CN110846277B - 一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号为CCTCC NO:C2019263，保藏日期为2019年11月6日。小鼠小胶质细胞系的建立方法包括如下步骤：a、原代小鼠小胶质细胞的分离和培养；b、原代小鼠小胶质细胞的纯化和克隆。本发明的小鼠小胶质细胞为自发永生化的小胶质细胞，IBA1阳性，CD45⁺CD11b⁺。B6Mi1细胞增殖旺盛，细胞周期分析显示超过一半的细胞处于S期和G2M期，细胞倍增时间为14小时。LPS处理可以显著增加该细胞表达TNFα，IL‑1β、IL‑6、iNOS等炎症因子。上述结果表明B6Mi1细胞为具有microglia细胞表型和生物学特性的小鼠小胶质细胞系，该细胞系可以用于小胶质细胞生物学特性及神经炎症的研究及相关药物的筛选和开发。

Description

一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1及其建立方法和应用。

背景技术

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的主要胶质细胞，约占哺乳动物大脑细胞总数的12％。小胶质细胞起源于髓系，是定居在CNS中的免疫细胞，在维持CNS内环境的稳定和重建中发挥重要作用。当CNS微环境发生变化时，小胶质细胞被激活，在包括神经退行性疾病、创伤性脑损伤和神经系统感染等多种损伤和疾病中都可以发现活化小胶质细胞的存在。激活的小胶质细胞增殖、形态发生改变，吞噬活性增强，产生大量的活性氧和活性氮，分泌促炎趋化因子和细胞因子。小胶质细胞通过产生生长因子和清除潜在的毒性细胞碎片来提高神经元的生存能力和存活率，但也有证据表明，激活的小胶质细胞通过过度产生炎症介质而损伤神经元。在神经退行性疾病中，小胶质细胞及其分泌是促进神经元死亡的主要因素。因此，了解小胶质细胞的分泌和调节小胶质细胞激活的机制是制定改善这些疾病症状的治疗策略的重要一步。培养的小胶质细胞是认识和研究其生物学功能的重要工具，也是研究多种中枢神经系统(CNS)疾病中炎症相关机制以及探讨靶向小胶质细胞治疗策略的一种重要的体外模型。

由于脑中细胞的高度异质性，很难直接获得小胶质细胞，需要通过原代培养的方法才能获得一定数量具有较好活性和较高纯度的小胶质细胞用于小胶质细胞的神经保护和神经毒性作用的研究。目前已建立了分离培养小鼠、大鼠、非人类灵长类动物和人类原代小胶质细胞的方法。这些方法通常都是采用机械和酶解相结合的方法将脑组织分散为单个细胞，混合培养后采用摇晃或者敲打的方式纯化出小胶质细胞(Tamashiro et al.，2012)。或在酶解后，通过密度梯度离心将小胶质细胞从含着大量髓鞘成分的酶解混合物中分离出来，然后通过磁珠分选(Nikodemova and Watters,2012；Mizee等，2017)或荧光标记结合流式分选(FACS)的方法直接分离出小胶质细胞(Olah等，2012)。由于便于操作且不要特殊仪器设备，混合原代培养最为常用。上述分离培养的时间通常包括6h解剖组织和接种细胞，随后2-3周的培养，以及最后的纯化和接种时间，通常需要6h。对于大鼠，每个脑能够获得的2.7*10⁴～1*10⁶的小胶质细胞。如果需要增加细胞的产量，则需要增加起始的幼崽数量。

尽管原代培养小胶质细胞的技术已十分成熟，但该过程繁琐、耗时长且结果不稳定，且原代培养的小胶质细胞通常不能够传代培养。相比之下，细胞系具有无限的增殖能力，具有易于维护和便于使用的优点，因而常替代原代小胶质细胞用于实验研究。目前已有小鼠、大鼠、猕猴和人类起源的小胶质细胞系，这些细胞系大多通过将病毒与癌基因(如v-myc、v-raf、v-mil、SV40 T抗原)转入到培养的大脑或脊髓的原代小胶质细胞以实现永生化。也有从原代培养小胶质细胞自发永生化的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系及其建立方法和应用，细胞系保持了小胶质细胞的特性，为研究小胶质细胞的生物特性、神经炎症和药物筛选提供了一个良好的体外模型。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1。

本发明还提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的建立方法，包括如下步骤：

a、原代大鼠小胶质细胞的分离和培养

无菌分离P0小鼠的大脑皮层，剪切为1mm³的组织块，PBS清洗多次后，加入0.125％胰酶，37℃消化10min，终止后吹打成混合细胞悬液，100μm筛网过滤后接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶，37℃、5％CO₂饱和湿度培养，每日观察并根据培养基的消耗情况半量换液；

b、原代大鼠小胶质细胞的纯化和克隆

混合细胞培养至2～3周，采用手工敲打法纯化原代小胶质细胞，待小胶质细胞脱落后，将细胞悬液转移至15ml离心管，300g室温离心5min，离心结束后用含10％胎牛血清的DEME培养基重悬后计数接种；通过有限稀释法进行克隆实验。

本发明还提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的检测方法，步骤b中随机选择其中一个克隆命名为B6Mi1；所述检测方法包括如下步骤：

(1)B6Mi1小胶质细胞标志物检测

(1-1)小胶质细胞标志物IBA-1的免疫荧光检测：对于培养好的小胶质细胞，加入预冷的4％的多聚甲醛室温下固定20min；固定结束后免疫染色封闭液室温下封闭1h；使用一抗IBA-1过夜染色，隔天二抗、染核试剂Hochest染色孵育后进行封片，于荧光显微镜下观察拍照；

(1-2)小胶质细胞表面标志物的流式分析：将培养好的B6Mi1/BV2细胞用0.125％胰蛋白酶消化后离心，1％BSA重悬细胞清洗一次后用小胶质细胞表面分子CD45和CD11b染色，放置冰上避光孵育1h后上机检测。

(2)B6Mi1的细胞倍增时间与细胞周期

(2-1)根据细胞倍增时间公式：DT＝t×[lg2/(lgN_t-lgN₀)]，计算得B6小胶质细胞倍增时间为13.25h；

其中，t为培养时间，N_t为t时间后的细胞数，N₀为接种细胞数；

(2-2)采用EdU检测细胞的增殖活性：将培养的原代大鼠小胶质细胞以1×10⁵cell/孔接种于24孔板中，培养24h后加入终浓度为10μEdU继续培养4h，固定、染色；

(2-3)采用PI染色检测细胞周期：将1.5*10⁵B6Mi1接种于12孔板，培养至8h，加入300μl 0.125％胰蛋白酶消化细胞，加入30μl FBS终止消化，轻轻吹散至单细胞悬液；逐滴加入预冷的7000μl无水乙醇，期间轻轻晃动培养板，将细胞悬液转移至流式管，置于冰上固定10min；加入1ml预冷的PBS，400g离心5min，倒扣弃上清；加入300μl预冷的含有PI染料的PBS，轻弹管壁重悬细胞，染色15min后流式检测细胞周期；

(3)B6Mi1小胶质细胞物种鉴定：根据细胞色素C氧化酶基因COI在不同的物种间存在物种差异进行物种鉴定。提取SD大鼠胎鼠皮层组织、C57/BL6小鼠尾尖和B6Mi1小胶质细胞基因组DNA，通过PCR扩增COI基因，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物确定。

本发明还提供一种体外模型，所述体外模型为利用如权利要求2所述的建立方法建立的可以在体外长期培养并保持小胶质细胞特性的小胶质细胞系。

本发明还提供了永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的检测方法在制备神经炎症药物方面的用途、在小胶质细胞生物学特性研究方面的用途。

本发明通过有限稀释法获得12个克隆，随机选择一个命名为B6Mi1，目前已传超过40代。于2019年11月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO:C2019263。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明提供了一种小鼠小胶质细胞系及其建立方法和应用，为自发永生化的小胶质细胞，呈IBA1阳性，CD45⁺CD11b⁺。B6Mi1细胞增殖旺盛，细胞周期分析显示超过一半的细胞处于S期和G2M期，细胞倍增时间为14小时。LPS处理可以显著增加该细胞表达TNFα，IL-1β、IL-6、iNOS等炎症因子。上述结果表明B6Mi1细胞为具有microglia细胞表型和生物学特性的小鼠小胶质细胞系，该细胞系可以用于小胶质细胞生物学特性及神经炎症的研究及相关的药物筛选和开发。

附图说明

图1为本发明中C57/BL6小鼠鼠原代细胞混合培养至5天、10天和15天时的示意图；

图2为本发明中纯化后的C57/BL6小鼠原代小胶质细胞形态和克隆实验结果示意图；

图3为本发明中小胶质细胞系B6Mi1标志物IBA-1的免疫荧光检测结果示意图；

图4为本发明中B6Mi1小胶质细胞的细胞表面分子的流式检测结果示意图；

图5为本发明中B6Mi1小胶质细胞物种鉴定的检测结果示意图；

图6为本发明中B6Mi1小胶质细胞增殖和细胞周期的分析结果示意图；

图7为本发明中LPS处理改变了B6Mi1细胞的形态并诱导炎症因子的转录示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的建立方法，包括如下步骤：

a、原代小鼠小胶质细胞的分离和培养

准备工作：

预先包被培养瓶：细胞培养瓶(底面积为75cm2)中加入5ml多聚-D-氨酸(0.1mg/mL)，保鲜袋包裹好后放置在4℃冰箱包被过夜，隔天用灭菌的Mini Q水清洗三次，于超净工作台紫外风干后备用。

解剖新生鼠脑组织:

1.取材过程全程在冰上操作，最大限度保持细胞活性。取3只C57/BL6小鼠，用酒精棉球将小鼠全身擦拭干净，再置于75％酒精浸泡1min后擦拭干净。手术剪剪断头置于盛有6ml预冷解剖液(庆大霉素用PBS稀释成400单位)的60mm培养皿中清洗，将组织转移至新的盛有6ml预冷解剖液的培养皿中清洗，再重复清洗两次直至没有血丝。

2.眼科直镊固定双眼，眼科弯镊沿着脑部中线撕取头皮以及软骨盖，暴露出整个脑部，更换新的显微镊小心去除全脑组织取出放置盛有3ml预冷解剖液的培养皿中，剩余组织同样操作。

3.在体视显微镜下进行精细操作，沿着大脑半球中线将皮层翻开，分离出两侧皮层，去除血管膜，海马组织后放置盛有3ml解剖液的60mm细胞培养皿中，剩余组织同样操作。

混合胶质细胞培养：

1.解剖完毕后，用1ml的枪头将组织吸入再转移至15ml离心管，待组织沉降管底后，弃取上清；加入4ml预冷PBS清洗组织，待组织沉降管底后，弃上清；重复清洗一次。

2.加入预热的6ml消化液(0.25％胰蛋白酶用PBS稀释1倍使用)，放置培养箱中(37℃、5％CO2)消化10min，期间每隔5min轻弹管壁以充分消化。

3.消化结束后，弃去消化液，加入4ml预冷的PBS终止消化，待组织沉降管底后弃上清；重复1次。

4.将100μm滤器放置在50ml离心管上，加入1ml PBS充分浸润。在组织中加入4ml预热的PBS，吹打15次，待组织沉降于管底后，吸取上清至滤器中，重复两次。

5.将细胞悬液以300g室温离心5min，加入3ml预热的完全培养基(DMEM/HIGHGLΜCOSE+10％胎牛血清)重悬细胞后接种至培养瓶，并补充培养基至8ml。

6.第二天将培养基弃去，添加10ml完全培养基，之后依据培养基的消耗情况(3-4天)补充新鲜的完全培养基。

培养至第10天，下层星形胶质细胞铺展成片状，小胶质细胞位于星形胶质细胞上层，细胞数量较少，胞体透亮，折光性较好，呈圆形，大小均一。培养至15天时，小胶质细胞数量显著增多并呈“簇状”生长，如图1所示为B6小鼠原代细胞混合培养5天至15天的示意图，比例尺分别为：200μm(左)、100μm(中)和50μm(右)。

b、原代小鼠小胶质细胞的纯化和克隆

混合细胞培养至2～3周，采用手工敲打法纯化原代小胶质细胞，待小胶质细胞大部分脱落后，将细胞悬液转移至15ml离心管，300g室温离心5min，离心结束后用含10％胎牛血清的DEME培养基重悬后计数接种。接种后贴壁的小胶质细胞胞体透亮，折光性较好，形态呈现圆形或梭形，部分从胞体伸出细长分支；培养至第2天，分支部分回缩，细胞变圆；培养至第3、4天细胞数量显著增多，细胞形态也转变为以圆形为主，如图2A(上行)所示为纯化后培养1-4天的B6小鼠原代小胶质细胞的形态。比例尺：100μm。

通过有限稀释法进行克隆形成实验，培养3天即可观察到克隆的形成，5天可形成巨大的细胞克隆。收集12个克隆，随机选择其中一个命名为B6Mi1，用于随后细胞生长和生物学特性的分析，该克隆多次传代后细胞的形态没有明显改变。如图2B(下行)所示为克隆实验，细胞接种后1天，5天和10天的克隆结果图。

实施例2

本实施例提供一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的检测方法，步骤b中随机选择其中一个克隆命名为B6Mi1；所述检测方法包括如下步骤：

(1)B6Mi1小胶质细胞标志物检测

(1-1)小胶质细胞标志物IBA-1的免疫荧光检测

取出培养好的小胶质细胞，吸除孔内的培养基，加入500μl PBS清洗1次；每孔加入预冷的4％的多聚甲醛500μl，室温下固定20min；吸除固定液，加入500μl PBS清洗3次，每次5min；每孔加入200μl免疫染色封闭液，室温下封闭1h；吸除封闭液，每个玻片上滴加200μl的一抗(IBA-1,1:200配置)，置于湿盒内4℃过夜；第二天取出培养板，吸除一抗，PBS洗3次，每次5min；加入200μl荧光二抗，室温避光孵育1h；吸除二抗，PBS清洗3次，每次5min；每孔加入200μl DAPI(1μg/ml)，室温避光孵育10min；吸除染核试剂，PBS清洗1次，5min；在载玻片上滴加7μl的仿淬灭荧光封片剂，取出玻片，细胞层面朝下放于滴加的封片剂上封片；荧光显微镜下观察拍照。

IBA-1是小胶质细胞典型标志物，免疫荧光染色显示，IBA-1阳性的细胞呈现“分支”状态，而多数圆形状小胶质细胞不表达IBA-1，如图3所示，IBA-1(1:250)，Hochest(1μg/ml)；比例尺：100μm(上)，50μm(下)。

(1-2)小胶质细胞表面标志物的流式分析

将1.5*10⁵B6Mi1/BV2细胞接种于12孔板,培养至8h；加入300μl 0.125％胰蛋白酶消化细胞，加入600μl含10％胎牛血清的DEME培养基终止消化，轻轻吹散至单细胞悬液，300g室温离心5min；加入2ml 1％BSA重悬细胞，平均分配到2个流式管中，再分别补充添加2ml BSA(扩大体积)；500g室温离心5min，倒扣，管中保留100μl液体；其中一管加入0.5μlCD45和CD11b，放置冰上避光孵育1h后上机检测。

通过流式分析了CD45、CD11b在B6Mi1和BV2细胞的表达，结果显示100％的BV2和B6Mi1细胞都是CD45和CD11b阳性的。值得注意的是根据CD45的荧光强度，BV2和B6Mi细胞都可以分为两个细胞群：CD45^highCD11b⁺和CD45^lowCD11b⁺，这与缺血脑组织中的单核细胞的种模式类似，其中CD45^high的是从外周募集的单核巨噬细胞，而CD45^low的则是脑中固有的小胶质细胞，因此BV2和B6Mi1细胞似乎也具有两种不同的表型。并且与BV2细胞相比，B6Mi1细胞中CD45^high的比例要高于BV2。如图4所示为B6Mi1小胶质细胞的细胞表面分子的流式检测结果示意图。

(2)B6Mi1的细胞倍增时间与细胞周期

(2-1)根据细胞倍增时间公式：DT＝t×[lg2/(lgN_t-lgN₀)]，计算得B6小胶质细胞(B6Mi)倍增时间为13.25h；

其中，t为培养时间，N_t为t时间后的细胞数，N₀为接种细胞数；

(2-2)采用EdU检测细胞的增殖活性：将培养的原代小鼠小胶质细胞以5×10⁴cell/孔接种于24孔板中，培养24h后加入终浓度为10μM EdU继续培养1h；培养结束，去除培养基，加入300μl4％多聚甲醛室温固定15min；1ml洗涤液(含3％BSA的PBS)清洗3次，每次3-5min；去除洗涤液，1ml通透液(含3％Triton*-100的PBS)室温孵育10-15min；洗涤液清洗细胞1-2次，每次3-5min；配制Click反应液，以下是每孔的量：

组分
		Click Reaction Bμffer	86μl
CμSO4	4μl
		Azide 555	0.2μl
Click Additive Solμtion	10μl
		总体积	100.2μl

。

去除洗涤液，每孔加入100μl Click反应液，轻轻摇匀，均匀覆盖样品，室温避光孵育30min；吸除Click反应液，洗涤液清洗细胞3次，每次3-5min；Hochest 33342按1：1000稀释，加入到细胞中，室温避光孵育10min；清洗细胞3次，每次3-5min；滴加一滴抗荧光封片剂进行封片，荧光显微镜下拍照。。结果如图6所示，EdΜ阳性细胞数不低于95％，说明该小胶质细胞系具有较高的增殖活性。其中，图6A为Edμ掺入检测B6Mi1细胞增殖检测，EdU(10μM)标记1h，Hochest(1μg/ml)，比例尺：100μm。图6B为B6Mi1细胞周期流式检测结果的ModFit软件拟合的结果示意图。

(2-3)采用PI染色检测细胞周期：将1.5*10⁵B6Mi1接种于12孔板，培养至8h(进入对数生长期)，加入300μl 0.125％胰蛋白酶消化细胞，加入30μl FBS终止消化，轻轻吹散至单细胞悬液；逐滴加入预冷的7000μl无水乙醇，期间轻轻晃动培养板，将细胞悬液转移至流式管，置于冰上固定10min；加入1ml预冷的PBS(扩大体积)，400g离心5min，倒扣弃上清；加入300μl预冷的含有PI染料的PBS(PI储存液浓度为1mg/ml，终浓度为40μg/ml)，轻弹管壁重悬细胞，染色15min后流式检测细胞周期。结果显示：处于G0/G1期的细胞占45％，S期的细胞占44％，G2/M期细胞大约占11％。

(3)小胶质细胞物种鉴定

基因组DNA小量抽提：取SD大鼠胎鼠皮层组织15mg、C57/BL6小鼠尾尖0.6cm，剪切成尽可能小的碎片，加入180μl样品裂解液A，20μl蛋白酶K涡旋5-10s混匀，55℃水浴孵育过夜直至完全裂解；将培养的原代小鼠小胶质细胞以8×10⁵cell/孔接种于底面积为21cm²的培养皿，待细胞生长至70％左右，收集细胞(约300万左右细胞)，消化离心后加入200μl PBS重悬细胞，加入20μl蛋白酶K涡旋5-10s混匀；大鼠胎鼠皮层组织、C57/BL6小鼠尾尖组织和原代小鼠小胶质细胞加入200μl样品裂解液后立即涡旋混匀，70℃金属浴孵育10min；加入200μl无水乙醇，涡旋5-10s混匀；将混合物转移至DNA纯化柱，8000g室温离心1min，弃去废液收集管内液体；加入500μl洗涤液1，8000g室温离心1min，弃去废液收集管内液体；加入600μl洗涤液2，17000g室温离心1min，弃去废液收集管内液体；17000g室温离心1min，去除残留的乙醇；将DNA纯化柱置于洁净的1.5ml离心管，加入50μl洗脱液，室温放置1min；17000g室温离心1min，所得液体即为纯化得到的总DNA，上机检测浓度。如图5所示为B6Mi1小胶质细胞物种鉴定的检测结果示意图。

PCR扩增体系依据下表：

PCR反应参数设置：

STEP1(起始变性):

3min STEP2(变性):

30sec STEP3(退火):

30sec STEP4(延伸):

1min STEP5(循环):Go To STEP2 for 30cycles STEP6(最终延伸):

10min STEP7(临时保存):

forever

细胞色素C氧化酶基因COI在不同的物种间存在物种差异，目前可作为物种鉴定的一种分子标记。依据该文献的物种COI基因序列扩增出大小鼠组织以及原代小鼠小胶质细胞COI基因。采用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，条带单一清晰可见，大小鼠COI基因条带作为阳性对照，原代小胶质细胞COI基因条带如图所示，条带位置正确。

(4)LPS处理可显著增加B6Mi1细胞炎症因子的表达

在体小胶质细胞的激活表现为由呈现多分支(ramified)状的静息小胶质细胞的形态转变为阿米巴样。脂多糖(LPS)被用于模拟革兰氏阴性菌的感染和研究小胶质细胞的激活过程。1μg/ml LPS处理B6Mi1和BV2细胞6h，细胞的形态从球形转变为扁平的圆形，Tnfα、iNOS、Il-6和Il-1β的转录水平显著增加。LPS对B6Mi1和BV2细胞的作用类似，除了Il-6。如图7所示为LPS处理改变了B6Mi1细胞的形态并诱导炎症因子的转录示意图，其中图7A为LPS处理对B6Mi1细胞形态的影响示意图，图7B为LPS显著增加B6Mi1细胞中炎症因子的表达示意图。

引物序列：

实施例3

实施例2中的结果说明本发明的建立方法获得的小胶质细胞可以在体外长期培养并保持小胶质细胞的特性，为小胶质细胞的研究和神经炎症药物筛选提供了一个体外模型。

实施例4

本实施例的永生化的小鼠小胶质细胞系可用于制备神经炎症药物，也可用于小胶质细胞生物学特性研究方面。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1，其特征在于，所述小鼠小胶质细胞系在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:C2019263，保藏日期为2019年11月6日。

2.一种如权利要求1所述的永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

（1）B6Mi1小胶质细胞标志物检测

（1-1）小胶质细胞标志物IBA-1的免疫荧光检测：对于培养好的小胶质细胞，加入预冷的4%的多聚甲醛室温下固定20min；固定结束后免疫染色封闭液室温下封闭1h；使用一抗IBA-1过夜染色，隔天二抗、染核试剂Hochest染色孵育后进行封片，于荧光显微镜下观察拍照；

（1-2）小胶质细胞表面标志物的流式分析：将培养好的 B6Mi1/BV2细胞用 0.125%胰蛋白酶消化后离心，1%BSA重悬细胞清洗一次后用小胶质细胞表面分子CD45和CD11b染色，放置冰上避光孵育1h后上机检测；

（2）B6Mi1的细胞倍增时间与细胞周期

（2-1）根据细胞倍增时间公式：DT=t×[lg2/(lgN_t-lgN₀)]，计算得B6小胶质细胞倍增时间为13.25h ；

其中，t为培养时间，N_t为t时间后的细胞数，N₀为接种细胞数；

（2-2）采用EdΜ检测细胞的增殖活性：将培养的原代小鼠小胶质细胞以5*10⁴cell/孔接种于24孔板中，培养24h后加入终浓度为10μM EdΜ继续培养1h，固定、染色；

（2-3）采用PI染色检测细胞周期：将1.5*10⁵ B6Mi1接种于12孔板，培养至8h，加入300μl0.125%胰蛋白酶消化细胞，加入30μl FBS终止消化，轻轻吹散至单细胞悬液；逐滴加入预冷的700μl无水乙醇，期间轻轻晃动培养板，将细胞悬液转移至流式管，置于冰上固定10min；加入1ml预冷的PBS，400g离心5min，倒扣弃上清；加入300μl预冷的含有PI染料的PBS，轻弹管壁重悬细胞，染色15min后流式检测细胞周期；

（3）B6Mi1小胶质细胞物种鉴定：根据细胞色素C氧化酶基因COI在不同的物种间存在物种差异进行物种鉴定；提取SD大鼠胎鼠皮层组织、C57/BL6小鼠尾尖和B6Mi1小胶质细胞基因组DNA，通过PCR扩增COI基因，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物确定。

3.权利要求1所述的永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1或者权利要求2所述的永生化的小鼠小胶质细胞系B6Mi1的检测方法在小胶质细胞生物学特性研究方面的用途。

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