KR102018783B1 - 간세포의 약물대사 기능 향상방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 간세포로 분화한 후, 분화된 간세포에 생체이물(xenobiotics)을 반복 처리하여 약물대사효소의 발현 및 활성과 간세포의 생리학적 기능을 높이는 고기능성 간세포의 제조방법에 관한 것이다.

Description

간세포의 약물대사 기능 향상방법{Method for enhancing metabolizing activity of hepatocytes}

본 발명은 고기능성 간세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 고기능성 간세포에 관한 것이다.

간 기능에 대한 악영향 및 간 조직 손상은 약물에 의한 주요 독성 유발 요인 중 하나로 신약개발의 초기 단계에서 약물의 간독성 여부 혹은 예상치 못한 대사물의 생성 여부에 대한 평가가 매우 중요하다. 그러나 간을 대체할 수 있는 in vitro 평가도구가 없는 실정이며, 현재 대체물로 쓰이는 간종양세포주의 경우는 간세포 특이 약물 대사 효소(CYP enzymes, GST 등 Phase I & II) 및 약물의 세포 내 흡수와 배출을 맡고 있는 주요 원형질막 수송자(plasma membrane transporters)(ABC, SLC transporters)의 발현 및 활성이 매우 낮다.

또한, 정상 간에서 직접 수확하여 초대 배양된 간세포의 경우는 다른 조직의 세포와 달리 증식력이 매우 제한적이고, 품질이 일정하지 못하며, 간세포 특이 약물대사효소 및 주요 단백질의 발현 수준이 정상 간세포와 현격한 차이를 보인다. 특히 초대배양 간세포의 경우 배양이 된다 하더라도 쉽게 간세포로서의 특성을 소실하는 경향을 보이며 약물대사활성을 잃어버려 장기간 간독성(long-term hepatotoxicity)을 평가하기에 큰 제약이 있다.

인간의 간에서 발현이 되는 CYP family는 인종별 개체별 다형성 (polymorphism) 때문에 같은 약물이라도 각 인종별 개체별 genetic variation으로 인하여 신약 개발 시 약효력의 차이와 부작용의 위험성이 항상 잠재되어 있다.

따라서 국내ㆍ외적으로 확립되어 있는 약 90종의 전분화능 인간 배아줄기세포(WiCell data)를 간세포분화를 통하여 약물 스크리닝, in vitro 안정성 시스템 구축에 활용할 경우, 개체 상호간 유전변이(genetic variation)에 의한 약물 활성 및 대사의 차이를 예측함으로써 후보 신약의 안정성을 확보하는데 기여할 수 있다.

또한, 인간의 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 및 인간으로부터 유래된 다능성 줄기세포에서 유도된 간세포 유사세포(hepatocyte-like cells, HLCs)를 이용한 생체 외 약물 스크리닝 및 독성연구를 위하여 사용된다. 하지만 현재까지 보고된 HLCs는 그 약물대사 능력이 매우 낮으며 이를 극복하기 위한 획기적인 방법을 찾기 위해서 전세계 연구자들이 연구에 매진하고 있다. 최근 이 낮은 약물 대사 능력을 향상하기 위해서 3D 배양 기술이나 스캐폴드, 나노패턴 칩, 다양한 세포들과의 co-culture 방법 등이 적용되기는 하였으나 향상되는 기능이 여전히 낮아서 인간 간세포처럼 생체 외 약물 스크리닝 및 독성연구를 위하여 사용에는 한계가 있다고 사료된다.

Woo, D. H., Kim, S. K., Lim, H. J., Heo, J., Park, H. S., Kang, G. Y., Kim, S. E., You, H. J., Hoeppner, D. J., Kim, Y., et al. (2012). Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611. Desta, Z., Zhao, X., Shin, J. G., Flockhart, D. A. (2002). Clinical significance of the cytochrome P450 2C19 genetic polymorphism. Clin Pharmacokinet. 41, 913-958. Gieseck, R. L, 3rd., Hannan, N. R., Bort, R., Hanley, N. A., Drake, R. A., Ameron, G. W., Wynn, T. A., Vallier, L. (2014). Maturation of induced pluripotent stem cell derived hepatocytes by 3D-culture. PloS one. 9, e86372. Ulvestad, M., Nordell, P., Asplund, A., Rehnstrom, M., Jacobsson, S., Holmgren, G., Davidson, L., Brolen, G., Edsbagge, J., Bjorquist, P., et al. (2013). Drug metabolizing enzyme and transporter protein profiles of hepatocytes derived from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biochem Pharmacol. 86, 691-702. Schwartz, R. E., Fleming, H. E., Khetani, S. R., Bhatia, S. N. (2014). Pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells. Biotechnology Adv. 32, 504-513.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과, 줄기세포로부터 분화된 간세포에 생체이물을 반복 처리하여 약물대사 효소의 발현을 높이는 간세포의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 약물대사 효소의 발현을 높이는 고기능성 간세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 분화방법에 의하여 제조된 고기능성 간세포를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

인간 만능 줄기세포로부터 분화된 간세포에 생체 이물(xenobiotics)을 반복 처리하는 단계

를 포함하는 약물대사효소의 발현 및 활성과 간세포의 생리학적 기능을 높이는 고기능성 간세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 고기능성 간세포를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 고기능성 간세포를 포함하는 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

약물 후보물질의 대사를 시험하는 방법으로서,

상기 방법으로 제조된 고기능성 간세포를 이용하여 약물 후보물질의 대사를 정량하는 약물 대사의 시험 방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

약물 후보물질의 독성을 시험하는 방법으로서,

상기 방법으로 제조된 고기능성 간세포를 이용하여 약물 후보물질에 의해 발생되는 세포의 약물대사 효소 변이 및 세포사멸을 정량하는 약물 후보물질 독성의 시험 방법을 제공한다.

본 발명은 기 신약개발 단계에서 인체조직과 매우 유사한 분석 및 평가 도구로 활용될 수 있으므로 본 기술개발은 질병의 원인을 밝히고 새로운 약물표적을 발굴하는 기술에 활용될 수 있을 뿐 아니라, 2차 약리효능연구, 안전성연구, 대사체 연구 등 신약개발의 초기단계부터 전임상 분야의 대부분 단계에 기술 활용이 가능할 것으로 기대된다.

다양한 종류의 유전적 배경을 보유하는 인간 전능성 줄기세포주(인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포)로부터 분화된 간세포의 독성 평가가 가능하므로 약물 대사반응을 통한 약효성 및 독성의 개인적 차이를 예측하고 평가할 수 있게 할 것으로 기대된다.

현재까지 전 세계적으로 보고된 줄기세포 유래 간세포의 CYP 효소 활성은 정상 간세포에 비교하여 매우 낮은 실정이다. 따라서, 이들 약물대사 및 전달에 관련된 필수 효소들의 활성을 증가시키기 위한 고기능성 간세포의 제조방법이 개발될 경우, 기능적으로 인간 간세포와 대등한 세포주의 개발이 용이해지며, 이는 약효 및 독성 평가를 포함하는 신약개발의 신뢰성 제고에 크게 기여할 것이다.

도 1은 영양세포가 없는 상태에서 증식한 미분화 인간 배아줄기세포를 여러 단계를 거쳐 기능성 간세포로 분화시키는 모식도로 단계별 분화 특이적 마커(미분화: OCT4, 완전내배엽: Sox17, 배쪽 전장: HNF4a, 간전구 세포: AFP, 미성숙 간세포: ALB, 성숙 간세포 (ALB, ASGPR1)와 분화 유도를 위한 유도인자(미분화: mTeSR1 배양액, 완전내배엽: Activin A, CHIR99021, Sodium butyrate, 배쪽 전장: BMP2, FGF4, B27, 간모세포: Retinoic acid, B27, 간모세포 증식: Nicotinamide, Ascorbic acid, bFGF, B27, 미성숙 간세포: HGF, 성숙 간세포: Oncostatin M, Dexamethesone)을 총 22일에 거쳐 분화를 유도하는 모식도이다.
도 2는 분화 단계별 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 3은 내배엽 세포로의 분화 후 RA를 통해 간모세포를 획득한 다음 간모세포의 증식 단계를 확인한 사진이다.
도 4는 간독성 물질의 반복 투여를 통한 인간 배아줄기세포 유래 간세포의 간세포 마커(알부민과 AFP) 및 CYP3A4 효소의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 간독성 물질의 반복 투여를 통한 인간 배아줄기세포 유래 간세포의 약물대사능력 향상을 나타낸 것이다.
도 6은 약물의 반복 처리에 의해서 약물대사효소가 증가된 3D 구체 간세포의 CYP3A4의 활성을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 생체 이물(xenobiotics)을 반복 처리하여 줄기세포로부터 간세포를 배양시키는 단계를 포함하는 약물대사효소의 발현을 높이는 고기능성 간세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 줄기세포는 시험관 내 배양에서 간세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포, 바람직하게는 만능 줄기세포(pluripotent stem cells) 또는 상기 세포의 기원 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서의 포유동물은 특별히 제한되지 아니하며, 설치목(rodentia), 토끼목(lagomorpha), 영장류(primates), 식육류(carnivora), 기제류(perissodactyla) 및 우제류(artiodactyla)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 포유동물일 수 있다. 일 양태로서 포유동물은 마우스, 토끼, 소, 돼지, 원숭이, 사람일 수 있으며, 구체적으로는 사람일 수 있으나, 시험관 내 배양에서 간세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포라면 그 출처에 제한되는 것은 아니다.

상기 "만능 줄기세포(pluripotent stem cells)"란 시험관 내 배양에 의해 미분화 상태로 유지된, 거의 영속적 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 적당한 조건에서 삼배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 현재 만능 줄기세포는, 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유동물 유래의 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포 (embryonic stem cells, 이하 "ES 세포"로 약칭함), 배아기(embryonic stage)의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cells, 이하 "EG 세포"로 약칭함) 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 줄기세포 (multipotent adult progenitor cells, 이하 "MAPC"으로 약칭함) 등이 있다.

하나의 양태로서, 본 발명의 줄기세포의 분화유도 방법에 있어서, 만능 줄기세포는 ES 세포, 각종 체세포의 역분화를 통해 제작된 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 세포(induced pluripotent stem cells, iPSC), EG 세포, 또는 MAPC인 방법, 바람직하게는 ES세포, 더욱 바람직하게는 인간 ES 세포인 줄기세포의 분화유도 방법일 수 있다.

마우스 유래 ES 세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E4 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129 SV 세포, J1 세포 등이 있다. 또한, ES 세포, EG 세포, MAPC의 제조, 계대, 보존 방법에 대한 표준적인 프로토콜이 이미 확립되어 있으며, 공지의 방법 (Matsui et al, Cell 70:841, 1992; Shamblott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Jiang et al, Nature 418:41, 2002; 미국 등록특허 제 6,060,622호; 국제 공개특허 01/11011호)을 참조하여, 이들 만능 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용 가능한 세포는, 상기 3종으로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 또는 혈액 등으로부터 유래된, 모든 다능성 줄기세포를 포함한다. 구체적인 예로, 모근 초세포나 표피세포에 5-아자사이티딘(5-azacytidine, 이하 "AZC"로 약칭함) 등의 약제를 처리하여 수득한 줄기세포 (Sharda & Zahner, 국제공개특허 제02/051980호)나, 단핵구 세포에 CR3/43 항체를 처리하여 수득한 줄기세포 (Abuljadayel, Curr. Med. Res. Opinion 19: 355, 2003), 또는 성체내 귀세포 유래 줄기세포(Li et al, Nature Med., Advance online publication) 등의 ES 세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 들 수 있다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질이란, ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, ES 세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마 (teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다.

또한, ES 세포와 유사한 형질을 갖지 않는 세포, 또는 만능 줄기세포가 아닌 세포라도, 적어도 시험관 내 배양에서 간세포형의 형질을 가지는 세포로 분화할 수 있는 성질을 가진 세포라면, 본 발명에 기재된 방법에 사용할 수 있다.

상기 '영양세포(feeder)' 또는 '피더세포'는 다른 유형의 세포와 공배양되어 제2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는, 한 유형의 세포를 기술하기 위해 사용되는 용어이다.

상기 "생체이물(xenobiotics)"은 생체화합이물이라고도 불리며, 생체에서 생산되지 않는 인공화학물질, 약물, 식품첨가물, 환경오염물질 등 생체에 대한 유해물질의 총칭한다. 특히, 지용성 물질은 세포막을 통과하여 독성을 나타낸다. 간에서는 시토크롬 P450 등의 작용으로 극성이 증가하여, 수용성이 되고, 요(尿)나 담즙에서 대부분은 무독화되어 배설된다. 이 과정에서는 제1상(相)과 제2상이 있어 전자에서는 시토크롬 P450이나 산화환원효소에의 에폭시드히드라다제 등에 의한 산화(수산화), 환원, 가수분해, 제2상에서는 글루타티온, 글루크론산, 황산 등과의 포합반응(抱合反應)이 일어난다. 특정한 생체이물에 대해, 시토크롬 P450 유전자 발현이 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 실시예에서는 생체이물로서 간독성 약물을 사용하였으며, 간독성 약물은 페노바르비톤(phenobarbital, PB), 아세트아미노펜(acetaminophen, AP) 및 림판피신(rifampicin, RIF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 줄기세포로부터 분화된 간세포는

(a) 줄기세포에 AA(activin A)를 처리하여 상기 줄기세포로부터 분화된 내배엽세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 수득한 내배엽세포에 RA(retinoic acid)를 처리하여 상기 내배엽세포로부터 분화된 간모세포를 수득하고, 상기 수득한 간모세포에 NA(nicotinamide)를 처리하여 간모세포를 증식시키는 단계; 및,

(c) 상기 증식된 간모세포에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하여 상기 간모세포로부터 분화된 간세포를 수득하는 단계

를 포함하는 분화방법에 의해 얻을 수 있다.

상기 (a) 단계에서 수득한 내배엽세포를 (b) 단계에 적용하기 전에, AA(activin A), 소듐부티레이트 및 FBS(fetal bovine serum)를 가하여 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계를 수행하기 전에 (a) 단계에서 수득한 내배엽세포에 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 FGF4(fibroblast growth factor 4)를 가하여 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계의 간모세포를 증식시킬 때, bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 아스코르브산을 추가로 처리할 수 있다.

상기 (c) 단계를 수행하기 전에 (b) 단계에서 수득한 간모세포에 트립신을 처리하여 간모세포를 단세포화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (c) 단계는 3D 부유 배양을 통해 수행되는 것이 보다 바람직하다.

상기 (c) 단계를 통해 수득한 간세포에 OSM(oncostatin M) 및 DEX(dexamethasone)를 처리하여 간세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 간세포로의 분화 과정을 거친 후, 생체이물을 간세포에 반복 처리함으로써 Phase I 대사 효소(시토크롬 P450) 및 Phase II 대사 효소(glutathione S-transferases, UDP-glucuronosyltransferases)의 유전자 발현 및 활성이 향상된 고기능성 간세포를 제조할 수 있다.

상기 생체이물의 반복 처리는 간세포에 생체이물을 1차 처리한 후, 회복 단계를 거치고, 생체이물을 2차 처리하는 것이 바람직하다. 이후, 생체이물을 1회 이상 추가로 처리할 수 있다.

이러한 단계를 거쳐 제조된 고기능성 간세포는 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성으로 CYP450 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

상기 CYP450 효소는 CYP1A2, CYP2A1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A6, CYP3A7 등을 포함할 수 있다.

상기 CYP450 효소 중 하나의 군에 속하는 관련 약물을 반복 처리하게 되면 약물이 속하는 CYP450 효소의 발현 및 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 일 구현예로서, CYP3A4에 속하는 약물 중 하나인 AP의 경우 약물 대사 효소 활성이 증가되었음을 확인하였다(도 5).

본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 간세포를 포함하는 치료용 조성물, 바람직하게는 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물, 더욱 바람직하게는 유전적 간 기능 손상의 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 치료용 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.

또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적으로 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제조된 줄기세포 유래 고기능성 간세포는, 약물 후보물질의 대사나 독성의 시험에 사용할 수 있다.

예를 들면, 대사의 시험에 이용하는 경우, 목적 약물 후보물질을 다능성 줄기세포 유래 고기능 간세포에 처리하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 16시간 정도 배양한 후, 범용의 Phase I(시토크롬 P450) 및/또는 Phase II(glutathione S-transferases, UDP-glucuronosyltransferases) 효소 활성 검출 키트를 이용한 시험을 행함으로써 실시된다. 예를 들면, 프로메가사의 p450-GloTM CYP 어세이 키트의 키트를 이용하는 경우, 50㎕의 배양 상청을 이용하면 어세이가 가능하기 때문에, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 후에 시간 경과를 쫓아, Phase I (시토크롬 P450) 및/또는 Phase II (glutathione S-transferases, UDP-glucuronosyltransferases) 효소 활성을 평가하는 것이 가능하다.

독성의 시험에 이용하는 경우, 목적 약물 후보물질을 다능성 줄기세포 유래 고기능 간세포에 첨가하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 범용의 세포사멸 측정 기술에 의해 세포 독성을 평가할 수 있다. 범용의 세포사멸 측정 기술로는, 전기영동에 의한 염색체 DNA 분단화의 검출, 유세포 분석기를 이용한 염색체 DNA 감소 세포의 검출, 세포주기, 아넥신(Annexin) V를 이용한 아포토시스 세포의 검출, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 등의 사세포 염색제를 이용한 사세포의 검출 등을 들 수 있다.

또한, 간세포에 대한 독성과, 담관 상피 세포에 대한 독성을 구별하는 것은, 목적 약물 후보물질을 다능성 줄기세포 유래 고기능 간세포에 처리하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 배양 상청을 회수하고, 간세포에 특징적인 효소군(글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(glutamic oxaloacetic transaminase; GOT), 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제(glutamic pyruvic transaminase; GPT) 등), 및 담관 상피 세포에 특징적인 효소군(γ-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-glutamyl transpeptidase; γ-GTP), 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase; LAP), 1형 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase type 1: ALP1) 등)을 범용의 방법으로 측정함으로써 실시된다.

다능성 줄기세포 유래 간세포를 이용한 약물 후보물질의 독성 시험을 행하는 경우에 대해서 보다 자세히 방법을 예시하면, 다음과 같은 방법으로 바람직하게 행할 수 있다.

우선, 다능성 줄기세포 유래 간세포의 배양 상청에, 약물 후보물질을 다양한 농도로 첨가한다(예: 아세토아미노펜 5 내지 10mM 등). 계속해서, 예를 들면, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 세포 생존성, 약물대사 효소의 활성 변이, 간세포의 생리학적 기능 변화의 상황을 측정함으로써 약물의 독성이 정량적으로 평가된다.

여기서 세포 생존성의 정량법으로는, 테트라졸륨염을 기질에 이용한 범용의 미토콘드리아 호흡능 측정법(MTT 어세이, WST 어세이 등) 등을 들 수 있다.

세포사의 정량법으로는, 1) 아포토시스 검출 기술(아넥신 V를 프로브로 하는 유세포 분석기에 의한 아포토시스 세포의 검출법, PI에 의한 세포 DNA 함유량의 측정(=sub G1 분획의 측정), 아가로스 전기 영동에 의한 염색체 유래 저분자 DNA의 정량, 튜넬(TUNEL) 어세이 등), 2) 범용의 사세포 검출 기술(유세포 분석기에 의한 PI 양성 세포의 측정, 코멧 어세이에 의한 염색체 DNA 분해량의 측정), 3) 범용법에 의한 배양 상청 중의 일탈 효소(글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제; GOT, 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제; GPT, γ-글루타밀 트랜스펩티다제; γ-GTP, 류신 아미노펩티다제; LAP, 알칼리 포스파타제(ALP) 등)의 측정을 들 수 있다.

이들 중, 배양 상청 중의 일탈 효소 측정은, 간세포 독성과 담관 세포 독성을 나눠 측정할 수 있는 점에서 특히 우수하다. 즉, 간세포에 특징적인 효소군(GOT, GPT)과, 담관 상피 세포에 특징적인 효소군(γ-GTP, LAP, 1형 ALP) 중 어느 쪽이 상승하고 있는지를 조사함으로써, 간세포 독성과 담관 세포 독성으로 구별해서 평가할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미분화 인간 배아줄기 세포주 및 초대배양 간세포 배양 방법

미분화 인간의 배아줄기세포(hESC) 세포주를, 20% knockout serum replacement(Invitrogen Life Technologies, USA), 4 ng/㎖ bFGF, 1% 비필수아미노산 및 100 mM 베타메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여, 유사분열로 불활성화된(10 ㎍/㎖ mitomycin-C) 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 상에서 배양하였다. 상기 세포를 표준조건(37℃, 5% CO₂ 및 포화습도)에서 배양하고, 매일 배지를 교체하였다. hESC 및 hiPSC(human induced pluripotent stem cells) 콜로니가 증식될 때, 상기 hESC 및 hiPSC 세포주의 모든 세포에 제4형 콜라게나제를 처리한 다음, 이들을 잘게 부수어 5 내지 6일 마다 새로운 피더세포에 접종하였다. BGO1 hESCs를 상기 프로토콜을 확립하기 위하여 사용하고, 다른 hESCs 및 hiPSCs를 간세포 분화 프로토콜을 검증하기 위하여 사용하였다.

고기능성 간세포의 증가된 약물대사효소의 발현과 활성을 위해서 대조군으로 사용된 hPH(Human primary hepatocytes)는 BD Biosciences Discovery Labware에서 백인, 흑인, 황인종의 초대 분양받았다. 제1형 콜라겐이 코팅된 24웰 플레이트에 배양된 사람의 간세포는 간세포 배양 배지를 처리하기 전에 적어도 24시간 동안 배양하여 유지하였다.

두 개의 사람의 간암 세포주(HepG2 및 Huh7)는 한국세포주은행에서 입수하였다. 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 접종하고, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포밀도가 70~80%의 포화도에 도달할 때, 계대 배양을 수행하였다. 배지는 3일마다 교체하였다.

<실시예 2> 미분화 인간 배아줄기세포에서 간세포로의 분화 방법

첨부도면 도 1에 미분화 인간 배아줄기세포에서 간세포로의 분화 방법의 모식도를 나타내었다.

간세포 분화를 시작하기 위하여, hESCs 및 hiPSCs를 TrypLE select(Invitrogen)를 사용하여 3분 동안 단일세포로 분산시킨 다음, 원심분리기로 1000rpm에서 5분간 세포만 분리하여 수확하였다. 마트리겔이 코팅된 배양용기에 단백질 인산화효소 억제제인 Y-27632(ROCK inhibitor)가 포함된 mTeSR1 배지를 이용하여 접종 후 하루 동안 배양하였다. Y-27632(ROCK inhibitor)가 포함되지 않은 mTeSR1 배지로 2일간 추가 배양한 다음, 간세포 분화를 수행하였다. 인간배아줄기세포의 확인은 qPCR을 통하여 미분화 마커인 OCT4의 발현을 확인하였다(도 2).

1 단계 ) 내배엽세포로의 분화/2D 부착 배양

내배엽세포는 소화관, 간 및 폐를 포함하는 내부 장기의 상피세포를 형성할 수 있다. 다능성 줄기세포를 내배엽세포로 분화시키는 단계는 생체 외에서 간세포의 분화에 필요하다. 본 발명에서는, hESCs 및 hiPSCs를 3일 동안 내배엽세포로 1차 분화시켰다. 최초 1.5일 동안 hESCs 및 hiPSCs의 분화는 2 μM CHIR99021 (GSK-3 inhibitor)과 100 ng/㎖ AA(activin A)를 포함하는 RPMI 배지에서 시작되었다. 이후 1.5일 동안, 상기 세포를 동일한 배양배지에서 100 ng/㎖ AA, 0.5~1 mM 소듐부티레이트 및 0.2% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 추가로 분화되었다. 내배엽세포의 유도는 qPCR을 통하여 내배엽세포의 마커인 SOX17의 발현 수준을 측정하여 확인하였다(도 2).

2 단계 ) 간모세포로의 분화/2D 부착배양

1 단계에서 수득한 내배엽세포를 8일 동안 추가 배양하여 간모세포로 분화시켰다. 우선, 상기 세포를 B27 보조제(Gibco)가 포함된 RPMI 배지에 접종하고, 20 ng/㎖ BMP2(bone morphogenetic protein 2)와 30 ng/㎖ FGF4(fibroblast growth factor 4)를 처리하여 2일 동안 배양하였다. 간모세포로의 분화는 상기 세포를 B27 보조제가 포함된 DMEM 배지에 접종하고, 2 μM RA(retinoic acid)를 2일 동안 처리하여 유도하였다. 간모세포를 B27 보조제가 포함된 DMEM 배지에 접종하고, 10 mM NA(nicotinamide), 1 ng/㎖ bFGF 및 100 μM 아스코르브산을 4일 동안 처리하고 배양하여 간모세포를 증식시켰다. 간모세포의 유도는 HNF4α 및 AFP의 발현을 RT-PCR 방법으로 측정하여 분석하였다(도 2). RT-PCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5 ㎕ SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8 ㎕ 10 mM의 프라이머, 10.4 ㎕ 증류수 및 0.5 ㎕ 주형 cDNA를 포함하는 25 ㎕로 구성하여 Phase I 약물대사효소인 CYP3A4 프라이머 조건에서 증폭하여 확인하였다. 간모세포의 증식은 EdU incorporation assay kit (invitrogen)를 사용하여 간세포 분화 중의 증식력을 평가하기 위하여, 10 μM EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)를 배지에 4시간 동안 첨가하여 배양하였다. DNA 복제 중에 세포내 DNA에 EdU가 투입한 다음, 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고, 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS에 고정하였다. EdU-염색된 세포를 상술한 방법으로 면역 염색하였다. EdU의 형광사진을 형광현미경(Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하고 평가하였다 (도 3).

3 단계 ) 간세포로의 분화/2D 부착 배양

간세포의 최종 성숙을 유도하기 위하여, 2 단계에서 수득한 간모세포에 트립신(TrypLE select)를 처리하여 단세포화하고, 2D 부착 배양을 수행하기 위하여 제1형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 ITS 배지에 접종하고, 20 ng/㎖ HGF를 처리한 다음, 4일 동안 배양하여 분화시켰다. 상기 세포를 10 ng/㎖ OSM(oncostatin M) 및 10 ?M DEX(dexamethasone)을 포함하는 ITS 배지에 접종하고 4일 동안 배양하여 추가로 성숙시켰다. 최종 분화된 세포의 마커로 AAT와 ALB를 사용하여 발현을 확인하였다 (도 2).

면역형광 염색은 분화된 간세포의 경우 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS를 처리하여 고정시켰다. 고정된 간세포에 0.3% Triton X-100/PBS 및 10% 혈청을 포함하는 0.1% BSA/PBS로 처리(ALB 항체의 경우 0.1% BSA가 포함되지 않은 PBS를 사용함)하여 블로킹 및 천공시킨 다음, 1차 항체를 처리하고, 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 동형 마우스 IgG 또는 정상 당나귀 혈청을 음성 대조군으로 사용하였는데, 상기 음성대조군에서는 형광이 검출되지 않았다. ALB에 대한 1차 항체를 희석하였다. PBS로 3회 세척하고, TRITC(rhodamine)가 결합되어 있는 1:400으로 희석된 2차 항체를 가하고, 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 다음으로, 1 ㎍/㎖ DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 세포의 핵을 염색하였다. 각 단계 사이에 세포들은 PBS로 세척하였다. EdU의 형광사진을 형광현미경(Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하였다.

도 2는 최종 분화한 간세포의 세포학적인 간세포 마커들을 잘 발현하고 있는가를 보여 주고 있는 결과로서 본 발명의 약물 반복 투여 전에 간세포들이 미분화 마커인 OCT4는 감소하고, 내배엽성 마커인 SOX17과 HNF4a는 내배엽 분화 단계인 stage I과 II에서만 선택적으로 잘 증가되어 있으며 미성숙 간세포의 마커인 AFP와 최종 간세포의 마커인 ALB는 분화단계의 후반부에서 증가됨을 확인하였다.

<실시예 3> 분화 유도 후, 약물 반복 처리를 통한 고기능성 간세포 제조를 위한 간세포 성질 변화 측정

약물을 반복 처리하여 최종 분화된 간세포의 최종 성숙을 유도하기 위해서 먼저 약물에 반복 투여가 간세포 특이적 성질에는 변화를 일으키지 않는 상태에서 약물대사 효소들의 발현과 활성만을 증가시킨다는 가설을 증명하기 위하여 실험을 진행하였다.

첫 번째 그룹으론 최종 분화된 간세포를 TrypLE select를 가하여 단일세포로 분리한 다음, 4% PFA를 처리하여 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 상기 세포에 BD에서 판매하는 FACS 세척 버퍼를 이용하여 세척 후, 1차 항체를 가하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 다시 2차 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 세척한 세포를 BD-FACS Calibur Flow Cytometer(FACS Calibur, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 실험 결과는 Flowjo software를 사용하여 분석하였다(도 4의 A).

두 번째 그룹으로는 간세포 마지막 분화단계에 사용되는 배지에 AP 200μM을 첨가하고 이를 48시간 동안 최종 분화된 간세포에 1차 처리하여 하기 FACS 방법을 이용한 알부민 발현 세포를 정량화하였다. TrypLE select를 가하여 단일세포로 분리한 다음, 4% PFA를 처리하여 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 상기 세포에 BD에서 판매하는 FACS 세척 버퍼를 이용하여 세척 후, 1차 항체를 가하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 다시 2차 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 세척한 세포를 BD-FACS Calibur Flow Cytometer(FACS Calibur, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 마커별로 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 실험 결과는 Flowjo software를 사용하여 분석하였다 (도 4의 B).

세 번째 그룹으로는 약물이 첨가되지 않은 간세포 마지막 분화 단계에 사용된 배지에서 두 번째 그룹과 같이 AP 200μM에 1차로 노출된 간세포를 다시 48시간 동안 회복시킨 후, AP 200μM를 2차로 반복 처리하고 하기 FACS를 이용한 알부민 정량화를 실행하였다. 결과적으로 상기 세 그룹의 세포에서 간세포의 대표적 생리학적 특이성인 알부민 합성이 약물의 반복처리에 의해서 변화되지 않음을 확인하였다 (도 4의 A, B, C). 이 결과로 간세포 대표적 성질은 유지시키면서 약물의 반복 처리로 약물대사 효소들의 발현과 활성만 증가시킬 수 있다는 가설을 확인했고, 본격적으로 3가지 약물인 PB 25μM, AP 200μM, 및 RIF 10 μM 각각을 최종 분화된 간세포에 반복 처리하기로 결정하였다. FACS 측정은 최종 분화된 간세포를 TrypLE select를 가하여 단일세포로 분리한 다음, 4% PFA를 처리하여 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 상기 세포에 BD에서 판매하는 FACS 세척 버퍼를 이용하여 세척 후, 1차 항체를 가하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 다시 2차 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 세척한 세포를 BD-FACS Calibur Flow Cytometer(FACS Calibur, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 마커별로 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 실험 결과는 Flowjo software를 사용하여 분석하였다.

약물의 지속적인 투여에 대한 CYP3A4 효소의 발현을 확인하는 실험에서는 PB 25μM 및 AP 200μM 각각을 분화된 간세포에 4일간 실시예 2의 최종 간세포 분화 배지에 1회만 첨가하고 (회복기간을 주지 않으면서 부가적인 PB와 AP 약물 첨가도 없이) 연속적으로 배양하여 약물의 반복 처리 실험 전에 증가된 CYP3A4의 발현이 유지되는지를 먼저 확인하였다. 4일째 세포를 트립신(TrypLE select)를 6분간 처리하여 수거한 후, TRIzol 시약을 사용하여 생체 이물질에 반복적으로 노출된 세포로부터 수득하고, 역전사 시스템(Promega Corp., USA)을 사용한 역전사 과정을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94℃ 5분, 35사이클(94℃ 30초, 50-57℃ 30초 및 72℃ 30초) 및 72℃ 10 분으로 설정하였다.

RT-PCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5 ㎕ SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8 ㎕ 10 mM의 프라이머, 10.4 ㎕ 증류수 및 0.5 ㎕ 주형 cDNA를 포함하는 25 ㎕로 구성하여 Phase I 약물대사효소인 CYP3A4 프라이머 조건에서 증폭하여 확인하였다(도 4의 D). 부가적으로 미성숙 간세포의 마커인 AFP의 발현도 (1) 각 간세포 분화 단계별, (2) 1차 약물 처리 후, (3) 2차로 약물을 반복 처리한 후, 그리고 (4) 3종의 백인(C로 표시), 흑인(AA로 표시), 동양인(A로 표시) 인간 간세포 초대 세포로 동일한 RT-PCR 방법으로 그 발현 패턴을 정량화하였다 (도 4의 E, CON: control(약물에 노출되지 않은 세포), 1ND: 1차 AP 200μM 처리한 세포, 2ND: 1차 AP 200μM로 처리하고 2일 휴식기를 주고 2차 반복 처리한 세포). 각 유전자의 상대적인 발현수준은 GAPDH을 사용하여 정규화하여 측정하였다.

사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다(표 1).

유전자	정방향(5'→3')	역방향(5'→3')	산물크기 (bp)
POU5F1	TGGGCTCGAGAAGGATGTG	GCATAGTCGCTGCTTGATCG	78
SOX17	CGCACGGAATTTGAACAGTA	GGATCAGGGACCTGTCACAC	181
ALB	GCCTGCTGACTTGCCTTCATTAG	TCAGCAGCAGCACGACAGAGTA	149
HNF4α	AAGAGGAACCAGTGCCGCTA	CGCATTGATGGAGGGCAG	141
AAT	TTTAAAGGCAAATGGGAGAG	CCTAAACGCTTCATCATAGG	106
CYP1A2	CCAGTCTGTTCCCTTCTCGG	GCTGGCTCATCCTTGACAGT	200
CYP2B6	AGCTTCATGACCGAGCCAAA	CAGGATTGAAGGCGTCTGGT	216
CYP2C9	ATTTGTGTGGGAGAAGCCCT	AAAGAGAGCTGCAGGGACTG	224
CYP2D6	GTGTCCAACAGGAGATCGACG	CACCTCATGAATCACGGCAGT	100
CYP2D6 -v1	GTTCCCAAGGGGTGTTCCTG	GGCTTTGTCCAAGAGACCGT	200
CYP2D6 -v2	CCCAAGGACGCCCCTTTC	GCTGGGATATGCAGGAGGAC	205
CYP2C19	GAAGAGGAGCATTGAGGACCG	GCCCAGGATGAAAGTGGGAT	103
CYP3A4	AGCCTGGTGCTCCTCTATCT	CCCTTATGGTAGGACAAAAT	116
CYP3A7	GATCTCATCCCAAACTTGGCCG	CATAGGCTGTTGACAGTCATAAATA	240
CAR	GAC CTG CCT GTC TTC CGT TC	GAT TTC CAC AGC TGC TCC CT	72
PXR	CCA CTG GGA GTG CA GGG GC	TGG CAG CCG GAA ATT CTT GA	101
PPARα	TCG GCG AGG ATA GTT CTG GA	TGG TGA AAG CGT GTC CGT GA	108
GSTA2	CCTTCTTTCAGTGGGAGGGA	GCCATGGTAGCAGTCTCCTG	140
GSTA4	CCGAGTGGACTCCAGAAAGC	GGCACTTGTTGGAACAGCAG	200
GSTM1	AGCTGGGCATGATCTGCTAC	CAAGCCCTTGTTTCCTGCAA	134
GSTM4	TGTACACAAGGGTGGCTGTC	GAAAGGAACGAGGAGGCAGG	144
PROX1	ACAGGGCTCTGAACATGCAC	GGCATTGAAAAACTCCCGTA	100
ATF5	CTATGAGGTCCTTGGGGGAG	CTCGCTCAGTCATCCAGTCA	76
C/ EBPα	ACAAGAACAGCAACGAGTACC	CATTGTCACTGGTCAGCTCCA	110
GAPDH	TTCAGTGGTGGACCTGACCT	CACCACCCTGTTGCTGTAGC	256

도 4의 A-C는 본 발명을 위해서 약물에 반복 노출된 분화된 간세포가 그 세포학적 특성을 잃지 않는다는 것을 증명하기 위해서 실시된 유세포 분석 결과로서, 먼저 인간배아줄기세포를 22일간 간세포로 유도 분화하고, (1) 200 μM AP을 2일간 처리한 세포와 (2) 2일 동안 약물을 처리한 후, 약물이 없는 배양액으로 2일간의 회복기를 가진 간세포에서 간세포 특이적 마커인 ALB(알부민)의 발현을 유세포분석기로 분석한 결과, 알부민의 발현이 거의 변화가 없음을 확인하였다.

D는 간세포로 유도 분화된 세포에 지속적으로 25 μM PB 및 200 μM AP 각각을 처리하였더니 CYP3A4의 발현이 지속적으로 증가함을 확인하였다. 이와는 대조적으로 E는 미성숙 간세포의 마커인 AFP(alpha-fetoprotein)는 약물의 반복 노출에 의해 그 발현이 감소함을 real-time PCR로 확인하였다. 결과적으로 간세포 특이적 세포의 성질에는 큰 영향을 주지 않고, 약물의 반복 처리를 통한 약물대사 효소의 발현을 높임으로써 분화 간세포의 약물대사능력 최적화를 가져올 수 있음을 검증한다. 즉, 신약 스크리닝 및 독성 테스트가 가능한 분화된 간세포를 생산할 수 있음을 증명한다.

< 실시예 4> 최종 분화된 간세포의 약물 반복 처리에 의한 약물대사효소들의 유전자 발현 증가 유무 및 세포 생리학적 변이 측정

최종 분화된 간세포의 약물대사능력의 증대를 위해서, 실시예 2의 최종 간세포 배양에 사용되는 배지와 동일한 조성에 PB 25μM, AP 200μM 및 RIF 10μM 각각을 첨가하였으며, 이를 최종 분화된 간세포에 48시간 동안 1차 처리하였다. 이후, 약물이 첨가되지 않은 배지에서 48시간 동안 세포를 다시 회복시킨 후, 예시된 1차 처리 약물인 PB 25μM, AP 200μM 및 RIF 10μM 각각을 2차로 반복 처리하고 약물대사효소들인 CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP 3A4, CYP3A7의 발현을 성숙한 간세포 특이적으로 발현이 되는 마커들인 ALB, PROX1, C/EBPa, ATF5와 함께 상기 실시예 3의 RT-PCR 방법으로 측정하였다

도 5는 간독성 물질의 반복 투여를 통한 인간 배아줄기세포 유래 간세포의 약물대사능력 향상을 나타낸 도면이다. 도 5는 인간 배아줄기세포를 22일간 간세포로 유도 분화한 후, 48시간 동안 25 μM phenobarbital(PB-페노바르비톤), 200 μM acetaminophen(AP-아세트아미노펜) 및 10 μM rifampicin(RIF-림판피신)을 각각 처리하여 1차 노출을 시킨 후, 2일 동안 배양액에서 간독성 약물을 제거하여 세포에 2일간 회복기간을 준 다음 다시 2일 동안 간독성 약물을 2차로 처리했다. 이들 간세포에서 1차 노출, 2차 약물 노출 후, 간세포 마커 및 간세포 특이적 약물대사 효소의 발현을 실시간 PCR로 확인한 결과, 2차 반복하여 약물에 노출된 간세포에서 간세포 특이적인 ALB, PROX1, C/EBPa, ATF5 마커 발현 및 CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP3A4 약물대사효소가 현저히 증가함을 확인하였다.

<실시예 5> 약물대사 효소인 시토크롬 P450(CYP) 효소 약물 대사활성의 세포 기반 분석

세포기반 CYP 효소활성 분석을 사용하여 CYP3A4의 세포 내 활성을 확인하였다. 대략적으로, (1)최종 분화된 2D 배양된 간세포, (2)3D 구체로 배양된 간세포, (3)3D 구체로 배양된 간세포에 AP를 2차 반복 처리한 세포, (4)대조군으로 2D와 3D 인간 초대배양 간세포를 24웰 배양용기에 준비하고, AP(10, 25, 50, 100 및 200 μM)을 48시간 동안 처리하여 동일하게 약물대사효소들의 활성을 측정하였다 (도 6). 인간 초대배양 간세포는 in vitro 즉 생체 외에서 48시간 이후에는 급격하게 약물대사능력이 저하되는 것으로 알려져 있기 때문에 본 실험에서는 동결 보존된 세포를 배양한 후 24시간 이내에 본 실험들을 실행하였다.

측정방법으로는 준비된 간세포 그룹들에 루시페린 기질(CYP3A4용 루시페린-IPA, CYP2C19용 루시페린-H EGE, CYP1A2용 루시페린-ME 및 CYP2D6용 P450-Glo)을 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 실온에서 각각의 반응물 50 ㎕를 96웰 불투명 백색 루미노미터 플레이트에 분주하였다. 다음으로, 루시페린 검출시약 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 암소에서 40 내지 60분간 반응시켜서 형광발색 반응을 유도하였다. 그 결과로서 생성된 형광 수준을 광학측정기(Perkin Elmer, Victor3)로 측정하였다. 형광수준을 측정값은 각 웰당 단백질 농도로 나누어서 평균 형광값을 산출하여 CYP3A4 활성을 최종 확인하였다.

도 6은 약물의 반복 처리에 의해서 약물대사효소가 증가된 3D 구체 간세포의 CYP3A4의 활성이(보라색 라인) 거의 2D로 배양된 인간 초대간세포의 활성도와(녹색 라인) 유사함을 확인하였다.

Claims (11)

1. (a) 인간 만능 줄기세포에 AA(activin A)를 처리하여 상기 줄기세포로부터 분화된 내배엽세포를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 내배엽세포에 RA(retinoic acid)를 처리하여 상기 내배엽세포로부터 분화된 간모세포를 수득하고, 상기 수득한 간모세포에 NA(nicotinamide)를 처리하여 간모세포를 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 증식된 간모세포에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하여 상기 간모세포로부터 분화된 간세포를 수득하는 단계;를 포함하는 분화방법에 의해 분화된 간세포에 간독성 약물을 반복 처리하여 분화된 간세포의 최종 성숙을 유도하는 단계
   를 포함하는 간의 약물대사효소의 발현을 향상시키는 고기능성 간세포의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 간모세포를 증식시킬 때, bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 아스코르브산을 추가로 처리하는 것인 제조방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 (c) 단계를 통해 수득한 간세포에 OSM(oncostatin M) 및 DEX(dexamethasone)를 처리하여 간세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 간세포는 Phase I 대사 효소 및 Phase II 대사 효소의 유전자 발현 및 활성이 증가된 간세포인 제조방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 약물은 간세포에 1차 처리 후, 회복 단계를 거치고, 2차로 반복 처리하는 제조방법.
   
7. 제 1 항의 방법으로 제조된 고기능성 간세포.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   Phase I 대사 효소 및 Phase II 대사 효소의 유전학적 발현 및 활성 증가를 유도한 고기능성 간세포.
   
9. 제 1 항의 방법으로 제조된 고기능성 간세포를 포함하는 간 기능 손상 치료용 조성물.
   
10. 약물 후보물질의 대사를 시험하는 방법으로서,
    청구항 7의 고기능성 간세포를 이용하여 약물 후보물질의 대사를 정량하는 약물 대사의 시험 방법.
    
11. 약물 후보물질의 독성을 시험하는 방법으로서,
    청구항 7의 고기능성 간세포를 이용하여 약물 후보물질에 의해 발생되는 세포의 약물대사 효소 변이 및 세포사멸을 정량하는 약물 후보물질 독성의 시험 방법.

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