KR102180598B1 - 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 및 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포를 현저히 높은 효율로 심근세포로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물{Medium composition for inducing differentiation of stem cells into cardiomyocytes}

본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 및 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.

현대 의학의 눈부신 발달에도 불구하고 심부전이나 심근경색과 같은 심장질환의 생존률은 극히 낮은 수준이다. 특히 심부전 질환의 경우에는 진단 후 5년간 생존율이 50% 미만으로, 이는 주요 악성종양질환의 5년간 생존율과 비슷한 수준이다.

그럼에도 불구하고 심부전 환자에 행해지는 현재의 내과적인 치료법은 생존율을 조금 더 높일 수 있을 뿐, 근본적 치료법인 심장이식술 같은 외과적 치료법을 대체할 수 없는 실정이다. 하지만, 심장이식 같은 외과적 치료법은 공여자 숫자의 절대적인 부족과 이식 후의 면역거부반응, 지속적인 면역억제제 투여에 따른 감염 등의 문제가 존재한다.

한편, 심부전 환자를 근본적으로 치료하기 위해서는 저하된 심근의 기능을 회복시키기 위해서 기능이 상실된 심근을 기능이 우수한 심근으로 대체해야 한다. 최근, 줄기세포를 이용하여 제조한 심근세포를 이용하여 손상된 심근을 재생시켜 심장의 기능을 회복시키고자 하는 치료방법이 부상하고 있다. 심근세포는 생후 2주까지는 세포분열을 하여 증식하지만 그 이후로는 세포의 수는 증가하지 않고 크기만 점진적으로 증가함으로써 성인의 심장 크기로 발달한다. 이러한 심근세포의 제한된 증식능력은 재생의학적 관점에서 손상된 심근을 대체하고자 하는 연구에 있어서 상당한 침체적인 요인으로 간주되고 있다.

인간 전분화능 줄기세포 (human pluripotent stem cells)는 이론적으로 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화 가능한 특징을 가지고 있으므로 심근세포로의 분화 유도 방법을 통하여 기능성 심근세포를 체외에서도 대량 생산하는 것이 가능할 것으로 예상되지만, 현재까지 확립되어 있는 다양한 심근세포 분화 방법들은 낮은 분화 효율로 인해 분화세포의 대량 생산이 어렵고 세포배양의 비용이 크게 증가되는 문제점이 있다. 이에, 본 발명자들은 cP1P(cyclic Phytosphingosine-1-phosphate)를 이용하여 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 효율을 현저히 상승시키는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 분화 유도된 심근세포를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 분화 유도된 심근세포를 제공한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 줄기세포에 cP1P를 처리한 경우 대조군(DMSO 처리)에 비해서 심근세포 마커 TNNT2의 발현이 현저하게 증가하는 것을 관찰하였고, 이 발현 증가는 S1P 처리 시 대조군에 비해서 심근세포 관련 마커인 TNNT2의 단백질 발현양 증가 정도보다 현저히 높았다 (도 1). 심근세포로 분화되어 심박동이 일어나는 콜로니의 개수가 대조군 및 S1P처리군에 비해 유의적으로 증가되었음을 확인하였고 (도 2), 심박동 콜로니의 면적 또한 유의하게 넓어졌음을 확인하였다 (도 3). 이는 cP1P 처리가 S1P에 비해 우수한 분화 유도 기능을 가졌다는 것을 의미하며 심박동 콜로니의 수와 면적이 유의적으로 증가함으로서 기능성 심근세포를 대량으로 생산할 수 있음을 의미하는 것이다.

cP1P를 처리하는 심근분화배양법은 도 4 에 나와있으며, 이러한 분화배양법에 의한 심근세포 분화 시 대조군에 비해 심근분화 관련 마커유전자 (NKX2.5, MEF2C, TBX5, GATA4 및 TNNT2)의 mRNA 발현 수준이 현저히 증가함을 확인하였다 (도 5).

또 다른 일 실시예에서는 cP1P를 줄기세포에 처리한 경우 대조군(DMSO 처리)에 비해서 TNNT2의 단백질 발현 수준이 현저히 증가함을 면역형광염색법으로 확인하였다 (도 6).

또 다른 일 실시예에서는 cP1P를 줄기세포에 처리한 경우 대조군(DMSO 처리)에 비해서 SMAD 신호기전의 활성이 현저히 증가함을 확인하였다.

구체적으로, 심근세포 분화 주요기전 중, SMAD 신호기전의 한 요소인 SMAD1, SMAD5, 또는 SMAD8 단백질의 활성 정도는 해당 단백질의 인산화(phosphorylation) 정도로 확인할 수 있는데, cP1P를 처리하고 분화 5일째의 경우 대조군에 비해서 SMAD1/5/8 단백질의 활성이 현저히 높았고(도 7), cP1P를 처리하고 분화 5일째의 경우 대조군에 비해서 심장전구세포 마커인 NKX2.5 단백질의 발현이 SMAD1/5/8 단백질의 활성과 상응하게 현저히 높았다(도 8).

또한, 심장전구세포 마커의 NKX2.5 단백질의 발현에 따라 최종적으로 분화 7일째에 심근세포 마커인 MLC2V 단백질의 발현 수준이 cP1P를 처리한 경우 대조군에 비해서 현저하게 높았다(도 8). cP1P에 의한 SMAD1/5/8의 활성은 cP1P 100 nM에서 가장 높았다 (도 9).

한편, SMAD1, SMAD5, 또는 SMAD8 단백질의 활성은 그 단백질의 인산화 정도에 의해 조절되므로, cP1P의 처리에 의해서 SMAD1, SMAD5, 또는 SMAD8 단백질을 인산화시키는 다른 단백질의 활성이 증가할 것으로 예상했다.

실제로, cP1P를 처리하고 분화 5일째에서 SMAD1/5/8 단백질의 활성화 증가와 RHOA/ROCK1의 신호기전의 활성 증가 패턴이 일치하였다(도 8). ROCK1(Rho-associated protein kinase 1)은 RHOA에 의해 활성화되고 RHOA/ROCK 신호기전(signaling)으로 알려져 있다. 즉, cP1P 처리에 의하여 분화 5일째에 RHOA/ROCK1 신호기전이 빠르게 활성화 되고, ROCK1 단백질에 의해 SMAD1/5/8 단백질이 인산화되어 활성화된 것으로 보인다. 또한, ROCK1 단백질에 의해서 인산화에 의해서 활성화된 SMAD1/5/8 단백질은 SMAD4와 복합체를 이루어 세포질에서 핵으로 전좌되어 NKX2.5과 같은 심장전구세포 유전자의 발현에 증폭자(enhancer)역할을 하여 최종적으로 심근세포 분화효율을 높인 것으로 보인다(도 10).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.

본 발명의 하나의 양태는 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 기재된 cP1P는 공지된 물질로 그 화학적 구조는 도 12에 개시되어 있다.

본원에 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 유기화학 분야에 공지되어 있는 통상의 지식을 이용하여 제조할 수 없으며, 예를 들어 (S. Li, W.K. Wilson, G.J. Schroepfer, Chemical synthesis of D-ribo-phytosphingosine-1-phosphate, potential modulator of cellular processes. J. Lipid Res. 40: 117-125, 1999)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 P1P를 제조할 수는 있지만, 이는 본원의 cP1P를 합성하는 기술과 상이하고, 본원의 cP1P는 본 발명자의 등록특허 "신규한 피토스핑고신-1-포스페이트 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 탈모의 예방, 치료 또는 육모용 조성물"(대한민국 등록특허 제10-1340556호)에 개시된 방법에 의해서만 합성이 가능하다.

상기 염은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여 시 통상적인 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하고, 상기 염으로는 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 약학적으로 허용 가능한 염은 상기 cP1P 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하는 산부가염으로 존재할 수 있다. 또한, 본원에 따른 상기 cP1P 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본원의 용어 "줄기세포"는 한 개의 세포가 여러 종류의 다른 세포를 생산해 낼 수 있는 전분화능을 가진 세포로서, 우리 몸의 손상 받은 부위의 세포들을 새로 재생할 수 있는 세포들을 통칭한다. 줄기세포는 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 자가 재생산 능력, 특정 환경에서 기능성 특정 세포로 분화할 수 있는 분화능, 면역세포와 반응하여 면역반응을 조절하는 면역 조절능을 갖는다. 줄기세포의 종류는 분화되는 세포의 영역에 따라 인체를 구성하는 200여 가지의 세포로 모두 분화할 능력을 가진 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)와 특정 종류의 세포로 분화할 수 있도록 특화된 조직-특이적 줄기세포(tissue-specific stem cell)로 나눌 수 있다. 또한 줄기세포를 획득하기 위한 공급원에 따라 수정란에서 출발한 배아 또는 배반포(blastocyte)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생 과정이 끝난 신생아 또는 성인의 신체 각 조직에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)로 분류될 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

본원에서 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며, 배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다. 한편, 본 발명의 배아줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 배아줄기세포이다.

배아줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽성 줄기세포로 분화할 수 있다.

본원에서 용어 “분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 전분화능 배아줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 혈관모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 혈관 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등)로 분화될 수 있다. 한편, 본 발명에서는 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 경우 심근세포로 분화가 촉진된다.

본원에서 용어 "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells)"는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능 분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 여기에서 처리하는 방법은 화합물, 유전적 변환 또는 특정 조건으로 배양하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells)"는 인간의 체세포 또는 인간의 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 상기의 인간 유도만능줄기세포는 섬유아세포 유래일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈액 등 다양한 기원으로부터 유래할 수 있다. 또한, 상기 인간 유도만능줄기세포는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 등 리프로그래밍 관련 유전자를 발현시켜 제작될 수 있다. 이때, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자 등의 발현은 렌티바이러스, 레트로바이러스 감염 또는 에피조말 시스템(episomal system)을 통해 유래될 수 있다.

본원에서 cP1P, 이들 유도체 화합물, 또는 이의 염은 줄기세포의 증식 또는 성장 촉진과 더불어 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 효과를 나타내기 위해서, 줄기세포배양 또는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는데 사용되는 통상의 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 본원의 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포의 증식이 촉진되고, 줄기세포 사멸이 저해되고, 줄기세포 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포의 증식이 촉진되고, 세포 사멸이 저해되고, 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 이와 동시에 줄기세포에서 심근세포로 분화되는 효율이 현저하게 증가하고, 우수한 기능의 심근세포로 분화되는 비율이 현저하게 증가한다.

상기 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 본원의 목적에 부합하는 한, 목적하는 구체적 세포의 종류에 따라 적절한 농도로 포함할 수 있다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 포함된 cP1P의 농도 범위는 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.5 내지 500 nM 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.8 nM 내지 200 nM 또는 1 nM 내지 100 nM 일 수 있고, 상기 농도 범위의 cP1P가 줄기세포 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

상기 cP1P를 유효성분으로 포함하는 조성물을 세포 배양 용기에 첨가하여 줄기세포를 배양하는 경우, 세포 배양 용기에서 줄기세포가 단일세포로부터 다수의 콜로니(colony, 세포 군집 형성)를 효과적으로 형성하여 성장할 수 있고, 바람직하게는 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포가 콜로니를 형성하여 성장할 수 있다.

본원에서 줄기세포 배양에 사용되는 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 또는 mTeSR1을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본원에 따른 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물을 배지(또는 배양액)에 첨가하는 경우 혈청성분이 없는 무혈청 배지 또는 혈청성분이 감소된 저혈청 배지 상태에서도 줄기세포의 증식이 이루어졌다.

본원 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물은 무혈청 또는 혈청성분을 0.1 내지 20 중량％ 함유하는 것일 수 있다.

상기 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

본원은 줄기세포의 증식 및 배양을 위해 필요한 동물 유래 혈청 대신 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 줄기세포 배지 첨가용 조성물 또는 무혈청 배지 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양하고, 높은 효율로 줄기세포를 심근세포로 분화시킬 수 있고, 재현성 있는 시험 및 생산 공정의 확립이 가능하다.

저혈청 배지에는 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청이 0.1 내지 3 중량％의 우태아혈청(FBS)을 첨가되며, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

본원의 상기 "줄기세포"는 상기한 바와 같으며, 골수, 지방조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 태반 등의 다양한 성체 조직 및 골수 유래 세포에서 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또 하나의 양태로 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 사항은 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 포함된 cP1P의 농도 범위는 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.5 내지 500 nM 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.8 nM 내지 200 nM 또는 1 nM 내지 100 nM 일 수 있고, 상기 농도 범위의 cP1P가 줄기세포 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

구체적으로, 상기 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 경우 줄기세포의 증식이 촉진되고, 줄기세포 사멸이 저해되고, 줄기세포 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포의 증식이 촉진되고, 세포 사멸이 저해되고, 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 이와 동시에 줄기세포에서 심근세포로 분화되는 효율이 현저하게 증가하고, 우수한 기능의 심근세포로 분화되는 비율이 현저하게 증가한다.

또 하나의 양태로 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 분화 유도된 심근세포에 관한 것이다.

상기 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 사항은 분화 유도된 심근세포의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 분화 유도된 심근세포에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 포함된 cP1P의 농도 범위는 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.5 내지 500 nM 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.8 nM 내지 200 nM 또는 1 nM 내지 100 nM 일 수 있고, 상기 농도 범위의 cP1P가 줄기세포 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

또한, 본원의 상기 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 분화 유도된 심근세포는 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로, 상기 심근세포는 줄기세포에서 심근세포로 분화되기 시작하면서 (i) NKX2.5, MEF2C, TBX5, GATA4, TNNT2, MLC2V, 또는 RHOA/ROCK1 유전자를 발현하고, (ii) SMAD 신호기전(signaling)이 활성화되어지고, (iii) 박동하는 세로포서, 박동하는 콜로니의 박동 면적 및 개수가 현저히 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 및 이를 이용하여 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 방법을 이용하여 제조한 심근세포 또는 오가노이드는 심장 질환을 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있고, 특히 오가노이드는 신약개발 및 독성분석에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포를 현저히 높은 효율로 기능성 심근세포로 분화시킬 수 있다.

도 1은 줄기세포를 심근세포로 분화시키기 위해서 cP1P 또는 S1P를 처리한 후, 심근세포 마커 TNNT2 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 2는 cP1P 처리 또는 S1P 처리 또는 각 대조군 처리에 따른 심근세포 분화 후, 심박동 콜로니의 개수를 확인한 결과이다.
도 3는 cP1P 처리 또는 S1P 처리 또는 각 대조군 처리에 따른 심근세포 분화 후, 심박동 콜로니의 면적을 확인한 결과이다.
도 4는 줄기세포를 심근세포로 분화시키기 위해서 cP1P를 처리하는 실험방법을 나타낸 것이다.
도 5는 cP1P 처리 또는 대조군 처리에 따른 분화과정에서 심근세포 관련 마커의 mRNA 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 6은 cP1P 처리 또는 대조군 처리에 따른 분화과정에서 심근세포 관련 마커의 발현을 면역형광염색법으로 분석한 결과이다.
도 7은 cP1P 처리 또는 대조군 처리에 따른 분화과정에서 SMAD 신호기전의 활성을 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 8은 cP1P 처리 또는 대조군 처리에 따른 분화과정에서 SMAD 신호기전의 활성을 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 9은 cP1P 처리 농도에 따른 분화과정에서 SMAD 신호기전 활성화 변화를 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 10는 cP1P가 SMAD 신호기전을 활성화시키고 이를 통해 RHOA/ROCK 신호기전을 활성화하여 종국적으로 심근세포 분화효율을 높일 수 있음을 나타낸 것이다.
도 11은 cP1P를 이용하여 분화시킨 심근세포의 이용을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 12은 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)의 화학적 구조를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

참고예 1. 인간 전분화능 줄기세포의 배양방법

35 mm 배양접시를 코팅액인 Matrigel(BD)를 이용하여 37℃ 인큐베이터에서 12시간 동안 코팅하고, 그리고 나서 상기 코팅액을 제거하고 배양하고자 하는 세포의 생존과 배양접시 내의 부착능을 향상시키기 위해서 10 uM Y27632(ROCK inhibitor, Tocris)가 포함된 mTeSR1(STEMCELL Tech.) 배양액을 배양접시에 넣고, hPSCs(CHA-ESC15; CHA Stem Cell Institute) 세포를 2000 cells/cm² 밀도로 배양접시에 파종하고, 다음 계대까지 Y27632가 포함되지 않은 mTeSR1 배양액으로 매일 교체하여 세포를 배양하였다(도 4, Step 1).

실시예 1. cP1P를 이용한 심근세포 분화유도

참고예 1과 같은 방법으로 미분화 줄기세포를 배양하여 단일세포(single cell)로 분리한 후, 코팅제인 Matrigel로 12-well 배양접시를 12시간 코팅한 후 분화를 유도하기 위해서 10 uM Y27632(ROCK inhibitor, Tocris)이 포함된 mTeSR1(STEMCELL Tech.) 배양액상에 상기 단일세포를 파종하고 매일 배양액을 Y27632가 포함되지 않은 mTeSR1 배양액으로 교체하여 세포를 배양하였다. 배양접시 내의 세포 밀도가 약 80~90%에 도달(약 5일)하면 상기 배양액을 100 nM의 cP1P(대한민국 공개특허 제10-2017-0129460호, 주식회사 엑세쏘바이오 제조), 8 uM CHIR99021(GSK3 inhibitor, Tocris) 및 2%(w/v) B27 minus insulin(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배양액(Gibco)으로 교체하고, 정확히 24시간 뒤에 2%(w/v) B27 minus insulin(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배양액(Gibco)으로 교체한 후, 분화시작 3일째 되는 날에 배양접시에 남아있는 분화 배양액과 새 분화배양액을 1:1을 비율로 섞은 후(CM(combined media)), 100 nM의 cP1P 및 5 uM IWR-1(Wnt inhibitor, Selleckchem)을 처리하고, 그리고 나서 배양액을 교체하지 않고 24시간 동안 배양하고, 그 이후 분화 8일까지 매일 2%(w/v) B27 minus insulin(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배양액(Gibco)으로 배양액을 교체하였다(도 4, Step 2).

비교예 1.

참조예 1 및 실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 배양하고 이를 심근세포로 분화를 유도하되, cP1P를 사용하지 않고 대신에 100 nM DMSO(Sigma-Aldrich, D4540) 또는 100 nM MeOH(Sigma-Aldrich, 34860)를 처리하였다.

비교예 2.

참조예 1 및 실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 배양하고 이를 심근세포로 분화를 유도하되, cP1P를 사용하지 않고 대신에 1 uM S1P(Sphingosine-1-phosphate)(Sigma-Aldrich US, 73914)를 처리하였다.

실험예 1. cP1P에 의한 줄기세포의 심근세포로의 분화를 qRT-PCR 방법으로 확인

cP1P가 줄기세포를 특이적이게 심근세포로 분화시키는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 8일째에 Qiazol(Qiagen, 미국)을 첨가하여 세포를 파쇄하고, 여기에 클로로포름을 넣어 12,000Xg 및 4℃의 조건하에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 수득된 상청액에 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침강시킨 후, 침강된 RNA를 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 세척하였다. 이를 7,500 Xg 및 4℃의 조건하에서 5분 동안 원심분리하여 RNA 펠렛을 수득하고, 10분 동안 상온에서 건조시켰다. 건조된 펠렛에 30 uL의 DEPC-증류수를 첨가하여 RNA를 수득하였다.

수득된 RNA는 역전사 키트(Toyobo, 일본)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 gDNA를 제거하고 cDNA를 수득하였다. 수득된 cDNA에 2x 에바그린 마스터 믹스(Labopass, 대한민국), 하기 표 1에 기재된 0.4 μM의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 첨가하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 결과로부터 유전자 각각의 발현량은 Pfaffl의 변형된 델타-델타 Ct 방법을 이용하여 수득하였다.

한편, 대조군 유전자는 GAPDH를 사용하였다.

이름	염기서열	서열번호
NKX2.5_F	AGT GTG CGT CTG CCT TTC	1
NKX2.5_R	GTT GTC CGC CTC TGT CTT C	2
MEF2C_F	ATG GAT GAA CGT AAC AGA CAG GT	3
MEF2C_R	CGG CTC GTT GTA CTC CGT G	4
TBX5_F	TTG CAT GTA TGC CAG CTC TG	5
TBX5_R	CTG GTA GGG TAG CCT GTC C	6
GATA4_F	AGA TGG GAC GGG TCA CTA TC	7
GATA4_R	CAG TTG GCA CAG GAG AGG	8
TNNT2_F	AGC GGA AAA GTG GGA AGA G	9
TNNT2_R	TCC AAG TTA TAG ATG CTC TGC C	10
GAPDH_F	GTC ATC CCT GAG CTG AAC GG	11
GAPDH_R	CCA CCT GGT GCT CAG TGT AG	12

그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 줄기세포 분화과정에서 cP1P를 처리한 경우 대조군에 비해서 심근세포 관련 마커(NKX2.5, MEF2C, TBX5, GATA4 및 TNNT2)의 mRNA 발현 수준이 1.3배 내지 6배 가량 높았다(도 5).

한편, NKX2.5, MEF2C, TBX5 및 GATA4 유전자는 심장전구세포 마커이고, TNNT2 유전자는 심근세포의 마커이다.

실험예 2. cP1P에 의한 줄기세포의 심근세포로의 분화를 면역형광염색 방법으로 확인

cP1P가 줄기세포를 특이적이게 심근세포로 분화시키는지 여부를 확인하기 위해서 심근세포 마커인 TNNT2 단백질의 발현을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 8일째 얻은 세포를 DAPI(VECTASHIELD, #H-1200) 또는 TNNT2 항체(Invitrogen(MA5-12960))로 염색하여 라이카 형광현미경(Leica, DM 5000B; Leica CTR 5000)으로 확인하였다.

그 결과 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 줄기세포 분화과정에서 cP1P를 처리한 경우 대조군에 비해서 심근세포 관련 마커인 TNNT2의 단백질 발현이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

즉, cP1P를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우 대조군에 비해서 세포 수 대비 심근세포 분화 효율이 높았다.

실험예 3. cP1P에 의한 줄기세포의 심근세포로의 분화를 웨스턴 블롯 방법으로 확인

cP1P가 줄기세포를 특이적이게 심근세포로 분화시키는지 여부를 확인하기 위해서 심근세포 마커인 TNNT2 단백질의 발현을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1, 비교예 1, 또는 비교예 2과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 8일째 얻은 세포에 용해 완충액[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1% NP40, 0.25% 소듐 디옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA], SDS(sodium dodecyl sulfate), Na₃O₄V 및 프로테아제 억제제 칵테일(GenDepot)을 첨가하고 4℃에서 15분 동안 방치하여 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 13,000 rpm 및 4℃의 조건하에서 30분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 상청액 내 존재하는 단백질은 BCA 시약(Thermo Scientifics)을 이용하여 정량하고, 여기에 4x 샘플 완충액[4 ㎖의 100% 글리세롤, 2.4 ㎖의 Tris-HCl(pH 6.8), 0.8 g의 SDS, 4 ㎎의 브롬화페놀 블루, 0.4 mL의 β-머캅토에탄올 및 3.1 mL의 H₂O를 첨가하고, 최종 부피가 10 mL가 되도록 맞춤]을 첨가하고, 100℃에서 5분 동안 끓였다. 이를 이용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 단백질을 Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Bio-rad)에 이동시켰다. 상기 막을 5%(w/v) 탈지 우유를 포함하는 용액에 넣어 1시간 동안 전처리하고, 1차 항체로서 GAPDH(Cell Signaling, 2118S) 또는 TNNT2(Invitrogen, MA5-12960) 단백질에 대한 항체를 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 이후, 2차 항체를 반응시키고, ECL 용액(ELPIS BIOTECH, 한국)을 사용하여 감광시킨 후, 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 줄기세포 분화과정에서 cP1P를 처리한 경우 대조군에 비해서 심근세포 관련 마커인 TNNT2의 단백질 발현이 3.58배 가량 높았고, 이는 S1P 처리 시 증가한 심근세포 관련 마커인 TNNT2의 단백질 발현양보다 현저하게 높았다.

실험예 4. cP1P 처리에 의한 심근세포 분화 과정에서 SMAD 신호기전 활성화 확인

심근세포 분화 과정 중 심장전구세포에서 심근세포로의 분화과정에 SMAD 신호기전(signaling)이 관여한다는 것으로 알려져 있으므로(van Wijk B. Cardiovascular research. 2007 74(2):244-255), cP1P 처리에 의한 심근세포 분화 과정에서 SMAD 신호기전(signaling)이 활성화되는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 시기별 얻은 세포를 실험예 3과 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하되, p-SMAD1/5/8(Millipore, Ab3848-I) 항체, SMAD1/5/8(Santa cruz, sc-6031-R) 항체, GAPDH 항체(Santa cruz, sc-32233), NKX2.5(Abcam, ab91196), MLC2V(Proteintech, 10906-1-AP), ROCK1(Santa cruz, sc-6055) 및 RHOA(Abcam, ab187027)를 이용하였고, 그 결과를 도 7 내지 도 8에 나타냈다.

그 결과 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 분화 5일의 경우 cP1P를 처리한 군의 SMAD1/5/8의 활성(p-SMAD1/5/8 단백질의 양)이 대조군의 SMAD1/5/8 활성에 비해 16배 가량 높은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 분화 5일의 경우 cP1P를 처리한 군의 심장전구세포 마커의 NKX2.5의 발현은 대조군과 비슷했으나, cP1P를 처리한 군의 분화 7일째에 성숙한 심근세포 마커인 MLC2V의 발현이 대조군에 비해서 1.4배 가량 높았고 분화 5일의 경우 cP1P를 처리한 군의 RHOA 및 ROCK1의 신호기전의 활성이 대조군에 비해서 6.5 및 1.6배 가량 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. cP1P 처리 농도에 따른 SMAD 신호기전 활성화 변화 확인

cP1P 처리 농도에 따라 SMAD 신호기전 활성화가 변화하는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, cP1P를 농도별로 처리 후 분화 5일째에 실험예 5와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 그 결과를 도 9에 나타냈다.

그 결과 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 100 nM의 cP1P를 처리한 경우 SMAD1/5/8의 신호기전이 가장 많이 활성화되었으나, cP1P를 처리하지 않거나 1000 nM의 고농도로 cP1P를 처리한 경우 SMAD1/5/8 신호기전이 활성화되는 정도가 상당히 낮았다.

실험예 6. cP1P 처리에 의해서 분화된 심근세포의 기능 분석-심박동 콜로니의 개수

cP1P가 줄기세포를 기능적으로 활성화된 심근세포로 분화시키는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 7일 후 배양접시 내에서의 심근 비팅 콜로니의 개수를 분석하였다.

그 결과 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 줄기세포 분화과정에서, cP1P 처리 배양접시 내의 심근 비팅 콜로니의 개수는 대조군에 비해서 약 1.9배 증가하였고, S1P처리 배양접시 내의 비팅 콜로니 개수는 대조군에 비해서 약 1.5배 증가된 것을 확인할 수 있었다(* P<0.05).

이를 통해, 줄기세포 분화과정에서 cP1P를 처리한 경우 대조군 및 S1P 처리군에 비해서 심근세포 분화효율이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7. cP1P 처리에 의해서 분화된 심근세포의 기능 분석-심박동 콜로니의 면적

cP1P가 줄기세포를 기능적으로 활성화된 심근세포로 분화시키는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1, 비교예 1, 또는 비교예 2와 같은 방법으로 줄기세포를 심근세포로 분화시키고, 분화 7일 후 배양접시 내에서의 심박동 콜로니의 면적을 분석하였다.

그 결과 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군 및 S1P 처리군에 비해 심박동 콜로니의 면적이 유의적으로 넓은 것을 확인할 수 있었다(* P<0.05).

이를 통해, 줄기세포 분화과정에서 cP1P를 처리한 경우 대조군 및 S1P 처리군에 비해서 심근세포 분화효율이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University AXCESO BIOPHARMA Co.,Ltd. <120> Medium composition for inducing differentiation of stem cells into cardiomyocytes <130> HYP19-0017KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2.5_F <400> 1 agtgtgcgtc tgcctttc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2.5_R <400> 2 gttgtccgcc tctgtcttc 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEF2C_F <400> 3 atggatgaac gtaacagaca ggt 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEF2C_R <400> 4 cggctcgttg tactccgtg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBX5_F <400> 5 ttgcatgtat gccagctctg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBX5_R <400> 6 ctggtagggt agcctgtcc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4_F <400> 7 agatgggacg ggtcactatc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4_R <400> 8 cagttggcac aggagagg 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNNT2_F <400> 9 agcggaaaag tgggaagag 19 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNNT2_R <400> 10 tccaagttat agatgctctg cc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 11 gtcatccctg agctgaacgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 12 ccacctggtg ctcagtgtag 20

Claims (13)

1. cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화 유도하기 위한 배지 조성물로서,
   상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)이고,
   상기 조성물은 심박동 콜로니의 숫자를 증가시키고, 심박동 콜로니의 면적을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 cP1P은 0.1 nM 내지 1000 nM의 농도인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 증식을 촉진하고, 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 무혈청 또는 혈청성분을 0.1 내지 3 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
   
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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