JP2016537022A

JP2016537022A - 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して肝細胞に分化させる方法

Info

Publication number: JP2016537022A
Application number: JP2016552367A
Authority: JP
Inventors: ヨンイ，サン; ジュチョン，ウォン; ビンキム，ホ; ソンオー，ミン; ホイ，キェ
Original assignee: ビービーエイチシーシーオー．，エルティーディー．
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2016-12-01
Anticipated expiration: 2033-11-05
Also published as: PT3064575T; HUE048804T2; US10072248B2; EP3064575B1; CY1122791T1; US20160272936A1; LT3064575T; ES2776183T3; AU2013403885B2; CN105683359A; WO2015064802A1; EP3064575A4; HRP20200474T1; PL3064575T3; RS60363B1; CN105683359B; EP3064575A1; SI3064575T1; KR101542849B1; JP6711757B2

Abstract

本発明は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）抽出物を含む誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｔｅｍｃｅｌｌ）逆分化用培地組成物に関する。また、本発明は、前記培地組成物を利用して製造された誘導万能幹細胞から肝細胞に分化させる方法に関する。本発明による培地組成物を利用すれば、間葉系幹細胞を利用して誘導万能幹細胞を効率的に製造することができ、製造された万能幹細胞は、肝細胞への分化が可能であるので、細胞治療剤として有用に使用することができる。

Description

本発明は、間葉系幹細胞の万能幹細胞誘導培地組成物を利用して誘導万能幹細胞を製造し、これを肝細胞に分化させる方法に関する。

幹細胞は、各組織から得られる分化する前の段階の未分化細胞を総称する。未分化状態で一定期間の間、自分と同一の細胞を持続的に作り出すことができる性質と、適当な条件下では生物組織を構成する多様な細胞に分化することができる性質を有している。
幹細胞は、分化能と生成時期により、大きく胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）と成体幹細胞（ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）に区分することができる。また、他の分類としては、幹細胞の分化能により、万能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）及び単分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）幹細胞に分けられる。
成体幹細胞は、多分化能または単分化能幹細胞に区分することができる。代表的な成体幹細胞としては、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）と造血母細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＨＳＣｓ）がある。間葉系幹細胞は、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）に分化し、造血母細胞は、赤血球、白血球、血小板など、主に血液内の血球細胞に分化すると知られている。
一方、万能幹細胞は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍｌａｙｅｒ）の全てに分化することができ、人体の全ての細胞や臓器組織に分化することができる多機能性を有した幹細胞を称し、一般に胚性幹細胞がこれに該当する。ヒト胚性幹細胞は、人間生命体として発生することができる胚芽から作られるため、多くの倫理的な問題点を抱えているが、成体幹細胞に比べて細胞増殖及び分化能力に優れていると知られている。成体幹細胞は、骨髓、血液、脳、肌などから得られるため倫理的な問題は少ないが、胚性幹細胞に比べて限定した分化能力を有している。
このような問題点を克服するための代案として、成体から由来した細胞を逆分化させて胚性幹細胞と類似したカスタマイズ型万能幹細胞を製造するための様々な方法が試みられてきた。代表的な方法として、細胞融合法（ｆｕｓｉｏｎｗｉｔｈＥＳｃｅｌｌ）、体細胞核置換法（ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒ）、特定因子注入法（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｂｙｇｅｎｅｆａｃｔｏｒ）などがある。細胞融合法は、誘導された細胞が２対の遺伝子をさらに有し、細胞の安定性の側面から問題点があり、体細胞核置換法は、卵子が大量で必要であるため、効率も非常に低いという点で問題がある。そして、特定因子注入法は、特定遺伝子を挿入して逆分化を誘導するために、発ガン遺伝子を含むウイルスを利用する方法であり、発ガンの危険が高く、低い効率と方法的な側面における難易度により、細胞治療剤の開発可能性の面で問題化されている。
万能幹細胞を成功的かつ多量で得るためには、分離した臍帯由来単核細胞を培養する段階における培養組成物が非常に重要であるので、より多量、高効率の誘導方法で万能幹細胞を製造するための研究が必要な状態である。
上記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を増進するためのものであるだけで、この技術分野で通常の知識を持った者には既に知られた従来技術にあたることを認めると受け入れられてはならない。

本発明者は、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のための万能幹細胞を高効率で誘導する方法を探し出すために努力してきた。その結果、安全な天然抽出物であるカジメ抽出物を細胞培養培地に添加する場合、間葉系幹細胞から誘導万能幹細胞を製造することができ、これを肝細胞に安全でかつ高い効率で分化させることができることを確認することで、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、カジメ抽出物を含む間葉系幹細胞を誘導万能幹細胞に逆分化させるための培地組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、カジメ抽出物が含まれた培地で間葉系幹細胞を誘導万能幹細胞に逆分化させ、これを再び肝細胞に分化させる方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、上記製造方法で製造された肝細胞を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、上記肝細胞を含む細胞治療用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってさらに明確になる。

本発明の一様態によると、本発明は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）抽出物を含む、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｔｅｍｃｅｌｌ）に逆分化させるための培地組成物であって、前記誘導万能幹細胞は肝細胞に分化することを特徴とする培地組成物を提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、下記の段階を含む間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）から肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）を分化させる方法を提供する：
（ａ）カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）抽出物を細胞培養培地に添加する段階；
（ｂ）前記培地で間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｔｅｍｃｅｌｌ）に逆分化させる段階；及び
（ｃ）前記誘導万能幹細胞を肝細胞に分化させる段階。
本発明者は、胚芽を破壊する倫理的問題なしに、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のための万能幹細胞を高効率で誘導する方法を探し出すために努力してきた。その結果、安全な天然抽出物であるカジメ抽出物を細胞培養培地に添加する場合、驚くべきことに高い効率で誘導万能幹細胞を製造することができ、これを再び肝細胞に分化することができるということを確認した。
本発明で使用された用語「胚性幹細胞」は、受精後、発生初期の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ）から分離して培養した細胞で、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞を称する。本発明で使用された用語「万能幹細胞」は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍｌａｙｅｒ）、即ち、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）の全てに分化することができる万能性を有した幹細胞を称する。
本発明で使用された用語「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が分裂増殖して成長する間に互いに構造や機能が特殊化する現象、即ち、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられたことを行うために形態や機能が変わっていくことをいう。
本発明で使用された用語「細胞治療剤」は、ヒトから分離、培養及び特殊な操作を通じて製造された細胞及び組織で、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品であり、細胞或いは組織の機能を復元するために、同種または異種細胞を体外で増殖、選別するか、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品を称する。細胞治療剤は、細胞の分化程度によって大きく体細胞治療剤、幹細胞治療剤に分類され、本発明は、特に幹細胞治療剤に関する。
本発明の間葉系幹細胞は、哺乳動物由来の胚性幹細胞または成体幹細胞から分離した細胞であり、好ましくは、臍帯由来間葉系幹細胞であり、より好ましくは、人体臍帯由来間葉系幹細胞である。前記幹細胞は、人体で胎盤と胎児を連結する臍帯から採取して得られる。臍帯からの間葉系幹細胞の採取は、多様な方法を利用して行うことができ、例えば、人体で臍帯を採取してＤＰＢＳで血液が出ないまで洗い、洗った臍帯を手術用刃で切り刻み、３７℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて単核細胞が含有された溶液が得られる。
以下、本発明の段階によって詳しく説明する。

段階ａ）カジメ抽出物を細胞培養培地に添加：
本発明の培地組成物に含まれる有効成分であるカジメ（甘苔、Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）は、主に南海岸、済州島海岸一帯及び鬱陵島海岸一帯で棲息する褐藻植物コンブ目コンブ科の多年生海藻類であり、主にアワビとサザエなどの餌となり、アルギン酸やヨード・カリウムを作る主要原料や、食用として利用したりもする。
本発明が含むカジメ抽出物は、水、（ａ）炭素数１〜４の無水または含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ノルマル−プロパノール、イソ−プロパノール及びノルマル−ブタノールなど）、（ｂ）前記低級アルコールと水との混合溶媒、（ｃ）アセトン、（ｄ）エチルアセテート、（ｅ）クロロホルム、（ｆ）１，３−ブチレングリコール、（ｇ）ヘキサン、（ｈ）ジエチルエーテルなどの有機溶媒を利用して抽出することができ、好ましくは、メタノールまたはエタノールと水との混合溶媒を利用して抽出することができる。混合溶媒を利用して抽出する場合、メタノールまたはエタノールの含量は、５０〜８０ｖ／ｖ％が好ましい。
現在、前記カジメ抽出物を化粧料などの肌組成物に適用するための事例が増加しているが（大韓民国公開特許第２０１３−００１７１５９号、第２０１２−００４０４８８号、第２０１０−００９７２９３号など参照）、万能幹細胞誘導用培地で開発された事例は全くない。
本発明で使用された用語「培地」は、糖、アミノ酸、各種の栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに必須的な要素を含む生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で幹細胞などの細胞の培養または分化のための混合物をいう。
当業界には多様な培地が市販されており、人為的に製造して使用することもできる。市販中の培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭＦ−１２、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＰＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘ2 ｃｏｍｐｌｅｔｅＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗｙｏｒｋ、ＵＳＡ）、Ｃｈａｎｇ’ｓＭｅｄｉｕｍＭｅｓｅｍＣｕｌｔ−ＸＦＭｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）などがあり、人為的に製造することができる培地と共に、本発明の培地組成物に含まれる基本培地として使用することができる。
前記基本培地には、通常添加される血清成分（例えば、ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ））及び抗生剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）などを添加することができる。前記基本培地に添加される血清成分または抗生剤成分の濃度は、本発明の効果を達成することができる範囲内で変わることができ、好ましくは、１０％のＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシンなどを添加することができる。
また、本発明の培地は、栄養混合物（ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅ）をさらに含むことができる。前記栄養混合物は、細胞培養に一般に使用される各種のアミノ酸、ビタミン、無機塩などを含む混合物であり、前記アミノ酸、ビタミン、無機塩などを混合して製造するか、商業的に製造された栄養混合物を使用することができる。商業的に製造された栄養混合物は、Ｍ１９９、ＭＣＤＢ１１０、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ３０２などが例として挙げられるが、これに制限されるものではない。
また、本発明の培地は、万能幹細胞の誘導と安定化のために、エネルギーウォーターをさらに含むことができる。前記エネルギーウォーターは、０．０１〜１０ｖ／ｖ％で追加することが好ましく、より好ましくは、０．０５〜０．５ｖ／ｖ％で追加する。
本発明の培地組成物は、万能幹細胞の誘導に特異的な培地であり、前記基本培地にカジメ抽出物を添加することで達成することができ、好ましくは、全体培地組成物基準１〜１，０００μｇ／ｍl濃度で、より好ましくは、１００〜４００μｇ／ｍl濃度でカジメ抽出物を含むことができる。

段階ｂ）間葉系幹細胞を誘導万能幹細胞で逆分化：
次いで、前記培地を利用して間葉系幹細胞を誘導万能幹細胞に逆分化させる。
本発明の一実施例によると、本発明のカジメ抽出物が含まれた培地組成物を利用した場合、ＤＭＥＭＦ−１２培地のみを利用した場合と違って、８〜１０日目に万能幹細胞コロニーが形成されたことが確認できた（図２及び図３）。
本発明で製造された誘導万能幹細胞は、胚性幹細胞と同一の分化能を有し、細胞の模様においても胚性幹細胞とほぼ同一である。本発明の一実施例によると、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ）及びタンパク質（ＳＳＥＡ４）の発現有無を調査した結果、本発明によって誘導された万能幹細胞で胚性幹細胞と同様に前記遺伝子及びタンパク質が発現することが確認できた（図４）。

段階ｃ）誘導万能幹細胞を肝細胞に分化：
次いで、前記製造された誘導万能幹細胞を利用して肝細胞に分化させる。
前記肝細胞への分化は、当業界に公知された多様な分化培地を使用してこれを分化することができ、好ましくは、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、トランスファリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）、インスリン及び成長因子（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）を含む分化培地を利用して行う。前記成分の好ましい含量は、１〜１００ｍＭのデキサメタゾン、１〜１０μｇ／ｍlのトランスファリング、１〜５０ｎｇ／ｍlの亜セレン酸ナトリウム、１〜５０μｇ／ｍlのインスリン、１０〜５００ｎｇ／ｍlのＨＧＦ及び／またはＦＧＦなどの成長因子を含む。
前記分化培地の基本培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭＦ−１２、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＰＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘ2 ｃｏｍｐｌｅｔｅＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗｙｏｒｋ、ＵＳＡ）、Ｃｈａｎｇ’ｓＭｅｄｉｕｍＭｅｓｅｍＣｕｌｔ−ＸＦＭｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）などを利用することができる。
本発明で製造された誘導万能幹細胞は、胚性幹細胞と同一の万能分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、本発明の一実施例によると、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化することができる万能性を有することが確認できた（図５）。
従って、本発明の誘導万能幹細胞は、肝細胞に効果的に分化することができる。
本発明の一実施例によると、万能幹細胞で予想された細胞が肝細胞に分化可能なことが確認できた（図６）。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、前記分化された肝細胞を含む細胞治療用組成物を提供する。
本発明の組成物は、任意の投与経路により、具体的には腹腔または胸腔投与、皮下投与、静脈または動脈血管内投与、筋肉内投与、注射による局所投与などの方法によって投与可能である。
本発明において、前記組成物は、通常の方法に基づいて注射剤、懸濁液剤、乳化剤などの形態で投与することができ、必要に応じてフロイント完全補助剤などの補助剤に懸濁されるか、またはＢＣＧのような補助剤活性を有する物質と共に投与することも可能である。前記組成物は、滅菌されるか安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩または緩衝剤などの補助剤及びその他に治療的に有用な物質を含有することができ、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法によって製造することができる。本発明による細胞治療用組成物は、薬剤学的に許容可能な担体や添加剤を含有することができるが、有効成分以外に希釈剤（例えば、デキストロース、ソルビトール、セルロース、グリシン、ラクトース、スクロース、マンニトール）、結合剤（例えば、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、トラガカンス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、崩解剤（例えば、澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩）または沸騰混合物及び／または吸収剤、甘味剤、香味剤及び着色剤を含有することができる。
本発明の細胞治療用組成物は、多様な疾患に適用可能であり、今後、ヒトに対する臨床試験結果によっては、ヒトに対する同種細胞治療剤としての可能性もある。

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである。
（ｉ）本発明は、カジメ抽出物を含む誘導万能幹細胞逆分化用培地組成物を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、前記培地組成物を利用して製造された誘導万能幹細胞から肝細胞に分化させる方法を提供する。
（ｉｉｉ）本発明による培地組成物を利用すると、間葉系幹細胞を利用して誘導万能幹細胞を効率的に製造することができ、製造された万能幹細胞は、肝細胞への分化が可能であるので、細胞治療剤として有用に使用することができる。

間葉系幹細胞でカジメ抽出物培地を注入して培養時に胚性幹細胞とほぼ同一の万能幹細胞が誘導されることを示す図である。本発明の方法で誘導された万能幹細胞を特異的タンパク質発現を利用して万能幹細胞であることを確認したものである。本発明の方法でカジメ抽出物の濃度によって誘導された万能幹細胞コロニー形成を示すものである。本発明の方法で誘導された万能幹細胞の遺伝子発現を示すものである。本発明の方法で誘導された万能幹細胞生体内分化能を試験した結果である。本発明の方法で誘導された万能幹細胞で肝細胞分化用培地を利用して肝細胞に分化した結果である。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を持った者において自明であろう。

実施例１：カジメ抽出物の製造
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を受けた後、実験に使用した。乾燥した生薬試料１００ｇを７０％メタノール１lに入れ、１６時間の間還流抽出し、ろ過紙を使用してろ過した。ろ液を回転減圧蒸発器で濃縮させて直ちに凍結乾燥した。

実施例２：人体臍帯で間葉系幹細胞の分離及び培養
実施例２−１：人体臍帯採取
臍帯組織は、出産直後に直ぐ収集される。試料が実験室に移される前に先ずきれいに洗浄した後、直ちに移送用培地（５０ＩＵ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購買））が添加されたＦ−１２培地が入っている５００ｍlの滅菌ガラス瓶に移される。実験室では、滅菌状態下でｃｌａｓｓ１００のフローフードで幹細胞の抽出が行われる。試料は、先ず、滅菌ステンレススチールの容器に移される。ＰＢＳは、数回洗浄した後、臍帯組織試料は、以後２ｃｍ長さで切られて１０ｃｍ直径の細胞培養皿に移され、ここで追加的な洗浄及び７０％エタノールで抗感染処理し、抗生剤混合物（５０ＩＵ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購買））が添加されたＰＢＳで前記溶液がきれいになるまで数回洗浄する。
実施例２−２：人体臍帯で幹細胞の分離及び培養
臍帯の血管及びその他の内部要素からワルトンゼリー（臍帯の基質）を分離するために、臍帯組織の切開が先ず行われる。血管を除去した後、分離したワルトンゼリーは、細胞の抽出のために、小さい切れ（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）の大きさで切られる。
外植（ｅｘｐｌａｎｔ）は、上皮幹細胞または間葉系幹細胞の抽出に適合な細胞培養条件が備えられているそれぞれ異なる組織培養皿に臍帯ワルトンゼリーの切れを入れて行われる。
間葉系細胞の分離／培養のために、前記の外植された組織は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）が添加された５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ）Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシンに浸されて二酸化炭素細胞培養器で３７℃に維持された。培地は、３日または４日毎に交替された。細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は、光学顕微鏡でモニタリングされた。伸張する細胞は、追加的な拡張及び冷凍保管（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ利用）のために、トリプシン処理（０．１２５％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ）した。
前記培地は、３日または４日毎に交替された。外植された組織からの細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は、光学顕微鏡でモニタリングされた。
間葉系幹細胞の抽出のために、細胞のペレットは、培地ＤＭＥＭＦ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシンに再懸濁及びカウントされ、１０ｃｍの組織培養皿に１×１０^６細胞／皿の密度で接種された。前記培地は、３日または４日毎に交換された。細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）及びクローン形成は、光学顕微鏡でモニタリングされた。約９０％の細胞数（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で、細胞は、上記に説明したようにサブ−培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）された。

実験例１：間葉系幹細胞から万能幹細胞の誘導
実験例１−１：カジメ抽出物濃度によるヒト由来間葉系幹細胞の万能幹細胞の製造
済州カジメ抽出物の濃度により、ヒト臍帯由来幹細胞から万能幹細胞を誘導するための実験で、対照群は、ＭＳＣの専用培地でＤＭＥＭＦ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍlのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシンを基本培地として使用し、実験群は、継代培養を三回目したヒト臍帯由来間葉系幹細胞を使用して、培地に済州カジメ抽出物を１μｇ／ｍl、１０μｇ／ｍl、１００μｇ／ｍl、２００μｇ／ｍl、４００μｇ／ｍl、８００μｇ／ｍl、１０００μｇ／ｍlの濃度と、エネルギーウォーター（ＳｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ＴｉＯ_３、Ｆｅ_２Ｏ_３、ＣａＯ、Ｎａ_２Ｏ、Ｋ_２Ｏ、ＬｉＯを含有する精製脱イオン水、ＳＴＣＬＩＦＥ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ）０．１ｖ／ｖ％を添加した（図１）。ヒト臍帯由来間葉系幹細胞を分離して洗浄された単核球細胞を６−ウェルプレート（ｄｉｓｈ）に１×１０^４個の細胞を接種して、３７℃と５％ＣＯ_２を維持して培養した。
本発明の方法によって誘導された万能幹細胞に対して、胚性幹細胞の特異タンパク質であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ４）の発現有無を、これに対する抗体を使用し免疫化学的染色法を使用してタンパク質発現有無を分析した。染色過程は、先ず４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を利用して細胞を固定した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ溶液でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）をした。ＯＣＴ４、ＳＯＸ３、ＳＳＥＡ４に対する１次抗体を処理して４℃で１８時間の間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、１次抗体に対する蛍光（ＦＩＴＣ）が付いた２次抗体を処理して、室温で１時間の間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して発現有無を分析し、その結果を図２に示した。ＢＦは、ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄを意味し、二つ目の図面は、各タンパク質発現に対する染色結果を意味し、三つ目の図面は、この二つの図面を合わせて示している（図２）。
その結果、実験群では、済州カジメ抽出物の濃度が１００〜４００μｇ／ｍlである時のみに１０日後にコロニーが形成することが観察され（図３）、万能幹細胞特異的マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４がコロニーでのみ染色されて、万能幹細胞であることを確認した。
実験例１−２：万能幹細胞遺伝子の分析比較
上記実施例２−１で製造された万能幹細胞を顕微鏡で見ながら、２００μlピペットを使用してコロニーのみを引き離した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製造）を使用して全体ＲＮＡを分離した。逆転写−重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用してｃＤＮＡを合成した後、ＯＣＴ４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ及び対照遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子に特異的なプリマーを利用してＰＣＲを進行した。Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、Ｓｏｘ−２は、胚性幹細胞で見られる特徴的遺伝子であり、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、胚性幹細胞及び成体細胞の両方で陽性として見られる非特異的な遺伝子である。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分析して、これらの遺伝子の発現を確認した結果を図４に示した。図４によると、誘導過程を経ていない間葉系幹細胞では、万能幹細胞の特徴的な遺伝子であるＯＣＴ４の発現度が低いことに対し、本発明の方法によって誘導された万能幹細胞（ＳＴＣ２０１３−Ｆ００２）では、これらの特徴的な遺伝子が顕著に高く発現された。幹細胞遺伝子であるＳＯＸ２とＮａｎｏｇは、類似した水準で発現され、非特異的な遺伝子であるｃ−Ｍｙｃは、誘導過程を経た細胞（ＳＴＣ２０１３−Ｆ００２）が誘導過程を経ていない細胞より低く発現することが分かった。
実験例２：テラトーマ試験による万能幹細胞の確認
本発明の方法で誘導された万能幹細胞の生体内分化能を分析するために、支持細胞上で培養した未分化万能幹細胞コロニーを培養５日目にトリプシン−ＥＤＴＡを処理して引き離した後、膠原質分解酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）に入れてインキュベーターで３０分間置いた。未分化万能幹細胞を回収して１×１０^６細胞を重症複合免疫欠乏症（ｓｅｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＳＣＩＤ）マウスに皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。４週後に形成された奇形種を得て４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた後、通常のパラフィン包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を実施した。１０μｍ厚さで組織を切り、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（Ｅｏｓｉｎ）染色をした。
図５によると、本発明の方法で製造された誘導万能幹細胞を注入した所で目視で奇形種（ｔｅｒａｔｏｍａ）が形成されることが分かり、さらに詳しくは、組織学的に外胚葉由来の神経組織（図５ａ）、中胚葉由来の筋肉組織（図５ｂ）、そして内胚葉由来の胃臓組織（円柱上皮、図５ｃ）などに分化することができる奇形種が形成されることを示した。前記実験を通じて、本発明の方法で誘導された細胞が実際に生体内で胚性幹細胞と同一の分化能、即ち外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化することができる万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有することを確認することができた。

実験例３：肝細胞への分化
肝細胞への分化を誘導するために、カジメ抽出物とエネルギーウォーターを混合した培地を使用して、湿度９５％、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器に培養して、間葉系幹細胞から万能幹細胞を誘導した後、肝細胞分化溶液ＤＭＥＭＦ−１２、２０ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ、５．５μｇ／ｍlのｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ、７ｎｇ／ｍlのｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ、１００ｎｇ／ｍlのＨＧＦ、５０ｎｇ／ｍlのＦＧＦ、１０μｇ／ｍlのｉｎｓｕｌｉｎで３週間培養した。肝細胞への分化検証のために、ａ−ｆｅｔｒｏｔｅｉｎ免疫組織化学染色を通じて確認した結果、図６に示すように、分化培地を処理する前は陰性反応（図６Ａ及びＢ）であり、処理した後は緑色蛍光で染色されて陽性反応（図６Ｃ及びＤ）を示し、万能幹細胞で予想された細胞が肝細胞に分化可能なことを確認することができた。免疫化学組織染色方法は、前記免疫組織化学法と同一である。
以上で本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を持った者において、このように具体的な記述は、単に好ましい具現例であるだけで、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は自明である。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されるといえる。

Claims

下記の段階を含む間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）から肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）を分化させる方法：
（ａ）カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）抽出物を細胞培養培地に添加する段階；
（ｂ）前記培地で間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｔｅｍｃｅｌｌ）に逆分化させる段階；及び
（ｃ）前記誘導万能幹細胞を肝細胞に分化させる段階。
前記カジメ抽出物は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘ2 ｃｏｍｐｌｅｔｅＭｅｄｉｕｍ及びＣｈａｎｇ’ｓＭｅｄｉｕｍＭｅｓｅｍＣｕｌｔ−ＸＦＭｅｄｉｕｍで構成された群から選択される培地に含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記カジメ抽出物は、培地組成物基準１００−４００μｇ／ｍl含まれたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記培地組成物は、エネルギーウォーター０．０１〜１０ｖ／ｖ％をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記段階ｃ）は、
デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、トランスファリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）、インスリン及び成長因子（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）を含む培地を利用して行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘ2 ｃｏｍｐｌｅｔｅＭｅｄｉｕｍ及びＣｈａｎｇ’ｓＭｅｄｉｕｍＭｅｓｅｍＣｕｌｔ−ＸＦＭｅｄｉｕｍで構成された群から選択される培地にデキサメタゾン、トランスファリング、亜セレン酸ナトリウム、インスリン及び成長因子が含まれたことを特徴とする請求項５に記載の方法。
請求項１の製造方法で製造された肝細胞。
請求項７の肝細胞を含む細胞治療用組成物。
カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａｃａｖａ）抽出物を含む、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｔｅｍｃｅｌｌ）に逆分化させるための培地組成物であって、前記誘導万能幹細胞は、肝細胞に分化することを特徴とする培地組成物。