疫响应中起关键作用的淋巴样细胞。
与T细胞不同的是，NK细胞以MHC非限制性方式识别其靶标。NK细胞可呈现抗病毒作用和抗癌作用。尽管NK细胞具有作为对抗感染性疾病或癌症的治疗剂的潜力，但是正常人体内大多的NK细胞以休眠状态存在，且NK细胞在体外难以大量培养很难应用于抗病毒治疗。因此，在体外获得足够数量的自然杀伤细胞十分重要。
因此，提供一种能够在体外大量扩增且具有抗病毒作用的工程化免疫细胞对人类感染疾病治疗具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用。利用细胞重编程方法构建出具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，所得工程免疫细胞兼具T细胞和NK细胞的功能，同时还可以在体外大量扩增。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。
本发明所述的工程化免疫细胞是能够同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞，由T细胞重编程得到，所述T细胞可以从外周血和脐带血血液中分离，也可以由多能干细胞、造血干细胞定向诱导分化而来；所述工程化免疫细胞可以同时表达NK细胞和T细胞的抗原来识别和杀伤受体，说明其相比于NK细胞和T细胞具有更好的抗病毒能力；同时，所述工程化免疫细胞具有较好的体外扩增能力，可以解决了功能性NK细胞在体外难以扩增的难题。
其中，所述NK细胞标志物包括CD16、CD56、CD69、NKp46、NKp30或NKp44中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述T细胞标志物包括CD3。
第二方面，本发明提供一种工程免疫细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；
(2)通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养后得到所述工程免疫细胞。
本发明中，通过构建CRISPR/CAS9基因敲除载体，将T细胞重编程为ITNK细胞，所得工程化免疫细胞同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物，具有更好的抗病毒能力；同时，使用所述方法构建得到的工程化免疫细胞具有较好的体外扩增能力，解决了功能性NK细胞在体外扩增难的问题。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子、第三外显子或第四外显子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述gRNA敲除靶基因的第二外显子和/或第三外显子。
优选地，所述gRNA的靶位点包括核苷酸序列GNNGG或CCNNC，所述N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种。优选地，所述N为鸟嘌呤。
作为本发明优选的技术方案，所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1～17所示。
优选地，步骤(1)所述gRNA包括正向引物和反向引物。
优选地，步骤(1)所述gRNA包括SEQ ID NO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合。优选地，所述gRNA包括如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:50和SEQID NO:51所示的序列。
根据CRISPR/CAS9靶位点的选择规则，以GN19NGG靶点序列，其中N19是靶位点，N最优选择为G，同时靶位点也可以在反义链上(即，在正义链上的序列顺序为：CCNN19C)，选择了靶点序列并分别设计了正向(F)、反向(R)引物作为guideRNA(gRNA)。
其中，靶点序列如表1所示：
表1
编号 序列(5′-3′)
SEQ ID NO:1 GACCCTGACCTGCTCACCTG
SEQ ID NO:2 GAAGCAGTGTGGCGGCAGCT
SEQ ID NO:3 CAGGTGGTCATCTTCGTCGG
SEQ ID NO:4 GCAGGTGGTCATCTTCGTC
SEQ ID NO:5 GCTCAGGAAAGTGTCCGAGC
SEQ ID NO:6 GAGTCCCGTCACCCGAGACC
SEQ ID NO:7 GAAGTGATCACGGATGAGTG
SEQ ID NO:8 GGTGACGGGACTCAGGGTGA
SEQ ID NO:9 TGCAGCGCGCGCCCGGTCTC
SEQ ID NO:10 CACGAGAGCGACCCGTCGCT
SEQ ID NO:11 GCGACGGGTCGCTCTCGTGG
SEQ ID NO:12 TCCATGCTGAAGCTCGACTC
SEQ ID NO:13 ACGGGTCGCTCTCGTGGTGG
SEQ ID NO:14 AGCCGCAACCGCGAGAACGG
SEQ ID NO:15 GCAACTTGACGGTGCACCGG
SEQ ID NO:16 GAGCTGGGCCGCCCGGGGCC
SEQ ID NO:17 GGTCAGACGGAGGCTCCCTT
其中，gRNA的序列如表2所示(其中)：
表2
Figure BDA0002600936350000031
Figure BDA0002600936350000041
将gRNA退火、连接到酶切好的PX458载体上，构建载体PX458-gBCL11B。
在293T细胞系中转染PX458-gBCL11B，并挑取单克隆，通过基因测序检测其中BCL11B敲除靶点的碱基缺失、错位等敲除情况，并统计计算敲除效率，所得结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0002600936350000042
Figure BDA0002600936350000051
根据上述的敲除效率情况，选择敲除第二、第三外显子的gRNA基因敲除质粒载体，用于下一步实验。
本发明优选在第二外显子、第三外显子中进行BCL11B基因敲除，利用第二外显子敲除效率最低的第一对gRNA和第二对gRNA的混合物，敲除效率最高的第三对gRNA，第三外显子敲除效率最低的第一对gRNA对应的基因敲除质粒以及它们的混合物均能将T细胞进行重编程，获得本发明的免疫杀伤淋巴细胞，但是敲除效率的高低直接影响ITNK细胞的比例高低，敲除效率越高获得的ITNK细胞比例越高。
优选地，步骤(2)所述电转化时CRISPR/CAS9基因敲除载体的浓度为20～50ng/μL，例如可以是20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL或50ng/μL等。
优选地，步骤(2)所述电转化时激活的T细胞的浓度为(0.8～1.2)×106个/mL，例如可以是0.8×106个/mL、0.85×106个/mL、0.9×106个/mL、0.95×106个/mL、1×106个/mL、1.05×106个/mL、1.1×106个/mL、1.15×106个/mL或1.2×106个/mL等。
通过电转仪(T-023，LONZAAmaxa Nucleofector，Lonza)将CRISPR/CAS9敲除载体PX458-gBCL11B通过电转化的方法转导入激活后的T细胞中，12h后，将PX458-gBCL11B转导的T细胞(简称PX458-T)离心，并用T551-H3培养基培养。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述培养时使用的培养基包括T551-H3(Takara，Japan)培养基。所述培养基中还含有5％自体血浆或胎牛血清(FBS)、500IU/mLhIL2和20μg/mL硫酸庆大霉素。
优选地，步骤(2)所述培养的时间为10～18天，例如可以是10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或18天等。
优选地，步骤(2)所述培养时培养基中的细胞密度为(0.5～1)×106个/mL，例如可以是0.5×106个/mL、0.6×106个/mL、0.7×106个/mL、0.8×106个/mL、0.9×106个/mL或1×106个/mL等。培养过程中，每3天更换新鲜培养基，保持细胞密度在(0.5-1)×106个/mL范围内，直至电转后第14天。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述T细胞采用Ficoll密度梯度离心法进行分离。优选地，步骤(2)中所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选。
优选地，步骤(2)中所述激活的方法为：使用包被抗人CD3、CD28和CD2的磁珠与T细胞混合孵育，得到所述激活的T细胞。优选地，所述T细胞的细胞密度为(2～4)×106个/mL，例如可以是2×106个/mL、2.2×106个/mL、2.5×106个/mL、2.6×106个/mL、3×106个/mL、3.2×106个/mL、3.5×106个/mL、3.6×106个/mL、3.8×106个/mL或4×106个/mL等，优选为2.5×106个/mL。优选地，所述混合孵育的时间为24～48h，例如可以是24h、26h、30h、32h、34h、36h、40h、44h或48h等。
本发明中，可以采用以下方法进行T细胞的分选和激活：
(i)分别将包含人成熟T细胞的外周血和脐带血血液以200～500g(例如可以是200g、250g、300g、350g、400g、450g或500g等)离心，收集血浆，在56℃下热灭活一定时间；
(ii)将沉淀的颗粒状血细胞用0.9％NaCl悬浮，通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)；
(iii)通过MACS Pan T分离试剂盒阴性分选，从血液如外周血、脐带血等富集全部T细胞(Pan T)
以上步骤(i)～(iii)为从外周血和脐带血血液中分离人成熟T细胞的步骤，需要说明的是，其它T细胞来源亦可，如来自多能干细胞、造血干细胞定向诱导分化等。
所有来源的T细胞均利用T细胞活化试剂盒(T cell activation kit)进行激活，使用包被着抗人CD3、抗人CD28抗体和抗人CD2的磁珠与T细胞以体积比1:2混合孵育激活，其中，T细胞密度为(2～4)×106个/mL；所用培养基为含有5％自体血浆、100IU/mL hIL2、20μg/mL硫酸庆大霉素、10mm HEPES、2mm谷氨酰胺和1％双抗(青霉素和链霉素)的T551-H3培养基；活化24～48h后，将T细胞从抗生物素MACS iBeadTM颗粒中洗脱，备用。
第三方面，如第一方面所述的工程化免疫细胞在研究病毒致病机理、构建动物模型或评估病毒药物治疗效果中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的工程化免疫细胞兼具T细胞和NK细胞的表面标志物和功能，同时表达NK细胞和T细胞的抗原识别杀伤受体，因此所述工程化免疫细胞比NK细胞和T细胞本身具有更好的抗病毒能力，在病毒感染的第0～3h时加入所述工程化免疫细胞，能够有效减少病毒的生长和繁殖，达到抑制病毒增殖的目的；
(2)本发明中通过基因编辑技术将T细胞重编程为ITNK细胞，所述重编程方法简单、高效，电转T细胞14天后，所得细胞中有部分细胞成功转化为所述ITNK细胞，即工程化免疫细胞；所述构建方法使T细胞具有NK细胞的功能并且可以在体外大量扩增，解决了功能性NK细胞在体外难以培养的难题。
附图说明
图1为实施例1中构建的质粒PX458-gBCL11B的结构示意图。
图2为通过基因测序检测BCL11B敲除靶点的敲除情况示意图。
图3为实施例1中所得ITNK细胞的流式细胞仪检测散点图。
图4为实施例4中不同组处理后SARS-CoV-2假病毒后检测得到的GFP含量柱状图。
图5为实施例5中不同组处理感染慢病毒的ALM6细胞后检测得到的GFP含量柱状图。
图6为实施例6中病毒在单独培养、与ITNK细胞共培养和与T细胞共培养时IFNγ的浓度柱状图。
图7为实施例7中对ITNK细胞对NP40-GL EBV+和NP40-GL EBV-的杀伤率曲线。
图8为实施例7中对ITNK细胞和T细胞对NPC43-GL EBV+的杀伤率曲线。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，采用的实验步骤或方法则均可采用本领域常规的技术手段得到；所用实验试剂均可通过常规渠道或常规厂商获得。
实施例1
本实施例提供一种构建具有抗病毒活性的工程免疫细胞，所述细胞记为ITNK细胞，其构建方法包括如下步骤：
(1)基因敲除载体的构建：在本实施例中，采用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQID NO:36和SEQ ID NO:37的gRNA分别构建BCL11B基因敲除质粒并将其混合，所得质粒PX458-gBCL11B的部分结构如图1所示；
在293T细胞系中转染PX458-gBCL11B，并挑取单克隆，通过基因测序检测其中BCL11B敲除靶点的碱基缺失、错位等敲除情况(如图2)，结果显示，靶标位点被成功敲除。
(2)T细胞的分选和激活
本实施例中从人成熟T细胞的外周血和脐带血中分离T细胞：(i)分别将包含人成熟T细胞的外周血和脐带血血液以300g离心10min，收集血浆，在56℃下热灭活30min；(ii)将沉淀的颗粒状血细胞用0.9％NaCl悬浮，通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)；(iii)通过MACS Pan T分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)阴性分选，富集全部T细胞(Pan T)；(iv)所得T细胞利用T细胞活化试剂盒(Miltenyi Biotec)进行激活，使用包被着抗人CD3、抗人CD28抗体和抗人CD2的磁珠与T细胞以1:2混合孵育激活，活化24h后，将T细胞从抗生物素MACS iBeadTM颗粒中洗脱，备用；
(3)诱导重编程
(i)通过电转(T-023，LONZA Amaxa Nucleofector，Lonza)，将CRISPR/CAS9敲除载体PX458-gBCL11B转导入上述激活后的T细胞；
(ii)12h后，将PX458-gBCL11B转导的T细胞(简称PX458-T)离心，并用T551-H3(Takara，Japan)培养基(含有5％自体血浆或胎牛血清(FBS)，500IU/ml hIL2和硫酸庆大霉素(20μg/mL))培养；
(iii)随后每3天更换新鲜培养基，保持细胞密度在(0.5～1)×106个/mL范围内，直至电转后第14天。
(4)重编程细胞的表型鉴定
电转T细胞14天后，对所得细胞进行表型鉴定，所得结果如图3所示，其中Mock T表示空白对照，NK表示正常的NK细胞，所得结果可知细胞中有存在既表达T细胞标志物CD3，也表达NK细胞标志物如CD56和NKp46的细胞亚群，因此确定获得了本发明的ITNK细胞。
实施例2
本实施例中提供一种含绿色荧光蛋白基因的SARS-CoV-2假病毒，具体的包装方法为：
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基，培养2h后，开始步骤(2)；本实施中所述培养基均为含有10％FBS和1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)的DMEM高糖培养基。
(2)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，并且加入7.2μL浓度为10μg/μL PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(3)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，取表达绿色荧光蛋白的质粒9μg、SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒15μg、psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀；
(4)待步骤(2)完成后，将步骤(3)的溶液与之混合，颠倒混匀，静置20min；
(5)将步骤(4)中的溶液全部加到步骤(1)中的细胞中，孵育6h之后，更换新鲜的培养基7mL，24h收集上清，更换新鲜的培养基7mL；
(6)24h后再次收集上清，更换新鲜的培养基7mL；
(7)24h后再次收集上清，并且丢弃细胞；
(8)培养基上清收集完毕后，将上清2500g离心0.5h后取离心上清，用0.45μm过滤器过滤，得到假病毒原液；
(9)将假病毒原液置于30KD超滤管中，5000rcf离心20min后收集浓缩液，利用AKTApure快速蛋白纯化系统将浓缩液纯化即可获得纯化SARS CoV-2假病毒。
实施例3
本实施例利用实施例2中制备的表达绿色荧光蛋白的SARS-CoV-2假病毒感染ACE2-tCD19细胞系。
(1)将培养皿中过表达ACE2-tCD19的BGC823细胞用0.25％胰蛋白酶消化5min，加入培养基终止消化并收集细胞悬液，置于15mL离心管中300g离心5min，弃去上清后用3mL新鲜培养基重悬；本实施例中所述培养基为含有5％FBS和1％双抗的1640培养基。
(2)对细胞进行计数，将1×105个BGC823细胞悬接种在24孔板中，每孔加入1mL培养基；
(3)将实施例2中纯化好的带有绿色荧光蛋白基因的SARS-CoV-2假病毒加入到过表达ACE2-tCD19的BGC823细胞中，每孔50μL；
(4)培养12h后更换新鲜培养基1mL；
(5)72h后弃去24孔板中的培养基，加入0.25％胰蛋白酶1mL，消化5min后加入3mL培养基终止消化；
(6)收集细胞悬液，300g离心5min后弃去上清，加入1mL pH 7.4的PBS重悬，取100μL进行流式检测；
实验结果证明，所得SARS-CoV-2假病毒可以特异性地感染过表达ACE2-tCD19的BGC823细胞系
实施例4
本实施例中用于检测实施例1中制备的ITNK细胞的抗SARS-CoV-2假病毒能力。
(1)将5×104个表达ACE2的BGC823细胞接种到24孔板中，并加入1mL培养基进行培养(培养基为含有5％FBS和1％双抗的1640培养基)。
(2)每孔加入20μL实施例2中制备的带有绿色荧光蛋白标记基因的SARS-CoV-2假病毒；
(3)每孔加入2.5×104NKP30阳性的ITNK细胞，同时在对照孔中加入总数与ITNK细胞一致的经过激活的T细胞；
(4)12h后吸去上清，并收集于1.5mL管中，并且用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗2次，检测IFN-γ水平；
(5)36h后利用流式细胞仪检测各组表达绿色荧光蛋白的细胞比例；
结果见图4所示，空白组(仅含有假病毒)的荧光表达量最高，实验组(含有假病毒和ITNK细胞)的荧光表达量明显低于空白组和对照组(含有假病毒和激活的T细胞)；说明本发明中制备的ITNK细胞能够抑制SARS-CoV-2病毒的生长和复制。
实施例5
本实施例用于检测实施例1提供的ITNK细胞预防和抑制抗慢病毒感染的能力，本实施例所使用靶细胞是病毒感染的NALM6细胞系，感染用的病毒是带有GFP的慢病毒。
(1)制备含绿色荧光蛋白基因的慢病毒，具体的包装方法与实施例2的区别在于：将步骤(3)中SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒15μg替换为PMD.G质粒3μg，其余步骤与实施例2中所述步骤相同，最终获得纯化的包含绿色荧光蛋白基因的慢病毒；
(2)将5×104NALM6细胞接种到24孔板中，并加入1mL培养基进行培养；
(3)每孔加入20μL纯化的带有绿色荧光蛋白标记基因的慢病毒；
(4)每孔准备2.5×104NKP30阳性的ITNK细胞，分别于病毒感染12h、3h、1h以及病毒感染同时加入ITNK细胞；
(5)36h后利用流式细胞仪检测各组表达绿色荧光蛋白的细胞比例；
结果如图5所示，在病毒感染同时、第1h、第3h加入ITNK细胞，所得到的绿色荧光蛋白均小于不加入ITNK细胞；
证明ITNK细胞可以有效减少病毒对NALM6细胞的感染，同时若是在病毒感染12h后再加入ITNK细胞，则无法达到减少细胞感染的效果。
实施例6
本实施例用于检测实施例1中制备的ITNK细胞中IFNγ的分泌水平。
(1)收集ITNK细胞与病毒感染细胞共培养的上清，使用达优Human IFN-γPrecoated ELISA Kit(货号1110003)试剂盒中的样品稀释液对共培养上清进行3倍稀释；
(2)取100μL上清稀释物加入到试剂盒的孔板中，每孔加入50μL稀释好的检测抗体，室温孵育2h；
(3)弃去孔板中的液体，每孔加入300μL清洗液静置1min重复三次后弃去孔板中的液体并甩干；
(4)每孔加入100μL链霉素标记的辣根过氧化物酶稀释液，室温孵育20min；
(5)弃去孔板中的液体，每孔加入300μL清洗液静置1min重复三次后弃去孔板中的液体并甩干；
(6)每孔加入100μL TMB，室温避光孵育10min后加入100μL浓硫酸终止反应，在酶标仪中检测450nm波长的吸收值；
所得结果如图6，加入ITNK细胞的实验组中IFNγ的含量较高，而对照组中均未检测到IFNγ。
实施例7
本实施例用于检测实施例1中制备的ITNK细胞对EBV病毒感染的鼻咽癌细胞系的杀伤能力。
(1)将GFP-Luciferase基因通过慢病毒介导，转导入鼻咽癌细胞系NP40 EBV+和NP40EBV-中，制备得到鼻咽癌细胞系NP40-GL EBV+和NP40-GL EBV-靶细胞；
(2)计数ITNK及其同一来源的野生T细胞，消化鼻咽癌靶细胞系NP40-GL EBV+和NP40-GL EBV-并计数，取出相应数量的ITNK和靶细胞，离心弃上清；
(3)于96孔白底板中加入100μL含5％胎牛血清的IMDM培养基，向第一个最高ET比(效价比)孔中加入4×104ITNK，每个比例设置3个复孔；
(4)将最高ET比下的ITNK进行梯度稀释，以保证从最高ET比(2:1)到最低ET比(1:4)，每个比例下每个孔含有2×104个ITNK，1×104个ITNK，0.5×104个ITNK，0.25×104个ITNK。
(5)将离心好的靶细胞用IMDM培养基重悬至1×104每100μL，向含有ITNK的96孔板中加入100μL含有靶细胞的培养基，将培养板置于37℃5％二氧化碳培养箱培养24h；
(6)取出共培养24h的培养板，每孔保留100μL上清，并加入含15mg/mL荧光素酶底物的PBS，室温反应1min；
测量荧光素荧光强度，处理数据后，结果如图7和图8所示：ITNK对EBV病毒感染阳性和阴性的鼻咽癌细胞系NPC43的体外杀伤实验结果显示，ITNK在ET比较低的时候(如1:2和1:4)，ITNK杀伤EB病毒感染阳性的细胞比例较高，且有显著性差异(见图7)；同时，ITNK相比于T细胞能更有效地杀伤NPC43细胞系(见图8)；实验结果表明，ITNK相对于T细胞有更为强大的对抗被病毒感染细胞的潜能。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 英基生物医药（香港）有限公司
<120> 一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用
<130> 20200702
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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cacccaggtg gtcatcttcg tcgg 24
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aaacccgacg aagatgacca cctg 24
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caccgagtcc cgtcacccga gacc 24
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aaacggtctc gggtgacggg act 23
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<212> DNA
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caccggtgac gggactcagg gtga 24
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aaactcaccc tgagtcccgt cac 23
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aaacggcccc gggcggccca gct 23

Claims (10)

1.一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。
2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述NK细胞标志物包括CD16、CD56、CD69、NKp46、NKp30或NKp44中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述T细胞标志物包括CD3。
3.一种如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；
(2)通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养后得到所述工程化免疫细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子、第三外显子或第四外显子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子和/或第三外显子；
优选地，步骤(1)所述gRNA的靶位点包括核苷酸序列GNNGG或CCNNC，所述N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种；
优选地，所述N为鸟嘌呤。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1～17所示；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括正向引物和反向引物；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括SEQ ID NO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合；
优选地，步骤(1)所述gRNA包括如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:50和SEQ IDNO:51所示的序列。
6.根据权利要求3～5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述电转化时CRISPR/CAS9基因敲除载体的浓度为20-50ng/μL；
优选地，步骤(2)所述电转化时激活的T细胞的浓度为(0.8～1.2)×106个/mL。
7.根据权利要求3～6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述培养时使用的培养基包括T551-H3培养基；
优选地，步骤(2)所述培养的时间为10～18天；
优选地，步骤(2)所述培养时培养基中的细胞密度为(0.5～1)×106个/mL。
8.根据权利要求3～7任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述采用Ficoll密度梯度离心法进行分离；
优选地，步骤(2)中所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选；
优选地，步骤(2)中所述激活的方法为：使用包被抗人CD3、CD28和CD2的磁珠与T细胞混合孵育，得到所述激活的T细胞；
优选地，所述T细胞的细胞密度为(2～4)×106个/mL，优选为2.5×106个/mL；
优选地，所述混合孵育的时间为24～48h。
9.根据权利要求3～8任一项所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；其中，所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1～17所示，所述gRNA包括SEQ ID NO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法和磁珠分选法得到T细胞，并激活所述T细胞，并通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养10～18天后得到所述工程免疫细胞。
10.如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞在研究病毒致病机理、构建动物模型或评估病毒药物治疗效果中的应用。
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CN112574952A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 英基生物医药(香港)有限公司 一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用

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