JP5764598B2 - 幹細胞を培養するための方法及びキット - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞を培養するための方法に関し、特には幹細胞の培養におけるフタリドの使用に関する；本発明はまた、幹細胞を培養するためのキットに関し、該キットはフタリドを含有する。

医療技術はこれまで、糖尿病、重症貧血、卒中、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、及びパーキンソン病といった多くの疾患に対する効果的な治療法においていまだ不十分である。幹細胞の多能性は、これらの疾患に苦しむ患者に一筋の光明をもたらす。

幹細胞は、自己複製能及び分化能に依存して、以下の４タイプに分類され得る：全能性幹細胞（totipotent stem cell）、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多能性幹細胞（multipotent stem cell）、及び単能性幹細胞（unipotent stem cell）である。発生プロセスの間の外観の状態及び幹細胞の分布プロファイルに依存して、幹細胞は、以下の２タイプに分類され得る：胚性幹細胞（embryonic stem cell）（ＥＳ細胞）及び成体幹細胞（adult stem cell）である。ＥＳ細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の両方は、典型的な幹細胞であり、それらは、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉を含む３つの胚葉に分化することができる。これらの幹細胞は、高い自己複製能を有し、優れた発生能を有する。

ＥＳ細胞は、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞又は卵子といった分化した細胞へと効率良く培養され得、細胞又は臓器の移植のために用いられ得る。他の観点において、ヒトＥＳ細胞のソース（例えば、不妊治療で得られた残りの胚、妊娠中絶により得られた胚期の始原生殖細胞、及び融合細胞）は、いまだ議論を呼んでいる。したがって、胚性幹細胞（embryonic stem cell）のそれらと似た性質及び機能を持つ細胞を作り（すなわち、人工多能性幹細胞を作り）、免疫拒絶なくこれらの細胞をうまくヒトの臓器に分化させるために、特定の遺伝子を（患者の皮膚から得られた）成熟繊維芽細胞に導入することで、細胞の再プログラム化を誘導する研究が行われてきた。

本明細書において用いられる多能性幹細胞（pluripotent stem cell）の用語は、不完全な分化の特性を有し、また増殖して及び異なる細胞タイプに分化して種々の成熟組織を形成する能力を有する幹細胞をいう。幹細胞の多能性は、疾患及び治療適用の研究に対して本質的なファクターであり、それゆえに、多能性を維持している間どのように肝細胞を培養するかについての研究が大きな話題となる。現在、多機能細胞因子（すなわち、白血病抑制因子（ＬＩＦ））を用いることが一般的であり、それは幹細胞の多能性を維持させることが１９６０年代後半に見出された。しかしながら、ＬＩＦは高価であるため、幹細胞を培養するコストが高くなる。加えて、ｉＰＳ細胞は臨床適用に対して優れた潜在力を有するにもかかわらず、その適用は、作製の非効率性に由来して限定されている。

上記の幹細胞を培養することについての観点において、幹細胞の適用性を高めるための幹細胞の効果的な培養方法がいまだに必要とされる。本発明者らは、フタリドが幹細胞の多能性を効果的に維持し得、それゆえ、それをＬＩＦの代替として用いて幹細胞の培養コストを低減させ得ることを見出した。本発明者らはまた、フタリドが作製の非効率性の問題を一部解決し得、それゆえ幹細胞の適用性を向上させ得ることを見出した。

本発明の目的は、
（Ａ）幹細胞の培地を提供することと、
（Ｂ）幹細胞の培地にフタリドを添加して、フタリド含有培地を提供することと、
（Ｃ）フタリド含有培地を用いて幹細胞を培養することと、
を含む、幹細胞を培養するための方法を提供することである。

本発明の他の目的は、幹細胞を培養することにおけるフタリドの使用を提供することである。

本発明のさらなる目的は、（１）幹細胞の培地；及び（２）フタリドを含む、幹細胞を培養するためのキットを提供することである。

詳細な技術及び本発明のために実施された好ましい実施態様は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図面とともに後述の段落において記載される。

培養後のＥＳ細胞の生存率を示す統計的な棒グラフの図である。 培養後のＥＳ細胞におけるＯｃｔ４及びＳｏｘ２の遺伝子発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のＥＳ細胞におけるアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の発現レベルを示す染色像（左）及び統計的な棒グラフ（右）の図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のｉＰＳ細胞におけるアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の発現レベルを示す染色像（左）及び統計的な棒グラフ（右）の図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇのタンパク質発現レベルを示す免疫染色像の図である。 培養後のＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇのタンパク質発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のＥＳ細胞におけるＳＳＥＡ１のタンパク質発現レベルを示す免疫染色像の図である。 培養後のＥＳ細胞におけるＳＳＥＡ１のタンパク質発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のｉＰＳ細胞におけるＮａｎｏｇのタンパク質発現レベルを示す免疫染色像の図である。 培養後のｉＰＳ細胞におけるＮａｎｏｇのタンパク質発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のｉＰＳ細胞におけるＳＳＥＡ１のタンパク質発現レベルを示す免疫染色像の図である。 培養後のｉＰＳ細胞におけるＳＳＥＡ１のタンパク質発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 フタリド含有培地で培養後のＥＳ細胞の３つの胚葉を示す免疫染色像の図である。 培養後のＥＳ細胞におけるＪａｋ２及びＳｔａｔ３遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のＥＳ細胞におけるリン酸化Ｊａｋ２及びリン酸化Ｓｔａｔ３の発現レベルを示すウェスタンブロット像（左）及び統計的な棒グラフ（右）の図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後のＥＳ細胞におけるＬＩＦ、ＥＧＦ、ＩＬ５、ＩＬ１１、ＥＰＯ及びＯＳＭ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後形成されたｉＰＳ細胞におけるＧＦＰ蛍光強度を示す統計的な棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．０５。：推計的有意性）。 培養後形成されたｉＰＳ細胞を示す免疫蛍光染色像の図である。 フタリド含有培地で培養後形成されたｉＰＳ細胞の３つの胚葉を示す免疫蛍光染色像の図である。

本発明のいくつかの実施態様が下記に詳細に開示される。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施態様において具体化され得、本明細書に記載される実施態様に限定されるべきではない。加えて、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に特許請求の範囲において）用いられる“一”、“該”又は同様の用語は、単数形式及び複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。

本発明は、幹細胞を培養するための方法を提供し、それは、幹細胞の培地にフタリドを添加することに特徴を有する。本発明は、以下の工程を含む：（Ａ）幹細胞の培地を提供する工程；（Ｂ）幹細胞の培地にフタリドを添加して、フタリド含有培地を提供する工程；及び（Ｃ）フタリド含有培地を用いて幹細胞を培養する工程である。

本発明の方法の工程（Ａ）で用いられる幹細胞の培地は、幹細胞の成長及び分化のために必須の栄養及びコンディション（例えば、ｐＨ）を含む培地をいう。幹細胞の培地の成分は、培養される幹細胞（すなわち、工程（Ｃ）における幹細胞）のタイプに依存して調節され得る。概して、幹細胞の培地は、ベース培養培地、動物の血清（例えば、ウシ胎児血清）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、及びＬ−グルタミン等を含む。本発明の方法に適するベース培地の例は、限定されることなく、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＭＥＭ（最小必須培地）、α−ＭＥＭ（α−最小必須培地）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、及びＲＰＭＩ（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を含む。本発明の方法の一実施態様において、ベース培地は、ＤＭＥＭである。

本発明者らは、幹細胞の培地へのフタリドの添加が、培養される幹細胞の多能性を維持し得、また幹細胞作製の非効率性の問題に取り組み得ることを見出した。したがって、本発明の方法の工程（Ｂ）において、フタリドが工程（Ａ）の幹細胞の培地に添加されて、フタリド含有培地が提供される。フタリドは、以下の化学式（Ｉ）を有する１又は２以上の化合物を含むことが好ましい：
Ｒ_１はそれぞれ独立して、水素原子、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_８のアルキル基、Ｃ_１−Ｃ_８のハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８のアルケニル基、フェニル基、ナフチル基、又はインドリル基であり、フェニル基、ナフチル基及びインドリル基は任意に、−ＯＨ、ハロゲン、アミノ基、及び／又はＣ_１−Ｃ_４のアルキル基により置換され、
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は独立して、水素原子、−ＯＨ、ハロゲン、シアノ基、アミン基、カルボキシル基、Ｃ_１−Ｃ_８のアルキル基、Ｃ_１−Ｃ_８のハロアルキル基、又はＣ_１−Ｃ_８のアルコキシ基であり、
ただし、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のすべてが水素原子ではない。

好ましくは、本発明の方法で用いられるフタリドは、限定されることなく、メチルフタリド、７−メチルフタリド、エチルフタリド、プロピリデンフタリド、ブチルフタリド、ｎ−ブチリデンフタリド、３−ブロモフタリド、５−ブロモフタリド、５−クロロフタリド、６−クロロフタリド、３，４−ジクロロフタリド、テトラクロロフタリド、３−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチルフタリド、３−メチル−３−（１−ナフチル）フタリド、３−（５−フルオロ−１−ナフチル）フタリド、４−アミノ−３−ヒドロキシフタリド、５−カルボキシフタリド、５−シアノフタリド、７−メトキシルフタリド、７−ヒドロキシ−６−メトキシフタリド、３−（１，２−ジメチル−３−インドリル）フタリド、及びフェノールフタレインからなる群より選択される１又は２以上の化合物を含む。

より好ましくは、本発明の方法で用いられるフタリドは、ｎ−ブチリデンフタリド、ブチルフタリド、テトラクロロフタリド、及びフェノールフタレインからなる群より選択される１又は２以上の化合物を含む。最も好ましくは、フタリドは、ｎ−ブチリデンフタリドである。Ｎ−ブチリデンフタリド（概して、“ＢＰ”又は“ｂｄｐｈ”と略される）は、中国医薬から精製及び単離され得、又は化学的合成方法により得られ得る。本発明の一実施態様において、ＢＰは、中国医薬であるトウキ（angelica sinensis）（通常、根が用いられる）から精製される。

本発明の方法の工程（Ｂ）において、フタリドは、幹細胞の培地に直接添加され、その後幹細胞の培地に溶解されて、フタリド含有培地を提供し得る。あるいは、フタリドをまず溶媒に溶解させてフタリド含有溶液を提供し、その後、フタリドの溶解を保証するために工程（Ａ）由来の幹細胞の培地とフタリド含有溶液を混合させて、フタリドの利用効率を向上させ得る。例えば、ＢＰを工程（Ｂ）のフタリドとして用いる場合、工程（Ｂ）は、（ｂ１）ＢＰを溶媒に溶解させ、フタリド含有溶液を作ること；及び（ｂ２）ＢＰ含有溶液を工程（Ａ）から得られた幹細胞の培地と混合させる（例えば、幹細胞の培地にフタリド含有溶液を添加する）ことを含み得る。工程（ｂ１）で用いられる溶媒は通常、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールといった極性溶媒である。

本発明の方法において、工程（Ｂ）で用いられるフタリドの量は、幹細胞の培地１ミリリットルにつき、１μｇから８０μｇの範囲、好ましくは５μｇから５０μｇの範囲、より好ましくは８μｇから１２μｇの範囲であってもよい。例えば、後に提供される実施例に記載されているように、ＥＳ細胞を培養するためにフタリドとしてＢＰが用いられる場合、幹細胞の培地１ミリリットルにつき、９μｇから１１μｇの範囲の量のＢＰが、ＥＳ細胞の多能性を効果的に維持し得る。一方、ｉＰＳ細胞を培養するためにＢＰが用いられる場合、幹細胞の培地１ミリリットルにつき、５μｇから１０μｇの範囲の量のＢＰが、ｉＰＳ細胞の多能性を効果的に維持し得、作製効率を向上させ得る。

本発明の方法の工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）から得られたフタリド含有幹細胞培地は、幹細胞を培養するために用いられる。原則として、本発明の方法は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉性幹細胞、脂肪幹細胞、造血性幹細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞といった、いかなる適切な幹細胞をも培養するように用いられ得る。本発明の方法のいくつかの実施態様において、工程（Ｃ）で培養される幹細胞は、以下の群より選択される：ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、及びこれらの組み合わせである。ＥＳ細胞は、胞胚期のマウスの胚から回収され得る。ｉＰＳ細胞は、マウスの胎児線維芽細胞に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫＩＦ４の４つの遺伝子をコトランスフェクションすることで提供され得る。

特に制限なく、培養された幹細胞のタイプに依存して、いかなる適切な培養条件をも工程（Ｃ）において選択され、使用され得る。概して、工程（Ｃ）は、３５℃から３９℃、３％から７％のＣＯ_２、及び９０％から９９％の湿度の条件下で、支持細胞の層上で幹細胞を培養することを含む。支持細胞は、幹細胞培養に用いられる通常のマテリアルであり、当業者に馴染みのあるものであるため、本明細書ではさらに説明されない。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、フタリドは、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ３シグナリング経路を活性化することにより、幹細胞（特にＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞）の多能性を維持して、生存率の低減を回避し、幹細胞、特にｉＰＳ細胞の作製効率を向上させると考えられる。

したがって、本発明はまた、幹細胞を培養することにおけるフタリドの使用に関する。フタリド及び幹細胞の特性及び特徴は、すべて前述の通りである。加えて、該使用の機能的経路及び適用されるモデルについても、前述の通りである。

本発明はさらに（１）幹細胞の培地、及び（２）フタリドを含む、幹細胞を培養するためのキットを提供する。幹細胞の培地及びフタリドを使用するための条件及び方法は、すべて前述の通りである。加えて、本発明のキットは、次に使用するフタリドを溶解させるように、極性溶媒といった溶媒を任意に含み得る。極性溶媒の例は、限定されることなく、ＤＭＳＯ及びエタノールを含む。

本発明のキットの成分（１）及び（２）は、分けて包装及び保存され、分けて又はセットで移送され、販売され得る。成分（１）は、計画された培養手順及びプロセスに従って、使用前に、顧客の設備で成分（２）と混合される。任意の成分を、成分（１）のための第一の容器、成分（２）のための第二の容器、及び／又は第三の容器に入れてもよい。例えば、フタリドのための極性溶媒を、成分（２）のための第二の容器、及び／又は第三の容器に入れてもよい。

本発明よれば、幹細胞の多能性を維持し、いくつかの幹細胞の作製効率を向上させ、幹細胞の培養手順を効果的に改善し、臨床薬剤の開発を改善するように、フタリドが高価なＬＩＦに代えて用いられた。

本発明はさらに、下記の通り特定の実施例により詳細に記述される。しかしながら、下記の実施例は本発明を記述するために単に提供されたものにすぎず、本発明の範囲はそれにより限定されない。

（実施例１）支持細胞の調製
初期のマウスの胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの１３．５日齢の胚から単離した。胚を、帝王切開により回収し、胚の頭部、足部、内部臓器、及び尾を除去した。残った胚の部分を鋭いはさみで切り刻み、細胞消化のためにトリプシンを含むチューブに入れた。あらかじめ温めたＭＥＦ培地［ＤＭＥＭ＋１０％加熱不活性化ＦＢＳ＋ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）＋ストレプトイマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）＋ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）］を加え、１時間、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中でＭＥＦ細胞を培養した。その後、ＭＥＦ細胞を、２時間、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で、あらかじめ温めた細胞培地［ＤＭＥＭ＋１５％加熱不活性化ＦＢＳ＋ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）］で培養ディッシュにおいて培養した。増殖を抑えるようにマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍＬ）で細胞を処理し、ＥＳ細胞の培養に必要な支持細胞を得た。

（実施例２）幹細胞の培養
実験Ａ．胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の培養（実施例群）
ＥＳ細胞を培養するために、以下の工程を実施した。
（１）幹細胞の培地を調製する（ＤＭＥＭ＋１５％加熱不活性化ＦＢＳ＋ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）＋β−メルカプトエタノール（０．２ｍＭ））。
（２）ＢＰ含有溶液を調製し（ＤＭＳＯにＢＰを溶解し、ＢＰ含有溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を作る）、−２０℃で該溶液を保存する。
（３）異なる量の工程（２）のＢＰ含有溶液を、工程（１）の幹細胞の培地に加え、異なるＢＰ含有培地を作る。各々幹細胞の培地１ミリリットルあたりＢＰの量は、５、１０、２０、又は４０μｇである（すなわち、実施例群の培地：ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、及びＢＰ４０）。
（４）工程（３）のＢＰ含有培地を用いて、ＥＳ細胞（胚胞期の１２９ｓｖ／Ｊマウスの胚から回収した）を、実施例１で得られた支持細胞上で、３７℃、５％ＣＯ_２、及び９５％の湿度で培養する。

実験Ｂ．人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の培養（実施例群）
実験Ａで示されたプロトコールを繰り返したが、工程（４）ではｉＰＳ細胞（理化学研究所（日本）より入手）を培養した。

実験Ｃ．ＥＳ細胞の培養（コントロール群）
ＥＳ細胞を培養するために、以下の工程を実施した。
（１）幹細胞の培地を調製する。
ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）：ＤＭＥＭ＋１５％加熱不活性化ＦＢＳ＋ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）＋β−メルカプトエタノール（０．２ｍＭ）＋ＬＩＦ（４ｎｇ／ｍＬ）；及び
コントロール培地（ＢＰ無し）：ＤＭＥＭ＋１５％加熱不活性化ＦＢＳ＋ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）＋β−メルカプトエタノール（０．２ｍＭ）；
（２）工程（１）の培地を用いて、ＥＳ細胞（胚胞期の１２９ｓｖ／Ｊマウスの胞胚期の胚から回収した）を、実施例１で得られた支持細胞上で、３７℃、５％ＣＯ_２、及び９５％の湿度で培養する。

実験Ｄ．ｉＰＳ細胞の培養（コントロール群）
実験Ｃで示されたプロトコールを繰り返したが、工程（２）ではｉＰＳ細胞（理化学研究所（日本）より入手）を培養した。

（実施例３）細胞生存率の評価（ＭＴＴアッセイ）
本実施例では、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いて、ＢＰをＬＩＦに代えて用いる場合に、幹細胞の生存率に影響を与えるかについて評価した。

ＭＴＴは、生細胞のミトコンドリア呼吸鎖において反応し得る水溶性のテトラゾリウム塩であり、ＭＴＴの構造で見られるテトラゾリウムブロミドが代謝及び還元されて、スクシネートデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）及びシトクロームｃ（ｃｙｔ ｃ）の反応下、水溶性で紫色の結晶性ホルマザンを形成する。形成される結晶の量は、生細胞の数に正比例する（ＳＤＨは死細胞から消え、ＭＴＴが還元され得ないからである）。さらに、ミトコンドリアは、環境に最も感受性の高い細胞における細胞小器官であり、そのため、ＭＴＴアッセイは、薬物により処理された細胞の生存率のマーカーとして役に立ち得る。

実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、及びＢＰ４０）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々９６ウェルのマイクロ培養プレートに加え、２４時間から７２時間、１ウェルにつき５×１０^３の初期濃度でＥＳ細胞を培養した。その後、１０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ（シグマ）を各ウェルに加え、細胞を２時間から４時間、３７℃及び５％ＣＯ_２で、インキュベーター中でインキュベートした。培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに加え、１０分間、３７℃で維持した。サンプルの吸光度を５７０ｎｍの波長で測定し、実施例群（ＢＰ有り）及びコントロール群（ＢＰ無し）のデータを得た。コントロール群の吸光度を参照とし、各実施例群の相対的な細胞生存率を算出した。結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１に示されるように、ＢＰのＥＳ細胞培地への添加は、幹細胞の生存率に影響を与えなかった。

（実施例４）幹細胞関連遺伝子の発現レベル
実験Ｉ．ＲＮＡの抽出
実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、及びＢＰ４０）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々加え、下記の工程を行った。ＥＳ細胞を、６ウェルの培養ディッシュにおいて１ウェルにつき１×１０^４の初期濃度で培養した。細胞が７０−８０％コンフルエンスに増殖するまで培地を除去し、その後各ウェルに１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を加えた。細胞を５分間インキュベートし、その後、スパチュラで剥がし、十分に溶解するように１．５ｍＬのマクロチューブに入れた。クロロホルム（０．２ｍＬ）をマイクロチューブに加えた。混合物を１５秒間、上下に振とうさせ、その後２−３分間室温でインキュベートした。その後、混合物を１５分間、４℃で、１２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を他の１．５ｍＬマイクロチューブに取り除き、イソプロパノール（０．５ｍＬ）をマイクロチューブに加えよく混合した。混合物を１０分間、室温でインキュベートし、その後１０分間、４℃で、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上清を取り除いた。ＤＥＰＣ・Ｈ_２Ｏを含有する１ｍＬの７０％エタノールを用いて、残りの沈殿物を洗った。沈殿物を、５分間、４℃で、７５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り除いた。沈殿物を、真空吸引により乾燥させた。乾燥させたサンプルを０．０１−０．０２ｍＬのＤＥＰＣ・Ｈ_２Ｏに溶解させ、実施例群ＲＮＡ及びコントロール群ＲＮＡを得た。両群とも、−８０℃で保存した。

実験ＩＩ．ｃＤＮＡの調製
上述の実験Ｉで得られた両群におけるＲＮＡサンプルのＯＤ値を、２６０ｎｍの波長で測定した（ＲＮＡ：ＯＤ２６０＝１で４０μｇ／ｍＬ溶液）。各ＲＮＡサンプル（２μＬ）に、サンプルの量が１０μＬに達するまで、ＲＮＡフリー水を加えた。２μＬのオリゴ（ｄＴ）（１００μｇ／ｍＬ）を各サンプルに加え、サンプルを５分間、６５℃でインキュベートした。その後、サンプルを即座に氷上に置き、スピンダウンした。次に、６．５μＬの反応溶液［４μＬの５×バッファー＋１μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ＋１μＬのＲＮａｓｅ ｏｕｔ＋０．５μＬのＳＳＩＩＩ（インビトロジェン）］をサンプルの各々に加え、サンプルを５０℃で３０−６０分間、７５℃で１５分インキュベートし、実施例群ｃＤＮＡ及びコントロール群ｃＤＮＡを得た。両群とも、−８０℃で保存した。

実験ＩＩＩ．リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ；Ｑ−ＰＣＲ）
本実験では、ＥＳ細胞関連遺伝子（すなわち、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２等）の発現レベルを検出した。最初に、４μＬの実施例群ｃＤＮＡ又はコントロール群ｃＤＮＡを９６ウェルのマイクロ反応プレートの各ウェルに加え、６μＬの反応溶液［０．５μＬの６μＭフォーワードプライマー＋０．５μＬの６μＭリバースプライマー＋５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ロシュ）］と混合させた（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘは、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び２×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ溶液といった、Ｑ−ＰＣＲに必要な試薬を含んでいた）。表２に示されるように、プライマーは、測定される遺伝子に従って選択された。混合物を良く混ぜ、スピンダウンし、リアルタイルＰＣＲ機器に置いた（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。反応を１０分間６０℃で行い、その後４０サイクル（９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間での反応）行った。Ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値（ＣＴ値）を測定した。結果を図２及び表３に示す。

図２及び表３に示されるように、ＢＰ含有ＥＳ細胞培養培地を含む実施例群におけるＯｃｔ４及びＳｏｘ２の遺伝子発現レベルは、コントロール群のそれらに比して、顕著にアップレギュレーションされた。ＢＰ１０を用いた群では、最も顕著な効果が得られた。

（実施例５）アルカリフォスファターゼ染色
アルカリフォスファターゼは、幹細胞のマーカータンパク質である。染色により測定される活性は、ＢＰが幹細胞の自己複製性及び多能性を効果的に維持し得るかについて評価するのに用いられ得る。

実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、及びＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、７２時間、１ウェルにつき１×１０^４の初期濃度で、６ウェルの培養ディッシュにおいてＥＳ細胞を培養した。培地を取り除き、細胞をＰＢＳで２回洗った。次に、ＰＢＳを取り除き、１ｍＬの８０％エタノールを各ウェルに加え、２時間から２４時間、４℃で固定を行った。次に、エタノールを取り除き、その後、細胞を蒸留水で１回洗った。蒸留水を再び加えて、細胞を２−３分間浸し、その後取り除いた。次に、細胞を５分間、室温で、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．２−８．５）に浸し、その後、バッファーを取り除いた。次に、白血球アルカリフォスファターゼキット（ベクター）を用いて、２０−３０分間染色を行い、その後、アルカリフォスファターゼの基質の使用溶液を取り除き、細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．２−８．５）に浸し、洗った。その後、蛍光顕微鏡で観察して、ＡＰ陽性クローンの数をカウントした。より高い活性を有する未分化のＥＳ細胞は、赤色を示し、一方、より低い活性を有する分化したＥＳ細胞は、薄い赤色を示し、さらには無色を示す。結果を図３及び表４に示す。

前述の培養条件を用いることで、実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、又はＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、ｉＰＳ細胞を培養した。その後、ｉＰＳ細胞の染色を、前述の工程により行った。より高い活性を有する未分化のｉＰＳ細胞は、赤色を示し、一方、より低い活性を有する分化したｉＰＳ細胞は、薄い赤色を示し、さらには無色を示す。結果を図４及び表４に示す。

図３、図４及び表４に示されるように、ＢＰ含有ＥＳ細胞培地を含む実施例群では、コントロール群の培地（ＢＰ無し）に比して、ＡＰ陽性クローンが多く、実施例群におけるＡＰ陽性クローンの数は、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）を用いた群のそれと同等であった。この結果から、ＢＰはたしかにＥＳ細胞及び／又はｉＰＳ細胞の自己複製性及び多能性を維持し得ることが示される。

（実施例６）免疫蛍光染色
Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ１もまた、幹細胞のマーカータンパク質であり、それらの発現レベルを免疫蛍光染色により評価することで、ＢＰが幹細胞の自己複製性及び多能性を効果的に維持し得るかをさらに確かめることができる。

実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、又はＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、６ウェル培養ディッシュ（各ウェルにスライドを備える）において、７２時間、１ウェルにつき１×１０^４の初期濃度でＥＳ細胞を培養した。培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗った。次に、ＰＢＳを取り除き、その後、４％パラホルムアルデヒドを加え、１０分間室温で固定を行った。次に、パラホルムアルデヒドを取り除き、その後スライドを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１×ＰＢＳで３回、各回１０分間洗った。０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０／１×ＰＢＳを加え、３０分間室温に保ち、染料が細胞膜に浸透して入り込むようにした。スライドを０．１Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗った後、５％ＦＢＳ／１×ＰＢＳを加え、２時間、室温でブロッキング反応を行い、その後、一晩、室温で、１：１００の希釈で一次抗体［ａｎｔｉ−Ｎａｎｏｇ（Ｎｏｖｕｓ）又はａｎｔｉ−ＳＳＥＡ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）］と反応させた。スライドをその後０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗い、その後、１：５００の希釈で二次抗体［ＦＩＴＣコンジュゲート−ａｎｔｉ−マウスＩｇＧ又はＴＲＩＴＣコンジュゲート−ａｎｔｉ−ウサギＩｇＧ（シグマ−アルドリッチ）］と反応させた。１０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗った後、スライドを、ＤＡＰＩ含有ＵｌｔｒａＣｒｕｚ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍに載せ、倒立蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を、図５Ａ−５Ｄ及び表５に示す。

前述の培養条件を用いることで、実施例群の培地（ＢＰ５、ＢＰ１０、ＢＰ２０、又はＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、ｉＰＳ細胞を培養した。ｉＰＳ細胞の染色を、前述の工程を用いることで行った。結果を、図６Ａ−６Ｄ及び表６に示す。

図５Ａ−５Ｄ、表５、図６Ａ−６Ｄ及び表６に示されるように、Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ１の発現レベルは、コントロール群（ＢＰ無し）に比して、ＢＰ含有ＥＳ細胞培地を含む実施例群においてより高く、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）を用いた群のそれと同等であった。前述の結果から、ＢＰはたしかにＥＳ細胞及び／又はｉＰＳ細胞の自己複製性及び多能性を維持し得ることが示される。

（実施例７）胚様体の形成及び分化
胚様体の形成及び分化もまた免疫蛍光染色により観察し、ＥＳ細胞の多能性の維持におけるＢＰの影響を検証した。

実施例群の培地（ＢＰ１０）を用いて、６ウェル培養ディッシュにおいて、１ウェルあたり１×１０^４の初期濃度でＥＳ細胞を培養した。ＥＳ細胞を３代継代し、胚様体形成培地［ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋βメルカプトエタノール（１ｍＭ）＋１％Ｌ−グルタミン＋１％ＮＥＡＡ］を含有するＵｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）においてさらに２−３日間インキュベートし、その後、胚様体形成を観察した。胚様体を、２４ウェル培養ディッシュに入れ（５−６胚様体／ウェル）、さらに３日間インキュベートした。次に、免疫蛍光染色を行い、ａｎｔｉ−Ｔｕｊ１抗体（外胚葉マーカー）、ａｎｔｉ−α−ＳＭＡ抗体（中胚葉）及びａｎｔｉ−Ｇａｔａ４抗体（内胚葉マーカー）で細胞を検出した。結果を図７に示す。

図７に示されるように、ＢＰのＥＳ細胞培地への添加により、ＥＳ細胞が胚様体を形成し、さらに、外胚葉、中胚葉及び内胚葉を含むすべての３つの胚葉に分化し得た。ＢＰはたしかに、幹細胞の多能性を維持し得ることが明白であった。

（実施例８）幹細胞のシグナリング経路
実験Ａ．ＤＮＡマイクロアレイ分析
ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、細胞がＢＰ含有培地により培養された場合に、細胞内の種々の経路における遺伝子発現プロファイルが影響を受けるかについて検証した。

実施例群の培地（ＢＰ１０又はＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、６ウェル培養ディッシュにおいて、２４時間、１ウェルにつき１×１０^４の初期濃度でＥＳ細胞を培養した。次に、トータルＲＮＡの抽出を行い、得られたＲＮＡをＣｙ３でラベルした。サンプルを、使用説明書に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｇ３ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ ８６×６０Ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）とハイブリダイズさせた。アレイをマイクロアレイスキャナーシステムでスキャンし、データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析した。

遺伝子の生物学的機能及び関係するシグナリング経路を、ＫＥＧＧ及びＢａｂｅｌｏｍｉｃｓのデータベースに従って分類して、発現レベルにおいて顕著に調節されている遺伝子の数を評価した。結果を表７に示す。表７に示されるように、ＢＰ含有培地で培養されたＥＳ細胞において顕著に調節された遺伝子は、大部分がＰＰＡＲ、ＥＣＭ受容体相互作用、及び／又はＪａｋ−Ｓｔａｔシグナリング経路に関係していた。現在関連する研究によると、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナリング経路は、幹細胞の自己複製性及び多能性維持の観点から最も関連性の高いものである。

実験Ｂ．リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ；Ｑ−ＰＣＲ）
実施例４に記載されたプロトコールを繰り返し、実施例群の培地（ＢＰ１０又はＢＰ４０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いたが、リアルタイムＰＣＲは、表８に示されるプライマーで行い、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。結果を図８に示す。図８に示されるように、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３のｍＲＮＡ発現レベルは、ＢＰ含有ＥＳ細胞培地で培養された細胞において、顕著にアップレギュレートされていた。

実験Ｃ．ウェスタンブロットアッセイ
現在知られている研究によると、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３のタンパク質はリン酸化されて、活性体を形成し、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ３シグナリング経路は、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３がリン酸化された場合に活性化される。

実施例群の培地（ＢＰ５又はＢＰ１０）、ＬＩＦ含有培地（ＢＰ無し）及びコントロール群の培地（ＢＰ無し）を各々用いて、６ウェル培養ディッシュにおいて１ウェルあたり１×１０^４の初期濃度でＥＳ細胞を培養した。培地を、細胞が７０−８０％コンフルエンスに増殖するまで、取り除いた。タンパク質を抽出し、ウサギａｎｔｉ−Ｊａｋ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｊａｋ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギａｎｔｉ−Ｓｔａｔ３抗体（ＢＤ）及びウサギａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロットアッセイを行い、ＢＰがＪａｋ２−Ｓｔａｔ３シグナリング経路における遺伝子のタンパク質発現レベルに影響を与えるかについて検証した。結果を図９及び表９に示す。

図９及び表９に示されるように、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３のトータルタンパク質発現及びリン酸化タンパク質発現レベルは、ＢＰを含有するＥＳ細胞培地で培養した群において顕著に増加した。この結果より、ＢＰはＪａｋ２−Ｓｔａｔ３シグナリング経路を活性化することでＥＳ細胞の自己複製性を維持し得ることが示される。

実験Ｄ．サイトカイン遺伝子調節の評価
ＢＰがどのようにＪａｋ２−Ｓｔａｔ３シグナリングの活性化をもたらすのかを理解するために、実施例４のプロトコールを繰り返した。実施例群の培地（ＢＰ５又はＢＰ１０）、ＬＩＦ含有培地及びコントロール群の培地を各々用いて、リアルタイムＰＣＲを表８に示されるプライマーを用いて行い、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３のシグナリング経路に関連するサイトカイン遺伝子（ＬＩＦ、ＥＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−５、ＩＬ−１１及びＯＳＭ）のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。結果を、図１０及び表１０に示す。

図１０及び表１０に示されるように、６遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＢＰを含有するＥＳ細胞培地で培養した細胞において顕著にアップレギュレートした。その効果は、ＢＰ１０で培養された細胞において最も顕著であった。この結果より、ＢＰはＪａｋ２−Ｓｔａｔ３に関連するサイトカインのレベルを増加させることができ、それゆえ、Ｊａｋ２及びＳｔａｔ３タンパク質を活性化させて幹細胞の多能性を維持することが明らかとなった。

（実施例９）ｉＰＳ細胞作製効率の評価
ＭＥＦ細胞は、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰトランスジェニックマウス（ジャクソンラボラトリー）から単離された。ｐｃＤＮＡ−Ｏｃｔ４、ｐｃＤＮＡ−Ｓｏｘ２、ｐｃＤＮＡ−ｃ−Ｍｙｃ及びｐｃＤＮＡ−Ｋｌｆ４プラスミドを２日に１回（全部で４回）、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦ細胞に導入し、コトランスフェクションによりｉＰＳ細胞を作製した。培地をトランスフェクション６日後、ＢＰ含有培地に代え、培地を毎日交換した。９日目、ＭＥＦ細胞を実施例１で得られた支持細胞上に継代し、ＧＦＰ陽性クローンを観察した。最後に、ｉＰＳ細胞のＧＦＰ蛍光シグナルを蛍光顕微鏡で検出した。蛍光シグナル強度は、細胞作製効率に正比例する。

本実施例は、２つの群、ＢＰ（Ｔ＋Ｐ）及びＢＰ（Ｔ）を含み、ＢＰ（Ｔ＋Ｐ）は、トランスフェクション前及び支持細胞上に置いた後に、実施例群の培地（ＢＰ１０）で培養された群であり、ＢＰ（Ｔ）は、トランスフェクション前に、実施例群の培地（ＢＰ１０）で培養された群である。結果を、図１１及び表１１に示す。

図１１及び表１１に示されるように、ＢＰ含有ｉＰＳ細胞培地を含む実施例群は、コントロール群（ＢＰ無し）のそれに比して、より高いＧＦＰ蛍光シグナルを示した。この結果より、ＢＰはたしかにｉＰＳ細胞の作製効率を向上させ得ることが示される。

得られたｉＰＳ細胞のＡＰ活性は、ＡＰ染色により評価された。Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ１の発現レベルは、胚葉体形成及び分化と同様に、免疫蛍光染色により観察された。結果を図１２に示す。図１２に示されるように、ＢＰ含有ｉＰＳ細胞培地を含む実施例群（Ｔ＋Ｐ）では、より高いＡＰ、Ｎａｎｏｇ、及びＳＳＥＡ１発現レベルを示した。この結果により、ＢＰはｉＰＳ細胞の作製効率を向上させるだけでなく、ｉＰＳ細胞の自己複製性及び多能性を維持させ得ることが示される。

加えて、ｉＰＳ細胞（Ｔ＋Ｐ）を、実施例７において示される工程により培養して、胚葉体の形成及び分化を観察した。結果を、図１３に示す。図１３に示されるように、免疫蛍光染色により、ａｎｔｉ−Ｔｕｊ１抗体（外胚葉マーカー）、ａｎｔｉ−α−ＳＭＡ抗体（中胚葉マーカー）、及びａｎｔｉ−Ｇａｔａ４抗体（内胚葉マーカー）を用いて細胞を検出した。ｉＰＳ細胞は、３つの胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることが観察された。この結果により、ＢＰがｉＰＳ細胞の作製効率を向上させるだけでなく、さらにこうして得られたｉＰＳ細胞の多能性を維持させ得ることが示される。

前述の結果によると、ＢＰを本発明における幹細胞培地に添加することで、幹細胞の作製効率を向上させるだけでなく、培養手順の間こうして得られた幹細胞の多能性を維持させることができる。したがって、高価なＬＩＦが回避され、それゆえ、経済的な方法で幹細胞を培養して幹細胞の適用を改善させることができる。

上述の実施例は、本発明の原理及び有効性を示すために単に例示されたにすぎず、本発明を限定することを意図していない。本技術分野における当業者であれば、本発明の技術的範囲において種々の変更及び修正を行い得ることが明白である。それゆえ、これらの変更及び修正は添付された特許請求の範囲及び同等物の範囲内に含まれることが明らかである。

（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願１０２１０２８０７（出願日２０１３年１月２５日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。

Claims (9)

1. （Ａ）幹細胞の培地を提供する工程と、
   （Ｂ）前記幹細胞の培地にｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）を添加して、ＢＰ含有培地を提供する工程と、
   （Ｃ）前記ＢＰ含有培地を用いて幹細胞を培養する工程と、
   を含み、
   前記幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、
   ことを特徴とする幹細胞を培養するための方法。
2. 前記工程（Ｂ）は、
   （ｂ１）前記ＢＰを溶媒に溶解させて、ＢＰ含有溶液を作る工程と、
   （ｂ２）前記ＢＰ含有溶液を前記幹細胞の培地と混合させる工程と、
   を含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（Ｂ）で用いられるＢＰの量は、前記幹細胞の培地１ミリリットルにつき、１μｇから８０μｇの範囲である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記工程（Ｂ）で用いられるＢＰの量は、前記幹細胞の培地１ミリリットルにつき、５μｇから５０μｇの範囲である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される幹細胞を培養することにおけるｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
6. 胚性幹細胞の多能性を維持し、人工多能性幹細胞の多能性を維持し、及び／又は人工多能性幹細胞の作製効率を向上させるための請求項５に記載の使用。
7. （１）幹細胞の培地と、（２）ｎ−ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、を含み、
   前記幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、
   ことを特徴とする幹細胞を培養するためのキット。
8. 前記ＢＰの量は、前記幹細胞の培地１ミリリットルにつき、１μｇから８０μｇの範囲である、
   ことを特徴とする請求項７に記載のキット。
9. 前記ＢＰの量は、前記幹細胞の培地１ミリリットルにつき、５μｇから５０μｇの範囲である、
   ことを特徴とする請求項７に記載のキット。