KR102038503B1

KR102038503B1 - 고기능성 간세포의 분화방법

Info

Publication number: KR102038503B1
Application number: KR1020150113616A
Authority: KR
Inventors: 김종훈; 김종현; 장유진
Original assignee: (주) 넥셀
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2015-08-12
Publication date: 2019-11-26
Also published as: KR20170019601A

Abstract

본 발명은 줄기세포에 AA(activin A)를 처리하여 상기 줄기세포로부터 분화된 내배엽세포를 수득하는 단계; 상기 수득한 내배엽세포에 RA(retinoic acid)를 처리하여 상기 내배엽세포로부터 분화된 간모세포를 수득하고, 상기 수득한 간모세포에 NA(nicotinamide)를 처리하여 간모세포를 증식시키는 단계; 및, 상기 증식된 간모세포에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하여 상기 간모세포로부터 분화된 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 고기능성 간세포의 분화방법에 관한 것이다.

Description

고기능성 간세포의 분화방법{Method for differentiation of hepatocyte}

본 발명은 고기능성 간세포의 분화방법 및 이로부터 분화된 고기능성 간세포에 관한 것이다.

인간의 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 및 인간으로부터 유래된 다능성 줄기세포에서 유도된 간세포 유사세포(hepatocyte-like cells, HLCs)를 이용한 비가역적 간 손실의 세포기반 치료는 장기이식으로 발전될 가능성이 있다. 추가로, 줄기세포 유래된 HLCs는 생체 외 약물 스크리닝 및 독성연구를 위하여 사용된다. 따라서, hESCs로부터 HLCs의 유도는 임상적이고 실험실적 연구를 위한 무제한적인 세포원천으로서 연구되었다. 그 결과, hESCs를 사용한 간세포분화 효율은 크게 증가하였다. 그러나, 다양한 분화방법에 의하여 생산된 대부분의 HLCs는 간세포분화의 마지막 단계에서 별도의 정제과정이 없이도 자연스럽게 다중세포 계열로 분화된다. 추가로, 대부분의 HLCs의 표현형은 성숙한 성인의 간세포 보다는 태아의 간세포와 더욱 유사한데, 중요한 성숙간세포의 기능인 phase I 및 II 효소활성이 인간의 기본적인 간세포(human primary hepatocytes, hPHs)에 비하여 HLCs에서는 더욱 감소한다. 아울러, 간담즙성 전달에 의한 phase I 및 II 약물대사와 간세포성 세관구조는 2D 배양된 HLCs에서는 빠르게 손실된다. 신체에서 3D 형태로 존재하는 간세포를 연구를 위해서 체외 실험에 사용할 경우 2D 배양법으로는 간세포의 기능성 중 하나인 phase I 및 II 약물대사기능이 상실되므로, 3D 배양 방법이 필요하다.

기존의 연구 결과 중, 인간배아줄기세포로부터 분화시킨 간세포를 3D 형태의 구체로 배양한 것이 존재하지만, hPHs와의 기능적 비교가 이루어지지 않거나 아직 약물대사 효소의 기능이 현저히 떨어져 있다[비특허문헌 1]. HLCs와 hPHs 사이의 이들 핵심적인 차이는 생체 내 및 실험실적 사용을 위한 기능적 성숙 간세포의 재생 가능한 원천으로서 줄기세포로부터 유도된 HLCs의 사용이 제한되는 결과를 초래한다.

줄기세포로부터 유도된 HLCs를 추가로 성숙시키기 위한 연구가 수행되었으나, 간세포의 성숙을 조절하는 생체 내 발달경로가 알려져 있지 않아서, 제대로 수행되지 않고 있다.

현재까지 연구 보고된 줄기세포 유래 간세포의 CYP 효소 활성은 정상 간세포와 비교하여 매우 낮은 편이다.

따라서, 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성을 나타내는 간세포의 분화방법을 개발이 필요한 실정이다.

Spheroid culture for enhanced differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells, Stem　Cells　Dev.　2014 Jan 15;23(2):124-31

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과, 기세포로부터 내배엽성 세포인 간모세포 및 간세포를 순차적으로 분화시키는 단계를 포함함으로써, 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성을 나타내는 간세포의 분화방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성을 나타내는 고기능성 간세포의 분화방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 분화방법에 의하여 분화된 고기능성 간세포를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

(a) 줄기세포에 AA(activin A)를 처리하여 상기 줄기세포로부터 분화된 내배엽세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 수득한 내배엽세포에 RA(retinoic acid)를 처리하여 상기 내배엽세포로부터 분화된 간모세포를 수득하고, 상기 수득한 간모세포에 NA(nicotinamide)를 처리하여 간모세포를 증식시키는 단계; 및,

(c) 상기 증식된 간모세포에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하여 상기 간모세포로부터 분화된 간세포를 수득하는 단계

를 포함하는 고기능성 간세포의 분화방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 고기능성 간세포를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 고기능성 세포를 포함하는 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 분화방법은 기 신약개발 단계에서 인체조직과 매우 유사한 분석 및 평가 도구로 활용될 수 있으므로 본 기술개발은 질병의 원인을 밝히고 새로운 약물표적을 발굴하는 기술에 활용될 수 있을 뿐 아니라, 2차 약리효능연구, 안전성연구, 대사체 연구 등 신약개발의 초기단계부터 전임상 분야의 대부분 단계에 기술 활용이 가능할 것으로 기대된다.

다양한 종류의 유전적 배경을 보유하는 인간 전능성 줄기세포주 (인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포)로부터 분화된 간세포의 독성 평가가 가능하므로 약물대사반응을 통한 약효성 및 독성의 개인적 차이를 예측하고 평가할 수 있게 할 것으로 기대된다.

따라서 이들 약물대사 및 전달에 관련된 필수 효소들의 활성을 증가시키기 위한 분화인자의 발굴 혹은 3-D 배양 기술이 개발될 경우, 기능적으로 인간 간세포와 대등한 세포주의 개발이 용이해지며, 이는 약효 및 독성 평가를 포함하는 신약개발의 신뢰성 제고에 크게 기여할 것이다.

도 1은 영양세포가 없는 상태에서 증식한 미분화 인간 배아줄기세포를 여러 단계를 거쳐 기능성 간세포로 분화시키는 모식도로 단계별 분화 특이적 마커(미분화: OCT4, 완전내배엽: Sox17, 배쪽 전장: HNF4a, 간전구 세포: AFP, 미성숙 간세포: ALB, 성숙 간세포 (ALB, ASGPR1)와 분화유도를 위한 유도인자(미분화: mTeSR1 배양액, 완전내배엽: Activin A, CHIR99021, Sodium butyrate, 배쪽 전장: BMP2, FGF4, B27, 간모세포: Retinoic acid, B27, 간모세포 증식: Nicotinamide, Ascorbic acid, bFGF, B27, 미성숙 간세포: HGF, 성숙 간세포: Oncostatin M, Dexamethesone)을 총 22일에 거쳐 분화를 유도하는 모식도 이다.
도 2는 분화 단계별 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 3은 내배엽 세포로의 분화 후 RA를 통해 간모세포를 획득한 다음 간모세포의 증식 단계를 확인한 사진이다.
도 4는 간세포 구체 형성에 적절한 단계를 도출하기 위해서 단계별 구체 형성 전 세포의 생존을 확인한 것(좌)과 형성된 구체의 크기를 단계별로 배양하면서 측정한 것(우)이다.
도 5는 2D 부착 배양 및 3D 부유 배양하여 최종적으로 분화된 성숙한 간세포의 분화적 정도를 성숙 간세포 마커인 ALB로 세포분리(FACS)로 확인한 것이다.
도 6은 2D 부착 배양 및 3D 부유 배양하여 최종적으로 분화된 성숙한 간세포의 분화적 정도를 성숙 간세포 표면 마커인 ASGPR로 세포분리(FACS)로 확인한 것이다.
도 7은 2D 부착 배양과 3D 부유 배양으로 분화시킨 간세포의 특성을 LDL uptake와 글리코겐 축적 확인을 위한 PAS 염색, ICG uptake를 통해 확인한 사진이다.
도 8은 2D 부착 배양과 3D 부유 배양으로 분화시킨 간세포의 특성을 알부민과 우레아 분비능을 통해 확인한 것이다.
도 9는 분화된 간세포의 세포소기관을 TEM을 통해 정밀 관찰한 사진이다.
도 10은 분화된 간세포에서 CYP 효소 발현에 관여하는 핵수용체의 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 11은 분화된 간세포에서 약물대사 2군 효소의 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 12는 분화된 간세포에서 약물대사 1군 효소의 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 13은 간세포의 약물대사 기능 효소 활성을 확인하기 위하여 분화된 간세포에 3가지 약물인 PB, AP, RIF를 농도별로 2일간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 분화된 간세포에 약물을 처리하였을 때 약물에 의한 간세포 특성 변화를 간세포 표지인자인 알부민(ALB)과 AFP의 형광염색으로 나타낸 사진이다.
도 15는 분화된 간세포에 약물을 처리하였을 때 약물에 의한 간세포 특성 변화를 확인하기 위해 글리코켄 축적 정도를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성을 나타내는 고기능성 간세포의 분화방법에 관한 것이다.

본 발명의 줄기세포 분화유도 방법에서, 줄기세포는 시험관 내 배양에서 간세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포, 바람직하게는 만능 줄기세포(pluripotent stem cells) 또는 상기 세포의 기원 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서의 포유동물은 특별히 제한되지 아니하며, 설치목 (rodentia), 토끼목(lagomorpha), 영장류 (primates), 식육류 (carnivora), 기제류 (perissodactyla) 및 우제류 (artiodactyla)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 포유동물일 수 있다. 일 양태로서 포유동물은 마우스, 토끼, 소, 돼지, 원숭이, 사람일 수 있으며, 구체적으로는 사람일 수 있으나, 시험관 내 배양에서 간세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포라면 그 출처에 제한되는 것은 아니다.

상기 "만능 줄기세포(pluripotent stem cells)"란 시험관 내 배양에 의해 미분화 상태로 유지된, 거의 영속적 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 적당한 조건에서 삼배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 현재 만능 줄기세포는, 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유동물 유래의 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포 (embryonic stem cells, 이하 "ES 세포"로 약칭함), 배아기(embryonic stage)의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cells, 이하 "EG 세포"로 약칭함) 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 줄기세포 (multipotent adult progenitor cells, 이하 "MAPC"으로 약칭함) 등이 있다.

하나의 양태로서, 본 발명의 줄기세포의 분화유도 방법에 있어서, 만능 줄기세포는 ES 세포, 각종 체세포의 역분화를 통해 제작된 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 세포(induced pluripotent stem cells, iPSC), EG 세포, 또는 MAPC인 방법, 바람직하게는 ES세포, 더욱 바람직하게는 인간 ES 세포인 줄기세포의 분화유도 방법일 수 있다.

마우스 유래 ES 세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E4 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129 SV 세포, J1 세포 등이 있다. 또한, ES 세포, EG 세포, MAPC의 제조, 계대, 보존 방법에 대한 표준적인 프로토콜이 이미 확립되어 있으며, 공지의 방법 (Matsui et al, Cell 70:841, 1992; Shamblott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Jiang et al, Nature 418:41, 2002; 미국 등록특허 제 6,060,622호; 국제 공개특허 01/11011호)을 참조하여, 이들 만능 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용 가능한 세포는, 상기 3종으로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 또는 혈액 등으로부터 유래된, 모든 다능성 줄기세포를 포함한다. 구체적인 예로, 모근 초세포나 표피세포에 5-아자사이티딘(5-azacytidine, 이하 "AZC"로 약칭함) 등의 약제를 처리하여 수득한 줄기세포 (Sharda & Zahner, 국제공개특허 제02/051980호)나, 단핵구 세포에 CR3/43 항체를 처리하여 수득한 줄기세포 (Abuljadayel, Curr. Med. Res. Opinion 19: 355, 2003), 또는 성체내 귀세포 유래 줄기세포(Li et al, Nature Med., Advance online publication) 등의 ES 세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 들 수 있다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질이란, ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, ES 세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마 (teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다.

또한, ES 세포와 유사한 형질을 갖지 않는 세포, 또는 만능 줄기세포가 아닌 세포라도, 적어도 시험관 내 배양에서 간세포형의 형질을 가지는 세포로 분화할 수 있는 성질을 가진 세포라면, 본 발명에 기재된 방법에 사용할 수 있다.

상기 '영양세포(feeder)' 또는 '피더세포'는 다른 유형의 세포와 공배양되어 제2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는, 한 유형의 세포를 기술하기 위해 사용되는 용어이다.

본 발명은

를 포함하는 고기능성 간세포의 분화방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 수득한 내배엽세포를 (b) 단계에 적용하기 전에, AA(activin A), 소듐부티레이트 및 FBS(fetal bovine serum)를 가하여 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계를 수행하기 전에 (a) 단계에서 수득한 내배엽세포에 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 FGF4(fibroblast growth factor 4)를 가하여 전배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계의 간모세포를 증식시킬 때, bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 아스코르브산을 추가로 처리할 수 있다.

상기 (c) 단계를 수행하기 전에 (b) 단계에서 수득한 간모세포에 트립신을 처리하여 간모세포를 단세포화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (c) 단계는 3D 부유 배양을 통해 수행되는 것이 보다 바람직하다.

상기 (c) 단계를 통해 수득한 간세포에 OSM(oncostatin M) 및 DEX(dexamethasone)를 처리하여 간세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 단계를 거쳐 제조된 고기능성 간세포는 생체 내 간세포와 유사한 약물대사 활성을 나타내며, 특히 약물 대사 중 시토크롬 P450(CYP) 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로 분화유도하여 상기에서 제공되는, 줄기세포로부터 분화유도된 간세포를 포함하는 치료용 조성물, 바람직하게는 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물, 더욱 바람직하게는 유전적 간 기능 손상의 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 치료용 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.

또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적으로 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 미분화 인간 배아줄기 세포주 및 초대 배양 간세포 배양 방법

미분화 인간의 배아줄기세포(hESC) 세포주를, 20% knockout serum replacement(Invitrogen Life Technologies, USA), 4 ng/㎖ bFGF, 1% 비필수아미노산 및 100 mM 베타메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여, 유사분열로 불활성화된(10 ㎍/㎖ mitomycin-C) 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 상에서 배양하였다. 상기 세포를 표준조건(37℃, 5% CO₂ 및 포화습도)에서 배양하고, 매일 배지를 교체하였다. hESC 및 hiPSC(human induced pluripotent stem cells) 콜로니가 증식될 때, 상기 hESC 및 hiPSC 세포주의 모든 세포에 제4형 콜라게나제를 처리한 다음, 이들을 잘게 부수어 5 내지 6일 마다 새로운 피더세포에 접종하였다. BGO1 hESCs를 상기 프로토콜을 확립하기 위하여 사용하고, 다른 hESCs 및 hiPSCs를 간세포 분화 프로토콜을 검증하기 위하여 사용하였다.

hPH(Human primary hepatocytes)는 BD Biosciences Discovery Labware에서 분양받았다. 제1형 콜라겐이 코팅된 24웰 플레이트에 배양된 사람의 간세포는 간세포 배양배지를 처리하기 전에 적어도 24시간 동안 배양하여 유지하였다.

두 개의 사람의 간암 세포주(HepG2 및 Huh7)는 한국세포주은행에서 입수하였다. 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 접종하고, 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포 밀도가 70~80%의 포화도에 도달할 때, 계대배양을 수행하였다. 배지는 3일마다 교체하였다.

< 실시예 2> 미분화 인간 배아줄기세포에서 간세포로의 분화 방법

첨부도면 도 1에 미분화 인간 배아줄기세포에서 간세포로의 분화 방법의 모식도를 나타내었다.

간세포 분화를 시작하기 위하여, hESCs 및 hiPSCs를 TrypLE select(Invitrogen)를 사용하여 3분 동안 단일세포로 분산시킨 다음, 원심분리기로 1000rpm에서 5분간 세포만 분리하여 수확하였다. 마트리겔이 코팅된 배양용기에 단백질 인산화효소 억제제인 Y-27632(ROCK inhibitor)가 포함된 mTeSR1 배지를 이용하여 접종 후 하루 동안 배양하였다. Y-27632(ROCK inhibitor)가 포함되지 않은 mTeSR1 배지로 2일간 추가 배양한 다음, 간세포 분화를 수행하였다. 인간 배아줄기세포의 확인은 qPCR을 통하여 미분화 마커인 OCT4의 발현을 확인하였다(도 2).

1 단계 ) 내배엽세포로의 분화/2D 부착 배양

내배엽세포는 소화관, 간 및 폐를 포함하는 내부 장기의 상피세포를 형성할 수 있다. 다능성 줄기세포를 내배엽세포로 분화시키는 단계는 생체 외에서 간세포의 분화에 필요하다. 본 발명에서는, hESCs 및 hiPSCs를 3일 동안 내배엽세포로 1차 분화시켰다. 최초 1.5일 동안 hESCs 및 hiPSCs의 분화는 2 μM CHIR99021 (GSK-3 inhibitor)과 100 ng/㎖ AA(activin A)를 포함하는 RPMI 배지에서 시작되었다. 이후 1.5일 동안, 상기 세포를 동일한 배양 배지에서 100 ng/㎖ AA, 0.5~1 mM 소듐부티레이트 및 0.2% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 추가로 분화되었다. 내배엽세포의 유도는 qPCR을 통하여 내배엽세포의 마커인 SOX17의 발현 수준을 측정하여 확인하였다(도 2).

2 단계 ) 간모세포로의 분화/2D 부착배양

1 단계에서 수득한 내배엽세포를 8일 동안 추가 배양하여 간모세포로 분화시켰다. 우선, 상기 세포를 B27 보조제(Gibco)가 포함된 RPMI 배지에 접종하고, 20 ng/㎖ BMP2(bone morphogenetic protein 2)와 30 ng/㎖ FGF4(fibroblast growth factor 4)를 처리하여 2일 동안 배양하였다. 간모세포로의 분화는 상기 세포를 B27 보조제가 포함된 DMEM 배지에 접종하고, 2 μM RA(retinoic acid)를 2일 동안 처리하여 유도하였다. 간모세포를 B27 보조제가 포함된 DMEM 배지에 접종하고, 10 mM NA(nicotinamide), 1 ng/㎖ bFGF 및 100 μM 아스코르브산을 4일 동안 처리하고 배양하여 간모세포를 증식시켰다. 간모세포의 유도는 HNF4α 및 AFP의 발현을 측정하여 분석하였고(도 2), 간모세포의 증식은 EdU incorporation assay kit (invitrogen)를 사용하여 평가하였다 (도 3).

3 단계 ) 간세포로의 분화/2D 부착 배양 또는 3D 부유 배양

간세포의 최종 성숙을 유도하기 위하여, 2단계에서 수득한 간모세포에 트립신(TrypLE select)를 처리하여 단세포화하고, 2D 부착 배양을 수행하기 위하여 제1형 콜라겐이 코팅된 배양용기에 접종하거나 또는 3D 부유 배양을 수행하기 위하여 부착 저해 배양용기에 접종하였다. 양자 모두, ITS 배지에 접종하고, 20 ng/㎖ HGF를 처리한 다음, 4일 동안 배양하여 분화시켰다. 상기 세포를 10 ng/㎖ OSM(oncostatin M) 및 10 μM DEX(dexamethasone)을 포함하는 ITS 배지에 접종하고 4일 동안 배양하여 추가로 성숙시켰다. 최종 분화된 세포의 마커로 AAT와 ALB를 사용하여 발현을 확인하였다 (도 2).

< 실시예 3> 구체 형성을 위한 분화 단계 선정

단일세포로 분리된 I, II, III 단계의 세포가 부유된 배양액 중 10㎕와 trypan blue 시약 10㎕를 섞어 세포 측정기를 통해 생존율을 분석하였다. I단계와 II단계에서 단일세포로 분리한 경우 세포의 생존율이 80~90% 정도로 유지되는 반면, III단계에서 40% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 이후, I단계에서 형성한 스페로이드와 II단계에서 형성한 스페로이드를 분화 마지막 단계까지 동일한 방법으로 배양 후 동일한 배율 (X40)에서 독립적인 위치의 광학사진을 5장씩 찍어 스페로이드의 크기를 비교한 결과, II단계에서 단일세포로 분리하여 스페로이드는 형성한 경우 배양이 잘 되는 것을 확인하였다 (도 4).

< 실시예 4> 유세포 분석을 통한 분화된 간세포의 마커 단백질 발현

2D 배양된 HLCs와 3D 배양된 간세포 스페로이드에 TrypLE select를 가하여 단일세포로 분리한 다음, 4% PFA를 처리하여 4℃에서 20분 동안 고정시켰다. 상기 세포에 BD에서 판매하는 FACS 세척 버퍼를 이용하여 세척 후, 1차 항체인 성숙 간세포 마커로 알려져 있는 ALB과 ASGPR 1 항체를 각각 처리하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 다시 2차 항체를 각각 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 세척한 세포를 BD-FACS Calibur Flow Cytometer(FACS Calibur, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 마커별로 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 실험결과는 Flowjo software를 사용하여 분석하였다. ALB의 경우 세포 분리기(FACS)로 분화 정도를 확인하였을 시, 배양 용기(2D)에 부착되어 분화된 세포는 92.84%의 분화 효율을 나타내며 구체 형성 후 (3D) 최종 분화를 유도하였을 경우 91%의 분화 효율을 확인함으로 두 군이 비슷하게 분화 효율을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5). ASGPR1의 경우 세포 분리기 (FACS)로 분화 정도를 확인하였을 시, 배양 용기(2D)에 부착되어 분화된 세포는 40.2%의 분화 효율을 나타내며 구체 형성 후 (3D) 최종 분화를 유도하였을 경우 50.85%의 분화 효율을 확인함으로 구체 형성을 통한 분화된 간세포에서의 발현이 높아짐을 확인하였다(도 6).

<실시예 5> 분화된 간세포의 특성 확인

LDL 흡수 분석

간세포 마커 발현세포인 2D 배양된 HLCs 세포와 3D 배양된 스페로이드에 흡수된 LDL의 위치를 분석하기 위하여, Dil-Ac-LDL 염색 키트(Biomedical Technologies, USA)를 사용하여 사용자 매뉴얼에 따라 분석을 수행하였다. 흡수된 LDL에서 발현하는 형광을 형광현미경(Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하였다. 2D 배양된 HLCs세포와 3D 배양된 스페로이드에서 모두 LDL 흡수가 잘 이루어졌음을 확인하였다 (도 7).

PAS(Periodic Acid- Schiff ) 염색

2D 배양된 HLCs와 3D 배양된 간세포 스페로이드로부터 유래된 세포를 4% 포르말린과 95% 에탄올을 포함하는 용액으로 고정시키고, PAS 용액으로 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 증류수로 여러 번 세척한 다음, 세포에 Schiff's 시약을 15분 동안 처리하고, 흐르는 물에 5분간 세척한 다음, 헤마톡실린을 사용하여 실온에서 90초 동안 염색하였다. 세포내 글리코겐 입자(보라색)를 광학현미경(Carl Zeiss)으로 검출하였다. 2D 배양된 HLCs세포와 3D 배양된 스페로이드에서 모두 글리코겐의 축적이 잘 이루어졌음을 확인하였다 (도 7).

ICG ( Indocyanin green) 염색

2D 배양된 HLCs와 3D 배양된 간세포 스페로이드로부터 유래된 세포의 배지에 1 mg/㎖ ICG를 가하고, 표준 배양조건에서 1시간 동안 반응시켰다. ICG 흡수는 광학현미경으로 관찰하였다. 2D 배양된 HLCs세포와 3D 배양된 스페로이드에서 모두 ICG 흡수가 잘 이루어졌음을 확인하였다 (도 7).

ALB 및 우레아 측정

세포배양 상등액에 포함된 ALB을 albumin ELISA 키트(Bethyl laboratories, Inc., USA)를 사용하여 측정하였다. 대략적으로, 96웰 플레이트에 항체 코팅 용액을 가하고 1시간 동안 코팅한 다음, 1차 ALB 항체를 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 50 ㎕ CM(conditioned medium-세포를 48시간 동안 배양한 동량의 메디아)을 각 웰에 분주하고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 항체와 결합된 ALB을 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하여 검출하였다. 실온에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨 다음, 상기 플레이트에 TMB(tetramethylbenzidine) 기질을 가하여 반응시키고, 0.5M 황산을 가하여 반응을 종료시켰다. 흡광도는 405 nm에서 측정하였다. 각 시료는 적어도 3개의 독립적인 시료를 사용하여 3번 반복실험 하였다.

우레아 역시 키트를 사용하여 사용자 매뉴얼에 따라 용액과 반응시킨 후 흡광도를 통해 측정하였다. 각 시료는 적어도 3개의 독립적인 시료를 사용하여 3번 반복실험 하였다. 일반적으로 알려진 간암세포주인 HepG2와 Huh7 보다 분화된 간세포의 알부민 및 우레아 분비능이 높음을 확인하였다. 3D 배양 스페로이드의 경우 초대 배양된 인간 간세포보다 알부민 및 우레아 분비능이 낮지만, 2D 배양된 HLCs보다 월등히 높아짐을 확인하였다 (도 8).

TEM (Transmission electron microscopy) 분석

2D 배양된 HLCs와 3D 배양된 간세포 스페로이드로부터 유래된 세포를 2.5% 글루타르알데히드-2% PFA를 포함하는 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.4)에 가하고 4℃에서 2시간 동안 고정시켰다. 0.1M 인산염 완충액으로 세척한 다음, 상기 세포에 1% OsO₄(osmium tetroxide)를 포함하는 0.1 M 인산염 완충액을 가하고, 암소에서 1시간 동안 후-고정시켰다. 후-고정된 세포를 탈수시키고, 프로필렌을 가한 다음, Epon812 mixture(EMS, USA)에 포맷하였다. 상기 블록을 Ultracut UCT ultramicrotome(Leica, Germany)을 사용하여 60 nm 두께의 박편으로 절단하였다. 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 염색한 다음, 박편을 H-7600 TEM(80 kV)으로 분석하였다. 2D 배양된 HLCs와 3D 배양된 간세포 스페로이드 모두 간세포의 특징인 bile canalicular junction을 관찰할 수 있고 (노란색 화살표 머리) 세포 내 축적된 글리코겐(노란색 화살표)이 존재함을 확인하였다. 간세포의 특징인 둥글고 큰 핵(N)과 MV(microvilli) 또한 확인하였다. 눈금자는 2 μm를 나타낸다 (도 9).

< 실시예 6> 분화된 간세포 내 약물 대사 관련 효소 및 핵수용체 유전자 발현 확인

총 RNA를 2D 배양된 HLCs, 3D 배양된 간세포 스페로이드로부터 유래된 세포 및 TRIzol 시약을 사용하여 생체 이물질에 반복적으로 노출된 세포로부터 수득하고, 역전사 시스템(Promega Corp., USA)을 사용한 역전사 과정을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94 ℃ 5분, 35사이클(94 ℃ 30초, 50-57 ℃ 30초 및 72 ℃ 30초) 및 72 ℃ 10 분으로 설정하였다.

qPCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5 ㎕ SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8 ㎕ 10 mM의 프라이머, 10.4 ㎕ 증류수 및 0.5 ㎕ 주형 cDNA를 포함하는 25 ㎕로 구성하여 각 프라이머에 맞는 조건에서 증폭하여 확인하였다. 각 유전자의 상대적인 발현수준은 β-액틴을 사용하여 정규화하여 측정하였다.

사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다(표 1).

유전자	정방향(5'3')	역방향(5'3')	산물크기 (bp)
CYP1A2 CYP2B6 CYP2C9 CYP2D6-v1 CYP2D6-v2 CYP3A4 CAR PXR PPARα GSTA2 GSTA4 GSTM4 GAPDH	CCAGTCTGTTCCCTTCTCGG AGCTTCATGACCGAGCCAAA ATTTGTGTGGGAGAAGCCCT GTTCCCAAGGGGTGTTCCTG CCCAAGGACGCCCCTTTC AGCCTGGTGCTCCTCTATCT GACCTGCCTGTCTTCCGTTC CCACTGGGAGTGCAGGGGC TCGGCGAGGATAGTTCTGGA CCTTCTTTCAGTGGGAGGGA CCGAGTGGACTCCAGAAAGC TGTACACAAGGGTGGCTGTC TTCAGTGGTGGACCTGACCT	GCTGGCTCATCCTTGACAGT CAGGATTGAAGGCGTCTGGT AAAGAGAGCTGCAGGGACTG GGCTTTGTCCAAGAGACCGT GCTGGGATATGCAGGAGGAC CCCTTATGGTAGGACAAAAT GATTTCCACAGCTGCTCCCT TGGCAGCCGGAAATTCTTGA TGGTGAAAGCGTGTCCGTGA GCCATGGTAGCAGTCTCCTG GGCACTTGTTGGAACAGCAG GAAAGGAACGAGGAGGCAGG CACCACCCTGTTGCTGTAGC	200 216 224 200 205 116 72 101 108 140 200 144 256

간세포의 약물대사 효소 발현에 관여하는 핵 수용체인 CAR, PPARα, PXR 모두 3D 배양 스페로이드가 초대배양 인간 간세포보다는 낮지만 2D 배양 HLCs 보다 높음을 확인하였다 (도 10).

간세포의 약물대사 2군 효소인 GSTA2, GSTA4, GSTM4 모두 3D 배양 스페로이드가 가장 높은 발현임을 확인하였다 (도 11).

간세포의 약물대사 1군 효소 중 CYP2D6-v1의 경우 3D 배양 스페로이드와 초대 배양 인간 간세포에서의 발현이 유사함을 확인하였고, CYP2D6-v2, CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9의 경우 초대 배양 인간 간세포보다는 발현이 낮지만 2D 배양 HLCs 보다 3D 배양 스페로이드에서 발현이 높아졌다. CYP1A2의 경우 3D 배양 스페로이드의 발현이 가장 높음을 확인하였다 (도 12).

< 실시예 7> 분화된 간세포의 시토크롬 P450( CYP ) 효소 약물 대사활성 분석

세포 기반 CYP 효소활성 분석을 사용하여 CYP3A4, CYP2C19, CYP1A2 및 CYP2D6의 세포 내 활성을 확인하였다. 대략적으로, PB(10, 25, 50, 100 및 200 ㎛), AP(10, 25, 50, 100 및 200 ㎛) 및 RIF(0.5, 1 및 5 ㎛)을 각각 48시간 동안 처리하여 CYP 발현을 유도하였다. 24웰 배양용기에서 2D 배양된 HLCs 및 3D 배양된 간세포 스페로이드에 루시페린 기질(CYP3A4용 루시페린-IPA, CYP2C19용 루시페린-H EGE, CYP1A2용 루시페린-ME 및 CYP2D6용 P450-Glo)을 가하고, 37에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 실온에서 각각의 반응물 50 ㎕를 96웰 불투명 백색 루미노미터 플레이트에 분주하였다. 다음으로, 루시페린 검출시약 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 암소에서 40 내지 60분간 반응시켜서 형광발색 반응을 유도하였다. 그 결과로서 생성된 형광수준을 측정하였다. 형광수준을 측정한 다음, 각 웰당 단백질 농도를 측정하고, 각 단백질 농도 당 형광 값을 산출하여 다양한 CYP 활성을 확인하였다. 3D 배양 스페로이드의 약물대사 효소 활성이 제일 높거나 초대배양 인간 간세포와 비슷한 수준으로 나타남을 확인하였다 (도 13). *는 p<0.05로 각 그룹의 약물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 이 수치가 통계적으로 의미가 있음을 나타낸다.

< 실시예 8> 약물처리로 인한 분화된 간세포 특성 변화 확인

면역형광염색을 위해 가장 높은 약물대사 효소 활성을 나타내는 PB, AP, RIF의 처리 농도를 선정하여 2D 배양 HLCs에 48시간 동안 노출시킨 후 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS를 20분간 처리하여 고정시켰다. 고정된 2D 배양 간세포에 0.3% Triton X-100/PBS 및 10% 혈청을 포함하는 0.1% BSA/PBS로 처리(ALB 항체의 경우 0.1% BSA가 포함되지 않은 PBS를 사용함)하여 블로킹 및 천공시킨 다음, ALB, AFP에 대한 1차 항체를 희석하여 처리하고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 동형 마우스 IgG 또는 정상 당나귀 혈청을 음성 대조군으로 사용하였는데, 상기 음성대조군에서는 형광이 검출되지 않았다. PBS로 3회 세척하고, Alexa flour 488 및 Alexa flour 594 형광 물질이 결합된 1:400으로 희석된 2차 항체를 가하고, 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 다음으로, 1 ㎍/㎖ DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 세포의 핵을 염색하였다. 다양한 약물(PB, AP, RIF) 처리에도 간세포의 표지인자 발현이 높은 수준으로 유지되고 있음을 확인하였다 (도 14). 눈금자는 100μm를 나타낸다.

글리코겐 축적 기능 확인을 위해 붉은색으로 염색되는 PAS 염색을 시행하여 다양한 약물(PB, AP, RIF) 처리에도 변함없이 간세포의 특성이 유지되고 있음을 확인하였다 (도 15). 눈금자는 100μm를 나타낸다.

< 실시예 9> 간모세포 증식 단계 확인

EdU 염색

간세포 분화 중의 간모세포 증식을 확인하기 위하여, 기본 배양액 그룹과 NA, AsA, bFGF를 처리한 배양액 그룹에 10 μM EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)를 배지에 4시간 동안 첨가하여 DNA 복제 중 세포 내 DNA에 EdU가 투입되도록 배양하였다. EdU에 노출된 세포를 PBS로 3회 세척하고, 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS에 20분간 고정하였다. 이후, EdU incorporation assay kit (invitrogen)의 제시된 매뉴얼에 따라 염색하고 간세포 표지인자인 ALB을 상기 면역형광염색법을 통해 공동 염색하였다. EdU의 형광사진을 형광현미경 (Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하였다. 그 결과, 세포의 수가 NA를 처리한 그룹에서 많아짐을 관찰하였고, ALB과 EdU 형광염색을 통해 간모세포가 NA를 처리한 그룹에서 증식이 더 많이 일어남을 확인하였다 (도 3). 증식된 세포의 수를 세어 NA를 처리한 그룹에서 세포 증식이 많이 일어났음을 유의성 있게 확인하였다 (도 3). 눈금자는 100μm를 나타낸다.

Claims

(a) 인간 만능 줄기세포를 GSK-3 억제제(inhibitor)와 AA(activin A)를 포함하는 배지에서 배양하고, 상기 배지에 AA(activin A), 소듐부티레이트 및 FBS(fetal bovine serum)를 추가 처리하여 상기 줄기세포로부터 분화된 내배엽세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 내배엽세포에 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 FGF4(fibroblast growth factor 4)를 처리하여 전배양한 다음, RA(retinoic acid)를 처리하여 상기 내배엽세포로부터 간모세포를 분화시키고, NA(nicotinamide), bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 아스코르브산을 처리하여 간모세포를 증식시키는 단계; 및
(c) 상기 증식된 간모세포에 트립신을 처리하여 간모세포를 단세포화하고, HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하여 배양한 다음, 상기 세포를 OSM(oncostatin M) 및 DEX(dexamethasone)를 포함하는 배지에 배양하여 간모세포로부터 분화된 간세포를 수득하는 단계
를 포함하는 고기능성 간세포의 분화방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 (c) 단계는 3D 부유 배양을 통해 수행되는 것인 분화방법.
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제 1 항의 방법으로 분화된 고기능성 간세포.
제 8 항에 있어서,
시토크롬 P450(CYP) 효소 활성을 나타내는 간세포.
제 1 항의 방법으로 분화된 고기능성 세포를 포함하는 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물.