KR102427028B1 - 가축 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 배양용 조성물은 돼지 근육세포의 증식능 및 분화능을 장기간 체외에서 유지시킬 수 있으므로, 배양육 생산과 같은 농생명공학적 활용에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 가축 근육 줄기세포의 체외 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
근육 조직의 재생을 담당하는 근육 줄기세포는 생장 정지 상태의 근위성세포(quiescent satellite cells)와 근아세포(myoblast)라 불리는 활성화된 근위성세포(activated satellite cells)와 같은 전구세포를 지칭한다. 체내에서 생장 정지 상태의 근위성세포는 근섬유의 기저층 아래에 존재하며, 근육이 손상되는 경우 성장 인자의 자극을 통해 근아세포로 활성화되고 근세포와 근섬유로의 분화가 진행된다. 체외에서 근육 줄기세포는 일반적으로 근아세포의 형태로 배양된다. 근육 조직으로부터 근육 줄기세포를 분리하고 배양하는 절차는 근아세포로 활성화시키는 일종의 근육 손상이기 때문에 줄기세포능을 유지하면서 근육 줄기세포를 배양하는 것은 일반적으로 용이하지 않다고 알려져 있다.
줄기세포의 체외 배양은 3차원 배양과 같이 체내 세포를 둘러싼 미세환경을 모방하여 이루어지는 것이 일반적이다. 따라서, 체외에서 근육 줄기세포의 증식 또는 배양을 위해서는 기질 및 간질세포와 같은 주변 세포와 분리된 근육 줄기세포 및 근육 줄기세포 자체에서 분비되는 것으로 알려진 다양한 사이토카인과 호르몬을 처리하여 배양하는 방법이 이용된다. 체외에서 근육 줄기세포의 성장을 돕는 것으로 알려진 인자로 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGFs) 및 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨(IL), 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터페론(IFN) 등이 있다. 또한 상기 성장인자들을 포함하는 소태아혈청(FBS)을 배양배지에 고농도로 처리하여 근육 줄기세포를 배양하는 방법도 널리 사용되어 왔다.
하지만, 이와 같이 다양한 근육 줄기세포 배양 방법에도 불구하고, 근육 줄기세포를 장기간 체외에서 배양하면 계대수에 따라 근육 줄기세포 표지유전자의 발현 정도, 근육 분화능 및 증식능이 점진적으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 또한 여러 연구자들이 돼지 근육 줄기세포를 장기간 체외배양하기 위해 소태아혈청(FBS)이 포함된 최소필수배지(MEM)를 널리 사용해왔지만, 본 발명에서는 돼지 근육 줄기세포를 해당 배양 조건에서 장기간 배양하는 경우, 분화능 유지가 어렵다는 것을 확인하였다.
이러한 배경하에서, 본 발명의 발명자들은 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 다각도로 연구한 결과, 본 발명의 근육 줄기세포 배양용 조성물을 이용하여 근육 줄기세포를 배양하는 경우, 장기간 체외 배양에도 불구하고 근육 줄기세포의 증식능 및 근세포로의 분화능을 유지하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. Doumit ME, Merkel RA. 1992. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue Cell 24:253-262.
2. Jeong JY, Kim JM, Rajesh RV, Suresh S, Jang GW, Lee KT, Kim TH, Park M, Jeong HJ, Kim KW, Cho YM, Lee HJ. 2013. Comparison of gene expression levels of porcine satellite cells from postnatal muscle tissue during differentiation. Reproductive & developmental biology 37:219-224.
본 발명은 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 가축 근용 줄기세포 배양용 조성물을 이용한 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 EGF, 덱사메타손을 포함하는 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 추가적으로 p38 저해제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 p38 저해제는 SB203580일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, EGF의 함량은 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml일 수 있고, 상기 덱사메타손의 함량은 10-3 μM 내지 100 μM일 수 있고, 상기 SB203580의 함량은 1 μM 내지 100 μM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라 상기 가축은 돼지일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라 상기 돼지는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라 상기 돼지는 버크셔종일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 이용하여 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 이용한 배양육 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 장시간의 체외배양 중에도 가축 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능을 유지시킬 수 있으므로, 향후 배양육 생산과 같은 농생명공학적 활용에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 소태아혈청(FBS)이 함유된 최소필수배지(MEM)에서 배양한 돼지 근육 줄기세포를 나타낸 것이다. 도 1A는 체외 배양동안 돼지 근육 줄기세포의 형태학적 관찰 결과(스케일바 = 400 μm)이고, 도 1B는 qPCR을 사용하여 측정한 체외 배양동안의 근육 표지 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과이다.
도 2는 돼지 근육 줄기세포의 체외 배양 조건의 최적화 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 FBS가 포함된 기초배지 및 EGF와 덱사메타손이 포함된 배지로 배양된 돼지 근육 줄기세포의 증식률을 비교 분석한 결과이고, 도 2B는 체외 배양동안 돼지 근육 줄기세포에 대한 EGF 및 덱사메타손의 효과이고, 도 2C는 EGF 및 덱사메타손 처리시 체외 배양 중 근육 관련 표지 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이고, 도 2D는 체외 배양 동안 돼지 근육 줄기세포에 대한 SB203580의 효과이고, 도 2E는 SB203580 처리시 체외 배양 동안 근육 관련 표지 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 3은 다양한 돼지 품종으로부터 분리된 근육 줄기세포의 배양 결과에 관한 것으로 도 3A는 본 발명의 배지가 다양한 품종 유래의 돼지 근육 줄기세포에서 근육분화 관련 유전자 발현량에 대한 효과를 분석한 결과이고, 도 3B는 다양한 돼지 품종에서 분리된 근육 줄기세포의 세포 분열 속도를 분석한 결과이다.
도 4는 다양한 돼지 품종으로부터 분리된 근육 줄기세포의 근육 분화능을 분석한 결과이다. 도 4A는 면역학적 염색법을 통한 근육 줄기세포의 분화능을 확인한 것이고(스케일바 = 400 μm), 도 4B는 장기간 배양에 따른 근육 줄기세포의 마이오신 중쇄 유전자 발현 경향을 확인한 결과이다.
도 2는 돼지 근육 줄기세포의 체외 배양 조건의 최적화 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 FBS가 포함된 기초배지 및 EGF와 덱사메타손이 포함된 배지로 배양된 돼지 근육 줄기세포의 증식률을 비교 분석한 결과이고, 도 2B는 체외 배양동안 돼지 근육 줄기세포에 대한 EGF 및 덱사메타손의 효과이고, 도 2C는 EGF 및 덱사메타손 처리시 체외 배양 중 근육 관련 표지 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이고, 도 2D는 체외 배양 동안 돼지 근육 줄기세포에 대한 SB203580의 효과이고, 도 2E는 SB203580 처리시 체외 배양 동안 근육 관련 표지 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 3은 다양한 돼지 품종으로부터 분리된 근육 줄기세포의 배양 결과에 관한 것으로 도 3A는 본 발명의 배지가 다양한 품종 유래의 돼지 근육 줄기세포에서 근육분화 관련 유전자 발현량에 대한 효과를 분석한 결과이고, 도 3B는 다양한 돼지 품종에서 분리된 근육 줄기세포의 세포 분열 속도를 분석한 결과이다.
도 4는 다양한 돼지 품종으로부터 분리된 근육 줄기세포의 근육 분화능을 분석한 결과이다. 도 4A는 면역학적 염색법을 통한 근육 줄기세포의 분화능을 확인한 것이고(스케일바 = 400 μm), 도 4B는 장기간 배양에 따른 근육 줄기세포의 마이오신 중쇄 유전자 발현 경향을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 개시내용의 특정의 특성을 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어는 달리 지정되지 않는 한 이하에 기술된 정의에 따라 사용될 것이다.
본 명세서에서 어떤 양태들이 "~를 포함하는"이란 용어와 함께 기술되더라도, "~로 구성된" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성된"의 관점에서 기술된 다른 유사 양태들 또한 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명에서 용어 "배지", "배양 배지", "배양용 배지", "배지 조성물"또는 "배양용 조성물"은 체외 배양 조건에서 줄기세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 영양물질을 포함하는 배양액을 의미하는 것으로서 본 명세서에서는 구분되지 않고, 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 "근육 줄기세포"는 생장 정지 상태의 근위성세포(quiescent satellite cells)와 근아세포(myoblast)라 불리는 활성화된 근위성세포(activated satellite cells)와 같은 전구세포를 포함한다. 근육 줄기세포는 근세포로 분화할 수 있고, 특히 가축 유래 근육 줄기세포는 실제 배양육 생산 등에 사용될 수 있어, 농생물학적으로 효용가치가 매우 높은 세포이다.
본 발명에서 "근육 줄기세포의 배양"은 근육 줄기세포가 줄기세포능인 분화능을 유지한 채로, 세포증식하는 것을 의미한다.
앞서 언급한 바와 같이 근육 줄기세포는 분리하는 과정 자체가 근아세포로의 활성화, 및 근세포와 근섬유로의 분화를 유도하는 과정이므로, 체외에서 근육 줄기세포를 배양하는 것은 다양한 시도에도 불구하고 지금까지 표준화된 방법이 존재하지 않는다.
특히 돼지 근육 줄기세포 배양의 경우, 배양육 생산의 기초 재료가 되므로, 다양한 배양 배지를 이용한 돼지 근육 줄기세포 배양이 시도되어 왔다. 미확인된 성장인자를 다양하게 포함하는 고농도의 FBS는 체외 배양동안 돼지 근육 줄기세포의 증식능과 근육 분화능의 유지를 돕는다고 알려져 있다. 구체적으로는 고농도의 FBS가 포함된 MEM을 사용하는 것이 다양하게 보고되었고, 상기 MEM 기반 배지는 McCoy의 5A, Ham's F12, 또는 DMEM/F12 기반 배지에 비해 더 높은 돼지 근육 증식률을 보이는 것으로 알려져 있다.
하지만, 이러한 다양한 보고에도 불구하고, 본 발명에서는 해당 배양 조건(고농도의 FBS를 포함하는 MEM 배지 조건)에서 돼지 근육 줄기세포를 2주 동안 장기간 채외 배양하는 경우 점진적으로 증식능을 상식하는 것을 확인하였을 뿐 아니라, 근육 줄기세포 표지유전자인 PAX7, MYF5, MYOD1 유전자 및 근신생 관련 유전자인 MYOG 유전자의 발현이 첫번째 계대 배양 후 급격히 감소하는 것을 확인하였다.
이에 본 발명은 가축으로부터 분리된 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능을 장시간동안 체외에서 유지시키기 위한 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 EGF 및 덱사메타손을 포함할 수 있다.
EGF는 상피세포성장인자(Epidermal growth factor)로서 in vivo 및 in vitro에서 표피 및 상피 조직에서 뿐 아니라, 세포 배양시 섬유아세포(fibroblast)의 성장과 증식에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 중간엽 줄기세포의 분화를 유도한다고 알려져 있다.
덱사메타손(dexamethasone)은 합성 글루코코르티코이드(glucocorticoid)로서, 중간엽 줄기세포에서 osteogenic, adipogenic, chondrogenic 분화를 유도한다고 알려져 있고, 배아줄기세포에서는 hepatocyte로 분화를 유도한다고 알려져 있다.
이와 같이 EGF 및 덱사메타손이 줄기세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 미친다는 것은 보고된 바 있으나, EGF 및 덱사메타손이 가축 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능의 유지에 영향을 끼친다는 것은 보고된 바 없다.
본 발명의 일 구현예에 따른 EGF 및 덱사메타손을 포함하는 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 돼지 근육 줄기세포의 체외 배양시 기존에 사용되던 고농도 FBS가 포함된 MEM 배지보다 돼지에서 분리한 근육 줄기세포의 증식능을 높이고, 근육 줄기세포 관련 표지 유전자의 발현 감소폭을 줄이는 효과를 보였다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 EGF 및 덱사메타손은 각각 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml 및 10-3 μM 내지 100 μM의 함량을 가진다. EGF의 함량이 10-1 ng/ml 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 104 ng/ml 이상인 경우 농도 증가에 따른 추가적인 효과를 기대할 수 없다. 덱사메타손의 함량이 10-3 μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 100 μM 이상인 경우 세포에 독성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 EGF 및 덱사메타손은 각각 10 ng/ml 및 10 μM의 함량을 가지지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 EGF 및 덱사메타손이 포함된 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물의 기본 배지은 줄기세포의 배양에 적절한 해당 분야에서 사용되는 통상의 배지에서 임의로 선택될 수 있다. 또한, 배양 조건 역시 해당 분야에서 사용되는 적절한 조건에서 임의로 선택될 수 있다. 즉 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 세포 배양 최소 배지(CCMM: cll culture minimum medium)으로서, 일반적으로 탄소원, 질소원, 및 미량원소 성분을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 세포 배양 최소 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, aMEM(a-modified Minimum Essential Media), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있지만, 반드시 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 해당 업계에서 세포 배양에 사용되는 F-10 배지를 기본 배지로 한다.
본 발명의 배양용 조성물에는 추가적으로, 박테리아, 곰팡이 등의 감염을 막기 위해 항생제, 항진균제 및/또는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 해당 업계에서 일반적으로 사용하는 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상적으로 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용 가능하며, 항진균제로는 알포레리신 B, 마이코플라즈마 억제제로는 젠타마이신, 시프로플로사신, 아지트로마이신 등의 일반적으로 사용하는 물질을 사용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 시판되는 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic; AA)(Gibco)가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 배양용 조성물에는 FBS가 포함될 수 있다. 배지에 포함된 FBS의 함량은 5% 내지 20%이다. 본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에는 5%, 10%, 15%, 또는 20%의 FBS를 포함할 수 있고, 바람직하게는 10%의 FBS를 포함한다. 여기서 %는 v/v%를 의미한다.
또한, 본 발명의 배양용 조성물에는 1% 글루타맥스(또는 글루타민)과 0.1 mM 베타-머캅토에탄올을 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 EGF 및 덱사메타손을 포함하고, 추가적으로 p38 저해제를 포함한다.
SB203580으로 대표되는 p38 저해제는 배아줄기세포의 자기 재생능(self-renewal) 및 다양한 중간엽 줄기세포의 증식능을 유도하고, 일부 줄기세포의 분화를 유도한다고 알려져 있으나, 가축 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능의 유지에 영향을 끼친다는 것은 보고된 바 없다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 SB203580은 1 μM 내지 100 μM의 함량을 가진다. SB203580의 함량이 1 μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 100 μM 이상인 경우 세포에 독성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 SB203580은 20 μM의 함량을 가지지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 EGF, 덱사메타손 및 SB203580을 포함하는 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물은 EGF 및 덱사메타손이 포함되고, SB203580이 포함되지 않은 배지보다 돼지에서 분리한 근육 줄기세포의 증식능을 높이고, 근육 줄기세포 관련 표지 유전자의 발현 감소폭을 줄이는 효과를 보였다.
본 발명의 근육 줄기세포는 일반적인 가축에서 수득할 수 있다. 가축은 일반적으로 돼지, 소, 양, 닭, 염소, 토끼, 개 등을 의미하고, 본 발명에서는 돼지에서 근육 줄기세포를 수득할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
돼지는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), YBD종(Yorkshire X Berkshire X Duroc), 버크셔종, 듀록종, 및 한국 토종 돼지 등의 품종이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 근육 줄기세포를 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지의 근육에서 분리했지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지에서 분리한 근육 줄기세포 모두 본 발명의 EGF, 덱사메타손 및 SB203580이 포함된 본 발명의 배양용 조성물에서 배양되는 경우, 기존의 FBS 기반의 MEM 배지보다 더 짧은 군집 증식 시간(population doubling time)을 가진다는 것을 확인하였다. 구체적으로는 본 발명의 배양액에서는 약 22시간의 군집 증식 시간을 보이는데 반해, FBS 기반의 MEM 배지에서는 36~40시간의 군집 증식 시간을 보이기 때문에, 본 발명의 줄기세포 배양용 조성물은 다양한 품종 및 개체 유래의 돼지 근육 줄기세포에서 실험적 편차를 줄이고 일관된 결과를 도출하는데 도움을 줄 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예의 배양용 조성물은 YBD종 및 한국 토종 돼지에서 분리한 근육 줄기세포보다는 버크셔종에서 분리한 근육 줄기세포의 분화능 유지에 좀 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물을 이용한 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
상기 방법은 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 줄기세포를 미분화 상태로 유지할 수 있으며, 구체적으로는, 계대 배양하는 동안 또는 그 이후에도 줄기세포를 미분화 상태로 유지할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 3 내지 10 이상 계대 배양 후에도 줄기세포능을 유지할 수 있다
본 명세서에서 사용되는 용어, "계대 배양"은 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 상기 용어, "계대(passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 다능성 줄기세포로의 성장을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 이용한 배양육 생산 방법을 제공한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 모든 숫자는, 언급되었든지 아니든지, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 정밀한 수치는 본 개시내용의 추가적인 실시양태를 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 실시예에 개시된 수치의 정확성을 보장하기 위해 노력을 기울였다. 그러나, 측정된 모든 수치는 내재적으로 이의 각각의 측정 기법에서 실측된 표준 편차로부터 생성된 특정 오차값을 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 배양 배지에 따른 돼지 근육 줄기세포의 배양능 분석
실시예 1-1. 돼지 근육 줄기세포의 분리
모든 동물실험은 서울대학교의 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인(승인번호: SNU-180612-2) 후 서율대학교 동물관리실의 표준 규정에 따라 실시하였다.
돼지 근육 줄기세포는 CO2 흡입을 통해 안락사시킨 LYD(LYD; Landrace Х Yorkshire Х Duroc), 버크셔, 한국 토종 돼지의 대퇴 이두근(biceps femoris muscle)으로부터 근육 줄기세포를 분리하였다. 대퇴 이두근을 채취하여 2X 항생제 항진균제 (antibiotic-antimycotic; AA; Gibco, Gaithersburg, USA)가 함유된 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS; Welgene, Gyeongsan, Korea)로 세척하고 결합 조직(connetive tissue)과 혈관(blood vessel)을 제거하였다. 분리된 조직을 분쇄기에서 다진 다음 0.8mg/mL pronase(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 37 ℃에서 40분 동안 10분마다 voltexing하면서 분해하였다. 결과물을 1200 Хg 에서 15분 동안 원심분리하고, 침전물을 10 % 소태아혈청 (FBS; Gibco)을 함유하는 MEM에 재현탁시켰다. 근육 줄기세포 집단을 포함하는 분리된 세포에서 분해되지 않은 조직을 분리하기 위해 근육 조직을 300 Хg에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 수집하였다. 상층액을 100μm 세포여과망으로 여과하고 15 분 동안 1200 Хg 에서 원심 분리하여 단일세포군을 수확하였다.
분리한 세포는 아래 표기된 배양배지에서 배양하거나 사용할 때까지 10 % 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 배양배지를 이용하여 동결보존하였다.
실시예 1-2. 배양 배지에 따른 분리된 돼지 근육 줄기세포의 배양
LYD 돼지에서 분리된 돼지 근육 줄기세포는 아래의 표에 기재된 배지들을 이용하여 젤라틴 코팅 접시에서 배양하였다. 돼지 근육 줄기세포는 3 일마다 계대배양하였다. 배양 배지는 아래 표 1에 기재한 바와 같이 MEM 기반의 10% FBS 및 1% AA가 포함된 MEM 배지(이하 'MEM 기반 배지'라 함)와, F-10 기반 배지로서 10% FBS, 1% AA, 1% 글루타맥스(GlutaMax(Gibco)), 0.1mM 베타-머캅토에탄올 10ng/ml EGF, 및 10uM 덱사메타손이 포함된 F-10 배지(이하 'F10/EGF+dexa 배지'라 함) 및 상기 F10/EGF+dexa 배지에 추가로 20μM SB203580(Cayman Chemical, Ann Arbor, USA)이 포함된 F-10 배지(이하 'F10/EGF+dexa+SB 배지'라 함)를 사용하였다. 근육 줄기세포는 배양기간 동안 배지는 48 시간마다 교체하고, 37℃에서 5% CO2가 포함된 조건에서 배양하였다.
| 배양 배지 명 | 배지에 포함된 성분 |
| MEM | 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) AA(Gibco)가 포함된 MEM 배지 |
| F10/EGF+dexa | 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) AA(Gibco), 1%(v/v) 글루타맥스(Gibco), 0.1mM 베타-머캅토에탄올, 10ng/ml EGF, 및 10uM 덱사메타손이 포함된 F-10 배지 |
| F10/EGF+dexa+SB | 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) AA(Gibco), 1%(v/v) 글루타맥스 (Gibco), 0.1mM 베타-머캅토에탄올, 10ng/ml EGF, 10uM 덱사메타손, 및 20μM SB203580이 포함된 F-10 배지 |
실시예 1-3. MEM 기반 배지를 이용한 분리된 돼지 근육 줄기 세포의 배양능 확인
돼지 근육 줄기세포는 MEM 기반 배지에서 앞서 실시예 1-1의 배양방법을 이용하여 2주 동안 장기간 배양한 후(passage 5) 현미경으로 세포 모양을 관찰하였다. 상기 관찰 결과는 도면 1A에 나타내었다. 돼지 근육 줄기세포를 MEM 기반 배지에서 2주에 걸쳐 장기간 배양하는 경우 점차적으로 증식능력과 방추형의 길게 늘어난 형태로 대표되는 근육 줄기세포의 특징적인 형태를 상실하였다(도 1A).
또한, 2주의 배양기간 동안 각각의 passage에서 세포를 분리하여 근위성세포의 표지자인 MYF5, PAX7 유전자, 근아세포의 표지자인 MYOD1 유전자 및 근 신생 관련 표지 유전자인 MYOG 유전자의 발현을 정량적 PCR법에 의해 검출하였다. 상기 MYF5, PAX7, MYOD1 및 MYOG 유전자는 근육 줄기세포 관련 표지 유전자로 알려져 있다.
분리된 세포의 Total RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 추출하고 cDNA는 High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 합성했다. cDNA는 아래 나열된 각 프라이머 세트와 DyNAmo HS SYBR Green qPCR 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 증폭하였다 : PAX7의 경우 5'-GTGCCCTCAGTGAGTTCGAT-3'(forward) 및 5 '-TCCAGACGGTTCCCTTTGTC-3'(reverse); MYOD1의 경우 5'-CTGCCCAAGGTGGAAATCCT-3'(forward) 및 5'-GGGGGCCGCTATAATCCATC-3'(reverse) MYF5의 경우 5'-AGTTCGGGGACGAGTTTGAG-3'(forward) 및 5'-TCAAACGCCTGGTTGACCTT-3'(reverse) MYOG의 경우 5'-GAGCTGTATGAGACATCCCCC-3 '(forward) 및 5'-GTGGACGGGCAGGTAGTTTT-3'(reverse) GAPDH의 경우 5'-TGCTCCTCCCCGTTCGAC-3'(forward) 및 5'-ATGCGGCCAAATCCGTTC-3'(reverse).
상기 MYF5, PAX7, MYOD1 및 MYOG 유전자의 발현양 분석 결과는 도 1B에 나타내었고, 각각의 발현 양은 GAPDH 유전자의 발현양으로 보정(normalized)되었다. 2주의 장기 배양기간 동안 계대가 지날수록 PAX7, MYF5, MYOD1, MYOG 유전자의 발현양이 급격하게 감소한 것으로 나타났다(도면 1B). 이와 같은 결과는 FBS를 포함하는 MEM 기반 배지는 체외배양에서 돼지 근육 줄기세포의 줄기세포능을 지원할 수 없다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 1-4. F10 기반 배지에 의한 분리된 돼지 근육 줄기 세포의 배양능 확인
앞서 MEM 기반 배지를 이용하여 돼지 근육 줄기세포를 계대배양하였을 때 급격하게 근위성세포, 근아세포의 표지자 및 근 신생 관련 표지 유전자의 발현양이 줄어드는 것을 확인하였기 때문에, 돼지 근육 줄기세포의 줄기세포능을 유지하는데 적합한 체외 배양 조건을 찾기 위해 표피 성장 인자(EGF) 및 덱사메타손을 포함하는 배지(F10/EGF+Dexa)를 시험하였다.
분리된 돼지 근육 줄기세포를 MEM 기반 배지 및 F10/EGF+Dexa 배지에서 각각 7일 동안 배양한 결과, 기존의 MEM 기반 배지 배양에 비해 F10/EGF+Dexa 배지 배양에서 돼지 근육 줄기세포의 증식률이 크게 증가하는 경향을 보였다(도 2A).
또한, 각 계대별로 관찰한 결과 근육 줄기세포의 특성이 F10/EGF+Dexa 배지 배양에서 MEM 기반 배지에 비해 유지되는 경향을 보였고(도 2B), 근육 줄기세포 관련 표지 유전자인 PAX7, MYF5, MYOD 및 MYOG 유전자의 발현 모두 MEM 기반 배지 배양에서보다는 F10/EGF+Dexa 배지 배양에서 계대별 감소폭이 줄어드는 경향을 보였다(도 2C).
다음으로 돼지 근육 줄기세포 배양에 있어서, EGF, 덱사메타손과 함께 p38 억제제의 효과를 조사하였다.
앞서 결과를 확인한 F10/EGF+Dexa 배지와 상기 배지에 대표적인 p38 억제제인 SB203580를 추가한 배양 배지(F10/EGF+Dexa+SB)에서 돼지 근육 줄기세포를 배양한 결과를 분석하였다. 광학현미경 하에서 F10/EGF+Dexa+SB 배지 배양군과 F10/EGF+Dexa 배지 배양군 사이에는 형태학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도면 2D). 하지만, 근육 관련 표지 유전자는 F10/EGF+Dexa+SB 배지 배양군에서 장기간 배양하는 동안 유의하게 지속적으로 높게 발현되었을 뿐 아니라, MYF5 및 MYOG 유전자의 경우 P1, P2에서 P0보다 발현율이 더 높았다(도면 2E).
실시예 2. 돼지 품종에 따른 돼지 근육 줄기 세포의 근육 분화능 확인
돼지 품종에 따른 돼지 근육 줄기세포의 근육 분화능을 확인하기 위해 앞서 효과를 확인한 F10/EGF+Dexa+SB 배지를 이용하여 LYD, 버크셔 및 한국 토종 돼지에서 분리된 근육 줄기세포를 배양하였다. 그 결과 F10/EGF+Dexa+SB 배지를 이용한 근육 줄기세포 배양은 다양한 돼지 품종 모두에서 근육 줄기세포 표지 유전자인 PAX7, MYF5, MYOD 및 MYOG 유전자의 발현 유지에 도움을 주는 것을 확인하였다(도 3A). 특히, F10/EGF+Dexa+SB 배지는 돼지 근육 줄기세포의 군집 증식 시간(population doubling time)을 약 22시간으로 감소시켜, MEM 배양 배지(약 36~40시간, 구체적인 data 생략)보다 세포증식에 더 효율적인 것을 확인하였다 (도면 3B). 뿐만 아니라, F10/EGF+Dexa+SB 배지에서의 배양은 다양한 품종의 돼지 및 개체에서의 실험적 편차를 줄이는 것으로 보인다.
따라서, 본 발명의 F10/EGF+Dexa+SB 배지는 돼지 품종과는 상관없이 돼지 근육 줄기세포의 근육 분화능을 유지하는데 이점을 가지는 배양 배지라는 것을 확인하였다.
다음으로 실제 각 품종의 돼지 근육 줄기세포를 F10/EGF+Dexa+SB 배지를 이용하여 일정 기간동안 배양한 후(passage 1, 2, 또는 3), 2%(v/v) 말혈청(Biowest, Nuaille, France), 1X 글루타맥스(Gibco), 1X AA(Gibco) 및 0.1 mM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 MEM으로 구성된 분화 배지에서 2일 동안 배지 변경없이 세포를 배양하여, 근육 줄기세포로부터 근섬유로 분화시킨 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다.
고정된 세포를 DPBS(Welgene)로 두 번 세척 한 후 샘플을 0.2%(v/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 15분 동안 처리하고 10%(v/v) 염소 혈청으로 1 시간 동안 처리했다. 혈청처리 된 세포는 미오신 중쇄(1:200; 05-716, Sigma-Aldrich)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 1 차 항체와 함께 배양한 후, 세포를 Alexa Fluor-접합 2차 항체로 4℃에서 하룻밤 처리하였다. 핵은 Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다.
F10/EGF+Dexa+SB 배지에서 배양된 다양한 품종 유래의 돼지 근육 줄기세포를 근세포로 분화시킨 후 Hoechst 33342로 핵을 염색한 결과 근세포의 특징인 다핵구조를 확인할 수 있었고, 체외 장기간 배양 후에도 미오신 중쇄를 발현하는 근섬유로의 분화가 가능하다는 것을 확인하였다(도 4A). 특히 본 발명의 F10/EGF+Dexa+SB 배지는 다양한 돼지 품종 중에서 버크셔종 돼지의 근육 줄기세포의 분화능 유지에 좀 더 효과적인 것을 확인하였다(도 4B).
Claims (10)
- 가축 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물에 있어서, EGF, 덱사메타손 및 p38 저해제를 포함하는, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물로서,
상기 p38 저해제는 SB203580이고,
상기 덱사메타손의 함량은 10 μM인 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 EGF의 함량은 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml이고, 상기 SB203580의 함량은 1 μM 내지 100 μM인, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 EGF의 함량은 10 ng/ml이고, 상기 SB203580의 함량은 20 μM 인, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가축은 돼지인, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 돼지는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지에서 선택되는, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 돼지는 버크셔종인, 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물. - 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 배양용 조성물을 이용한 가축 근육 줄기세포 배양 방법
- 제9항의 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 이용한 배양육 생산 방법.
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| US7541183B2 (en) | 2003-06-25 | 2009-06-02 | Ottawa Health Research Institute | Growth and differentiation of adult muscle stem cells with activators or inhibitors of Wnt signaling |
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