JP2023537102A - 間葉系前駆体又は幹細胞及びそれらの使用を含む組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、改善された細胞組成物及びそれを得るための効力アッセイに関する。そのような組成物及びアッセイは、様々な炎症性障害の治療における使用に好適であり得る。

Description

本開示は、改善された細胞組成物及びそれを得るための効力アッセイに関する。そのような組成物及びアッセイは、様々な炎症性障害の治療における使用に好適であり得る。

再生又は免疫療法用途のためのいくつかの細胞療法製品は、臨床評価及び市場認可に進んでいる。しかしながら、これらの細胞療法製品の市場へのリリースは、その複雑さ及び不均一性によって妨げられており、関連する生物学的活性の同定、したがって、一貫した細胞療法製品の品質の定義が困難である。

生理化学的パラメータ（例えば、サイズの特徴付け、形態、光散乱特性、引張強度、細胞数、コンフルエンス、表現型マーカーの同定、分泌物質、遺伝子型、遺伝子発現プロファイル）は、活性物質、中間体、不純物及び汚染物質の同定及び定量化のために日常的に使用される。しかしながら、生理化学的パラメータは、生成物が生物学的に活性であり、強力である（すなわち、所望の効果を誘発する）ことを確認することはできない。対照的に、生物学的特徴付けは、動物において、かつ最終的には臨床において、インビトロ又はインビボでモデル化されたいずれかの生物学的系に対する生成物の効果を考慮に入れている。

効力試験は、製品の関連する生物学的活性又は活性を実証しなければならない。製品の全ての生物学的機能を反映することは効力試験の要件ではないが、１つ以上の関連する生物学的機能を示す必要がある。効力試験で使用される分析方法については、正確性、感度、特異性及び再現性が確立され、それらが好適ロバストであることが予想される。

免疫抑制が所望される疾患の治療のために、改善された効力を有する製品を開発する必要がある。細胞療法製品の有効性に重要なパラメータを同定し、一貫した品質の製品を製造できるように（例えば、効力試験を介して）パラメータを制御することも好ましい。

間葉系前駆体系統又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の調製は、現在、治療の可能性が高まっていることが確認されている。そのような調製物は、様々な炎症性疾患に関連する刺激などの炎症性刺激に曝露されたときに、ＮＦ ＮＦ－κＢの活性化（すなわち、ＮＦ－κＢリン酸化）を配向する高レベルの受容体を発現する。したがって、一例では、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物に関するものであり、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化すると、ＮＦ－κＢをリン酸化する受容体を発現し、ＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも３．５倍高く増加させるのに十分なレベルの受容体を発現する。一例では、ＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも４倍高く増加させるのに十分なレベルの受容体を発現する。一例では、受容体は、ＴＮＦ－Ｒ１又はＩＬ－１Ｒの１つ又は両方である。一例では、炎症刺激を介したＭＬＰＳＣの活性化は、培養条件下でのＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、及びＰＧＥ２のうちの１つ以上の分泌を増加させる。例えば、炎症刺激を介したＭＬＰＳＣの活性化は、培養条件下で、以下のうちの１つ以上の分泌をもたらし得る。１８，０００ｐｇ／ｍｌのＭＣＰ－１、１，５００ｐｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、４０，０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２。

一例では、組成物は、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含む。

別の例では、ＮＦ－κＢのリン酸化は、細胞をＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－１βと接触させた後に決定される。この例では、非刺激ＭＬＰＳＣは、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－１βと接触しない。

一例では、受容体は、ＴＮＦ－Ｒ１である。

一例では、本開示の組成物は、高レベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現し、炎症性疾患における治療転帰、特に患者の生存に関連する治療転帰を改善する。更に、これらの調製物中のＭＬＰＳＣは、治療用量を提供するように増殖することができ、現在では臨床スケール調製物でさえも作製することができる。したがって、一例では、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物を包含し、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。例えば、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、１０^６個の細胞当たり少なくとも約２３．５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現することができる。別の例では、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物を包含し、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。例えば、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、１０^６個の細胞当たり少なくとも約２６．５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現することができる。別の例では、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、少なくとも約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。例えば、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、１０^６個の細胞当たり少なくとも約２７ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現することができる。一例では、組成物は、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含む。したがって、別の例では、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞の集団を含む組成物を包含し、組成物は、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含み、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために培養増殖された細胞の集団が選択されている。一例では、培養条件下で、少なくとも約２２０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために培養増殖された細胞の集団が選択されている。一例では、培養条件下で、少なくとも約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために培養増殖された細胞の集団が選択されている。別の例では、培養条件下で、少なくとも約２５×１０^６個のＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために培養増殖された細胞の集団が選択されている。

一例では、培養増殖された細胞の集団は、バイオリアクター内で培養増殖される。別の例では、炎症性疾患は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）である。

一例では、組成物は、凍結保存剤を含む。

別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５８％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも６０％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５５～７５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５８～６５％阻害する。

別の例では、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物を包含し、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５８％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも６０％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５５～７５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５８～６５％阻害する。

別の実施形態では、本発明者は、間葉系統前駆体又は幹細胞を含む、細胞療法製品の生物学的活性又は治療有効性を測定するための効力アッセイを開発した。したがって、別の例では、本開示は、間葉系統前駆体又は幹細胞の治療有効性を決定するための方法に関しており、
（ｉ）間葉系統前駆体又は幹細胞を含む集団を得ることと、
（ｉｉ）細胞を培養培地中で培養することと、
（ｉｉｉ）培養条件下で、細胞によって培養培地中に発現されるＴＮＦ－Ｒ１の量を決定することであって、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の量が、治療有効性を示す、決定することと、を含む。

一例では、部分（ｉｉｉ）は、培養条件下で、細胞によって培養培地中に発現されるＴＮＦ－Ｒ１の量を決定することを含み、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の量が、治療有効性を示す。

一例では、部分（ｉｉｉ）は、培養条件下で、細胞によって培養培地中に発現されるＴＮＦ－Ｒ１の量を決定することを含み、少なくとも約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の量が、治療有効性を示す。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞の集団は、３Ｄ細胞培養物から得られる。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞の集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物からの３Ｄ細胞培養物中で培養増殖されている。

別の例では、本開示は、炎症性疾患を有する対象を治療する方法に関しており、それを必要とする対象に、間葉系統前駆体又は幹細胞の組成物を投与することを含み、細胞は、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。一例では、細胞は、培養条件下で、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。一例では、細胞は、培養条件下で、少なくとも約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。

一例では、炎症性疾患は、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患である。別の例では、炎症性疾患は、ＧｖＨＤである。一例では、ＧｖＨＤは、慢性ＧｖＨＤである。一例では、治療された対象は、１００日生存率を改善している。

一例では、対象は、ステロイド免疫抑制剤及び／又は生物学的療法に難治性である。一例では、対象は、少なくとも２回の用量の組成物を受ける。一例では、対象は、週に２回投与を受ける。

一例では、間葉系前駆体系統又は幹細胞は、間葉系幹細胞である。一例では、組成物は、プラズマライトＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を更に含む。一例では、組成物は、プラズマライトＡ（７０％）、ＤＭＳＯ（１０％）、ＨＳＡ（２５％）溶液を含み、ＨＳＡ溶液は、５％ＨＳＡ及び１５％緩衝液を含む。別の例では、各用量は、対象の少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重を含む。

（上部ＬＨＳ）：ＭＳＣにおけるＴＮＦ－Ｒ１のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン。培養増殖されたＭＳＣを、ＴＮＦ－Ｒ１を標的とするｓｉＲＮＡ（２０、１００又は５００ｐＭ）で４時間トランスフェクトした。（下部ＬＨＳ）：非刺激及びＴＮＦα刺激ＭＳＣにおけるリン酸化ＮＦ－ｋＢ。ＯＤ＝光学密度。列は、平均±ＳＤを表す。（上部ＲＨＳ）ＴＮＦ－Ｒ１のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン及びＴＮＦαとの接触後のＭＳＣからのＣＣＬ２分泌。（下部ＲＨＳ）ＴＮＦ－Ｒ１のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン及びＴＮＦαとの接触後のＭＳＣからのＭ－ＣＳＦ分泌。 ＴＮＦαは、培養増殖されたＭＳＣにおいてＮＦ－ｋＢによって調節される免疫調節性サイトカインの発現を誘導する。バーは、平均±ＳＤを表す。 ＭＳＣと共培養したＣＤ１４＋単球によるＴＮＦａ媒介性ＩＬ－１０産生に対するＭＣＰ－１に対する遮断抗体の効果。 改善されたプロセスを用いて製造された生成物は、より高い平均ＴＮＦ－Ｒ１レベルを有し、ＩＬ－２Ｒαの阻害における変動性が少ない。 ＴＮＦ－Ｒ１レベルの増加をもたらす製造上の変化は、１００日目の生存期間の増加を伴っている。 ６０％を超えるＩＬ－２Ｒα発現レベルに関連するＭＳＣを受けた患者における生存率が著しく改善した。 インビトロでのＩＬ２Ｒａ阻害は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ低減と相関する。

一般的な技術及び定義
別途特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものとする（例えば、細胞培養、分子生物学、幹細胞培養、免疫学、及び生化学）。

特に指示がない限り、本開示で利用される細胞培養技術及びアッセイは、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ）などソースの文献を通じて記載され、説明されている。

「及び／又は」という用語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味することが理解され、両方の意味又はいずれかの意味を明示的に支持するように解釈される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、反対に記載されない限り、指定された値の＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％を指す。

「レベル」及び「量」という用語は、細胞調製物中の特定の物質の量を定義するために使用される。例えば、特定の濃度、重量、パーセンテージ（例えば、ｖ／ｖ％）又は比率を使用して、特定の物質のレベルを定義することができる。一例では、レベルは、培養条件下で本開示の細胞によって発現される特定のマーカーの量に関して表される。一例では、発現は、細胞表面発現を表す。別の例では、レベルは、培養条件下で本明細書に記載される細胞からどの程度の特定のマーカーが放出されるかという点で表される。

一例では、レベルは、ｐｇ／ｍｌで表される。別の例では、レベルは、１０^６個の細胞当たりｐｇで表される。ｐｇ／ｍｌのレベルは、必要に応じて１０^６個の細胞当たりｐｇに変換され得る。例えば、ＴＮＦ－Ｒ１の文脈では、一例では、２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、１０^６個の細胞当たり約２３．５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１に対応する。一例では、ＴＮＦ－Ｒ１の文脈では、一例では、２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、１０^６個の細胞当たり約２６．５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１に対応する。一例では、２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、１０^６個の細胞当たり約２７ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１に対応する。別の例では、２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、１０^６個の細胞当たり約３０ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１に対応する。別の例では、２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、１０^６個の細胞当たり約３２ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１などに対応する。

一例では、特定のマーカーのレベルは、培養条件下で決定される。「培養条件」という用語は、培養物中で成長する細胞を指すために使用される。一例では、培養条件は、能動的に分裂する細胞集団を指す。そのような細胞は、一例では、指数増殖期にあり得る。例えば、特定のマーカーのレベルは、細胞培養培地の試料を採取し、試料中のマーカーのレベルを測定することによって決定することができる。別の例では、特定のマーカーのレベルは、細胞の試料を採取し、細胞溶解物中のマーカーのレベルを測定することによって決定することができる。分泌マーカーが培養培地をサンプリングすることによって測定される一方で、細胞の表面上に発現されるマーカーは、細胞溶解物の試料を評価することによって測定され得る当業者。一例では、細胞が指数増殖期にあるときに試料が採取される。一例では、試料は、少なくとも２日間の培養後に採取される。

凍結保存された中間体からの細胞を増殖させる培養とは、細胞の増殖に好適な条件下で極低温凍結及びインビトロ培養を受ける細胞を解凍することを意味する。

一例では、ＴＮＦ－Ｒ１などの特定のマーカーの「レベル」又は「量」は、細胞が凍結保存された後に決定され、次いで培養物に播種される。例えば、レベルは、細胞の第１の凍結保存後に決定される。別の例では、レベルは、細胞の第２の凍結保存後に決定される。例えば、凍結保存した中間体から細胞を培養増殖し、２回目の凍結保存を行った後に培養中に再播種して、培養条件下で特定のマーカーのレベルを決定することができる。

一例では、細胞は、炎症刺激によって活性化される受容体を発現する。そのような受容体は、サイトカインなどの炎症性メディエーターに結合する。そのような受容体の様々な例は、既知であり、例えば、ＴＮＦ－Ｒ１及びＩＬ－１Ｒを含む。当業者は、適切な炎症刺激が標的とされる受容体によって決定されることを理解するであろう。例えば、ＴＮＦ－Ｒ１に対する適切な炎症刺激は、ＴＮＦ－αである。別の例では、ＩＬ－１Ｒの適切な炎症刺激は、ＩＬ－１である。

「播種」という用語は、本明細書で使用され、細胞を三次元（３Ｄ）培養物に導入するプロセスを指す。一例では、本開示の細胞は、動的播種を介して培養物に播種され、培養培地は、細胞が接着物質に結合するにつれて混合し続ける。別の例では、細胞を３Ｄ培養物に播種し、細胞が材料に結合することができるように、培養培地中の接着材料に接着するのに十分な期間放置する。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、５，０００～２０，０００細胞／ｍｌで播種される。別の例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、８，０００～２０，０００細胞／ｍｌで播種される。別の例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、８，０００～１５，０００細胞／ｍｌで播種される。

「回収する」という用語は、本明細書で使用され、２Ｄ又は３Ｄ培養物からの細胞の除去を指す。例えば、細胞は、本明細書に開示される培養物から回収することができる。一例では、回収された細胞を、生理食塩水又は同等の溶液で最初に洗浄する（例えば、２～３回）。洗浄ステップに続いて、接着性材料上で解離ステップを行ってもよい。一例では、好適な解離酵素が、解離ステップ中に用いられる。一例では、３Ｄ培養物から回収された細胞を洗浄し、濃縮してから凍結保存する。一例では、洗浄及び濃縮された細胞は、凍結保存される前に、保管、充填、仕上げ、及び目視検査され得る。

本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療する」、又は「治療」という用語は、間葉系統幹細胞又は前駆体細胞及び／又はその子孫及び／又はそれに由来する可溶性因子の集団を投与することを含み、それによって、本明細書で開示される疾患の少なくとも１つの症状を低減又は除去する。一例では、治療は、本開示の組成物を投与することを含む。一例では、治療は、治療が開始された後に部分奏効を誘導する。一例では、治療は、治療が開始された後に完全奏効を誘導する。

ＧｖＨＤの治療の文脈では、一例では、部分奏効は、治療が開始されてから２８日後に誘導される。一例では、部分奏効は、治療が開始されてから少なくとも３０日後に誘導される。一例では、部分奏効は、治療が開始されてから少なくとも２ヶ月後に誘導される。別の例では、部分奏効は、治療が開始されてから少なくとも３ヶ月後に誘導される。別の例では、部分奏効は、治療が開始されてから２８～５６日後に誘導される。別の例では、部分奏効は、２回の用量の後に誘導される。別の例では、部分奏効は、週に１回投与される２回の用量の後に誘導される。別の例では、部分奏効は、２週間ごとに週１回投与される２回の用量の後に誘導される。別の例では、部分奏効は、３回以上の用量の後に誘導される。

一例では、ＧｖＨＤにおける部分奏効は、
少なくとも１ポイントの皮膚％ＢＳＡスコアの低減、
少なくとも１ポイントの口腔スコアの低減、
少なくとも１ポイントの眼スコアの低減、
少なくとも１ポイントの皮膚特徴スコアの低減、
少なくとも１ポイントの胃腸管スコアの低減、
少なくとも１ポイントの肝臓スコアの低減、
少なくとも１ポイントの肺症状スコアの低減、
少なくとも１ポイントの肺ＦＥＶ１スコアの低減、
少なくとも１ポイントの関節及び筋膜スコアの低減、
少なくとも１ポイントの生殖器官スコアの低減、のうち１以上又はその全てを特徴とする。

一例では、部分奏効は、少なくとも１ポイントの皮膚％ＢＳＡスコアの低減を特徴とする。別の例では、部分奏効は、少なくとも１ポイントの口腔スコアの低減を特徴とする。別の例では、部分奏効は、少なくとも１ポイントの眼スコアの低減を特徴とする。これらの例では、スコアは、ＧｖＨＤについてのＮＩＨコンセンサス基準２０１４を使用して得ることができる（例えば、以下の実施例の項を参照）。

一例では、本開示の組成物は、ＧｖＨＤを予防又は阻害するために投与され得る。本明細書で使用される場合、「予防する」又は「予防すること」という用語は、間葉系統幹細胞又は前駆体細胞及び／又はその子孫及び／又はそれに由来する可溶性因子の集団を投与することを含み、それにより、ｃＧｖＨＤのうちの少なくとも１つの症状の発症を停止又は阻害する。

ＧｖＨＤを特徴付けるための様々な分類システムが存在する（Ｌｅｅ，Ｓ．，（２０１７）Ｂｌｏｏｄ．，１２９（１）：３０－３７）。一例では、ＮＩＨコンセンサス基準２０１４は、本明細書に開示される転帰をスコアリングするために使用され得る（Ｊａｇａｓｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２１：３８９－４０１）。ＮＩＨコンセンサス基準２０１４の構成要素を以下の表に示す。

繰り返すが、ＧｖＨＤの文脈において、一例では、部分奏効は、上記の表からの臓器特異的ＮＩＨコンセンサス基準２０１４スコアの１ポイント以上の減少である。したがって、一例では、治療は、皮膚％ＢＳＡスコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、口腔スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、眼スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、皮膚特徴スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、胃腸管スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、肝臓スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、肺症状スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、肺ＦＥＶ１スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、関節及び筋膜スコアの１ポイント超の減少を誘導する。別の例では、治療は、生殖器官スコアの１ポイント超の減少を誘導する。

一例では、治療は、治療が開始された後にＧｖＨＤに対する完全奏効を誘導する。一例では、完全奏功は、治療が開始されてから２８日後に誘導される。一例では、完全奏功は、治療が開始されてから少なくとも２８ヶ月後に誘導される。一例では、完全奏功は、治療が開始されてから少なくとも３０ヶ月後に誘導される。一例では、完全奏功は、治療が開始されてから少なくとも２ヶ月後に誘導される。別の例では、完全奏効は、治療が開始されてから少なくとも３ヶ月後に誘導される。別の例では、完全奏功は、治療が開始されてから２８～５６日後に誘導される。別の例では、完全奏功は、２回の用量の後に誘導される。別の例では、完全奏功は、週に１回投与される２回の用量の後に誘導される。別の例では、完全奏功は、２週間ごとに週１回投与される２回の用量の後に誘導される。別の例では、完全奏功は、３回以上の用量の後に誘導される。

一例では、本開示の方法は、対象におけるｃＧｖＨＤ疾患の悪化又は疾患の合併症を阻害する。対象におけるｃＧｖＨＤ疾患の悪化又は疾患の合併症の「阻害」とは、対象におけるｃＧｖＨＤの進行及び／又は疾患の合併症を予防又は低減することを意味する。

一例では、治療は、患者の生存率を増加させる。一例では、治療は、治療の開始後少なくとも１００日間生存する対象の確率を増加させる。一例では、増加した確率は、本開示の組成物で治療されていない対象に対して決定される。

「炎症性腸疾患」（ＩＢＤ）という用語は、本開示の文脈において、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、過敏性結腸症候群クローン大腸炎及びクローン病（ＣＤ）などの胃腸管の炎症性疾患を指す。

「潰瘍性大腸炎（ＵＣ）」という用語は、軽度から中等度の潰瘍性大腸炎を含み得る。軽度から中等度の潰瘍性大腸炎は、以下：
潰瘍性大腸炎疾患活性指数（ＵＣ－ＤＡＩ）のスコア４～１０、
Ｓ状結腸鏡検査スコア＞４、
医師による全般的評価（ＰＧＡ）スコア＞２、のうち１以上又はその全てを特徴とし得る。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト対象を指す。例えば、対象は、成人であってもよい。別の例では、対象は、小児であってもよい。別の例では、対象は、青年であってもよい。「対象」、「患者」、又は「個体」などの用語は、文脈において、本開示において互換的に使用することができる用語である。一例では、対象は、ステロイド療法に難治性である。一例では、対象は、生物学的療法に難治性である。一例では、対象は、ステロイド療法及び生物学的療法に難治性である。

本明細書全体を通して、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形例は、記載された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップのグループの包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップのグループの排除を意味するものではないと理解されるであろう。

本明細書全体を通して、別段に具体的に記載されない限り、又は文脈が別様に要求する場合を除き、単一のステップ、物質の組成物、ステップのグループ、又は物質の組成物のグループへの言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップのグループ、又は物質の組成物のグループのうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含するように取られなければならない。

当業者は、本明細書に記載される開示が、具体的に記載されるもの以外の変形及び修正の影響を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、個別に又は集合的に、本明細書で言及又は示される全てのステップ、特徴、組成物、及び化合物、並びに当該ステップ又は特徴のうちの任意及び全ての組み合わせ、又は任意の２つ以上を含む。

本開示は、例示のみを目的とする本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。機能的に等価な生成物、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本開示の範囲内である。

本明細書に開示される任意の例は、特に明記されない限り、任意の他の例に準用されるものとする。

一例では、本開示の組成物は、遺伝的に修飾されていない間葉系前駆体系統又は幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「遺伝的に修飾されていない」という用語は、核酸によるトランスフェクションによって修飾されていない細胞を指す。疑義を避けるために、本開示の文脈において、ＴＮＦ－Ｒ１をコードする核酸でトランスフェクトされた間葉系統前駆体又は幹細胞は、遺伝的に修飾されるとみなされる。

間葉系統前駆体細胞
本明細書で使用される場合、「間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）」という用語は、多能性を維持しながら自己更新する能力を有する未分化多能性細胞を指し、間葉起源、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞及び腱、又は非中胚葉起源、例えば、肝細胞、神経細胞及び上皮細胞のいずれかのいくつかの細胞型に分化する能力を指す。疑義を避けるために、「間葉系統前駆体細胞」は、骨、軟骨、筋肉及び脂肪細胞、並びに線維性結合組織などの間葉系細胞に分化することができる細胞を指す。

「間葉系統前駆体又は幹細胞」という用語は、親細胞及びそれらの未分化子孫の両方を含む。この用語はまた、間葉系前駆体細胞、多能性間質細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、血管周囲間葉系前駆体細胞、及びそれらの未分化子孫を含む。

間葉系統前駆体又は幹細胞は、自己、同種異系、異種、同系、又は同種であり得る。自己細胞は、それらが再移植されるのと同じ個体から単離される。同種異系細胞は、同種のドナーから単離される。異種細胞は、別の種のドナーから単離される。同系又は同種細胞は、双子、クローン、又は高度に近交系の研究動物モデルなどの遺伝的に同一の生物から単離される。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、同種異系である。一例では、同種異系間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養増殖及び凍結保存される。

間葉系統前駆体又は幹細胞は、主に骨髄に存在するが、例えば、臍帯血及び臍帯、成人末梢血、脂肪組織、海綿骨及び歯髄を含む多様な宿主組織にも存在することが示されている。それらはまた、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、靭帯、腱、骨格筋、真皮、及び骨膜に見られ、中胚葉及び／又は内胚葉及び／又は外胚葉などの生殖細胞系に分化することができる。したがって、間葉系統前駆体又は幹細胞は、脂肪性、骨性、軟骨性、弾性、筋性、及び線維性結合組織を含むが、これらに限定されない多数の細胞型に分化することができる。これらの細胞が入る特定の分化系列決定及び分化経路は、成長因子、サイトカイン、及び／又は宿主組織によって確立された局所的な微小環境条件などの機械的影響及び／又は内因性生物活性因子からの様々な影響に依存する。

「濃縮された」、「濃縮」という用語又はその変形は、本明細書では、１つの特定の細胞型の割合又は多数の特定の細胞型の割合が、未処理の細胞集団（例えば、その天然環境中の細胞）と比較して増加する細胞集団を説明するために使用される。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞のために濃縮された集団は、少なくとも約０．１％又は０．５％又は１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％又は２５％又は３０％又は５０％又は７５％の間葉系統前駆体又は幹細胞を含む。この点で、「間葉系統前駆体又は幹細胞のために濃縮された細胞の集団」という用語は、「Ｘ％間葉系統前駆体又は幹細胞を含む細胞の集団」という用語を明示的に支持するために使用され、Ｘ％は、本明細書に列挙されるようなパーセンテージである。間葉系統前駆体又は幹細胞は、いくつかの例では、クローン原性コロニーを形成することができ、例えば、ＣＦＵ－Ｆ（線維芽細胞）又はそのサブセット（例えば、５０％又は６０％又は７０％又は７０％又は９０％又は９５％）は、この活性を有することができる。

本開示の一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣは、均質な組成物であってもよく、又はＭＳＣを濃縮した混合細胞集団であってもよい。均質なＭＳＣ組成物は、接着性骨髄又は骨膜細胞を培養することによって得られ得、ＭＳＣは、独自のモノクローナル抗体で同定される特定の細胞表面マーカーによって同定され得る。ＭＳＣを濃縮した細胞集団を得るための方法は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。ＭＳＣの代替の供給源としては、血液、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、骨、及び軟骨膜が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、ＭＳＣは、同種異系である。一例では、ＭＳＣは、凍結保存される。一例では、ＭＳＣは、培養増殖及び凍結保存される。

別の例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、ＣＤ２９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０２＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６＋、ＣＤ１６６＋、ＭＨＣ１＋ＭＳＣである。

単離された又は濃縮された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養によってインビトロで増殖され得る。単離された又は濃縮された間葉系統前駆体又は幹細胞は、凍結保存され、解凍され、その後、培養によってインビトロで増殖され得る。

一例では、単離された又は濃縮された間葉系統前駆体又は幹細胞を、培養培地（無血清又は血清補充）、例えば、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びグルタミンを補充したα最小必須培地（αＭＥＭ）中で５０，０００個の生存細胞／ｃｍ^２で播種し、３７℃、２０％Ｏ_２で一晩培養容器に付着させる。その後、必要に応じて培養培地を置き換え、かつ／又は改変し、細胞を更に６８～７２時間、３７℃、５％Ｏ_２で培養する。

当業者によって理解されるように、培養された間葉系統前駆体又は幹細胞は、インビボでの細胞と表現型的に異なる。例えば、一実施形態では、これらは、以下のマーカー、ＣＤ４４、ＮＧ２、ＤＣ１４６、及びＣＤ１４０ｂのうちの１つ以上を発現する。培養された間葉系統前駆体又は幹細胞もまた、インビボでの細胞とは生物学的に異なり、インビボでの大部分が非サイクリング（静止）細胞と比較して高い増殖速度を有する。

一例では、細胞集団は、選択可能な形態のＳＴＲＯ－１＋細胞を含む細胞調製物から濃縮される。この点で、「選択可能な形態」という用語は、細胞が、ＳＴＲＯ－１＋細胞の選択を可能にするマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解されるであろう。マーカーは、ＳＴＲＯ－１であり得るが、そうである必要はない。例えば、本明細書に記載及び／又は例示されるように、ＳＴＲＯ－２及び／若しくはＳＴＲＯ－３（ＴＮＡＰ）及び／若しくはＳＴＲＯ－４及び／若しくはＶＣＡＭ－１及び／若しくはＣＤ１４６及び／若しくは３Ｇ５を発現する細胞（例えば、間葉系前駆体細胞）もＳＴＲＯ－１を発現する（及びＳＴＲＯ－１ｂｒｉｔｈｂｒｉｇｈｔであり得る）。したがって、細胞がＳＴＲＯ－１＋であることを示すことは、細胞がＳＴＲＯ－１発現によってのみ選択されることを意味するものではない。一例では、細胞は、少なくともＳＴＲＯ－３発現に基づいて選択され、例えば、それらは、ＳＴＲＯ－３＋（ＴＮＡＰ＋）である。

細胞又はその集団の選択への言及は、必ずしも特定の組織源からの選択を必要としない。本明細書に記載されるように、ＳＴＲＯ－１＋細胞は、多種多様な供給源から選択されるか、単離されるか、又は濃縮されることができる。とは言うものの、いくつかの例では、これらの用語は、ＳＴＲＯ－１＋細胞（例えば、間葉系前駆体細胞）を含む任意の組織、又は末梢細胞（例えば、ＳＴＲＯ－１＋末梢細胞）を含む血管化組織若しくは組織、又は本明細書に列挙される組織のうちのいずれか１つ以上からの選択のためのサポートを提供する。

一例では、本開示で使用される細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ－１＋、ＴＨＹ－１＋、ＳＴＲＯ－２＋、ＳＴＲＯ－４＋（ＨＳＰ－９０β）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から個別に又は集合的に選択される１つ以上のマーカーを発現する。

「個別に」とは、本開示が、列挙されたマーカー又はマーカーのグループを別々に包含することを意味し、個々のマーカー又はマーカーのグループが本明細書に別々に列挙され得ないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、そのようなマーカー又はマーカーのグループを、互いに別々にかつ分割可能に定義し得る。

「集合的に」とは、本開示が、列挙されたマーカー又はマーカーのグループの任意の数又は組み合わせを包含することを意味し、そのようなマーカー又はマーカーのグループの数又は組み合わせが本明細書に具体的に列挙され得ないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、そのような組み合わせ又はサブ組み合わせを、マーカー又はマーカーのグループの任意の他の組み合わせから別々にかつ分割可能に定義し得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図される。例えば、この用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）及び腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。一例では、ＴＮＡＰは、ＢＡＰである。一例では、本明細書で使用されるＴＮＡＰは、ブダペスト条約の規定に基づいて２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたＳＴＲＯ－３抗体に、寄託受託番号ＰＴＡ－７２８２の下で結合することができる分子を指す。

更に、一例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞は、クローン原性ＣＦＵ－Ｆを生じさせることができる。

一例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞の大幅な割合は、少なくとも２つの異なる生殖細胞系に分化することができる。ＳＴＲＯ－１＋細胞に深く関与し得る系統の非限定的な例としては、骨前駆体細胞、胆管上皮細胞及び肝細胞に対して多能性である肝細胞前駆細胞、乏突起膠細胞及び星状細胞に進行するグリア細胞前駆体を生成することができる神経制限細胞、ニューロンに進行する神経前駆体、心筋及び心筋細胞の前駆体、膵β細胞株を分泌するグルコース応答性インスリンが挙げられる。他の系統としては、象牙芽細胞、象牙質生成細胞及び軟骨細胞、並びにケラチノサイト、樹状細胞、毛包細胞、腎管上皮細胞、平滑筋及び骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、星状細胞及び乏突起膠細胞などの網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、皮膚細胞の前駆体細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーから得られ、ドナー試料又は間葉系統前駆体又は幹細胞は、その後プールされ、次いで培養増殖される。

本開示によって包含される間葉系統前駆体又は幹細胞もまた、対象への投与前に凍結保存され得る。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、対象への投与前に培養増殖及び凍結保存される。

一例では、本開示は、間葉系統前駆体又は幹細胞、並びにその子孫、それに由来する可溶性因子、及び／又はそれから単離される細胞外小胞を包含する。別の例では、本開示は、間葉系統前駆体又は幹細胞、並びにそこから単離された細胞外小胞を包含する。例えば、本開示の間葉系前駆体系統又は幹細胞を、細胞外小胞を細胞培養培地に分泌するのに好適な条件下で一定期間培養増殖することが可能である。分泌された細胞外小胞は、その後、療法に使用するために培養培地から得ることができる。

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」という用語は、典型的には、２００ｎｍ未満のサイズであるが、細胞から自然に放出され、約３０ｎｍ～１０ミクロンの大きさの範囲の脂質粒子を指す。これらは、放出細胞（例えば、間葉系幹細胞；ＳＴＲＯ－１^＋細胞）からのタンパク質、核酸、脂質、代謝物、又はオルガネラを含有することができる。

本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、一般に、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍのサイズの範囲であり、細胞膜に輸送され、放出される哺乳類細胞のエンドソーム区画に由来する一種の細胞外小胞を指す。それらは、核酸（例えば、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、タンパク質、脂質、及び代謝物を含有してもよく、１つの細胞から分泌され、それらのカーゴを送達するために他の細胞に取り込まれることによって、細胞間情報伝達において機能する。

細胞の培養増殖
一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養増殖される。「培養増殖された」間葉系統前駆体又は幹細胞培地は、細胞培養培地中で培養され、継代された（すなわち、サブ培養された）という点で、新鮮に単離された細胞とは区別される。一例では、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、約４～１０の継代にわたって培養増殖された。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の継代にわたって培養増殖される。例えば、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～１０の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～８の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～７の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、１０を超える継代にわたって培養増殖させることができる。別の例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、７を超える継代にわたって培養増殖させることができる。これらの例では、幹細胞は、中間凍結保存されたＭＬＰＳＣ集団を提供するために凍結保存される前に培養増殖され得る。一例では、本開示の組成物は、中間凍結保存されたＭＬＰＳＣ集団、又は別の言い方をすると、凍結保存された中間体からの細胞を培養することによって産生される。

一例では、本開示の組成物は、凍結保存された中間体から培養増殖される間葉系統前駆体又は幹細胞を含む。一例では、凍結保存された中間体から培養増殖された細胞は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の継代にわたって培養増殖される。例えば、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～１０の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～８の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも５～７の継代にわたって培養増殖させることができる。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、１０を超える継代にわたって培養増殖させることができる。別の例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、７を超える継代にわたって培養増殖させることができる。

一例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、動物性タンパク質を含まない培地中で培養増殖させることができる。一例では、凍結保存された中間体から増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞培養物は、ゼノフリー培地中で培養増殖させることができる。一例では、凍結保存された中間体から増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞培養物は、ウシ胎仔血清を含まない培地中で培養増殖させることができる。

一実施形態では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーから得ることができ、ドナー試料又は間葉系統前駆体又は幹細胞は、その後プールされ、次いで培養増殖される。一例では、培養増殖プロセスは、
ｉ．継代増殖によって生存細胞の数を増殖して、少なくとも約１０億個の生存細胞の調製物を提供することであって、継代増殖は、単離された間葉系統前駆体又は幹細胞の一次培養物を確立し、次いで、前の培養物から単離された間葉系統前駆体又は幹細胞の第１の非一次（Ｐ１）培養物を連続的に確立することを含む、増殖することと、
ｉｉ．単離された間葉系統前駆体又は幹細胞のＰ１培養物を、間葉系統前駆体又は幹細胞の第２の非一次（Ｐ２）培養物に継代増殖することによって増殖することと、
ｉｉｉ．間葉系統前駆体又は幹細胞のＰ２培養物から得られたプロセス中の中間間葉系統前駆体又は幹細胞調製物を調製し、凍結保存することと、
ｉｖ．凍結保存されたプロセス中の中間間葉系統前駆体又は幹細胞調製物を解凍し、継代増殖によりプロセス中の中間間葉系統前駆体又は幹細胞調製物を増殖することと、を含む。

一例では、増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞調製物は、
ｉ．約０．７５％未満のＣＤ４５＋細胞、
ｉｉ．少なくとも約９５％のＣＤ１０５＋細胞、
ｉｉｉ．少なくとも約９５％のＣＤ１６６＋細胞、を含む抗原プロファイル及び活性プロファイルを有する。

一例では、増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞調製物は、対照と比較して、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＰＢＭＣによるＩＬ２－Ｒα発現を少なくとも約３０％阻害することができる。

一例では、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、約４～１０の継代にわたって培養増殖され、間葉系統前駆体又は幹細胞は、更なる培養増殖される前に、少なくとも２又は３継代後に凍結保存されている。一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５の継代にわたって培養増殖され、凍結保存し、次いで、本開示の方法に従って培養される前に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５継代にわたって更に培養増殖される。

間葉系統前駆体又は幹細胞単離及びエクスビボ増殖のプロセスは、当該技術分野で既知の任意の装置及び細胞ハンドリング方法を使用して実施され得る。本開示の様々な培養増殖実施形態は、細胞の操作を必要とするステップ、例えば、播種、栄養補給、接着培養物の解離、又は洗浄のステップを採用する。細胞を操作する任意のステップは、細胞を侵襲する可能性を有する。間葉系統前駆体又は幹細胞は、一般に、調製中にある程度の侵襲に耐えることができるが、細胞への侵襲を最小限に抑えながら、所与のステップを適切に実行する手順及び／又は装置を取り扱うことによって、細胞を操作することが好ましい。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，２５１，２９５に記載される、細胞源バッグ、洗浄液バッグ、再循環洗浄バッグ、入口及び出口ポートを有する回転膜フィルタ、濾液バッグ、混合ゾーン、洗浄細胞用の最終生成物バッグ、及び適切なチューブを含む装置において洗浄される。

一例では、本開示に従って培養した間葉系統前駆体又は幹細胞組成物は、ＣＤ１０５陽性及びＣＤ１６６陽性であり、ＣＤ４５陰性であることに関して９５％均質である。一例では、この均質性は、エクスビボ増殖を通じて持続する。すなわち、複数の集団が倍増する。

一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、３Ｄ培養物中で培養増殖される。例えば、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、バイオリアクター内で培養増殖することができる。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、３Ｄ培養物中で更に増殖される前に、２Ｄ培養物中で最初に培養増殖される。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、マスター細胞バンクから培養増殖される。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、３Ｄ培養物に播種する前に、２Ｄ培養物中のマスター細胞バンクから培養増殖される。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、バイオリアクター内の３Ｄ培養物に播種する前に少なくとも３日間、２Ｄ培養物中のマスター細胞バンクから培養増殖される。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、バイオリアクター内の３Ｄ培養物に播種する前に少なくとも４日間、２Ｄ培養物中のマスター細胞バンクから培養増殖される。一例では、本開示の間葉系統前駆体又は幹細胞は、バイオリアクター内の３Ｄ培養物に播種する前に３～５日間、２Ｄ培養物中のマスター細胞バンクから培養増殖される。これらの例では、２Ｄ培養物は、セルファクトリーにおいて実施され得る。様々なセルファクトリー製品が市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ）。

細胞培養培地
本明細書に開示される間葉系統前駆体又は幹細胞は、様々な好適な成長培地中で培養増殖することができる。

本開示の文脈で使用される場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細胞を取り囲む環境の構成要素を含む。培地は、細胞の成長を可能にするのに好適な条件に寄与する、かつ／又はそれを提供する。培地は、固体、液体、気体、又は相及び材料の混合物であり得る。培地は、液体増殖培地、並びに細胞増殖を維持しない液体培地を含むことができる。培地としては、寒天、アガロース、ゼラチン、及びコラーゲンマトリックスなどのゼラチン性培地も挙げられる。例示的な気体培地としては、ペトリ皿又は他の固体若しくは半固体支持体上で成長する細胞が曝露される気相が挙げられる。

培養増殖に使用される細胞培養培地は、全ての必須アミノ酸を含有し、非必須アミノ酸も含有し得る。一般に、アミノ酸は、必須アミノ酸（Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）及び非必須アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ）に分類される。

当業者は、最適な結果を得るために、基底培地が目的の細胞株に適していなければならないことを理解するであろう。例えば、このエネルギー源が枯渇していることが判明し、したがって成長を制限する場合、基底培地中のグルコース（又は他のエネルギー源）のレベルを増加させるか、又は培養の過程でグルコース（又は他のエネルギー源）を添加する必要があり得る。一例では、溶存酸素（ＤＯ）レベルも制御され得る。

一例では、細胞培養培地は、ヒト由来添加物を含有する。例えば、ヒト血清及びヒト血小板細胞溶解物を、細胞培養培地に添加することができる。

一例では、細胞培養培地は、ヒト由来添加物のみを含有する。したがって、一例では、細胞培養培地は、ゼノフリーである。疑義を避けるために、これらの例では、培養培地は、動物性タンパク質を含まない。一例では、本開示の方法で使用される細胞培養培地は、動物成分を含まない。

一例では、培養培地は、血清を含む。他の例では、培養培地は、間葉系統前駆体又は幹細胞増殖を促進する成長因子を含むウシ胎仔血清を含まない培養培地である。一実施形態では、培養培地は、無血清幹細胞培養培地である。一例では、細胞培養培地は、
基底培地、
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、
線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を含む。

一例では、培養培地は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を含み、ＦＧＦ２のレベルは、約６ｎｇ／ｍｌ未満である。例えば、ＦＧＦ２レベルは、約５ｎｇ／ｍｌ未満、約４ｎｇ／ｍｌ未満、約３ｎｇ／ｍｌ未満、約２ｎｇ／ｍｌ未満、約１ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。他の例では、ＦＧＦ２レベルは、約０．９ｎｇ／ｍｌ未満、約０．８ｎｇ／ｍｌ未満、約０．７ｎｇ／ｍｌ未満、約０．６ｎｇ／ｍｌ未満、約０．５ｎｇ／ｍｌ未満、約０．４ｎｇ／ｍｌ未満、約０．３ｎｇ／ｍｌ未満、約０．２ｎｇ／ｍｌ未満である。

別の例では、ＦＧＦ２のレベルは、約１ｐｇ／ｍｌ～１００ｐｇ／ｍｌである。別の例では、ＦＧＦ２のレベルは、約５ｐｇ／ｍｌ～８０ｐｇ／ｍｌである。

一例では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ－ＢＢである。一例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約１ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約７．５ｎｇ／ｍｌ～１２０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約１５ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２１ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２２ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２３ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２４ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌである。

別の例では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ－ＡＢである。一例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、約１ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、約７．５ｎｇ／ｍｌ～１２０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、約１５ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２１ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２２ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２３ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２４ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌである。

他の例では、追加の因子を細胞培養培地に添加することができる。一例では、培養培地は、ＥＧＦを更に含む。ＥＧＦは、受容体ＥＧＦＲに結合することによって細胞増殖を刺激する成長因子である。一例では、本開示の方法は、ＥＧＦを更に含むウシ胎仔血清を含まない細胞培養培地中で幹細胞の集団を培養することを含む。一例では、ＥＧＦのレベルは、約０．１～７ｎｇ／ｍｌである。例えば、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌであり得る。

別の例では、ＥＧＦのレベルは、約０．２ｎｇ／ｍｌ～３．２ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、約０．４ｎｇ／ｍｌ～１．６ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、約０．２ｎｇ／ｍｌの間である。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌである。別の例では、ＥＧＦのレベルは、少なくとも約１．０ｎｇ／ｍｌである。

上記の例では、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ又はＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）などの基底培地を、参照される量の成長因子で補充することができる。一例では、培養培地は、３２ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＢＢ、０．８ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び０．０２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを補充したＡｌｐｈａ ＭＥＭ又はＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）を含む。

他の例では、追加の因子を細胞培養培地に添加することができる。例えば、細胞培養培地は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ｌα，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－ｌβ（ＩＬ－ｌβ）、及び間質由来因子ｌα（ＳＤＦ－ｌα）からなる群から選択される１つ以上の刺激因子で補充され得る。別の実施形態では、細胞はまた、細胞の成長をサポートするのに十分な量で、少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養され得る。別の実施形態では、細胞は、ヘパリン又はその誘導体の存在下で培養され得る。例えば、細胞培養培地は、約５０ｎｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。他の例では、細胞培養培地は、約６０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約７０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約８０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約９０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１００ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１１０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１１０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１２０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１３０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１４０ｎｇ／ｍｌのヘパリン、約１５０ｎｇ／ｍｌのヘパリン又はそれらの誘導体を含有する。一例では、ヘパリン誘導体は、硫酸塩である）。様々な形態のヘパリン硫酸塩は、当該技術分野で既知であり、ヘパリン硫酸塩２（ＨＳ２）を含む。ＨＳ２は、例えば、雄及び／又は雌の哺乳類の肝臓を含む様々な供給源に由来することができる。したがって、例示的なヘパリン硫酸は、雄肝臓ヘパリン硫酸塩（ＭＭＬ ＨＳ）及び雌肝臓ヘパリン硫酸塩（ＦＭＬ ＨＳ）を含む。

別の例では、本開示の細胞培養培地は、幹細胞を未分化状態に維持しながら幹細胞増殖を促進する。幹細胞は、特定の分化系統に深く関与しない場合、未分化とみなされる。上述のように、幹細胞は、それらを分化細胞から区別する形態学的特徴を示す。更に、未分化幹細胞は、分化状態を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現する。ポリペプチド生成物はまた、分化状態を検出するためのマーカーとして使用され得る。したがって、当業者は、本開示の方法が、日常的な形態学的、遺伝的及び／又はプロテオーム分析を使用して幹細胞を未分化状態に維持するかどうかを容易に決定することができる。

細胞の修飾
本明細書に開示される間葉系統前駆体又は幹細胞は、投与時に細胞の溶解が阻害されるような方法で改変され得る。抗原の改変は、免疫学的非応答性又は寛容性を誘導することができ、それによって、正常な免疫応答における外来細胞の拒絶に最終的に関与する免疫応答のエフェクター相（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞生成、抗体産生など）の誘導を防止する。この目的を達成するために改変され得る抗原としては、例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＬＦＡ－３及びＩＣＡＭ－１が挙げられる。

間葉系統前駆体又は幹細胞はまた、線条骨格筋細胞の分化及び／又は維持のために重要なタンパク質を発現するように遺伝的に修飾され得る。例示的なタンパク質としては、成長因子（ＴＧＦ－β、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、ＦＧＦ）、筋原性因子（例えば、ｍｙｏＤ、ミオゲニン、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）、筋原性調節因子（ＭＲＦ））、転写因子（例えば、ＧＡＴＡ－４）、サイトカイン（例えば、心臓プロピン－１）、ニューレグリンファミリーのメンバー（例えば、ニューレグリン１、２及び３）、及びホメオボックス遺伝子（例えば、Ｃｓｘ、ｔｉｎｍａｎ及びＮＫｘファミリー）が挙げられる。

組成物
本明細書に開示される間葉系統又は幹細胞は、凍結保存された中間体から培養増殖され、少なくとも１つの治療用量を含有する調製物を産生し得る。

一例では、本開示の組成物は、ＮＦ－κＢを活性化する受容体の発現に関して定義される。一例では、ＮＦ－κＢ活性化は、ＮＦ－κＢリン酸化のレベルによって測定される。ＮＦ－κＢを活性化する受容体の例としては、ＴＮＦ－Ｒ１及びＩＬ－１Ｒが挙げられる。ＮＦ－κＢ活性化を測定する様々な手段が当該技術分野で既知である。例えば、ＮＦ－κＢの受容体媒介性リン酸化は、細胞の適切な刺激後にＥＬＩＳＡ又は免疫蛍光を介して測定され得る。一例では、刺激されたＭＬＰＳＣにおけるＮＦ－κＢ活性化のレベルを、非刺激ＭＬＰＳＣにおけるＮＦ－κＢ活性化のレベルと比較する。例えば、ＭＬＰＳＣは、ＮＦ－κＢ活性化のレベルが決定される前に、ＴＮＦ－αとの接触によって刺激され得る。次いで、刺激された細胞におけるＮＦ－κＢ活性化のレベルを、ＴＮＦ－αと接触しなかったＭＬＰＳＣにおけるＮＦ－κＢ活性化のレベルと比較する。

一例では、本開示のＭＬＰＣは、炎症刺激を介して活性化すると、ＮＦ－κＢをリン酸化する受容体を発現し、ＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも３．０倍高く増加させるのに十分なレベルの受容体を発現する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも３．５倍高く増加させるのに十分なレベルの受容体を発現する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも４倍高く増加させるのに十分なレベルの受容体を発現する。

一例では、非刺激ＭＬＰＳＣと比較して炎症刺激を介した活性化時にＮＦ－κＢのリン酸化を増加させる受容体は、ＴＮＦ－Ｒ１である。

したがって、一例では、本開示の組成物は、解凍後に高レベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現し、培養増殖する細胞を含む。したがって、本開示は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物を包含し、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で特定のレベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。例えば、培養増殖されたＭＬＰＳＣの集団は、培養条件下で約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現することができる。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２２０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２４５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。

別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２８０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約２９０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、約３００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、２００ｐｇ／ｍｌ～５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、２２０ｐｇ／ｍｌ～４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で、２２５ｐｇ／ｍｌ～４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。

同様に、一例では、培養増殖されたＭＬＰＳＣの集団は、培養条件下で約２３．５ｐｇ／１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１を発現することができる。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約２６．５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約２９ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約３０ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約３２ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約３３ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約３４ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約３５ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞当たり約２７ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１～１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約５９ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞当たり約２９ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１～１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約５３ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。別の例では、凍結保存された中間体から培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞は、培養条件下で１０^６個の細胞当たり約３２ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１～１０^６個の細胞ＴＮＦ－Ｒ１当たり約５３ｐｇのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。

一例では、培養条件下で、ＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために培養増殖された細胞の集団が選択される。例えば、上記参照レベルのＴＮＦ－Ｒ１の発現は、培養条件下で決定され得る。一例では、培養増殖された細胞の集団は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療に使用するために選択される。しかしながら、炎症性障害の様々な他の例が本明細書で論じられる。

一例では、本開示の組成物は、炎症性刺激に曝露されたときに、培養条件下で、ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、及びＰＧＥ２のうちの１つ以上の上昇したレベルを分泌するＭＬＰＳＣを含む。一例では、非刺激ＭＬＰＳＣに対してレベルが上昇する。一例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも１６，０００ｐｇ／ｍｌのＭＣＰ－１を分泌する。一例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも１８，０００ｐｇ／ｍｌのＭＣＰ－１を分泌する。別の例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも１，２００ｐｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを分泌する。別の例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも１，５００ｐｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを分泌する。一例では、炎症性刺激は、ＴＮＦ－αである。別の例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも３０，０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２を分泌する。別の例では、本開示のＭＬＰＳＣは、炎症性刺激に曝露されたとき、少なくとも４０，０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２を分泌する。一例では、炎症性刺激は、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－１βである。一例では、炎症性刺激は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βである。

別の例では、本開示の組成物は、ＩＬ－２Ｒα発現を阻害する細胞を含む。例えば、本開示の組成物は、培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含むことができ、ＭＬＰＳＣの集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、培養増殖されたＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも５８％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を少なくとも６０％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５５～７５％阻害する。別の例では、ＭＬＰＳＣは、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒα発現を５８～６５％阻害する。一例では、そのような細胞は、培養条件下で上記参照レベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現する。

一例では、本開示の組成物は、少なくとも５×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも１０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも１５×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも２０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも３０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも３５×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも４０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、少なくとも５０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、５×１０^６個の細胞～５０×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、１０×１０^６個の細胞～３５×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、２０×１０^６個の細胞～３０×１０^６個の細胞を含む。他の例では、組成物は、少なくとも１００×１０^６個の細胞を含む。別の例では、組成物は、５０×１０^６個の細胞～５００×１０^６個の細胞を含む。

一例では、本開示の組成物は、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む。「担体」及び「賦形剤」という用語は、活性化合物の貯蔵、投与、及び／又は生物学的活性を促進するために、当該技術分野で従来使用される物質の組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）を参照。担体はまた、活性化合物の任意の望ましくない副作用を低減し得る。好適な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応することができない。一例では、担体は、治療のために使用される投与量及び濃度で、レシピエントに有意な局所的又は全身的な有害作用をもたらさない。

本開示に好適な担体としては、従来使用されているもの、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、ラクトース、リンガー溶液、緩衝溶液、ヒアルロナン及びグリコールが挙げられ、特に（等張の場合に）溶液用の例示的な液体担体である。好適な薬学的担体及び賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

別の例では、担体は、例えば、細胞が増殖又は懸濁される培地組成物である。そのような培地組成物は、それが投与される対象にいかなる有害作用も誘導しない。例示的な担体及び賦形剤は、細胞の生存率及び／又は疾患を治療若しくは予防する細胞の能力に悪影響を及ぼさない。

一例では、担体又は賦形剤は、細胞及び／又は可溶性因子を好適なｐＨに維持し、それによって生物学的活性を発揮する緩衝活性を提供し、例えば、担体又は賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、細胞及び因子と最小限に相互作用し、細胞及び因子の急速な放出を可能にするため、魅力的な担体又は賦形剤を表し、このような場合、本開示の組成物は、血流に直接適用するための液体として、又は例えば、注射によって、組織の周囲又は隣接する組織又は領域に直接適用するための液体として産生され得る。

本開示の組成物は、凍結保存され得る。間葉系統前駆体又は幹細胞の凍結保存は、当該技術分野で既知の低速冷却方法又は「高速」凍結プロトコルを使用して行われ得る。好ましくは、凍結保存の方法は、凍結していない細胞と比較して、凍結保存された細胞の類似の表現型、細胞表面マーカー及び増殖速度を維持する。

凍結保存された組成物は、凍結保存溶液を含み得る。凍結保存溶液のｐＨは、典型的には６．５～８、好ましくは７．４である。

凍結保存溶液は、例えば、プラズマライトＡＴＭなどの滅菌された非発熱性等張溶液を含み得る。１００ｍＬのプラズマライトＡＴＭは、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ））、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）、及び３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有する。抗菌剤は含有されない。ｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。ｐＨは、７．４（６．５～８．０）である。

凍結保存溶液は、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（商標）を含み得る。凍結保存溶液は、追加的又は代替的に、培養培地、例えば、αＭＥＭを含み得る。

凍結を容易にするために、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保護剤を通常、凍結保存溶液に添加する。理想的には、凍結保護剤は、細胞及び患者に対して無毒、非抗原性、化学的に不活性であるべきであり、解凍後に高い生存率を提供し、洗浄することなく移植を可能にするべきである。しかしながら、最も一般的に使用される凍結保護剤、ＤＭＳＯは、ある程度の細胞毒性を示す。ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）は、凍結保存溶液の細胞毒性を低減させるために、代替物として又はＤＭＳＯと組み合わせて使用され得る。

凍結保存溶液は、ＤＭＳＯ、ヒドロキシエチルデンプン、ヒト血清成分、及び他のタンパク質増量剤のうちの１つ以上を含み得る。一例では、凍結保存溶液は、プラズマライトＡ（７０％）、ＤＭＳＯ（１０％）、ＨＳＡ（２５％）溶液を含み、ＨＳＡ溶液は、５％ＨＳＡ及び１５％緩衝液を含む。

一例では、凍結保存溶液は、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及びトレハロースのうちの１つ以上を更に含み得る。

凍結保存された組成物は、解凍され、対象に直接投与され得、又は例えば、ヒアルロン酸を含む別の溶液に添加され得る。代替的に、凍結保存された組成物を解凍し、投与前に間葉系統前駆体又は幹細胞を代替的担体中に再懸濁され得る。

本明細書に開示される組成物は、単独で、又は他の細胞との混合物として投与され得る。異なるタイプの細胞を、投与の直前又はすぐ前に本開示の組成物と混合してもよく、又は投与の前に一定期間共培養してもよい。

一例では、組成物は、有効量若しくは治療上若しくは予防上有効量の間葉系統前駆体若しくは幹細胞及び／又はその子孫及び／又はそれに由来する可溶性因子を含む。例えば、組成物は、約１×１０^５個の幹細胞～約１×１０^９個の幹細胞、又は約１．２５×１０^３個の幹細胞～約１．２５×１０^７個の幹細胞／ｋｇ（８０ｋｇ対象）を含む。投与される細胞の正確な量は、対象の年齢、体重及び性別、並びに治療される障害の程度及び重症度を含む様々な因子に依存する。

組成物中に提供される細胞数にもかかわらず、一例では、５０×１０^６～２００×１０^７個の細胞が投与される。他の例では、６０×１０^６～２００×１０^６個の細胞又は７５×１０^６～１５０×１０^６個の細胞が投与される。一例では、７５×１０^６個の細胞が投与される。別の例では、１５０×１０^６個の細胞が投与される。

一例では、組成物は、５．００×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む。別の例では、組成物は、５．５０×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む。別の例では、組成物は、６．００×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む。別の例では、組成物は、６．５０×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む。別の例では、組成物は、６．６８×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％を含む。

一例では、本明細書に記載の組成物は、単回用量として投与され得る。別の例では、細胞組成物は、複数回用量にわたって投与される。例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回の用量である。例えば、用量は、週に２回投与され得る。

一例では、組成物は、所望の目的のために書かれた説明書、例えば、特定の濃度を提供するために組成物を細胞培養培地と混合することとともに、好適な容器に任意に包装され得る。

一例では、組成物は、バイオリアクター中で提供される。

本開示の組成物は、例えば、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与によって、全身投与され得る。他の例では、組成物は、鼻腔内、筋肉内、又は心腔内投与によって投与され得る。他の例では、本開示の組成物は、対象の気道に投与され得る。例えば、組成物は、対象の肺に投与され得る。別の例では、組成物は、静脈内投与され、対象の気道に投与される。

受容体発現量の決定
細胞から発現される受容体（例えば、ＴＮＦ－Ｒ１又はＩＬ－２Ｒα）のレベルは、当該技術分野で既知の様々なアッセイを介して決定することができる。例としては、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、競合アッセイ、放射免疫アッセイ、ラテラルフロー免疫アッセイ、フロースルー免疫アッセイ、電気化学発光アッセイ、ネフェロメトリックベースのアッセイ、濁度ベースのアッセイ、間葉系統又は前駆体細胞を培養するために使用される培養培地中のＴＧＦβ１の検出のための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ又はＢｉａｃｏｒｅ）が挙げられる。

好適なアッセイの１つの形態は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡである。この例では、そのようなアッセイは、例えばポリスチレン又はポリカーボネートマイクロウェル又はディップスティック、膜、又はガラス支持体（例えば、ガラススライド）などの固体マトリックス上にＴＮＦ－Ｒ１結合タンパク質を固定化することを伴う。指数増殖期の細胞からの細胞培養培地の試料などの試験試料を、次いで、ＴＮＦ－Ｒ１結合タンパク質と直接接触させ、試料中のＴＮＦ－Ｒ１を結合又は捕捉する。試料中の任意の非結合タンパク質を除去するために洗浄した後、異なるエピトープでＴＮＦ－Ｒ１に結合するタンパク質を、捕捉されたＴＮＦ－Ｒ１と直接接触させる。この検出器タンパク質は、一般に、ＥＬＩＳＡの場合には酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、若しくはβ－ガラクトシダーゼ）、又はＦＬＩＳＡの場合にはフルオロフォアなどの検出可能なレポーター分子で標識される。代替的に、検出器タンパク質に結合する第２の標識タンパク質を使用することができる。任意の非結合タンパク質を除去するために洗浄した後、検出可能なレポーター分子は、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、又はトルイジン、又は５－ブロモ－４－クロロ－３－インドール－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ｘ－ｇａｌ）などのＥＬＩＳＡの場合、基質の添加によって検出される。固定化（捕捉）タンパク質及び検出器タンパク質は、反対の方法で使用され得る。

次いで、試料中の抗原のレベルは、既知の量のマーカーを使用して、又は対照試料との比較によって産生された標準曲線を使用して決定される。一例では、抗原のレベルは、分析された試料中の細胞数と比較される。例えば、抗原のレベルは、１０^６個の細胞に対して提示され得る。

上記のアッセイは、検出の基礎として化学発光又は電気化学発光を使用するように容易に修飾される。上記のアッセイはまた、ＩＬ－２Ｒαなどの他のマーカーのレベルを決定するために容易に修飾される。

当業者に明らかであろうように、免疫吸着アッセイに基づく他の検出方法は、本開示の実施に有用である。例えば、検出のための放射標識、又は検出のための金標識（例えば、コロイド金）、又はリポソーム、例えば、検出のためのＮＡＤ＋を封入するか、又はアクリジニウム結合免疫吸着アッセイを使用する、上記の説明に基づく免疫吸着方法。

本開示のいくつかの例では、ＴＧＦβ１のレベルは、表面プラズモン共鳴検出器（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、フロースルーデバイス（例えば、米国特許第７２０５１５９号に記載されている）、マイクロ又はナノ免疫アッセイデバイス（例えば、米国特許第７２７１００７号に記載されている）、ラテラルフローデバイス（例えば、米国公開第２００４／０２２８７６１号又は米国公開第２００４／０２６５９２６号に記載されている）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ、例えば、米国特許第４５９３０８９号又は米国特許第４７５１１９０号に記載されている）、又は免疫濁度アッセイ（例えば、米国特許第５５７１７２８号又は米国特許第６２４８５９７号に記載されている）を使用して決定される。

効力アッセイ
一例では、本開示は、間葉系統前駆体又は幹細胞の治療有効性を決定するための方法を包含し、
（ｉ）間葉系統前駆体又は幹細胞を含む集団を得ることと、
（ｉｉ）細胞を培養培地中で培養することと、
（ｉｉｉ）培養条件下で、細胞によって培養培地中に発現されるＴＮＦ－Ｒ１の量を決定することと、を含む。

一例では、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌ［２３．５ｐｇ／１０^６個の細胞］のＴＮＦ－Ｒ１の量は、治療有効性を示す。一例では、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌ［２６．５ｐｇ／１０^６個の細胞］のＴＮＦ－Ｒ１の量は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２３０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２８０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約２９０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、少なくとも約３００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、２００ｐｇ／ｍｌ～５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、２２０ｐｇ／ｍｌ～４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、２２５ｐｇ／ｍｌ～４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、ｐｇ／１０^６個の細胞中のＴＮＦ－Ｒ１の対応する量は、治療有効性を示す。別の例では、２３０ｐｇ／ｍｌ～４５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１は、治療有効性を示す。別の例では、ｐｇ／１０^６個の細胞中のＴＮＦ－Ｒ１の対応する量は、治療有効性を示す。

別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約５５％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約５８％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約６０％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の５５％～７５％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の５８％～６５％の阻害は、治療有効性を示す。

一例では、本開示は、間葉系統前駆体又は幹細胞の治療有効性を決定するための方法を包含し、
（ｉ）間葉系統前駆体又は幹細胞を含む集団を得ることと、
（ｉｉ）細胞を培養培地中で培養することと、
（ｉｉｉ）培養条件下での細胞によるＩＬ－２Ｒα阻害の量を決定することと、を含む。一例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約５５％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約５８％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の少なくとも約６０％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の５５％～７５％の阻害は、治療有効性を示す。別の例では、ＩＬ－２Ｒα発現の５８％～６５％の阻害は、治療有効性を示す。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞の集団は、３Ｄ細胞培養物から得られる。例えば、集団は、バイオリアクターから得ることができる。

一例では、間葉系統前駆体又は幹細胞の集団は、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物からの３Ｄ細胞培養物中で培養増殖されている。一例では、細胞が凍結保存される前に、ＴＮＦ－Ｒ１のレベルが決定される。

治療
一例では、本開示は、炎症性疾患を有する対象を治療する方法を包含する。一例では、炎症性疾患は、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患である。

一例では、炎症性疾患は、移植片対宿主疾患である。「移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）」は、同種異系骨髄又は幹細胞移植の成功及び可用性を制限する主要な要因である免疫学的障害である。ＧｖＨＤは、急性（ａＧｖＨＤ）又は慢性（ｃＧｖＨＤ）形態で発生する。急性ＧｖＨＤは、通常、骨髄又は幹細胞移植後１００日以内に発現する。慢性ＧｖＨＤは一般的にａＧｖＨＤ（移植後１００日超）より後に発現し、自己免疫疾患のいくつかの特徴を有する。これは、ａＧｖＨＤの回復後に続いて新たに、又はａＧｖＨＤの延長でのいずれかで発症し得る。慢性ＧｖＨＤは、広範囲の皮膚発疹、痛みを伴う口内潰瘍、息切れ、並びに四肢及び関節痛を含む、複数の、しばしば衰弱させる症状を引き起こす可能性がある。一例では、ｃＧｖＨＤ患者は、ＣＤ５＋Ｂ細胞の再構築が損なわれている。一例では、ｃＧｖＨＤは、ステロイド療法に難治性である。一例では、ｃＧｖＨＤは、生物学的療法に難治性である。一例では、ｃＧｖＨＤは、ステロイド療法及び生物学的療法に難治性である。

例では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。一例では、炎症性疾患は、クローン病である。一例では、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎である。一例では、本開示の組成物は、腸内の炎症を制限するために投与される。

一例では、炎症性疾患は、高炎症である。一例では、高炎症は、ウイルス感染によって引き起こされる。ウイルス感染は、例えば、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）又はコロナウイルスによって引き起こされ得る。一例では、高炎症は、コロナウイルス感染によって引き起こされる。コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＣＯＶＩＤ－１９、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、又はＫＨＵ１であり得る。一例では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＣＯＶＩＤ－１９である。一例では、対象はまた、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する。一例では、高炎症は、サイトカインストームによって引き起こされる。

一例では、炎症性疾患は、関節炎である。一例では、関節炎は、変形性関節症又は関節リウマチである。一例では、本開示の組成物は、骨の炎症を低減させるために投与される。

別の例では、炎症性疾患は、糖尿病又は異常な創傷治癒、心臓発作の症状、脳卒中の症状、末梢血管疾患の症状、切断、腎疾患の症状、腎不全、失明、神経障害、腎症、網膜症、炎症、インポテンス若しくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される糖尿病の関連状態若しくは症状である。

別の例では、炎症性疾患は、糖尿病性網膜症である。

本開示によって治療される炎症性疾患の他の例としては、掻痒、皮膚炎、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、糖尿病性腎症、喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝損傷、炎症性糸球体損傷、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン症候群が挙げられる。

一例では、本開示の方法は、合計６億個の細胞を投与することを包含する。例えば、本開示に従って治療された対象は、細胞の総用量が６億個の細胞を超えない限り、上記の参照組成物の複数回投与を受けることができる。例えば、対象は、２億個の細胞の３回投与を受け得る。一例では、細胞の総用量は、５億個の細胞である。一例では、細胞の総用量は、４億個の細胞である。例えば、対象は、１億個の細胞の４回投与を受け得る。一例では、対象は、ベースライン時に１億個の細胞の１回用量を受け、続いて３ヶ月にわたって１ヶ月に１回投与される１億個の細胞の３回用量を受ける。

一例では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一例では、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、過敏性結腸症候群、クローン大腸炎又はクローン病（ＣＤ）である。

広く記載される本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、本発明に多数の変形及び／又は修正が行われ得ることが、当業者によって理解されるであろう。したがって、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。

本明細書で論じられ、かつ／又は参照される全ての刊行物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

本出願は、２０２０年８月１０日に出願されたＡＵ２０２０／９０２８２７からの優先権を主張し、それらの開示は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などの任意の議論は、単に本発明のための文脈を提供することを目的とする。これらの事項のいずれか又は全てが、本出願の各特許請求の範囲の優先日より前に存在していたように、先行技術の基礎の一部を形成するか、又は本発明に関連する分野で共通の一般的な知識であったことを認めるものではない。

実施例１：培養増殖された間葉系前駆体細胞（ＭＳＣ）の抗炎症効果
培養増殖されたＭＳＣを、ＴＮＦ－Ｒ１を標的とするｓｉＲＮＡ（５、１０、２０、１００又は５００ｐＭ）で４時間トランスフェクトした。培地をリフレッシュし、細胞を７２時間培養した。細胞を溶解し、ＴＮＦ－Ｒ１レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。試料を３回ずつアッセイした。非標的化ｓｉＲＮＡ対照でのトランスフェクションと比較して、ＴＮＦ－Ｒ１を標的化するｓｉＲＮＡでのＭＳＣのトランスフェクションは、３０％（２０ｐＭのｓｉＲＮＡ）、３５％（１００ｐＭ）及び７０％（５００ｐＭ）のＴＮＦ－Ｒ１発現の低減をもたらした（図１）。

培養増殖されたＭＳＣを、ＴＮＦ－Ｒ１を標的とするｓｉＲＮＡ（５、１０、２０、１００、又は５００ｐＭ）で再度トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間刺激し、次いで溶解した。ＭＳＣ溶解物中の総ＮＦ－ｋＢ及びリン酸化ＮＦ－ｋＢのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ＭＳＣ中のＴＮＦ－Ｒ１の発現におけるｓｉＲＮＡ媒介性低減は、ＮＦ－ｋＢのリン酸化（ｓｅｒ－５３６）形態のレベルの用量依存的低減をもたらした（図１）。重要なことに、これらのデータは、ＭＳＣによって発現されるＴＮＦ－Ｒ１のレベルの比較的小さい低減が、ＴＮＦ－αの最大刺激に対する細胞の応答に影響を及ぼし、その結果、ＮＦ－ｋＢのリン酸化が著しく損なわれることを実証した。

ＴＮＦ－αが自己調節及びＴＮＦ－α産生の阻害が可能な培養増殖されたＭＳＣによる抗炎症性メディエーターの産生を誘導するかどうかを調べるために、ＴＮＦ－αへの曝露に応答してＭＳＣにおいて発現が刺激され、ＭＳＣの免疫調節効果に関与していると報告されている遺伝子産物を評価した。これらの遺伝子産物には、ＭＣＰ－１／ＣＣＬ２、Ｍ－ＣＳＦ ＰＧＥ２が含まれ、これらは全て正準ＮＦ－ｋＢ経路を介して活性化された。

ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ及びＰＧＥ２の測定のために、ＭＳＣを、２４ウェル培養プレート中の血清補充培地に播種し、一晩付着させた。培地をリフレッシュし、ＴＮＦαの存在下又は非存在下で、細胞を７２時間インキュベートした（１０ｎｇ／ｍｌ）。培養期間の終了時に、ＥＬＩＳＡによる分析のために条件培地を回収した。

図１は、ＮＦ－ｋＢのリン酸化の低減が、条件化培地中で分泌されるＣＣＬ２及びＭ－ＣＳＦのレベルの対応する低減によって正確に反映されることを示す（図１）。図２に示されるように、ＴＮＦ－αは、用量依存的な方法で、ＭＳＣを誘導して、徐々により高いレベルのＭＣＰ－１／ＣＣＬ２、Ｍ－ＣＳＦ及びＰＧＥ２を分泌した。ＭＣＰ－１及びＭ－ＣＳＦは、細胞外で分泌され、単球／マクロファージ上のそれぞれの受容体に結合し、ＴＮＦ－α産生の低減及び抗炎症サイトカインＩＬ－１０の産生の増加に関連する分解Ｍ２表現型へのＭ１マクロファージの分極に寄与する。実際、図３に示されるように、ＭＣＰ－１／ＣＣＬ２の抗体媒介阻害は、ＭＳＣ及びＴＮＦ－αとの共培養におけるＣＤ１４＋単球によるＩＬ－１０の分泌を著しく損なう。

一緒に、これらのデータは、培養増殖されたＭＳＣが、ＰＧＥ２などのＴ細胞に直接作用する可溶性因子の分泌、又はＭＣＰ－１若しくはＭ－ＣＳＦなどの間接的に作用する可溶性因子の分泌に起因する抗炎症作用を媒介し、Ｍ１～Ｍ２マクロファージ分極化及びＩＬ－１０分泌を誘導することを確認する。

ＭＳＣは、様々な炎症促進性サイトカインのための受容体を発現し（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２８４：１４３－１４７）、機能性細胞表面受容体が、特に、移植片対宿主疾患又はサイトカインストームなどの様々な炎症性設定で観察されるようなＴＮＦαなどの高レベルの炎症性サイトカインに応答して、培養増殖されたＭＳＣのその環境への免疫調節応答を促進し得ることを示唆する。上記の知見は、ＴＮＦαに応答するＭＳＣの免疫調節効果は、ＴＮＦ－Ｒ１活性化、ＮＦ－ｋＢ核転座、及び効果がマクロファージＭ２分極及びＴ細胞阻害の両方を協調してもたらす複数のパラクリン因子の転写を介して生じることを示唆する。これらのデータは、ＴＮＦ－Ｒ１などのＮＦ－ｋＢ活性化を媒介する高レベルの受容体を発現するＭＳＣが、炎症性の設定に応答して、改善されたマクロファージＭ２分極と、複数のパラクリン因子のＮＦ－ｋＢ媒介転写を介したＴ細胞阻害の両方を指示する能力が増加しているため、炎症性障害の治療に有利であることを示唆する。

実施例２：効力アッセイ
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）上のＴＮＦ－Ｒ１の表面発現を、ステロイド難治性（ＳＲ）移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）患者における３つの臨床試験（試験２７５、２８０、００１／００２、表１）の後に調査した。ＭＳＣ上のＴＮＦ－Ｒ１の表面発現は、ＴＮＦ－Ｒ１の高レベルで観察される変動性が少ないＩＬ２－Ｒα発現の阻害（図示せず）によって測定されるＴ細胞増殖を阻害するＭＳＣの能力と密接に関連していた（図４）。更に、ＴＮＦ－Ｒ１レベルの増加とＩＬ２－Ｒαの阻害の増加との間に有意な相関が観察された。
ＴＮＦ－Ｒ１＞１００ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．１３、ｐ＜０．０００１
ＴＮＦ－Ｒ１＞１９０ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．２０、ｐ＜０．０００１
ＴＮＦ－Ｒ１＞２００ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．２２、ｐ＜０．０００１
ＴＮＦ－Ｒ１＞２１０ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．２１、ｐ＜０．０００１
ＴＮＦ－Ｒ１＞２２０ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．１７、ｐ＜０．０００１
ＴＮＦ－Ｒ１＞２５０ｐｇ／ｍｌ、ｒ^２＝０．１３、ｐ＜０．０００１

ＩＬ２－Ｒα阻害との最も強い相関を検出するための最適なＴＮＦ－Ｒ１閾値は、２００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルであるように思われた。上記の知見は、ＴＮＦ－Ｒ１閾値を設定する論理的根拠を支持しており、Ｔ細胞の活性化／増殖を阻害するパラクリン因子の分泌を最もよく予測するレベルを示唆している。

これらのデータに基づいて、目的は、２つの提案された効力アッセイ１）ＴＮＦ－Ｒ１、及び２）ＩＬ－２Ｒαを検証することであった。効力検証のゴールドスタンダードは、臨床転帰との関係を決定することである。

提案された効力アッセイは、研究２６５、２７５、２８０、００１／００２と呼ばれるランダム化、対照、オープンラベル試験（表１）を介して間葉系幹細胞療法を受けた急性ＧＶＨＤ患者の全生存期間と比較して評価された。

驚くべきことに、１００日目の全生存期間のロジスティック回帰結果は、ＴＮＦ－Ｒ１について有意であった（ｐ＝０．００２、１．０１１（１．００４、１．０１９）、ポイント推定（９５％ＣＩ）、図５）。したがって、ＴＮＦ－Ｒ１は、１００日目の全生存期間との相関に基づいて検証される効力アッセイであるように思われる。これらのデータは、閾値レベルのＴＮＦ－Ｒ１発現、特に培養条件下で２００ｐｇ／ｍｌ超のＴＮＦ－Ｒ１、より好ましくは２２５ｐｇ／ｍｌ超のＴＮＦ－Ｒ１を有するＧｖＨＤの治療のための改善された組成物のための健全な基礎を提供する。

ＩＬ２－Ｒα発現レベル６０％超のＭＳＣを受けたＧｖＨＤ患者においても、有意に改善された生存率が観察された（図６）。更に、ＩＬ－２Ｒα阻害は、免疫活性化のインビボ低減と相関していた（図７）。図７は、ＧｖＨＤ患者において、ＩＬ２－Ｒα阻害のインビトロ測定と、ＭＳＣによる治療の２８日後の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの低減との間に相関があることを示す。観察された逆関係は、スピアマン又はホーフィング係数測定のいずれかを使用して有意である。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞レベルの変化は、応答状態にかかわらず、全ての特許で見られ、ＩＬ２－Ｒα阻害も、ＭＳＣ生物活性のインビボ測定において一貫していることを示す。

実施例３：改善された製造方法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、ＭＳＣの凍結保存された中間集団から解凍し、培養物中で確立した後、細胞工場で培養増殖させ、次いで細胞取り扱いを低減する合理化された製造プロセスを使用してバイオリアクターを培養増殖させた。細胞工場のＣＯ_２プライミングなしで細胞を培養増殖させ、継代３の後にｃｙｔｏｍａｔｅを培養プロセスから排除した。培養プロセスからＣＯ_２プライミングを除去することは、細胞工場の取り扱いを低減させ、継代３からのｃｙｔｏｍａｔｅの排除は、経路ステップを完了するために、細胞の滅菌洗浄をより少なく必要とした。更に、細胞を、継代したときにトリプシンと少なくとも１５分間接触させ、培養容器の取り扱いを最小限に抑えた。

ＴＮＦ－Ｒ１発現は、典型的には、細胞の凍結保存後に有意に減少する。しかしながら、細胞の取り扱いが低減した改善された製造プロセスを介して凍結保存された中間体から培養増殖されたＭＳＣのＴＮＦ－Ｒ１発現分析は、驚くべきことに、細胞が高レベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現したことを明らかにした。図５に示されるように、細胞は、以前に産生された細胞（３３３ｐｇ／ｍｌ対２１８ｐｇ／ｍｌ）よりも高いレベルを発現する。

次に、生存と、以前の技術（「オリジナルの製造プロセス」）を使用して培養増殖された細胞で作られた製品を患者が受けたかどうか、又は上述のように改善された製造プロセスとの間に関係があるかどうかを直接調べるために、臨床データを調べた。下の表２に示されるように、改善された製造プロセスを介して産生されたＭＳＣは、有意に高レベルのＴＮＦ－Ｒ１を発現し、ＩＬ２－Ｒα阻害を有意に増加させた。更に、これらのＭＳＣを投与された患者は、２８日間の全奏効（ＯＲ）が上昇し、１００日間の全奏効（ＯＳ）の見込みが有意に高かった。
表２：改善された製造プロセスを使用して産生されたＭＳＣで治療された患者におけるＴＮＦ－Ｒ１、ＩＬ２－Ｒα阻害及び１００日目生存率の高いレベル。

実施例１及び２からの上記の所見と併せて、本発明者らは、改善された治療有効性を有するＭＬＰＳＣの集団、特に少なくとも２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは２２５ｐｇ／ｍｌを発現するＭＬＰＳＣを同定し、そのような細胞、特に３３１ｐｇ／ｍｌを超えるＴＮＦ－Ｒ１のレベルを発現するＭＬＰＳＣを産生する方法を提供した。

Claims (36)

1. 培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物であって、前記ＭＬＰＳＣの集団が、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、前記培養増殖されたＭＬＰＳＣが、炎症刺激を介して活性化すると、ＮＦ－κＢをリン酸化する受容体を発現し、前記ＭＬＰＳＣが、前記炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも３．５倍高く増加させるのに十分なレベルの前記受容体を発現する、組成物。
2. 前記ＭＬＰＳＣが、前記炎症刺激を介して活性化するとＮＦ－κＢのリン酸化を非刺激ＭＬＰＳＣに比べて少なくとも４倍高く増加させるのに十分なレベルの前記受容体を発現する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記受容体が、ＴＮＦ－Ｒ１又はＩＬ－１Ｒの１つ又は両方である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記炎症刺激を介した前記ＭＬＰＳＣの活性化が、培養条件下でのＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、及びＰＧＥ２のうちの１つ以上の分泌を増加させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記炎症刺激を介した前記ＭＬＰＳＣの活性化が、培養条件下で、以下：
   －１８，０００ｐｇ／ｍｌのＭＣＰ－１、
   －１，５００ｐｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、
   －４０，０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２、のうちの１つ以上の分泌をもたらす、請求項４に記載の組成物。
6. 炎症刺激を介して活性化すると、ＮＦ－κＢをリン酸化する前記受容体は、ＴＮＦ－Ｒ１であり、前記ＭＬＰＳＣが、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記組成物が、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記ＮＦ－κＢのリン酸化が、前記細胞をＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－１βと接触させた後に決定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞（ＭＬＰＳＣ）の集団を含む組成物であって、前記ＭＬＰＳＣの集団が、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖され、前記培養増殖されたＭＬＰＳＣが、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、組成物。
10. 培養増殖された間葉系統前駆体又は幹細胞の集団を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも２５×１０^６個の細胞を含み、前記培養増殖された細胞の集団が、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の発現を決定することによって、炎症性疾患の治療に使用するために選択されている、組成物。
11. 前記培養増殖された細胞の集団が、培養条件下で、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、少なくとも約２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは少なくとも約２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記培養増殖された細胞の集団が、培養条件下で、少なくとも約３００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは少なくとも約３５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記培養増殖された細胞の集団が、３Ｄ培養物中で培養増殖される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記炎症性疾患が、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 凍結保存剤を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記ＭＬＰＳＣが、培養条件下で、ＩＬ－２Ｒαを少なくとも５５％阻害する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 間葉系統前駆体又は幹細胞の治療有効性を決定するための方法であって、
    （ｉ）間葉系統前駆体又は幹細胞を含む集団を得ることと、
    （ｉｉ）前記細胞を培養培地中で培養することと、
    （ｉｉｉ）培養条件下で、前記細胞によって前記培養培地中に発現されるＴＮＦ－Ｒ１の量を決定することであって、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１の量が、治療有効性を示す、決定することと、を含む、方法。
18. 少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１が、治療有効性を示す、請求項１０に記載の方法。
19. 少なくとも約２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１が、治療有効性を示す、請求項１１に記載の方法。
20. 間葉系統前駆体又は幹細胞の前記集団が、３Ｄ細胞培養物から得られる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 間葉系統前駆体又は幹細胞の前記集団が、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物からの３Ｄ細胞培養物中で培養増殖されている、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 炎症性疾患を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、間葉系統前駆体又は幹細胞の組成物を投与することを含み、前記細胞が、培養条件下で、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、方法。
23. 前記細胞が、培養条件下で、少なくとも約２２５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、少なくとも約２６０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは少なくとも約２７０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは少なくとも約３００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１、好ましくは少なくとも約３５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ－Ｒ１を発現する、請求項１５に記載の方法。
24. 前記炎症性疾患が、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患である、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 前記炎症性疾患が、ＧｖＨＤである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ＧｖＨＤが、慢性ＧｖＨＤである、請求項２５に記載の方法。
27. 治療された対象が、１００日生存率を改善している、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記対象が、ステロイド免疫抑制剤及び／又は生物学的療法に難治性である、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記対象が、少なくとも２回の用量の前記組成物を受ける、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記間葉系前駆体系統又は幹細胞が、凍結保存された中間体ＭＬＰＳＣ調製物から培養増殖される、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記間葉系前駆体系統又は幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記組成物が、プラズマライトＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記組成物が、プラズマライトＡ（７０％）、ＤＭＳＯ（１０％）、ＨＳＡ（２５％）溶液を更に含み、前記ＨＳＡ溶液が、５％ＨＳＡ及び１５％緩衝液を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記組成物が、６．６８×１０^６個超の生存細胞／ｍＬを含む、請求項１～１６若しくは３１～３３のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
35. 各用量が、対象の少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重を含む、請求項２９に記載の方法。
36. 前記対象が、週に２回投与を受ける、請求項２９又は３５に記載の方法。