KR101694315B1 - 간성상세포를 이용한 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법 - Google Patents

간성상세포를 이용한 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)를 이용한 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법에 관한 것으로, 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현은 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 간성상세포와 공동배양하는 방법을 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

간성상세포를 이용한 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법{A method for improvement of drug metabolizing function of human stem cell-derived hepatocytes using hepatic stellate cells}
본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)와 공동배양하는 것을 포함하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법에 관한 것이다.
복잡하고 다양한 스트레스가 쌓이는 현대사회에서 만성적인 알코올 섭취에 의한 환자의 증가는 서구 선진국뿐 아니라 전 세계적으로 커다란 사회문제로 대두되고 있다. 알코올은 대부분 간에서 대사되지만 알코올을 처리하는 간의 능력에는 한계가 있으므로 이 한계를 넘어서게 되면 여러 가지 대사장애를 초래하게 된다. 즉 과량의 알코올을 만성적으로 섭취하게 되면 세포 내 NADH/NAD+의 비율이 증가하여 탄수화물, 단백질 및 지질대사의 장애를 초래하며, 특히 간 조직 지방대사의 장애로 인하여 지방산의 산화가 억제되고 합성이 증가되며, 아세트알데히드(acetaldehyde)의 독성에 의해 미세소관(microtubule)의 손상이 일어나 결국 지방간이 유발되고 심하면 알코올성 간염이나 간 경변증을 일으킬 수 있다.
간질환의 간 이식 치료에 있어서 가장 큰 문제점은 공여자의 부족이다. 이러한 간 이식의 문제점에 대한 대안으로 최근 간세포를 이용한 세포 대체 치료방법이 새로운 대안으로 떠오르고 있고, 이에 따라, 무한 증식할 수 있는 인간 배아 줄기세포는 간질환의 세포 치료에 사용될 간세포를 다량 공급할 수 있는 재료로 각광을 받고 있다. 하지만, 인간 배아 줄기세포로부터 유도 분화한 간세포를 간질환 세포 치료제로써 사용하기에는 현재까지 몇 가지 한계점을 가지고 있다. 첫째, 인간 배아 발생 과정의 정확한 이해 부족으로 인한 정확한 분화 유도 기술의 부재로 완벽한 정상 간 기능을 가진 간세포를 만들기 어렵다는 것이고, 둘째, 상기 이유에 기인하여 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 간질환 실험동물에 이식 시 낮은 생착률을 보이며, 이에 따라 손상된 간 기능을 효율적으로 회복시킬 수 없다는 것이다. 셋째, 분화 유도 후 잔여 미분화 줄기세포로 기인한 기형종 생성 등의 부작용이 있다. 따라서 인간 배아 줄기세포로부터 분화 유도한 간세포를 간질환의 세포 대체 치료 목적으로 사용하기에는 현재까지 많은 어려움이 따른다.
이에, 본 발명자들은 상기 어려움을 해결하기 위해 노력한 결과, 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 간성상세포와 공동배양하는 방법을 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법으로서 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)와 공동배양하는 것을 포함하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인간 줄기세포 유래 간세포에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체 외(ex vivo)에서 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)와 공동배양하는 것을 포함하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인간 줄기세포 유래 간세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은
1) 생체 외(ex vivo)에서 상기 간세포에 피검 약물 또는 알코올을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 간세포의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 통해 약물 또는 알코올 대사 정도를 평가하는 단계를 포함하는 간세포의 약물 또는 알코올 대사 평가 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 상기 간세포를 포함하는 약물 또는 알코올 대사 평가용 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명은 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)를 이용한 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법에 관한 것으로, 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현은 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 간성상세포와 공동배양하는 방법을 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 인간 배아 줄기세포로부터 분화시킨 간세포(human embryonic stem cell-derived hepatocytes, hES-Hep)와 인간 간세포(Human-Hep)의 형태를 확인한 도이다.
도 2는 성인 간세포(Adult-Hep)와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)의 유전자 발현을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 성인 간세포(Adult-Hep) 및 태아 간세포(Fetal-Hep)의 유전자 발현 비교, 및 태아 간세포(Fetal liver) 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep) 의 유전자 발현을 비교한 도이다.
도 4는 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양 방법을 나타낸 도이다.
도 5는 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 간세포의 손상 정도를 확인하여 나타낸 도이다.
도 6은 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 세포 사멸(apoptosis) 정도를 확인한 도이다.
도 7은 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 알코올 및 약물 대사 관련 효소, 및 항산화효소의 유전자 발현을 확인한 도이다.
도 8은 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 알코올 및 약물 대사 관련 효소, 및 항산화효소의 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 9는 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 CYP2E1 발현을 확인한 도이다.
도 10은 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)와 마우스 간성상세포(mHSCs)의 공동배양한 후 항산화효소 활성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 생체 외(ex vivo)에서 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)와 공동배양하는 것을 포함하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 간세포는
1) 인간 줄기세포를 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및
2) 상기 분화된 세포를 간세포 성장인자를 첨가한 배지에 배양하는 단계를 포함한 방법으로 분화되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 인간 줄기세포는 인간 배아 줄기세포 또는 체세포 유래 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS cell)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 간성상세포는 마우스 유래 간성상세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 공동배양은 간성상세포:인간 줄기세포 유래 간세포의 세포 간 비율이 1:2인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 배양된 간세포는 알코올 또는 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현이 증가하는 것이 바람직하고, 상기 알코올 대사 관련 효소는 ADH1a, ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1 중 적어도 하나이고, 약물 대사 관련 효소는 CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4 중 적어도 하나이며, 항산화효소는 카탈라아제(catalase) 및 Mn-SOD 중 적어도 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도하고, 이렇게 분화시킨 인간 배아 줄기세포 유도 간세포를 인간 간세포와 비교한 결과, 세포 모양이 매우 유사하지만(도 1 참조), 약물 또는 알코올에 대한 대사기능과 관련된 유전자 및 항산화기능과 관련된 유전자의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였으며(도 2 참조), 성인 간세포(Adult-Hep) 및 태아 간세포(Fetal-Hep)의 유전자 발현 비교, 태아 간세포(Fetal liver) 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)의 유전자 발현 비교한 결과, 성인 간세포와 태아 간세포의 유전자 발현 비교시에도 알코올과 관련된 여러 유전자들이 태아 간세포에서 감소되어 있는 것이 관찰되었으며, 태아 간세포보다 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 그 발현이 더 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후(도 4 참조), 간세포의 손상 정도를 확인한 결과, 마우스 간성상세포와 24시간 동안 공동배양한 것만으로도 AST, ALT 및 LDH의 수치가 감소하였고, 에탄올(알코올) 처리 시에도 AST, ALT 및 LDH의 수치가 감소하는 것을 확인하였고(도 5 참조), 세포 사멸 정도를 확인한 결과, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포는 알코올 처리시 세포 사멸이 많이 증가하였고, 이와 반대로 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포는 세포 사멸이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며(도 6 참조), 알코올 대사 관련 효소, 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현을 확인한 결과, 유전자 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였고(도 7 내지 도 8 참조), 알코올 대사 관련 효소인 CYP2E1의 발현을 면역형광법으로 확인한 결과, 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 CYP2E1의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며(도 9 참조), 항산화 효소인 카탈라아제 및 Mn-SOD의 활성을 확인한 결과, 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 카탈라아제 및 Mn-SOD 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 10 참조).
상기 결과들을 토대로 마우스 간성상세포와의 공동 배양 방법이 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 및 알코올 대사 관련 효소 발현 증가에 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현은 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 간성상세포와 공동배양하는 방법을 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인간 줄기세포 유래 간세포를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생체 외(ex vivo)에서 상기 간세포에 피검 약물 또는 알코올을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 간세포의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 통해 약물 또는 알코올 대사 정도를 평가하는 단계를 포함하는 간세포의 약물 또는 알코올 대사 평가 방법을 제공한다.
상기 인간 줄기세포는 인간 배아 줄기세포 또는 체세포 유래 유도만능 줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 간세포는 알코올 또는 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현이 증가하는 것이 바람직하고, 상기 알코올 대사 관련 효소는 ADH1a, ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1 중 적어도 하나이고, 약물 대사 관련 효소는 CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4 중 적어도 하나이며, 항산화효소는 카탈라아제(catalase) 및 Mn-SOD 중 적어도 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 피검 약물 또는 알코올은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현은 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 간성상세포와 공동배양한 인간 줄기세포 유래 간세포를 약물 또는 알코올 대사 평가 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 간세포를 포함하는 약물 또는 알코올 대사 평가용 시스템을 제공한다.
상기 간세포는 알코올 또는 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현이 증가하는 것이 바람직하고, 상기 알코올 대사 관련 효소는 ADH1a, ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1 중 적어도 하나이고, 약물 대사 관련 효소는 CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4 중 적어도 하나이며, 항산화효소는 카탈라아제(catalase) 및 Mn-SOD 중 적어도 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
약물 또는 알코올은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 인간 줄기세포 유래 간세포는 인간 간세포와 모양은 유사하지만, 약물 또는 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현은 감소되어 있음을 확인하였고, 이에 인간 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양한 결과, 알코올에 의한 독성이 줄어들어 간세포의 손상이나 세포 사멸 정도가 감소하였고, 약물 및 알코올 대사 관련 효소, 및 항산화 효소의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 상기 간성상세포와 공동배양한 인간 줄기세포 유래 간세포를 약물 또는 알코올 대사 평가용 시스템으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도
인간 배아 줄기세포주 CHA15(차 연구소(CHA Research Institute))는 표준 프로토콜에 따라 유지하였다. 인간 배아 줄기세포는 지지세포(feeder cell)와 함께 마트리겔(matrigel)(BD biosciences)이 코팅된 플레이트에 5 내지 6일 동안 배양하였다. 배양 배지는 RPMI 1640 배지(Welgene, 대한민국)를 사용하여 매 24시간마다 교체하였다. 인간 배아 줄기세포의 콜로니는 6 내지 9 조각으로 나누고, 세포 덩어리는 마트리겔이 코팅된 지지세포 없는 플레이트에 놓고, 37℃ 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 이는 안정화 단계이다. 인간 배아 줄기세포 콜로니의 성장이 확인된 후, 다른 세포 파편 및 배양액은 피펫팅(pipetting)을 이용하여 제거하였다. 50X B27(Gibco), 50 ng/uL 액티빈(activin) A를 포함하는 RPMI 1640 배지로 0 내지 5일 동안 확실한 내배엽으로의 분화를 유도하였고, 배양 배지는 매 24시간 마다 RPMI 1640 배지를 사용하여 교체하였다. 상기 분화된 세포를 50X B27, 100 ng/uL 섬유아세포 성장인자-4(fibroblast growth factor-4), 50ng/uL 골형성 단백질-2(bone morphogenetic protein-2)을 포함하는 RPMI 배지로 5 내지 10일 동안 간세포로 유도하였다. 그 후, 50 ng/uL 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF; Peprotech 사)를 고농도 배양액 bulletkit에 첨가하여 10 내지 15일 동안 배양하고, 50 ng/uL 온코스태틴 M(oncostatin M) 및 1mM 덱사메타손(dexametasone)을 고농도 배양액에 첨가하여 15 내지 19일간 배양하여 간세포의 성숙(Maturation)을 유도하였다. 모든 분화단계에서 배양 배지는 24시간 마다 교체하였다. 1차 인간 간세포는 실험에 사용하기 전, 낮은 포도당(glucose)을 포함하는 DMEM으로 37℃, 5% CO2로 유지하였다. 기능 비교를 위해, Life Technologies Gibco(미국)에서 제공하는 냉동 보관된 46세 남성으로부터 얻은 인간 간세포(Lot no. Hu4246)를 사용하였다.
< 실시예 2> 실험 동물의 관리
C57BL/6 야생형(wild-type, WT) 수컷 마우스는 Jackson Laboratory(미국)으로부터 구입하였다. 동물은 한국 과학 기술원(KAIST)의 무균 동물 시설에서 유지되었다. 동물은 미국 국립 보건원(NIH)의 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 설명서에 명시된 기준에 따라 인도적인 케어를 받았고, 모든 실험 절차는 KAIST의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
< 실시예 3> 마우스로부터 간성상세포(hepatic stellate cells, mHSCs )의 분리
상기 <실시예 2>의 마우스로부터 간성상세포를 분리하였다.
구체적으로, 체중 30 내지 34 g의 마우스에 펜토바비탈 나트륨(sodium pentobarbital)을 30 mg/kg 복강 내 주사하여 마취시키고, 무균 조건에서 간문맥(portal vein)에 삽관하였다. 간은 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ester)-N,N,N', N'-tetraacetic acid) 용액(5.4 mmol/L KCl, 0.44 mmol/L KH2PO4, 140 mmol/L NaCl, 0.34 mmol/L Na2HPO4, 0.5 mmol/L EGTA 및 25 mmol/L Tricine, pH 7.2) 및 HBSS(Hanks’ Balanced Salt solution, Sigma-Aldrich, 미국)으로 관류시키고, 0.075% 타입 Ⅰ 콜라게나아제(type Ⅰ collagenase; Warthington)을 포함하는 HBSS으로 분해시켰다. 마우스 간세포의 분리는 랫트-꼬리 콜라겐(rat-tail collagen) 코팅된 플레이트에 10% FBS를 포함하는 DMEM(Gibco-BRL)으로 60 내지 70% 차도록(confluence) 배양하였다. 간성상세포(mHSC)의 분리를 위해 마우스 간은 제자리(in situ)에서 먼저 EGTA 용액을 넣고, 이어서 관류 완충액 및 분해 완충액(0.02% DNase Ⅰ이 포함된 HBSS에 0.009% 콜라게나아제 타입 Ⅰ)으로 20 내지 30분 동안 37℃로 관류시켰다. 세포 현탁액은 70 um 세포 여과기(strainer)를 통해 여과하고, 실온에서 5분 동안 420 rpm으로 원심분리하여 간세포를 제거하였다. 상층액은 세척하고, HBSS로 재현탁한 후, 11.5% OptiPrep에 로딩하고, 4℃에서 15분 동안 1400 g로 원심분리하였다. 간성상세포는 인터페이스(interface)로부터 수득하였다. 분리된 간성상세포는 레티놀을 함유하고 있는 지방구가 선명하게 다량 관찰되어야한다.
< 실험예 1> 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 간세포( hES -Hep)와 인간 간세포(Human-Hep)의 비교
<1-1> 형태학적인 비교
상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제조한 인간 배아 줄기세포로부터 분화시킨 간세포(hES-Hep)와 인간 간세포(Human-Hep)의 형태를 광학현미경을 이용하여 비교하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, hES-Hep와 Human-Hep의 세포 모양이 매우 유사한 것을 확인하였다(도 1).
<1-2> 유전자 발현 비교
상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제조한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포와 성인 간세포의 유전자 발현을 비교하였다.
구체적으로, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포 및 성인 간세포에서 RNA를 추출한 후, 각 풀(pool)은 각 칩(chip)을 혼성화하고, 일루미나(Illumina) 인간 HT-12(v3) 비드칩(beadchip)은 KRIBB(한국 생명 공학 연구원)에서 처리하였다. 마이크로어레이 분석의 통계 분석은 http://www.r-project.org/에서 구할 수 있는 무료 소프트웨어 환경인 R을 이용하여 수행하였다. 히트맵(heat map)은 로그 유전자 발현 레벨(0은 표준 편차를 의미한다)을 색깔-코딩 genewise로 표준화시켜 생성하였다. 도면은 Matrix2png 프로그램(http://www.chibi.ubc.ca/matrix2png/)을 사용하여 만들었다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 성인 간세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 유전자 발현에서 약 929개의 유전자 발현이 상대적으로 감소되었고, 특히 약물 또는 알코올에 대한 대사기능과 관련된 유전자인 ADH1A, ADH1B, ADH1C, CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 및 항산화기능과 관련된 유전자인 SOD2, 카탈라아제(catalase)의 발현이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 2).
<1-3> 약물 또는 알코올 대사 효소의 발현 비교
성인 간세포(Adult-Hep) 및 태아 간세포(Fetal-Hep)의 유전자 발현 비교, 태아 간세포(Fetal liver) 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포(hES-Hep)의 유전자 발현 비교하여 약물 또는 알코올 대사 효소의 발현을 비교하였다.
구체적으로, 성인 간세포, 태아 간세포, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, cDNA는 amfi-rivert II cDNA synthesis Master Mix(Gendepot)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 합성하였다. 전사물은 SYBR 그린 실시간 PCR Master Mix(Toyobo, 일본)를 사용하여 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 관심있는 유전자를 증폭하였고, 실시간 PCR 분석은 Bio-rad CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-rad)을 사용하여 수행하였다. 유전자 발현 결과 레벨은 △△Ct 방법 및 β-액틴(actin)을 유전자 발현의 분모로 사용하여 계산하였다. 값은 대조 유전자와 비교하여 배의 변화(fold change)로 표현하였다.
이름 크기 정방향(Forward) 역방향(Reverse)
ADH1a 102 AGTCATCCCACTCGCTATTCC
(서열번호: 1)		 GTCCCCTGAGGATTGCTTACA
(서열번호: 2)
ADH1b 224 CCCGGAGAGCAACTACTGC
(서열번호: 3)		 AACCAGTCGAGAATCCACAGC
(서열번호: 4)
ADH1c 223 CTCGCCCCTGGAGAAAGTC
(서열번호: 5)		 GGCCCCCAACTCTTTAGCC
(서열번호: 6)
ALDH2 196 TCGGCTACATCAACACGG
(서열번호: 7)		 TCTCCCAACAACCTCCTCT
(서열번호: 8)
CYP2E1 67 GCAAGAGATGCCCTACATGGA
(서열번호: 9)		 GGGCACGAGGGTGATGAA
(서열번호: 10)
CYP2C9 137 CCTCTGGGGCATTATCCATC
(서열번호: 11)		 ATATTTGCACAGTGAAACATAGGA
(서열번호: 12)
CYP2D6 289 CTAAGGGAACGACACTCATCAC
(서열번호: 13)		 CTCACCAGGAAAGCAAAGACAC
(서열번호: 14)
CYP3A4 78 CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT
(서열번호: 15)		 GTCAAGATACTCCATCTGTAGCACAGT
(서열번호: 16)
Catalase 129 GTTACTCAGGTGCGGGCATTCTAT
(서열번호: 17)		 GAAGTTCTTGACCGCTTTCTTCTG
(서열번호: 18)
Mn-SOD 369 CTCCCCGACCTGCCCTACGACTAC
(서열번호: 19)		 AAACCAAGCCAACCCCAACCTGAG
(서열번호: 20)
b-actin 285 AGCGAGCATCCCCCAAAGTT
(서열번호: 21)		 GGGCACGAAGGCTCATCATT
(서열번호: 22)
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 성인 간세포와 태아 간세포의 유전자 발현 비교시에도 알코올과 관련된 여러 유전자들이 태아 간세포에서 감소되어 있는 것이 관찰되었으며, 태아 간세포보다 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 그 발현이 더 감소되어 있는 것을 확인하였다. 다만, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에 알코올을 처리하면 대사 효소의 증가가 확인되었다(도 3).
< 실험예 2> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양에 따른 효과
<2-1> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양
마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양하였다.
구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1>에서 수득한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포와 상기 <실시예 3>에서 얻은 마우스 간성상세포를 가지고 실험하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM에 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포 위에 8 ㎛ 구멍이 있는 플레이트(Corning, 미국)에 2 × 105 개의 마우스 간성상세포를 배양하였다. 간성상세포:인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 세포 비율은 1:2가 유지되어야 한다. 24시간 후 세포 및 상층액을 수득하거나, 200 mM(0.2 M) 에탄올(EtOH, ethanol)을 처리하고 24시간 더 배양하였다. 48시간 후, 세포 및 배지를 수득하였다(도 4).
<2-2> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 간세포의 손상 정도 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 간세포의 손상 정도를 확인하기 위하여, AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 LDH(lactate dehydrogenase)의 수치를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후 배지를 수거하여 간세포의 손상 정도를 확인하였다. IDEXX Laboratories(미국)에서 구입한 키트를 이용하여 AST, ALT 및 LDH를 분석하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 마우스 간성상세포와 24시간 동안 공동배양한 것만으로도 AST, ALT 및 LDH의 수치가 감소하였고, 에탄올(알코올) 처리 시에도 AST, ALT 및 LDH의 수치가 감소하는 것을 확인하였다(도 5). 이러한 결과는 알코올을 빠르게 분해해서 알코올에 의한 독성이 줄고 항산화효소 발현 증진에 따른 활성산소기(ROS)의 억제 효과로 인해 나타난 결과임을 예측할 수 있다.
<2-3> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 세포 사멸 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 세포 사멸 정도를 확인하기 위하여, 터널(TUNEL) assay를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후 에탄올을 처리한 세포들을 가지고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 고정시킨 세포를 100% 메탄올(Merck, millipore)을 15분 동안 처리하여 투과 가능하게(permeabilized) 하였다. 세포 사멸 측정 키트(In Situ Cell Death Detection Kit)인 Fluorescence(Roche)를 이용하였고, DAPI로 핵을 염색하여 다양한 배율에서 형광 여기를 위한 외부 광원으로의 Leica EL6000 및 Leica CTR 4000 CCD 카메라를 갖춘 Leica DMI 4000B 자동화 수직 현미경 시스템(독일)을 사용하여 가시화하였고, Leica Application Suite Advanced Fluorescence(LAS AF, Leica)로 컴퓨터 보조 이미지를 분석하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스 간세포를 대조군으로 알코올에 의한 세포 사멸이 거의 없는 것을 확인한 반면, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포는 알코올 처리시 세포 사멸이 많이 증가하였고, 이와 반대로 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포는 세포 사멸이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 마우스 간성상세포가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 알코올 대사 기능을 향상시킨다는 것을 보여준다.
<2-4> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 유전자 발현 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 알코올 대사 관련 효소, 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후 에탄올을 처리한 세포들을 가지고, 상기 실험예 <1-3>과 동일한 방법으로 상기 표 1의 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하여, 알코올 대사 관련 효소(ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1), 약물 대사 관련 효소(CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4) 및 항산화효소(카탈라아제 및 Mn-SOD)의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 마우스 간성상세포와 공동배양하였을 때, 알코올 대사 관련 효소(ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1), 약물 대사 관련 효소(CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4) 및 항산화효소(카탈라아제 및 Mn-SOD)의 발현이 모두 증가하는 것을 확인하였다(도 7).
<2-5> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 단백질 발현 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 알코올 대사 관련 효소, 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후 에탄올을 처리한 세포를 단백질 추출을 위해 RIPA 완충용액(30 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L 염화나트륨(sodium chloride), 1 mmol/L PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 mmol/L 오르토바나듐산나트륨(sodium orthovanadate), 1% NP-40(nonidet p-40), 10% 글리세롤(glycerol), 포스포타제 억제인자(phosphotase inhibitor) 및 프로테아제 억제인자(protease inhibitor))을 첨가하여 균질화하였다. 이렇게 얻은 단백질 50 내지 80 ㎍을 SDS-PAGE에 로딩한 후, 나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 멤브레인(membrane)으로 이동시켜 1차 항체로 항-베타-엑틴 항체(anti-β-actin antibodies)(Sigma-Aldrich), 항-알파-CYP2E1 항체(anti-α-CYP2E1 antibodies)(Millipore), 항-CYP3A4, 항-카탈라아제(Cell signaling, 미국), 항-ADH1 및 항-Mn-SOD 항체(Santa-Cruz)를 사용하여 단백질 발현량을 확인하였다. 2차 항체로 알칼리인산염(alkalinephosphate)이 결합된 항-토끼 항체를 사용하였고, PhosphoImager(GE Healthcare, 미국)와 ECL 검출 시스템을 이용하여 단백질을 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 인간 배아 줄기세포 유래 간세포와 마우스 간성상세포를 공동배양한 경우 ADH1, CYP2E1, CYP3A4, 카탈라아제 및 Mn-SOD의 발현이 모두 증가하는 것을 확인하였다(도 8).
<2-6> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 면역세포화학(immunocytochemistry) 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 알코올 대사 관련 효소인 CYP2E1의 발현을 확인하기 위해, 면역형광법(immunofluorescence)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후 에탄올을 처리한 세포들을 가지고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 고정시킨 세포를 100% 메탄올(Merck, millipore)을 15분 동안 처리하여 투과 가능하게(permeabilized) 한 후, 5% 염소 혈청(goat serum)을 37℃에서 1시간 동안 처리하여 블로킹(blocked)하였다. 여기에 항-CYP2E1 항체(Millipore, 독일)로 염색하였고, DAPI로 핵을 염색하여 다양한 배율에서 형광 여기를 위한 외부 광원으로의 Leica EL6000 및 Leica CTR 4000 CCD 카메라를 갖춘 Leica DMI 4000B 자동화 수직 현미경 시스템(독일)을 사용하여 가시화하였고, Leica Application Suite Advanced Fluorescence(LAS AF, Leica)로 컴퓨터 보조 이미지 분석하였다.
그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 CYP2E1의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 9).
<2-7> 마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 항산화 효소 활성 확인
마우스 간성상세포 및 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 공동배양 후 항산화 효소인 카탈라아제 및 Mn-SOD의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 마우스 간성상세포와 인간 배아 줄기세포 유래 간세포를 공동배양한 후, 카탈라아제 및 Mn-SOD 효소 활성을 확인하였다. 이러한 효소 활성은 특정 효소 활성 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 카탈라아제 분석 키트 및 SOD 활성 분석 키트(색도(Colorimetric))(Abcam)는 제조사의 방법에 따라 사용하였다.
그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 마우스 간성상세포와 공동 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 카탈라아제 및 Mn-SOD 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
지금까지의 결과들을 토대로 마우스 간성상세포와의 공동 배양 방법이 인간 배아 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 및 알코올 대사 관련 효소 발현 증가에 효과가 있음을 확인하였다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A method for improvement of drug metabolizing function of human stem cell-derived hepatocytes using hepatic stellate cells <130> 2014P-12-047 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1a_F <400> 1 agtcatccca ctcgctattc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1a_R <400> 2 gtcccctgag gattgcttac a 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1b_F <400> 3 cccggagagc aactactgc 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1b_R <400> 4 aaccagtcga gaatccacag c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1c_F <400> 5 ctcgcccctg gagaaagtc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1c_R <400> 6 ggcccccaac tctttagcc 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH2_F <400> 7 tcggctacat caacacgg 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH2_R <400> 8 tctcccaaca acctcctct 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2E1_F <400> 9 gcaagagatg ccctacatgg a 21 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2E1_R <400> 10 gggcacgagg gtgatgaa 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9_F <400> 11 cctctggggc attatccatc 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9_R <400> 12 atatttgcac agtgaaacat agga 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_F <400> 13 ctaagggaac gacactcatc ac 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_R <400> 14 ctcaccagga aagcaaagac ac 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP3A4_F <400> 15 caggaggaaa ttgatgcagt ttt 23 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP3A4_R <400> 16 gtcaagatac tccatctgta gcacagt 27 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catalase_F <400> 17 gttactcagg tgcgggcatt ctat 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catalase_R <400> 18 gaagttcttg accgctttct tctg 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mn-SOD_F <400> 19 ctccccgacc tgccctacga ctac 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mn-SOD_R <400> 20 aaaccaagcc aaccccaacc tgag 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin_F <400> 21 agcgagcatc ccccaaagtt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin_R <400> 22 gggcacgaag gctcatcatt 20

Claims (10)

  1. 생체 외(ex vivo)에서 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포(human embryonic stem cell-derived hepatocytes, hES-Hep) 및 간성상세포(hepatic stellate cells, HSCs)를 간세포 성장인자를 첨가한 배지에서 세포 간 비율이 2:1(hES-Hep:HSC)이 되도록 공동배양하는 것을 포함하는, 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인간 줄기세포는 인간 배아 줄기세포인 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 배양된 간세포는 알코올 또는 약물 대사 관련 효소 및 항산화효소의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 알코올 대사 관련 효소는 ADH1a, ADH1b, ADH1c 및 CYP2E1 중 적어도 하나이고, 약물 대사 관련 효소는 CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A4 중 적어도 하나이며, 항산화효소는 카탈라아제(catalase) 및 Mn-SOD 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포 유래 간세포의 약물 대사 기능 개선 방법.
  8. 제 1항의 방법으로 제조된 인간 줄기세포 유래 간세포.
  9. 1) 생체 외(ex vivo)에서 제 8항의 간세포에 피검 약물 또는 알코올을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 간세포의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 약물 또는 알코올 대사 관련 효소 발현 수준을 통해 약물 또는 알코올 대사 정도를 평가하는 단계를 포함하는 간세포의 약물 또는 알코올 대사 평가 방법.
  10. 제 8항의 간세포를 포함하는 약물 또는 알코올 대사 평가용 키트.
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