TWI776450B

TWI776450B - 正丁基苯酞於促進脂肪褐變、以及預防或治療脂肪肝及相關肝病變之應用

Info

Publication number: TWI776450B
Application number: TW110112159A
Authority: TW
Inventors: 林欣榮; 韓鴻志; 邱紫文; 陸康芸
Original assignee: 長春藤生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2022-09-01
Also published as: TW202239401A

Abstract

正丁基苯酞之應用，包括使用正丁基苯酞以提供一種用於誘導幹細胞分化成脂肪細胞的組合；使用正丁基苯酞於製造一組成物的用途，其中該組成物係用於抑制白色脂肪堆積、促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、抑制體重增加、抑制肥胖、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、及/或降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量；以及使用正丁基苯酞於製造一醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係用於預防或治療肥胖、預防與肥胖相關的代謝症候群、預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害。

Description

正丁基苯酞於促進脂肪褐變、以及預防或治療脂肪肝及相關肝病變之應用

本發明係關於正丁基苯酞之應用，尤其是使用正丁基苯酞以誘導幹細胞分化成類棕色脂肪細胞及其相關應用，包括：使用正丁基苯酞於抑制白色脂肪堆積、促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、抑制體重增加、抑制肥胖、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、及/或降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量的應用；以及使用正丁基苯酞於預防或治療肥胖、預防與肥胖相關的代謝症候群、預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害的應用。

白色脂肪係由白色脂肪細胞所組成，故呈現白色外觀，其形態上包含單一且大顆的脂肪滴，主要功能為儲存能量。棕色脂肪則由含有大量粒線體之棕色脂肪細胞所組成，故其主要功能為能量代謝。棕色脂肪細胞中的解耦聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)表現量亦較高，可於粒線體解耦合呼吸鏈中透過電子傳遞鏈而進行氧化作用、但無法進行磷酸化作用，故不產生ATP，此一反應會促使養分及氧氣的消耗，但過程中所釋放之自由能係以熱的形式散失。已知規律運動及冷刺激皆可促進脂肪棕化作用，刺激能量消耗並減少體內脂肪，且有許多文獻證實，脂肪棕化作用除了可以應用在肥胖治療之外，棕色脂肪組織在老化、病原感染、發炎反應、心臟疾病、癌症、神經退化性疾病亦扮演重要的角色。因此，雖然研究已知可透過細胞輸注的方式將棕色脂肪細胞注射至動物體內，但業界仍致力於開發有效促進動物體內之脂肪褐變的方法、以及可有效解決棕色脂肪細胞取得不易之問題的方法。

根據統計，身體質量指數(BMI)大於或等於30的人幾乎都有脂肪肝。然而，若生活型態不健康或腹部脂肪過多，即使BMI正常，亦可能是脂肪肝的高危險群。過去幾乎只有酗酒才會得到的脂肪肝，但在現代人飲食失調、缺乏運動的生活習慣下，脂肪肝已成為21世紀的流行病。調查結果顯示，必須至少減去9%體重，方可改善非酒精性脂肪肝的組織型態。於此，市面上雖有許多標榜可達到減重或控制體重之目的的藥物，但該些藥物大多是藉由增加飽足感、抑制食慾、或是抑制脂肪吸收等機制來達成減重目的，通常伴隨許多副作用，例如頭痛、低血糖、便秘、失眠、油便等，甚至會增加心臟病及中風的風險。因此，持續開發副作用低且可有效抗預防肥胖與其相關之代謝症候群的方法或藥物係有其必要性。

全球約有四分之一的成人患有非酒精性脂肪肝，且非酒精性脂肪肝會演變成慢性肝病，嚴重受脂肪侵襲的肝臟會發生非酒精性脂肪肝炎，進而增加發展成肝纖維化、肝硬化及肝癌的可能，最終走向肝病末期而必須進行肝臟移植手術。在日本，脂肪肝為肝硬化、肝癌等相關肝臟疾病最主要的因素。根據統計，預估2027年在美國、日本、歐洲五國(英國、法國、德國、義大利、西班牙)被診斷出非酒精性脂肪肝炎的人口將會達到1800萬人次。然而，一般生活方式干預措施(例如日常飲食限制或增加運動量)很難被確實執行，一旦不能維持即無法達成對脂肪肝的有效控制及改善。除了日常飲食限制或增加運動量，減肥手術是治療非酒精性脂肪肝的另一種方法，但有研究發現，在肥胖症患者進行減肥手術後，脂肪肝的患病率更高，且手術後罹患脂肪肝的患者當中有12%在晚期甚至發生肝臟纖維化。

由於美國食品藥物管理局至今尚未核准任何治療非酒精性脂肪肝的藥物上市，而是針對不同階段病徵投予以下10類藥物：抗氧化劑(如維他命E、谷胱甘肽、熊去氧膽酸)、過氧化物酶體增殖物活化受體促進劑(如吡格列酮、苯扎貝特、非諾貝特、沙羅格列扎)、糖尿病藥物、降血脂藥物(如依澤替米貝、Pemafibrate、Aramchol)、高血壓藥物(如血管張力素II型受體拮抗劑)、FXR(Farnesoid X-receptor)配體(如奧貝膽酸)、抗發炎藥物(如Pentoxifylline)、抗細胞凋亡藥物(如Selonsertib)、腸道菌、抗纖維化藥物(如Cenicriviroc)。然而，上述針對非酒精性脂肪肝之臨床試驗藥物或多或少均有副作用。舉例言之，利用維他命之抗發炎效果雖可改善非酒精性脂肪肝炎，但卻會增加前列腺癌與出血的風險；吡格列酮雖可透過調控萄萄糖及脂質代謝進而改善脂肪肝損傷、胰島素亢進、增加肝臟相關酵素，但在臨床試驗中卻有增加受試者體重3至5公斤、心臟受損、骨質流失、增加膀胱癌風險等強烈副作用；FXR配體促進劑奧貝膽酸雖可改善肝纖維化，但伴隨搔癢及血脂異常。因此，業界仍致力於開發脂肪肝及相關肝病變(肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌)之治療藥物及治療方法的研究。

正丁基苯酞為一種小分子化合物，本案發明人研究發現，對於經高脂飼料誘導出肥胖之小鼠投予正丁基苯酞，可提供以下效果：(1)抑制體重增加、(2)減少皮下脂肪及內臟脂肪堆積、(3)促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、(4)降低小鼠血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量、(5)降低低密度膽固醇含量、動脈粥狀硬化指數、心血管風險指數、及三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)、(6)降低肝損傷指數(丙胺酸氨基轉移酶、天門冬胺酸轉胺酶)、(7)提升抗氧化活性指標(SOD、CAT及GPx)、(8)提升氧氣消耗率及能量消耗率、以及(9)減少脂質油滴積累在肝細胞。本案發明人另經由細胞實驗發現，正丁基苯酞處理可提供以下效果：(1)抑制脂肪細胞之油滴積累、(2)降低脂肪細胞之三酸甘油酯含量、(3)降低肝細胞之脂肪含量、以及(4)減少脂質油滴積累在肝細胞。

因此，本發明之一目的，在於提供一種使用正丁基苯酞於製造一組成物的用途，其中該組成物係用於抑制白色脂肪堆積、促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、抑制體重增加、抑制肥胖、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、及/或降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量。較佳地，該組成物係一醫藥組成物、食品組成物、或飼料組成物。更佳地，該食品組成物係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品。

本發明之另一目的，在於提供一種使用正丁基苯酞於製造一醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係用於預防或治療肥胖、預防與肥胖相關的代謝症候群、預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害。其中，所涉與肥胖相關的代謝症候群較佳係糖尿病、腦血管疾病、心血管疾病、高血壓、及腎病變之至少一者，所涉脂肪肝係非酒精性脂肪肝，所涉肝病變係肝臟纖維化、肝硬化、肝炎、或肝癌，且所涉肝損害係肝組織損害及肝功能損害之至少一者。

本發明之又一目的，在於提供一種組合，其係包含：(1)一誘導幹細胞分化成脂肪細胞之成分；以及(2)正丁基苯酞。其中，所涉誘導幹細胞分化成脂肪細胞之成分係選自以下群組：地塞松(dexamethasone)、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、羅格列酮(rosiglitazone)、去氧羥四環素(doxycycline)、三碘甲狀腺素(triiodothyronine，T3)、吲哚美辛(indomethacin)、轉鐵蛋白(transferrin)、硒(selenium)、及前述之組合。

圖1所示為“標準飼料”組、“高脂飼料”組、“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠於飼養期間(第1至24週)之體重變化的曲線圖，其中，“標準飼料”組及“高脂飼料”組小鼠係分別餵食標準飼料及高脂飼料；NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠除了餵食高脂飼料，另透過管餵分別給予80毫克/公斤及200毫克/公斤之正丁基苯肽。

圖2所示為上述各組小鼠於飼養期間之食物攝取量變化的曲線圖。

圖3所示為上述各組小鼠於飼養期間最後一日之體型外觀的照片圖。

圖4所示為上述各組小鼠之食物轉化效率的長條圖。

圖5所示為上述“高脂飼料”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠於24小時期間的氧氣消耗量(VO₂)。

圖6所示為上述“高脂飼料”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠於24小時期間的二氧化碳呼出量(VCO₂)

圖7所示為上述“高脂飼料”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠於24小時期間的能量消耗

圖8所示為上述“高脂飼料”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠於24小時期間的呼吸交換率。

圖9所示為上述各組小鼠之皮下脂肪組織(左上兩條)、附睪脂肪組織(左下兩條)、心臟(右上)、肝臟(右邊中間)、腎臟(右下)外觀的照片圖。

圖10所示為上述各組小鼠之皮下脂肪重量的長條圖。

圖11所示為上述各組小鼠之附睪脂肪重量的長條圖。

圖12所示為上述各組小鼠之肝臟重量的長條圖。

圖13所示為上述各組小鼠之血液中葡萄糖含量的長條圖。

圖14所示為上述各組小鼠之血液中三酸甘油酯含量的長條圖。

圖15所示為上述各組小鼠之血液中總膽固醇含量的長條圖。

圖16所示為上述各組小鼠之血液中低密度膽固醇含量的長條圖。

圖17所示為上述各組小鼠之血液中低密度與高密度膽固醇比值的長條圖。

圖18所示為上述各組小鼠之動脈粥狀硬化指數的長條圖。

圖19所示為上述各組小鼠之心血管風險指數的長條圖。

圖20所示為上述各組小鼠之三酸甘油酯-葡萄糖指數的長條圖。

圖21所示為上述各組小鼠之丙胺酸轉胺酶活性的長條圖。

圖22所示為上述各組小鼠之天門冬胺酸轉胺酶活性的長條圖。

圖23所示為上述各組小鼠之超氧化物歧化酶活性的長條圖。

圖24所示為上述各組小鼠之過氧化氫酶活性的長條圖。

圖25所示為上述各組小鼠之麩胱甘肽過氧化物酶活性的長條圖。

圖26所示為上述各組小鼠之肝臟組織切片染色結果的照片圖。

圖27所示為上述各組小鼠之皮下脂肪組織切片染色結果的照片圖。

圖28所示為上述各組小鼠之附睪脂肪組織切片染色結果的照片圖。

圖29所示為脂肪幹細胞(即，“未分化”組)、以及“分化”組、“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”與“分化+NBP(50微克/毫升)組”細胞之紅油染色結果的照片圖，其中，“分化”組細胞係將脂肪幹細胞培養於脂向分化培養基中14天而獲得者，“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”及“分化+NBP(50微克/毫升)組”細胞與“分化”組細胞的差異僅在於培養至第8天時係於培養基中額外添加不同濃度之正丁基苯肽。

圖30所示為上述“未分化”組、“分化”組、“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”及“分化+NBP(50微克/毫升)組”細胞在進行紅油染色之後，於490奈米(nm)波長下的相對吸光值的長條圖。

圖31所示為上述各組細胞中之油滴增加百分比。

圖32所示為上述各組細胞中之三酸甘油酯含量。

圖33所示為肝細胞在經過不同處理後之細胞型態的照片圖。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者。

除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物(例如：狗、貓)。

正丁基苯酞具有神經保護作用，且經中國國家食品藥品監督管理局已核准為缺血性腦中風之臨床用藥。本案發明人研究發現，對於經高脂飼料誘導出肥胖之小鼠投予正丁基苯酞，可提供以下效果：(1)抑制體重增加、(2)減少皮下脂肪及內臟脂肪堆積、(3)促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、(4)降低小鼠血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量、(5)降低低密度膽固醇含量、動脈粥狀硬化指數、心血管風險指數、及三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)、(6)降低肝損傷指數(丙胺酸氨基轉移酶、天門冬胺酸轉胺酶)、(7)提升抗氧化活性指標(SOD、CAT及GPx)、(8)提升氧氣消耗率及能量消耗率、以及(9)減少脂質油滴積累在肝細胞。本案發明人另經由細胞實驗發現，正丁基苯酞處理可提供以下效果：(1)抑制脂肪細胞之油滴積累、(2)降低脂肪細胞之三酸甘油酯含量、(3)降低肝細胞之脂肪含量、以及(4)減少脂質油滴積累在肝細胞。

因此，本發明係關於正丁基苯酞之應用，尤其是使用正丁基苯酞以誘導幹細胞分化成類棕色脂肪細胞及其相關應用，包括：使用正丁基苯酞以提供一種用於誘導幹細胞分化成脂肪細胞的組合；使用正丁基苯酞於製造一組成物的用途，其中該組成物係用於抑制白色脂肪堆積、促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、抑制體重增加、抑制肥胖、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、及/或降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量；以及使用正丁基苯酞於製造一醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係用於預防或治療肥胖、預防與肥胖相關的代謝症候群、預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害。

本發明所涉之正丁基苯酞為一種小分子化合物，其可以由芹菜籽萃取、純化而得，亦可以由商業上購得或經由已知之合成方法製備而得。根據本發明所提供之組成物可以為醫藥組成物、食品組成物或飼料組成物。

於根據本發明之應用中，所涉與肥胖相關的代謝症候群的例子包括：糖尿病、腦血管疾病、心血管疾病、高血壓、及腎病變；所涉脂肪肝的例子包括：非酒精性脂肪肝；所涉肝病變的例子包括：肝臟纖維化、肝硬化、肝炎、及肝癌；且所涉肝損害的例子包括：肝組織損害及肝功能損害。

根據本發明所提供之醫藥組成物係可用於全身性投藥或局部性投藥，且可透過各種藥物傳遞系統(drug delivery system，DDS)進行傳遞，合宜的藥物傳遞系統包括口服藥物傳遞系統(oral drug delivery system)、經皮藥物傳遞系統(transdermal drug delivery system)、注射藥物傳遞系統(injectable drug delivery system)、吸入性藥物傳遞系統(inhalation drug delivery system)、以及經黏膜藥物傳遞系統(transmucosal drug delivery system)等。舉例言之，但不以此為限，根據本發明所提供之醫藥組成物可以藉由微脂體(liposome)、微膠囊(microcapsule)、奈米微粒(nanoparticle)、微針(microneedle)等系統進行傳遞，以達到提高生物利用率、控制藥物釋放速度、針對病灶精準投藥、減少藥物副作用等效果。

根據本發明所提供之醫藥組成物係可呈現任何合宜的形式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈現對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可以口服、經皮(例如貼片、軟膏等)、靜脈注射(包含點滴輸注及快速注射)、肌肉注射、皮下注射、動脈注射、腹腔注射、皮下植入、組織間植入、經呼吸道(例如噴劑、鼻滴劑等)、經黏膜(例如口溶錠等)之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用醫藥上可接受之載劑以提供該醫藥組成物，其中，該載劑為本領域已知可採用者，包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收促進劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。

以口服劑型為例，可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於口服投藥的劑型提供，其中，適於口服之液態劑型包括糖漿劑、口服液、懸浮液、酏劑等，適於口服之固態劑型則包括粉劑、顆粒劑、口含錠、糖衣錠、腸溶錠、咀嚼錠、發泡錠、膜衣錠、膠囊劑、長效緩釋錠等。於根據本發明所提供之醫藥組成物中，可含有任何不會不利地影響正丁基苯酞之所欲效益的醫藥上可接受之載劑。舉例言之，但不以此為限，前述液態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子包括：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、油(例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、甘油、聚乙二醇、及前述之組合；前述固態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子則包括：纖維素、澱粉、高嶺土(kaolinite)、膨潤土(bentonite)、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻膠、單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、硬脂酸鈣(calcium stearate)、及前述之組合。

於上述適於經皮投藥之劑型中，可含有任何不會不利影響本發明醫藥組成物所含正丁基苯酞之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、礦物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液體石蠟脂、去水山梨醇單硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於經皮投藥的劑型提供，例如以乳液、乳霜、油狀物、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、洗劑、噴霧劑、及貼片(例如微針貼片)等形式提供，但不以此為限。

於上述適於注射之針劑或點滴劑中，則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組成物。或者，可將該醫藥組成物製備成一注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，以提供所欲之注射劑。

至於適於皮下植入、或組織間植入之劑型，則可於本發明所提供之醫藥組成物中另含有一或多種例如賦形劑、安定劑、緩衝劑、以及其他載劑等成分，以例如晶片(wafer)、錠劑、丸劑、膠囊等劑型提供，從而得以將該醫藥組成物植入一個體中，以緩慢且持續的釋放所含正丁基苯酞至投藥部位周圍的組織，達到局部穩定高劑量的效果。舉例言之，但不以此為限，可於本發明所提供之醫藥組成物中含有一生物可相容聚合物，使醫藥組成物呈一供皮下植入、或組織間植入之晶片劑型。前述生物可相容聚合物可以由商業上購得或經由已知之合成方法製備而得。舉例言之，可以由雙(對羧基苯氧基)丙烷與癸二酸所提供之聚酸酐(例如『p(CPP-SA)共聚物』)作為該生物可相容聚合物。

有關經呼吸道投藥之醫藥組成物，視需要地，可使用任何合宜之方法將該醫藥組成物氣霧化，以利該醫藥組成物進入呼吸道中。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可經由霧化器(nebulizer)、或加壓容器而施用(例如鼻噴劑)。或者，可將該醫藥組成物製備成一鼻滴劑。

至於經黏膜投藥之醫藥組成物，則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種穿透劑、界面活性劑、黏度調節劑、pH調節劑、防腐劑、穩定劑、滲透壓調節劑、以及其他載劑等成分，以口溶錠、塞劑、鼻噴劑、鼻滴劑等劑型提供該醫藥組成物。

視需要地，亦可於根據本發明所提供之醫藥組成物中進一步含有合宜用量之添加物，例如可提高該組成物於使用時感受之調色劑、著色劑等，以及可改善該組成物組的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。

根據本發明所提供之食品組成物可為飲品、固態食品、或半固態食品，且可以健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品的形式提供。舉例言之，但不以此為限，該食品組成物可為乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、冰品、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、氣泡水、酒精飲料、運動飲料、營養飲料等產品。較佳地，該食品組成物係以健康食品或保健食品的形式提供。

此外，視使用形式及需求而定，可於根據本發明所提供之食品組成物中含有任何適宜之食品添加物。舉例言之，可採用之食品添加物包括但不限於，保存劑、防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、漂白劑、保色劑、膨脹劑、營養添加劑、著色劑、調味劑(例如：甜味劑)、黏稠劑、結著劑、食品工業用化學藥品、乳化劑、以及品質改良用、釀造用及食品製造用劑。

可於根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品的外包裝上標示建議使用量、使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。

視使用形式及需求而定，除了植物性蛋白(例如粉碎或破碎的小麥、大麥、玉米等)、動物性蛋白(例如血粉、肉粉、魚粉等)、植物性脂肪、及動物性脂肪以外，可於根據本發明所提供之飼料組成物中添加有機酸、磷酸鹽、礦物質、維生素、胺基酸等各種輔助組分、以及保存劑、防腐劑、抗流感劑、抗氧化劑、抗真菌劑、抗微生物劑、營養補充劑、生長促進劑及消化-吸收促進劑之至少一者。根據本發明所提供之飼料組成物亦可用作飼料添加劑，與其他組分一起使用。

此外，可於根據本發明所提供之飼料組成物中含有任何適宜之溶解促進劑、緩衝劑、稀釋劑、分散劑、界面活性劑、黏度調節劑、黏合劑、穩定劑、以及潤滑劑，以將該飼料組成物配製成例如水溶液、懸浮液、乳液等可注射製劑、膠囊、顆粒或片劑。根據本發明所提供之飼料組成物亦可與無毒性的載體結合，而將該飼料組成物製備成速釋(immediate-release)配方或緩釋(sustained-release)配方的施用形式。視使用形式及用途而定，可選用任何適宜之可食用載劑以提供該飼料組成物。舉例言之，但不以此為限，前述可食用載劑的例子包括：糖及其衍生物(例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇)、澱粉(例如玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉)、纖維素及衍生物(例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基羥基纖維素)、蛋白質衍生物(例如玉米蛋白、明膠)、以及合成聚合物(例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮)。

根據本發明所提供之飼料組成物係可應用於動物的飲食，即包括哺乳動物及家禽的許多動物的飼料。所述飼料組成物可用於例如豬、牛、羊等商業上重要的哺乳動物、例如大象、駱駝等動物園的動物或例如狗、貓等家畜。商業上重要的家禽可包括雞、鴨、鵝等。根據本發明所提供之飼料組成物理想地將具有欲投予之動物所喜愛的口味、口感及/或香味，以便易於經口投予該飼料組成物。

根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物、及飼料組成物皆可以視需要另外含一或多種其他活性成分，以進一步加強該組成物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明組成物所含正丁基苯酞之效益沒有不利的影響即可。

於根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物、或飼料組成物中，以該組成物之總重量計，正丁基苯酞之含量為至少約0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.007、0.0075、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100重量%，且其含量可為自前述數值之任意二者選擇的範圍，例如：約0.0001重量%至約90重量%、約0.001重量%至約25重量%、約0.01重量%至約10重量%、約0.01重量%至約5重量%、約0.05重量%至約1重量%、及約0.05重量%至約0.5重量%。

根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物、及飼料組成物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀及施用目的而異。亦可視實際應用需求調整根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物、及飼料組成物中之正丁基苯酞的含量，例如：調整至每日應服用或外用的量。

根據本發明所提供之套組係可有效解決棕色脂肪細胞取得不易之問題，於該套組中，(1)作為第一組分之誘導幹細胞分化成脂肪細胞之成分與(2)作為第二組分之正丁基苯酞通常係分開包裝、各自儲存於不同的容納空間(例如塑膠袋、塑膠瓶、玻璃瓶、安瓿(ampoule))中，該二組分可各自分開運送或銷售，亦可組合成套一起配送與銷售。此外，該套組可另包含一使用說明書，以利使用者在使用時根據其中所擬定之程序與流程，於現場才混合各成分以進行處理及施用。

於根據本發明所提供之套組中，適用為第一組分以誘導幹細胞分化成脂肪細胞之成分的例子包括：地塞松(dexamethasone)、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、羅格列酮(rosiglitazone)、去氧羥四環素(doxycycline)、三碘甲狀腺素(triiodothyronine，T3)、吲哚美辛(indomethacin)、轉鐵蛋白(transferrin)、硒(selenium)、及前述之組合。於根據本發明應用之部分具體實施態樣中，所涉誘導幹細胞分化成脂肪細胞之成分係地塞松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、及羅格列酮之一或多者。

於根據本發明之套組中，有關正丁基苯酞的來源以及種類，均如上述之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

於以下實施例中，所使用的物料及器材如下：

1. C57BL/6J小鼠(平均體重：24至29克)：購自國家實驗動物中心(NLAC；National Laboratory Animal Center,Taipei,Taiwan；https：//www.nlac.narl.org.tw/)。

2.標準飼料：購自LabDiet(Missouri，USA)；產品編號：#5001；熱量：3.02千卡路里/克，其中13.496%之卡路里來自脂肪。

3.高脂飼料：購自Research Diets(New Jersey，USA)；產品編號：D12451；熱量：4.7千卡路里/克，其中45%之卡路里來自脂肪。

4.正丁基苯酞(3-N-butylphthalide，NBP)：購自Toronto Research Chemicals(TRC)；產品編號：B693850。

5.超氧化物歧化酶(SOD)試劑套組(Superoxide dismutase assay kit)：購自Cayman；產品編號：706002。

6.過氧化氫酶試劑套組(catalase assay kit)：購自Cayman；產品編號：707002。

7.麩胱甘肽試劑套組(glutathione assay kit：購自Cayman；產品編號：703002。

8.脂肪幹細胞：購自ATCC；編號：PCS-500-011^TM。

9.基礎培養基(basic medium)：KSFM(Keratinocyte serum free medium)培養液(購自Gibco；產品編號：17005042)，每500毫升添加25毫克之牛腦垂體萃取物(bovine pituitary extract，BPE)、2.5微克之人類表皮生長因子重組蛋白(EGF Human Recombinant Protein)、10%(v/v)胎牛血清(Gibco,Grand Island,USA)、及1%(v/v)青黴素/鏈黴素溶液。

10.脂向分化培養基(differentiation medium)：DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養液(購自Gibco；產品編號：11965092)，於其中添加10%(v/v)胎牛血清(Gibco,Grand Island,USA)、1%(v/v)青黴素/鏈黴素溶液、1微莫耳濃度(μM)之地塞松(dexamethasone)、0.5毫莫耳濃度(mM)之3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、170奈莫耳濃度(nM)之胰島素、700奈克/毫升之去氧羥四環素(doxycycline)、及0.5微莫耳濃度之羅格列酮(rosiglitazone)。

11.油紅染劑：購自Sigma aldrich；產品編號：O1391-250ML。

12.小鼠肝細胞：購自ATCC；編號：CRL-2254^TM。

13.DMEM/F12培養液：購自Gibco；產品編號：11320033。

實施例1：動物實驗

1-1.動物模型之建立

將C57BL/6J小鼠隨機分成四組(每組10隻)，分別以如下條件進行飼養(維持25℃室溫環境及12小時白天黑夜循環，食物與飲用水在實驗過程中無限提供給實驗動物使用)：

(1)“標準飼料”組(亦稱「對照組」)：餵食正常飼料，歷時24週。

(2)“高脂飼料+低劑量正丁基苯酞”組(亦稱「NBP(80毫克/公斤)組」)：餵食高脂飼料24週，且於最後的8週(即，第17至24週)當中，每天額外管餵一次含有正丁基苯酞之橄欖油(正丁基苯酞之劑量：80毫克/公斤體重)。

(3)“高脂飼料+高劑量正丁基苯酞”組(亦稱「NBP(200毫克/公斤)組」)：餵食高脂飼料24週，且於最後的8週(即，第17至24週)當中，每天額外管餵一次含有正丁基苯酞之橄欖油(正丁基苯酞之劑量：200毫克/公斤體重)。

(4)“高脂飼料”組：餵食高脂飼料24週，且於最後的8週(即，第17至24週)當中，每天額外管餵一次橄欖油(所投予之橄欖油體積與餵食正丁基苯酞的組別相同)。

1-2.體重、攝食量、體型之觀察

於實施例1-1的飼養過程中，每週測量記錄一次小鼠之體重及食物攝取量變化，並於最後一日以拍照方式記錄小鼠的體型。前述體重、攝食量及體型之觀察結果分別示於圖1至圖3。其後，以公式A計算各組小鼠於實驗流程中的平均體重增加量(average body weight gain)，其中，起始體重為第1週之體重平均值，最終體重則為第24週之體重平均值。接著，再以公式B計算各組小鼠之食物功效比(food efficiency ratio；亦稱食物轉換效率)，結果示於圖4。

公式A：平均體重增加量(克)=最終體重(克)-起始體重(克)。

由圖1及圖3可知，相較於“標準飼料”組，“高脂飼料”組小鼠之體重明顯較高且體型明顯比較龐大；然而，相較於“高脂飼料”，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之體重明顯較低且體型明顯較瘦小。此外，由圖4可知，相較於“高脂飼料”組，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之食物轉換效率皆明顯量較低。前述結果顯示，正丁基苯酞可有效抑制體重增加、抑制肥胖。

1-3.氧氣消耗及二氧化碳呼出之紀錄

於實施例1-1的飼養過程中，實驗動物先置放於飼養籠適應24小時，同樣維持25℃室溫環境及12小時白天黑夜循環，食物與飲用水在實驗過程中無限提供給實驗動物使用，接著利用CLAMS(Columbus Instruments)紀錄實驗動物的氧氣消耗量(VO₂)、二氧化碳呼出量(VCO₂)、能量消耗、熱量產生、呼吸交換率(或稱「氣體交換率」)等基本代謝參數，歷時24時。結果示於圖5至圖8

由圖5至圖7可知，相較於“高脂飼料”組，“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠具有較高之氧氣消耗量(圖5)、二氧化碳呼出量(圖6)及能量消耗(圖7)。此外，由圖8可說明，正丁基苯酞提升氣體交換量及能量消耗並非因為小鼠過度呼吸頻率造成，顯示“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠體內有較高的代謝能量產生。前述結果顯示，正丁基苯酞可提升氧氣消耗率及能量消耗率。相對於白色脂肪，類棕色脂肪細胞/棕色脂肪細胞具有較大之氧氣消耗率及能量消耗率，因此，由前述實驗結果可知，投予正丁基苯酞應可提高動物體內之棕色脂肪的比例。

1-4.樣本採集及觀察

於完成實施例1-2之拍照記錄後，使小鼠空腹12小時，再將小鼠麻醉，並採集小鼠血液靜置於血清管中30分鐘後進行離心(4℃、3000rpm、15分鐘)，接著將上清液(此為血液樣本)轉移至微量離心管凍於-80℃保存，供後續實驗分析。

於完成上述血液樣本採集後，將小鼠犧牲，取下其皮下脂肪組織、附睪脂肪組織、肝臟、腎臟、及心臟，拍照成像，結果示於圖9；測量並記錄各組小鼠之皮下脂肪組織、附睪脂肪組織、及肝臟的平均重量，結果示於圖10至圖12；以及將所採集之臟器保存於-80℃下，供後續實驗分析。

由圖9至圖12可知，相較於“標準飼料”組，“高脂飼料”組小鼠之皮下及內臟(附睪、肝臟、腎臟等)有大量的白色脂肪堆積，且肝臟的顏色明顯較白、重量明顯較高；然而，相較於“高脂飼料”，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之皮下及內臟脂肪堆積的情形皆明顯改善，且肝臟顏色與重量亦回復到與“標準飼料”組相當。前述結果顯示，正丁基苯酞可有效減少皮下脂肪及內臟脂肪堆積，尤其可以降低個體之肝脂肪含量，達到預防或改善脂肪肝的效果。

1-5.血液生化值分析

取實施例1-4所提供之各組小鼠的血液樣本，以SYSMEX K-1000及TOSHIBA TBA200FA全自動血液分析儀進行檢測，分析小鼠血液中葡萄糖、三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(TC)與高密度膽固醇(HDL-C)的含量、以及丙胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)活性與天門冬胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)的活性。其後，以公式C計算各組小鼠之低密度膽固醇(LDL-C)的含量，再進一步算出低密度與高密度膽固醇比值。此外，以公式D計算各組小鼠之動脈粥狀硬化指數(atherogenic index)，以公式E計算各組小鼠之心血管風險指數，並以公式F計算各組小鼠之三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)。前述葡萄糖、三酸甘油酯、總膽固醇與低密度膽固醇之含量的結果示於圖13至圖16，低密度與高密度膽固醇比值、動脈粥狀硬化指數、心血管風險指數、與三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)的結果示於圖17至圖20，丙胺酸轉胺酶(AST)活性與天門冬胺酸轉胺酶(ALT)活性則示於圖21及圖22。

公式C：低密度膽固醇=總膽固醇-高密度膽固醇-(三酸甘油酯/5)。

由圖13至圖20可知，相較於“標準飼料”組，“高脂飼料”組小鼠之血液中葡萄糖、三酸甘油酯、總膽固醇與低密度膽固醇的含量、低密度與高密度膽固醇比值、動脈粥狀硬化指數、心血管風險指數、三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)皆明顯較高；然而，相較於“高脂飼料”，“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之前述數值皆明顯較低，甚至與“標準飼料”組相當或低於“標準飼料”組。前述結果顯示，正丁基苯肽可降低血液中葡萄糖、三酸甘油酯、總膽固醇與低密度膽固醇的含量、動脈粥狀硬化指數、心血管風險指數、及三酸甘油酯-葡萄糖指數(TyG)，而可用於預防與肥胖相關的代謝症候群。

已知丙胺酸轉胺酶(AST)及天門冬胺酸轉胺酶(ALT)均為胺基酸代謝酵素，廣泛地存在心臟、肝臟、骨骼肌、腎臟及腦中，當臟器中的細胞受到損傷，AST及ALT會釋放至血液中。因此，AST及ALT的活性可作為前述該等臟器的損傷指標，用以監測內臟損傷的情形，活性越高表示內臟受損越嚴重。其中，ALT在肝臟中含量較多，活性越高表示肝臟受損越嚴重。由圖21及圖22可知，相較於“標準飼料”組，“高脂飼料”組小鼠之血液中的丙胺酸轉胺酶(AST)活性與天門冬胺酸轉胺酶(ALT)活性皆明顯較高；然而，相較於“高脂飼料”，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之丙胺酸轉胺酶(AST)活性與天門冬胺酸轉胺酶(ALT)活性皆明顯較低，甚至與“標準飼料”組相當。前述結果顯示，正丁基苯肽可改善脂肪肝引起的肝病變、降低個體之肝損害。

1-6.肝臟樣本分析

已知超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及穀胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)皆為相當重要的抗氧化酵素，超氧歧化酶(SOD)可將活性含氧物(Reactive oxygen species，ROS)轉變成反應性較低的H₂O₂，再由過氧化氫酶(CAT)及穀胱甘肽過氧化酶(GPx)轉變為氧氣及水。

為了解正丁基苯肽對小鼠肝臟脂質過氧化、氧化壓力、及抗氧化能力的影響，取實施例1-4所提供之各組小鼠的肝臟樣本，浸於0.5毫升PBS中進行均質，將均質後的樣本放置於離心機中離心(4℃、3500rpm、15分鐘)，將上清液樣本轉移至微量離心管後，分別以市售之超氧化物歧化酶試劑套組、過氧化氫酶試劑套組、麩胱甘肽試劑套組，依使用者操作手冊進行分析。結果示於圖23至圖25。

由圖23至圖25可知，相較於“標準飼料”組，“高脂飼料”組小鼠之超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶的活性皆明顯下降；然而，相較於“高脂飼料”，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶的活性皆明顯提升。前述結果顯示，正丁基苯肽可有效提高肝臟之抗氧化活性。

1-7.皮下與內臟脂肪組織之切片染色分析

取實施例1-4所提供之各組小鼠的肝臟樣本、及皮下與附睪脂肪組織樣本，經福馬林固定後，再以石蠟包埋，並進行切片。對前述切片進行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-sosin stain，H&E stain)染色，以觀察各組小鼠之肝臟組織的細胞型態，並將結果示於圖26(肝臟組織)、圖27(皮下脂肪)及圖28(附睪脂肪)。

由圖26至圖28可知，“高脂飼料”組小鼠之肝臟組織、及皮下與附睪脂肪組織主要係由單一且大型之白色脂肪細胞所組成，“NBP(80毫克/公斤)”組及“NBP(200毫克/公斤)”組小鼠之肝臟組織、及皮下與附睪脂肪組織則類似“標準飼料”組，具有多粒小型脂肪滴的棕色脂肪細胞型態。前述結果顯示，正丁基苯酞確實可有效將高脂飲食所誘導之小鼠皮下及內臟白色脂肪轉換成棕色脂肪細胞，具有促進脂肪褐變(Browning)的效果。

實施例2：脂肪細胞實驗

2-1.細胞前培養

於37℃、5%二氧化碳下，將脂肪幹細胞培養於基礎培養基中，每2至3天更換一次培養基，待細胞長至90%滿後，於顯微鏡下觀察前述經前培養之細胞型態並拍照，結果示於圖29(未分化)。

2-2.細胞之分化

取實施例2-1所提供之經前培養之脂肪幹細胞，於37℃、5%二氧化碳下，置於脂向分化培養基中進行培養，歷時7天，其後將細胞分成四組，並分別以如下培養基培養各組細胞，歷時7天，使脂肪幹細胞分化成脂肪細胞：

(1)“分化”組：脂向分化培養基。

(2)“分化+NBP(2微克/毫升)組”：添加有正丁基苯肽的脂向分化培養基，其中正丁基苯肽於培養基中的濃度為2微克/毫升。

(3)“分化+NBP(10微克/毫升)組”：添加有正丁基苯肽的脂向分化培養基，其中正丁基苯肽於培養基中的濃度為10微克/毫升。

(4)“分化+NBP(50微克/毫升)組”：添加有正丁基苯肽的脂向分化培養基，其中正丁基苯肽於培養基中的濃度為50微克/毫升。

2-3.紅油染色

以油紅染劑分別對實施例2-1所提供之脂肪幹細胞(未分化)、以及實施例2-2所提供之“分化”組、“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”與“分化+NBP(50微克/毫升)組”的細胞進行脂肪滴染色後，於顯微鏡下觀察各組細胞型態並拍照，結果亦示於圖29。接著，測量各組細胞在490奈米(nm)波長下之吸光值，並量化成相對吸光值，結果示於圖30。

另一方面，分別對實施例2-1所提供之脂肪幹細胞(未分化)、以及實施例2-2所提供之“分化”組、“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”與“分化+NBP(50微克/毫升)組”細胞中的油滴及三酸甘油酯進行量化，結果分別示於圖31及圖32。

由圖29至圖32圖可知，未經正丁基苯肽處理之“分化”組細胞有高量的油滴堆積以及三酸甘油酯；然而，相較於“分化”組細胞，經正丁基苯肽處理之“分化+NBP(2微克/毫升)組”、分化+NBP(10微克/毫升)組”與“分化+NBP(50微克/毫升)組”細胞的油滴推積及三酸甘油酯含量皆明顯減少。前述結果說明，正丁基苯肽可以有效抑制脂肪細胞之油滴積累、降低脂肪細胞中三酸甘油酯含量。

實施例3：肝細胞實驗

將小鼠肝細胞分成三組，並分別進行下處理：

(1)“未誘導”組：於37℃、5%二氧化碳下，將細胞培養於DMEM/F12培養液中，歷時24小時。

(2)“脂肪酸誘導”組：比照“未誘導”組進行，但於培養基中添加脂肪酸以誘導小鼠肝細胞內油滴形成。

(3)“脂肪酸誘導+正丁基苯肽”組：比照“脂肪酸誘導”組進行，但於培養基中進一步添加正丁基苯肽，其中正丁基苯肽於培養基中的濃度為20微克/毫升。

其後，以油紅染劑分別對上述三組細胞進行脂肪滴染色，並於顯微鏡下觀察各組細胞型態及拍照，結果示於圖33。由圖33可知，相較於未經正丁基苯肽處理之“脂肪酸誘導”組細胞，“脂肪酸誘導+正丁基苯肽”組細胞中之油滴明顯減少。此結果說明，正丁基苯肽可以有效降低肝細胞之脂肪含量、減少脂質油滴積累在肝細胞。

由上述實施例之結果可知，正丁基苯肽可用於抑制白色脂肪堆積、促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、抑制體重增加、抑制肥胖、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、總膽固醇及低密度膽固醇之含量、預防或治療肥胖、預防與肥胖相關的代謝症候群、預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害。

Claims

一種使用正丁基苯酞於製造一組成物的用途，其中該組成物係促進白色脂肪轉換成棕色脂肪、降低個體之肝脂肪含量、降低肝細胞之脂肪含量、提高肝臟抗氧化活性、及/或降低血液中三酸甘油酯、葡萄糖、及總膽固醇之含量。
如請求項1之用途，其中該組成物係一醫藥組成物、食品組成物、或飼料組成物。
如請求項2之用途，其中該食品組成物係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品。
一種使用正丁基苯酞於製造一醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係用於預防或治療脂肪肝、改善脂肪肝引起的肝病變、及/或降低個體之肝損害。
如請求項4之用途，其中該脂肪肝係非酒精性脂肪肝。
如請求項4之用途，其中該肝病變係肝臟纖維化、肝硬化、肝炎、或肝癌。
如請求項4之用途，其中該肝損害係肝組織損害及肝功能損害之至少一者。