CN104789531B

CN104789531B - 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法

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Publication number: CN104789531B
Application number: CN201510140095.1A
Authority: CN
Inventors: 安沂华; 董健伸
Original assignee: Individual
Current assignee: Third Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: CN104789531A

Abstract

公开了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入结构改进的苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成多巴胺能神经，并且分化比例较高。

Description

一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法

技术领域

本发明涉及神经生物学领域，特别涉及一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。

背景技术

自2000年Erices等报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物。目前人们已经可以成功地体外分离培养脐带血间充质干细胞，并且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。

脐带间充质干细胞(MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。

CN104004713A公开了一种将脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的神经细胞。

CN103585177A公开了间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途，特别是间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途，还涉及包含间充质干细胞和/或基因修饰的间充质干细胞的组合物和细胞膜片。

CN103695369A公开了一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：先将清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05w/v%胶原酶于37℃消化后，清洗3次以上，而得脐带间充质细胞。用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育，之后用磷酸缓冲液清洗，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入二抗并孵育，再次用磷酸缓冲液液洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选，将所得到CD271+亚群细胞接种，加入浓度10v/v%的自体脐带血血清，于37℃、5%CO2扩增培养6天。

CN103031275A公开了一种脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分化为神经干细胞的诱导方法，所述诱导方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测，该诱导方法应用全反式维甲酸联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力。

CN102250829A公开了一种人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包括以细胞爬片技术提取人脐带间充质干细胞进行分离培养，并加入表皮生长因子、地塞米松、肝细胞生长因子、抑瘤素将所述细胞分阶段定向诱导分化为肝细胞。

CN101914493A公开了一种脐带间充质干细胞分化为神经细胞的诱导方法，其特征是采用以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞在MSC培养基中培养至铺满培养皿；(2)取稳定传代的间充质干细胞在铺有胞外基质的培养皿中以MSC培养基培养至70％汇合；(3)70％汇合的间充质干细胞依次经过添加有如下因子的四种诱导培养基培养，第一种诱导培养基：添加5-氮胞苷和三酰叠氮脂蛋白，第二种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子和Noggin蛋白，第三种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和Wnt3a蛋白，第四种诱导培养基：添加骨成形蛋白4、Shh蛋白、维甲酸、神经生长因子和脑源性神经营养因子。

CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal-medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。

CN103146642A公开了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括如下步骤：将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。

CN102191217A公开了一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方法将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0.4μm孔径的Transwell小室隔离共培养,所用培养液为许旺细胞培养液；每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。

MSC定向诱导分化为神经细胞的实验研究有少数研究机构正在进行，而且现有报道的诱导分化方法诱导周期长，得到的神经细胞分化效率低、细胞分化均一度低。在上述现有技术中，CN104004713A公开的方法通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的神经细胞，是一种可行性比较高的方法。然而，该专利文献没有公开如何有效地将MSC定向诱导分化为多巴胺能神经元，并且如何将MSC有效地定向诱导分化为多巴胺能神经元的研究在其它现有技术中也非常少。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。

为此，本发明提供了如下方法，该方法包括如下步骤：

(1)、脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5×10⁵/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；

所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27（重量），2-4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸（重量），EGF 20-40ng/ml，bFGF 20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，60-70μg/ml链霉素；

(2)、预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物，并且保持培养液中所述诱导物的浓度为5-10μg/mL；

所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）。

所述苷类诱导物为抗氧化剂类物质，该类物质具有耐缺氧、清除自由基、抑制细胞内钙超载的作用，可在体外可促进脐带间充质干细胞向神经元细胞分化，其通过作用于干细胞激活了与神经细胞定向分化相关的信号通路Wnt /β-cantine、BMPs /Smad 和Nother等，促进干细胞向神经细胞分化，或者可促进干细胞表达与神经生长、分化有关的如NGF、NT-3 和BDNF 等细胞因子，这些细胞因子能诱导干细胞向神经细胞定向分化。

在一个最优选的实施方式中，为了进一步促进脐带间充质干细胞向神经元细胞分化的有效性例如分化效率和选择性，本发明人在一些天然苷类物质的基础上，进行了结构改进，使得脐带间充质干细胞向神经元细胞分化的效率和选择性得到明显提高。本发明人经过大量试验和复杂的结构分析，设计出具有如下结构式（I）～（IV）任一种所示的苷类物质：

（I）

（II）

（III）

（IV）

所述化合物的使用，与一般天然苷类物质相比，可以非常有效地促进脐带间充质干细胞向多巴胺神经元细胞分化的有效性例如分化效率和选择性。例如，所述诱导物结构中的酯基在0.01M磷酸盐缓冲液所维持的pH（7.1-7.7）能够缓慢水解成有效的活性苷类物质，这使得在一方面能够避免预诱导分化初期诱导物浓度过高，导致分化选择性过低，在另一方面还可以使诱导物的浓度稳定在一定水平，使得分化效率得到保证。进一步地，对于具有结构式（II）～（III）的物质，由于吸电子基团Cl和F的引入，增强了诱导物的诱导分化能力。另外，特别地，对于具有结构式（IV）的物质，由于邻位羟基的引入，增强了其清除自由基的能力，促进细胞有效合成多巴胺。应指出的是，苷类化合物的结构对所述分化影响的报导或技术启示在现有技术中没有任何记载，也不是本领域技术人员容易想到的。

具有结构式（I）～（III）的物质可以通过如下方法合成：将天然红景天苷与乙酰氯、氯代乙酰氯或氟代乙酰氯以1:1～1.2的摩尔比加入到环己烷溶剂中，然后加入铁改性的HZSM-5分子筛这样的选择性催化剂，使用苯作为带水剂，反应温度为60-100℃，反应时间为2-6小时，即可制得所述物质。其中，铁改性的HZSM-5分子筛可以通过将HZSM-5分子筛用FeCl₃溶液浸渍来制备。

具有结构式（IV）的物质可以通过如下方法合成：将具有结构式（I）的物质在作为催化剂的四苯基钴卟啉（Co-TPP）存在下，使用三氯甲烷或DMF为溶剂，通入空气或分子氧，反应物温度为30-90℃，优选70℃，反应时间为1-3小时，反应完成后将反应物浓缩结晶即可获得具有结构式（IV）的物质。

当然，在本发明中，具有上述结构式的苷类物质可以按两种或更多种的混合物使用。

优选地，所述方法还包括步骤(3)诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nM～40nM的维生素B1，0.01-0.02％的二甲基亚砜，0.1mM2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素。

另外地或优选地，所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2％B27，4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml90U/ml青霉素，70μg/ml链霉素；所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80μg/ml链霉素；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01％的二甲基亚砜，0.1mM2-β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

在一个特别优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，培养液的pH维持在7.1-7.7。

本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于：DMEM，DMEM/F12，2％B27。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。

作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。它们可以包括但不限于：氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。

本发明所用的所有试剂均可通过商业途径购买得到。

本发明所述方法获得的神经细胞至少具有如下特征之一：

(a)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；

(b)至少表达蛋白：β-tublin III；

(c)神经细胞占诱导细胞群体86-91％左右；

(d)对外界刺激具有放电功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：相比现有技术中使用的诱导物相比，脐带间充质干细胞向神经元细胞分化的效率和选择性（细胞分化均一度）大大提高，诱导周期缩短8-12天，细胞分化均一度高达90%以上，并且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能。

具体实施方式

实施例1：脐带间充质干细胞获取和培养

使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。

将新生儿脐带在含1％双抗的生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，然后剪成约1厘米长的小段。用眼科剪将脐带沿血管平行方向纵向剖开，将2根脐动脉和1根脐静脉血管从脐带中剥离干净。剥掉表面羊膜，华通胶部分用含1％双抗的生理盐水充分洗涤3次，剪碎至约1mm³大小。将剪碎的组织块均匀的平铺在75cm²培养瓶内，室温放置5-10min，使组织块贴紧。加入5ml培养基，培养基含DMEM/F12，2％B27，4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油(MTG)，1％非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，90U/ml青霉素，70μg/ml链霉素，37℃5％CO₂孵箱培养。每隔三天更换一次培养基，细胞生长至铺满培养皿后传代培养。

也可以使用市售或商售的合法来源的脐带间充质干细胞通过实施例1的方法直接进行培养。

实施例2：脐带间充质干细胞体外定向诱导分化

新鲜传代的P3-6代脐带间充质干细胞以5×10⁴/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，1ml/孔，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导。

预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80μg/ml链霉素。

将预诱导培养得到的细胞按5×10⁴/ml的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导，在培养液中不添加诱导物、添加红景天苷（市售获得）、添加上文结构式（I）～（IV）所示的苷类诱导物分别进行试验，并且在如果加入诱导物时，在培养过程中，保持培养液中所述诱导物的浓度为8μg/mL，得到多巴胺神经细胞；

诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01％的DMSO，0.1mM2-β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，80μg/ml链霉素。

采用免疫荧光化学染色法、流式细胞分析和电生理检测进行结果分析，结果表明上述诱导培养均产生了多巴胺能神经细胞，其中实施例2中各种方法获得的多巴胺能神经细胞的分化比例（即诱导细胞中多巴胺能神经细胞比例）经测定，结果如下表1所示：

表1：诱导结果对照

序号	诱导方式	分化比例
			1（对照）	不加入诱导物	22.15%
2（对照）	加入红景天苷	82.26%
			3（根据本发明）	加入式I所示化合物	90.07%
4（根据本发明）	加入式II所示化合物	90.32%
			5（根据本发明）	加入式III所示化合物	91.66%
6（根据本发明）	加入式IV所示化合物	93.79%

通过上述对比结果清楚地可知，苷类物质的加入明显可以诱导脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元，根据本发明的苷类化合物与红景天苷相比，诱导效果明显提高，其中当使用式IV所示化合物作为诱导物时，分化比例高达93.79%，这样的效果是本领域技术人员所预料不到的。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例旨在处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims

1.一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5×10⁵/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27，2-4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸，EGF 20-40ng/ml，bFGF 20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，60-70μg/ml链霉素；和

(2) 预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物，并且保持培养液中所述诱导物的浓度为5-10μg/mL；并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.01M磷酸盐缓冲液；

所述苷类诱导物为如下结构式（III）～（IV）任一种所示的苷类物质：

（III）

（IV）；

还包括步骤(3)诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nM～40nM的维生素B1，0.01-0.02％的二甲基亚砜，0.1mMβ-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素。

2.根据权利要求1所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2％B27，4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，90U/ml青霉素，70μg/ml链霉素；所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80μg/ml链霉素；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01％的二甲基亚砜，0.1mM β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

3.根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，培养液的pH维持在7.1-7.7。