KR20160002248A - 다공성 막을 가진 세포배양 삽입체를 이용한 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포의 분리 방법 - Google Patents

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홍기성
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건국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 다공성 막을 가진 세포배양 삽입체를 이용한 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포의 분리 방법 및 분리된 신경능 줄기세포의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 다공성 막을 가진 세포배양 삽입체를 사용하여 세포공급원 및 세포 계대 배양의 제한성을 없앴으며, 기존의 인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포 분리방법보다 분리효율 및 분화능력을 크게 향상시키고, 비용을 절감하는 효과가 있는 새로운 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 분리 및 배양된 신경능 줄기세포는 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지고 있어 신경계 질환 등 다양한 질환의 치료를 위한 세포치료제로서 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

다공성 막을 가진 세포배양 삽입체를 이용한 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포의 분리 방법{Method for isolating neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells using cell insert culture system having porous membrane}
본 발명은 다공성 막을 가진 세포배양 삽입체를 이용한 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포의 분리 방법 및 분리한 신경능 줄기세포의 용도에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)는 적당한 체외 배양조건에서 무한 증식(자가재생산능; self-renewal)을 할 수 있고, 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 특성(다능성 또는 전분화능 ;pluripotency)으로 인해 개체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식 이해 측면에서 뿐만 아니라 개체의 손상 또는 다양한 질병의 근본적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로 한 연구성과의 활용범위가 확대되고 있다. 다양한 분야에서 인간 다능성 줄기세포 이용에 대한 수요가 급증하고 있음에도 불구하고 미분화 상태의 인간 다능성 줄기세포를 유지 및 배양하기 위한 배양 배지가 한정적일 뿐만 아니라 배양이 어렵다는 점은 관련 기술 개발의 장애요소로 작용하고 있으며 특히, 세포치료제 개발을 위해서는 영양 공급 세포, 동물 유래 인자 등을 사용하지 않은 배지 사용 등 임상적용 가능한 배양조건을 구축하고 수요가 발생할 시 필요한 양을 효율적으로 수급할 수 있는 대량 배양 시스템을 개발하는 것이 필수적이다.
최근 FDA 임상 시험 승인에 따르면, 인간 배아줄기세포(hESC)-기반 세포 치료는 실험실에서부터 임상까지 진행되고 있다. 그러나, 현재 이용 가능한 플레이트 및 T-플라스크-기반 배양 플랫폼은 상업적으로 연관된 롯트 사이즈까지 hPSC 생산의 확장성을 심하게 제한한다. 세포 치료 및 재생 의학에 있어서 hPSC의 가능성을 촉발시키기 위해서는 확장 가능한 hPSC 제조과정의 개발이 반드시 필요하다. 플라스크-기반 공정의 스케일 업은 최근 hPSC 연구를 임상에 적용하는데 있어 중요한 디딤돌이다. 가장 큰 도전 중 하나는 높은 수율, 다능성 표현형 및 핵형 안정성을 유지하는 대규모 다층 용기에 대해 확장 가능한 계대 방법을 확립하는 것으로 이러한 방법에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.
또한, 최근에는 이러한 인간 배아줄기세포로부터 다양한 기능을 할 수 있는 줄기세포를 분리하는 기술도 개발되고 있는데, 종래 개발된 기술을 살펴보면, 한국특허출원 2010-0064540A호에 따르면, 간질환 치료를 위한 세포치료제의 원료로서 인간 배아줄기세포로부터 분화된 간세포를 분리하는 기술이 개시되어 있고, 한국특허출원 2010-0097543A호에는 인간 배아줄기세포 유래 심근세포를 배양 및 정제하여 심근세포를 제조하는 방법 및 제조된 심근세포의 심장 관련 질환 치료를 위한 세포 치료제 등의 개발 가능성에 대한 내용이 개시되어 있다.
한편, 아직까지 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포를 분리하는 기술에 대해서는 연구가 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인간 배아줄기세포로부터 다분화능 신경능 줄기세포를 효과적으로 분리하는 방법과 더불어 분리한 신경능 줄기세포의 세포 치료제로서의 사용 가능성에 대한 내용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 특허출원 제2010-0064540A호 2. 대한민국 특허출원 제2010-0097543A호
본 발명의 목적은 (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 신경능 줄기세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 분리된 신경능 줄기세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이에 본 발명은 (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 신경능 줄기세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 분리된 신경능 줄기세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포배양 삽입체는 0.1 내지 100㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배아줄기세포는 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells) 또는 인간을 포함한 포유동물 유래인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 신경능 줄기세포의 분리 방법은 효소적 분리를 통한 단일 세포로 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 신경능 줄기 세포의 분리 방법은 스크랩퍼를 이용하여 단일세포화하지 않고, 상피세포모양 시트로 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, (b) 단계에서 상피세포모양 시트를 분리한 후, (c) 단계에서 상기 상피세포모양 시트를 먼저 분리한 다음 효소적 분리를 이용해 계대 배양 증식하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 먼저 분리된 상피세포모양 시트를 다음 계대에 다시 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포배양 삽입체 위에 있는 세포를 외배엽 세포 분화에 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 배양 시 배양 배지 내에 0.1%부터 20% 범위의 FBS(Fetal bovine serum) 또는 0.1%부터 20% SR(Serum replacement)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 배양 시 사용하는 배지는 사이토카인을 함유하지 않은 EBM-2 ,Ham F-10, F12, RPMI, DPBS, DMEM 또는 MEM-α 배지를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 분리된 신경능 줄기세포를 특정 표지자의 존재 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분리된 신경능 줄기세포는 신경세포, 신경아교세포 (별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 뇌실막세포) 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포, 감마아미노부틸에시드 (γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포, 평활근세포로의 분화력을 지닌 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분화된 세포는 상기 신경능 줄기세포로부터 분화된 신경세포; 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 또는 뇌실막세포인 신경아세포 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포; 감마아미노부틸에시드(γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포; 성상세포; 슈반세포; 조골세포; 연골세포; 지방세포; 골격근세포 또는 평활근세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환, 관절염, 백반증, 뇌졸중, 다발성 경화증, 근위축성 축상경화증, 선청성 거대결장증, 말초신경장애, 디조지 증후군, 트리처콜린스 증후군, 차지 증후군, 바르덴부르크증후군, 선천성 심장병, 가족성자율신경실조증, 악센펠드 증후군, 골텐하르증후군, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분화된 세포는 상기 신경능 줄기세포로부터 분화된 신경세포; 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 또는 뇌실막세포인 신경아세포 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포; 감마아미노부틸에시드(γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포; 성상세포; 슈반세포; 조골세포; 연골세포; 지방세포; 골격근세포 또는 평활근세포일 수 있다.
본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 효율적으로 분리해 냄으로써, 세포공급원 및 세포 계대 배양의 제한성을 없앴으며, 기존의 인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포 분리방법보다 분리효율 및 분화능력을 크게 향상시키고, 비용을 절감하는 효과가 있다. 또한 다양한 질병의 세포 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 계대 배양의 제한이 없으면서도 효과적으로 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 분리 및 배양할 수 있는 방법을 규명한 점에 특징이 있으며, 특히 시험관 내에서 세포배양 삽입체를 이용하여 인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포를 분리하였고 분리한 신경능 줄기세포가 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포로 분화가 가능하여 각종 신경계 질환을 치료할 수 있는 세포치료제로서의 사용 가능성을 확인하였다는 점에 특징이 있다.
따라서 본 발명은 (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계;(b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 신경능 줄기세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 분리된 신경능 줄기세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 분리한 상기 신경능 줄기세포는 배아줄기세포로부터 분리하였는데, “배아줄기세포(Embryonic stem cells)”는 포유동물의 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(Inner Cell Mass, ICM)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로, 동물의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능(Pluripotency)을 가진 세포를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간, 영장류, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 가축을 포함하는 포유동물 유래의 모든 배아줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 인간 배아줄기세포일 수 있다.
상기 인간 배아줄기세포는 예를 들면, H9(James A. Thomson et. al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998 Dec 4; 282(5395):1827) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 인간 배아줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.
한편, 신경능 줄기세포(Neural crest stem cell)는 발생기의 이주기(migratory stage) 동안에 신경주름(neural fold) 후방부에서부터 이주하며, 신경능줄기세포는 신체 내 광범위한 조직과 장기로 이주하여 분포하고 있고 이주기 이후 신경능 줄기세포는 말초신경계의 신경세포, 신경아교세포(glial cells), 피부의 멜라닌세포(melanocytes), 내분비계 세포, 그리고 다양한 중간엽세포(mesenchymal cells)로 분화하여 성인의 비 신경계 조직과 장기에 분포하는 것으로 알려졌다.
이러한 신경능 줄기세포를 인간으로부터 분리하기 위해 개발된 대표적인 방법으로 하기 세 가지 방법이 적용되고 있는데, 첫째, 성인의 진피유두, 모낭, 혹은 치아속질을 콜라제네이즈(collagenase), 디스페이즈(dispase), 혹은 트립신(trypsin) 등과 같은 조직분해효소를 처리하여 고형성 조직으로부터 해리된 단일세포군을 분리하는 조직해리과정(tissue dissociation step)을 거쳐 단일세포를 단층배양법으로 증폭시킨 후 신경구(neurosphere)를 형성시키는 단계를 거쳐 신경구를 형성하는 세포만을 분리시키고, 신경구 형성 세포만을 배양하는 과정을 거쳐서 신경능선줄기세포를 분리 배양하는 방법이 있고, 둘째 방법은 첫 번째 방법과 동일하게 고형성 조직의 조직해리과정을 거친 후 얻어진 단일해리세포(single dissociated cells)를 기분리한 후 p75 혹은 CD140a와 같은 표지자를 이용하여, 해당 표지자가 발현되는 세포만을 면역학적 방법을 이용하여 정제하고, 이후 단층배양법으로 증폭 시키는 방법이 있다. 셋째 방법은 진피유두, 모낭, 혹은 치아속질 절편을 외식배양법(explant culture)이 배양용기에 파종한 후 조직절편에서부터 배양용기로 이동 성장하는 세포를 배양하고, 이차적으로 면역학적 방법 혹은 신경구 형성 세포를 정제하는 방법이 있다.
그러나 이들 종래의 방법은 다양한 문제점을 가지고 있는데, 첫째 신경능선 기원 조직으로부터 단일해리세포를 분리하기 위하여 조직해리과정은 필수적이다. 조직해리과정은 사용한 조직분해효소의 종류, 역가, 반응시간, 반응온도, 사용한 조직의 상태에 따라 얻어지는 단일세포 수는 큰 편차를 나타내며, 또한 조직해리과정 중 세포의 손상은 피할 수 없다는 단점이 널리 제시되었다. 그 결과 조직해리과정은 표준화하기 어려우며 또한 분리수율이 낮다는 비효율성의 단점이 제시되었다. 둘째, 조직해리과정 후 얻어진 단일해리세포는 신경능선 조직을 구성하는 다양하고 이질적 특성을 지닌 세포를 모두 함유하고 있다. 상기 조직에서부터 분리된 단일해리세포는 신경능선줄기세포외에도 혈관내피세포, 혈관평활근세포, 지방세포, 혈구세포, 섬유모세포를 모두 포함하고 있다. 상기 이질적 단일해리세포에서부터 신경능선줄기세포를 선택적으로 분리하기 위하여 신경능선줄기세포에서만 특정적으로 발현되는 표지자를 이용한 면역학적 정제방법이 요구된다. 그러나 신경능선줄기세포에서만 특이적으로 발현되는 표지자는 현재 밝혀져 있지 않다는 근본적인 문제점이 대두되었다. 셋째, 신경구는 신경능선줄기세포에서만 나타나는 특징적인 현상이 아니다. 종래의 연구결과에서 신경구와 같은 구조는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 혈관내피전구세포, 조혈모세포에서도 나타나는 현상으로, 신경능선줄기세포만을 정제하는 방법으로는 적합하지 않다.
따라서 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 신경능 분리 및 배양 방법의 개발이 필요한 시점에서 본 기술은 인간 배아줄기세포부터 효과적으로 신경능 줄기세포를 분리 및 배양할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체로부터 신경능 줄기세포를 분리하는 방법에 있어서, 공지의 배지를 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 EBM-2, DMEM, MEM-α, STEMPRO-MSC, MesenCult-MSC 배지일 수 있으며, 바람직하게는 사이토카인이 첨가되지 않은 EBM-2, DMEM 또는 MEM-α일 수 있다. 이와 같은 배지는 각 단계에 따라 필요에 따라 자유롭게 선택할 수 있다. 아울러, 상기 공지의 배양액에 0.1% 이상의 FBS(Fetal bovine serum) 또는 0.1% 이상의 SR(Serum replacement)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5% FBS 또는 5% SR을 포함할 수 있고, 더욱더 바람직하게 상기 세포 배양 시 배양 배지 내에 0.1%부터 20% 범위의 FBS(Fetal bovine serum) 또는 0.1%부터 20% SR(Serum replacement)를 포함할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 단계(a)에서 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계에 있어서, 세포배양 삽입체는 정상산소 상태에서 0.1 내지 100㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체를 이용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 8㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 “세포배양 삽입체”란 다공성 막을 가지는 기구로서 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체를 배양시, 배아 발생 중에 일어나는 상피-중간엽 이행이 자연스럽게 일어날 수 있도록 해주는 기구를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 8㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에 인간 배아줄기세포 유래의 배상체를 올려서 약 1주일 간 배양한 결과, 아래로 이동한 세포에서 중간엽 세포의 특징인 피브로넥틴(Fibronectin)이 강하게 발현하는 반면 위부분에 남아 있는 세포에서는 상기 마커가 거의 발현되지 않는 것을 확인하였으며(도 1b), 이와 같은 결과는 본 발명의 세포배양 삽입체가 세포의 이행 현상을 통해 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 원칙적으로 분리할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 단계(b)에서 삽입체 아래부분으로 이동한 신경능 줄기세포를 분리하는 단계에 있어서, 효소적 분리를 통해 단일 세포로 분리하는 방법, 또는 기계적 분리를 통해 단일세포화하지 않고, 상피세포 모양 시트로 분리하는 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 삽입체 아래부분으로 이동한 세포를 단일세포화하지 않고, 상피세포 모양 시트로 분리할 수 있다.
본 발명에서 용어, “효소적 분리”란 효소 처리를 통하여 세포 덩어리를 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 콜라게네이즈 I, II, III, IV를 포함하는 콜라게네이즈(Collagense), 아큐타제(Accutase), 디스파제(Dispase) 또는 트립신-EDTA를 처리하여 분리하여 계대 배양할 수 있다.
스크랩퍼를 이용하여 상피세포 시트 모양을 그대로 유지한 상태에서 옮겨 분리, 배양하는 것이 본 발명의 목적상 더 바람직하다.
바람직한 일 실시 태양으로 상기 단계(c)에서 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포는 상기 단계(b)에서 분리한 상피세포 시트 모양을 그대로 유지된 상태에서 지속적으로 배양하여 얻을 수 있다. 상피세포 시트 모양세포 주위에 뻗어 나와 자라는 세포가 신경능 줄기세포인데, 이 세포를 얻기 위해 먼저 지속적으로 배양 후 남아 있는 상피세포 시트 모양의 세포를 스크랩퍼를 이용해 제거하고, 남아있는 중간엽 세포를 효소적 분리를 이용해 떼어낸 후 새로운 배양용기에 계대 배양하여 증식할 수 있다. 바람직하게는 상기 효소적 분리는 트립신-EDTA를 처리하여 분리하는 것일 수 있다. 이 때, 먼저 떼어낸 상피세포 시트 모양 세포는 버리지 않고 다음 계대를 위해 다시 이용할 수 있으며, 상기와 동일한 방법을 반복하여 신경능 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명자들은 인간 배아줄기세포를 배양체 형성을 통해 초기 분화시킨 후 8㎛ 다공 크기를 가진 세포 배양 삽입체 위로 올려서 약 1주일 간 배양 후, 아래로 이동한 상피세포 모양 시트를 스크랩퍼를 이용해 긁어 낸 후 새로운 배양 접시에 옮겨 계대 배양하였으며, 지속적 배양을 통해 가장자리부터 신경능 줄기세포로 세포 모양의 변화가 일어나면서 뻗어나오는 것을 확인하였다. 뻗어나오는 신경능 줄기세포를 얻기 위해 뻗어나오지 않은 잉여의 상피세포 모양 시트를 걷어내고 남은 신경능 줄기세포를 트립신-EDTA를 이용해 계대 배양하였으며, 40계대 이상 배양해도 세포가 가지는 특징이나 염색체의 이상이 발견되지 않았다. 또한 염색체 분석을 통해 계대의 횟수와 기간에 상관 없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 성체 유래 줄기세포에 비해 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포가 계대의 제한성을 받지 않는다는 것을 입증하는 것이다. 또한 분리한 세포에 줄기세포 특이성을 가진 세포표면 항원들이 존재하는지 유세포분석을 실시하여 신경능 줄기세포의 분화를 확인하였다. 또한 이러한 세포표면 항원들의 발현은 몇 차례의 계대 배양을 한 후의 세포들에서도 동일하게 유지되는 특성을 보여 분리한 세포가 계대 배양을 하더라도 신경능 줄기세포의 특이 항원들이 지속적으로 유지됨을 확인하였다. 나아가 신경능 줄기세포는 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포로의 분화가 일어남을 확인할 수 있었는데, 이와 같은 결과는 본 발명의 방법으로 분리한 신경능 줄기세포가 일반적인 줄기세포가 가지는 다분화능을 가지는 것임을 뒷받침하는 것이다.
바람직한 일 실시 태양으로 본 발명의 방법은 상기 (b) 단계의 세포배양 삽입체 위에 있는 세포를 외배엽 세포 분화에 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 생체 내의 자연스러운 배아 발생 중에 일어나는 현상이 자연스럽게 유도되어, 세포배양 삽입체 아래로는 신경능 줄기세포가 분리되고, 삽입체 위에는 외배엽 세포가 남게 되어 이를 외배엽 세포의 분화에 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어 “외배엽 세포(Ectodermal cell)”란 상기 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체에서 유래된 외배엽 세포를 의미하고, 외배엽 줄기세포, 외배엽 전구세포를 포함한다. 또한, 테라토마가 제거된 고농도의 순수 외배엽 세포를 포함한다. 이와 같은 외배엽 세포는 표피, 신경계, 감각기관으로 분화할 수 있다.
바람직한 일 실시 태양으로, 본 발명의 방법은 분리된 신경능 줄기세포에 네스틴 (nestin), p75, sox-10 및 CD56와 같은 신경능 줄기세포의 표지자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같은 검출은 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 유세포 분석이나 PCR 등을 이용해 분석할 수 있다. 이와 같이 조혈줄기세포 항원(1% 미만)이 검출되지 않는 것은 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포에 조혈줄기세포가 포함되지 않았음을 입증하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신경능 줄기세포는 앞서 기술한 바와 같이, 중간엽계 세포로의 분화력을 보유할 수 있으며, 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포로의 분화가 가능하다.
이와 같이 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포는 계대의 제한성 없이 신경능 줄기세포를 제조할 수 있으며, 분리된 신경능 줄기세포는 신경세포, 신경아교세포 (별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 뇌실막세포) 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포, 감마아미노부틸에시드 (γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포, 평활근세포로의 분화력을 가지고 있어 신경계 질환의 치료를 위한 세포치료제 또는 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 예방 또는 치료할 수 있는 상기 신경계 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 퇴행성 신경질환, 관절염, 백반증, 뇌졸중, 다발성 경화증, 근위축성 축상경화증, 선청성 거대결장증, 말초신경장애, 디조지 증후군, 트리처콜린스 증후군, 차지 증후군, 바르덴부르크증후군, 선천성 심장병, 가족성자율신경실조증, 악센펠드 증후군, 골텐하르증후군, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 1x106 cell/kg 내지 5x107 cell/kg의 세포치료제가 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 1×104 cell/kg 내지 1×108 cell/kg의 양을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이상 본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 효율적으로 분리해 냄으로써, 세포공급원 및 세포 계대 배양의 제한성을 없앴으며, 기존의 인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포 분리방법보다 분리효율 및 분화능력을 크게 향상시키고, 비용을 절감하는 효과가 있다. 또한 다양한 질병의 세포 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포의 분리
인간 배아줄기세포를 정상산소 상태(37℃, 5% CO2세포배양기)에서 배상체 형성을 통해 초기 분화시킨 후, 8㎛ 다공크기를 가진 세포배양 삽입체 위에 올렸다. 올릴 때는 적어도 5%의 FBS가 혼입되어 있으나, 사이토카인은 첨가되지 않은 배지인 EBM-2 (Lonza); Cat:CC-3156을 사용하였다. 상기 올려진 초기 배상체를 약 일주일간 세포배양 삽입체 위에서 배양하였고 이와 같은 배양으로 세포가 배양 삽입체 아래로 이동하였으며, 세포의 이행 패턴은 특정 마커의 발현 정도를 PCR 분석을 통해 확인하였다.
< 실시예 2>
인간 배아줄기세포 유래 신경능 줄기세포의 배양 및 증식
상기 실시예 1에서 이동된 시트의 세포는 지속적 배양을 하면 가장자리부터 신경능 줄기세포로 세포 모양의 변화가 일어나면서 뻗어나오는데, 이러한 세포를 얻기 위해 우선 뻗어나오지 않은 잉여의 세포 모양 시트를 걷어내는 것이 중요하다. 걷어낸 후의 세포가 함유된 시트를 계대하면 지속적으로 신경능 줄기세포를 얻을 수 있으므로 제거하되 버리지 않고 사용할 수 있다. 이렇게 걷어내고 남은 신경능 줄기세포는 트립신-EDTA를 사용해서 세포를 떼어내어 계대 배양하였다. 계대 시 세포의 수는 2x104/cm2 정도가 적당하였다. 실제로 20계대 이상 배양해도 세포가 가지는 특징이나 염색체의 이상 등은 발견되지 않았다.
< 실시예 3>
분리한 신경능 줄기세포의 세포특성 및 다분화능 검증
유세포 분석기를 이용하여 표지인자의 발현을 확인하였다. 확인 방법은 다음과 같은 방식으로 수행하였다. 1) 트립신-EDTA를 사용하여 떼어낸 세포들을 5×105 cells/㎖의 농도로 PBS(Phosphate buffered saline)에 부유시켰다. 2) 신경능 줄기세포를 확인할 수 있는 세포 표지자에 대한 항체를 상기 수득한 신경능 줄기세포에 첨가하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 3) 대조군으로 anti-mouse monoclonal 항체를 5X105 cells/㎖ 농도의 세포에 더하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 4) 반응시킨 세포들은 FACS Calibur(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 상에서 분석하였다.
그 결과, EBM-2 , MEM-α 배양액을 이용하여 분리한 신경능 줄기세포는, 신경능 줄기세포가 갖는 일반적 특정 표지자가 발현되는 것으로 확인되었으나, 이들의 발현 정도는 EBM-2 배양배지 조건과 MEM-α 배양배지 조건에서 발현 정도의 차이를 보였고, 신경능 줄기세포가 각종 세포로 분화할 수 있는 표지자의 발현이 확인되었다.
따라서 이러한 결과를 통해 상기 본 발명의 방법으로 분리한 신경능 줄기세포는 줄기세포가 가지는 특성과 함께 다분화능의 특징을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
염색체의 확인
계대의 횟수와 기간에 상관없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것인지 여부를 확인하기 위하여 염색체 분석을 하였다. 확인 방법은 다음과 같다. 1) 10 ㎖의 배양액이 담긴 각 배양 용기에 100 ㎍/㎕ 농도의 콜히친 용액 20 ㎕를 첨가하고 배양용기를 약하게 흔들어 잘 섞은 후, 37℃에 2시간 방치하였다. 2) 500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 3) 상층액을 제거하고 약간의 배양액만을 남겼다. 4) 5 ㎖의 저장액(0.075 M KCl)에 세포를 부유시킨 후 37℃ 항온수조에 25분간 방치하였다. 5) 각 튜브에 새로 준비한 고정액(methanol : glacial acetic acid=3:1, v/v)을 5방울씩 첨가하고 튜브를 1~2회 약하게 섞어준 후 1,200 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 6) 상층액을 제거한 후 5 ㎖의 고정액에 세포를 가볍게 두드려 부유시킨 후 상온에 10분간 방치하였다. 7) 5~6 과정을 2회 반복한 후 0.5 ㎖의 고정액에 부유시켰다. 8) 차가운 70% ethanol에 담가 둔 슬라이드 글라스 위에 세포 부유액을 한 방울 떨어뜨렸다. 9) 알코올 램프 위에서 슬라이드의 ethanol을 건조시킨 후 공기 중에서 물기를 말렸다. 10) 5% Giemsa 용액에 12분간 담가두었다. 11) 슬라이드 글라스를 뒤집은 후 증류수로 염색액을 씻어냈다. 12) 공기 중에서 건조한 후 커버슬립을 덮고 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 계대의 횟수와 기간에 상관없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (18)

  1. (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 신경능 줄기세포를 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 분리된 신경능 줄기세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포로부터 신경능 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포배양 삽입체는 0.1 내지 100㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포는 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells) 또는 인간을 포함한 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 신경능 줄기세포의 분리 방법은 효소적 분리를 통한 단일 세포로 분리하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 신경능 줄기 세포의 분리 방법은 스크랩퍼를 이용하여 단일세포화하지 않고, 상피세포모양 시트로 분리하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (b) 단계에서 상피세포모양 시트를 분리한 후, (c) 단계에서 상기 상피세포모양 시트를 먼저 분리한 다음 효소적 분리를 이용해 계대 배양 증식하는 것인 방법.
  7. 제7항에 있어서,
    상기 먼저 분리된 상피세포모양 시트를 다음 계대에 다시 이용하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포배양 삽입체 위에 있는 세포를 외배엽 세포 분화에 이용하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 시 배양 배지 내에 0.1%부터 20% 범위의 FBS(Fetal bovine serum) 또는 0.1%부터 20% SR(Serum replacement)를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 시 사용하는 배지는 사이토카인을 함유하지 않은 EBM-2 ,Ham F-10, F12, RPMI, DPBS, DMEM 또는 MEM-α 배지를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 분리된 신경능 줄기세포를 특정 표지자의 존재 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 신경능 줄기세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 분리된 신경능 줄기세포는 신경세포, 신경아교세포 (별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 뇌실막세포) 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포, 감마아미노부틸에시드 (γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 골격근세포, 평활근세포로의 분화력을 지닌 것을 특징으로 하는 신경능 줄기세포.
  14. 제12항의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 분화된 세포는 상기 신경능 줄기세포로부터 분화된 신경세포; 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 또는 뇌실막세포인 신경아세포 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포; 감마아미노부틸에시드(γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포; 성상세포; 슈반세포; 조골세포; 연골세포; 지방세포; 골격근세포 또는 평활근세포인 것을 특징으로 하는 세포치료제.
  16. 제12항의 신경능 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환, 관절염, 백반증, 뇌졸중, 다발성 경화증, 근위축성 축상경화증, 선청성 거대결장증, 말초신경장애, 디조지 증후군, 트리처콜린스 증후군, 차지 증후군, 바르덴부르크증후군, 선천성 심장병, 가족성자율신경실조증, 악센펠드 증후군, 골텐하르증후군, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 분화된 세포는 상기 신경능 줄기세포로부터 분화된 신경세포; 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 또는 뇌실막세포인 신경아세포 티로신수산화효소(TH) 양성인 도파민 신경세포; 감마아미노부틸에시드(γ-aminobutylic acid, GABA) 신경세포; 성상세포; 슈반세포; 조골세포; 연골세포; 지방세포; 골격근세포 또는 평활근세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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