KR101429217B1

KR101429217B1 - 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR101429217B1
Application number: KR1020120011717A
Authority: KR
Inventors: 박정극; 윤희훈; 김수연; 서영권
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2014-08-12
Also published as: KR20130090512A; WO2013119026A1; US20150004701A1; US9499787B2

Abstract

본 발명은 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 줄기세포를 배양한 후 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양첨가물을 처리하여 신경세포로 분화시키는 것을 특징으로 한다.

Description

줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법{Method for differentiating stem cell into neural cell}

본 발명은 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease), 척추 손상(spinal cordinjury) 등은 신경 세포 손상에 의해 신경기능에 이상이 생기는 질환이다. 상기 질환들로 인해 손상된 신경세포를 치료하는 방법은 약물요법 또는 외과적 수술이 일반적이지만, 이러한 치료는 정상적인 세포에도 손상을 입혀 문제점으로 지적되고 있다.

이에 최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상된 세포를 외부로부터 공급해 주는 세포 치료제가 효과적인 것으로 제시되고 있다. 이러한 세포 치료제로는 줄기세포(stem cell)가 각광을 받고 있다.

중간엽줄기세포가 신경세포로 분화할 수 있다는 연구는 2000년대 초반부터 발표되기 시작하여 생체 외 연구뿐만 아니라 생체 내 연구까지 진행되어오고 있는 상황이다. 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화하는 과정동안의 신호전달 메커니즘, 그리고 유전자 발현 변화 등을 평가하기 위해서는 궁극적으로 생체 내 이식연구가 수반되어야 하지만 너무 많은 비용, 시간, 그리고 장애물(너무 다양한 신호전달)이 존재하여 이를 증명하기가 쉽지 않다. 또한 향후 재생의학을 위한 세포치료제로서 생체 내 이식시 미분화 중간엽줄기세포(undifferentiated MSC)가 효과적일지 아니면 신경특이 중간엽줄기세포(neural-committed MSC)가 효과적일지 분명하지 않다. 따라서 이러한 문제들을 해결하기 위하여 생체 외에서 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화시키는 적절한 기술이 수립되어야 한다. 신경세포 분화기술은 크게 두 가지가 존재하는데, 하나는 화학적 분화법이고, 다른 하나는 성장인자 또는 싸이토카인 분화법이다. 화학적 분화법은 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol, BME), 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸하이드록실 톨루엔(butylated hydroxyl toluene, BHT), 레티노익산(retinoic acid, RA) 등과 같은 항산화제를 이용하는 것으로 성장인자 또는 싸이토카인 분화법보다 훨씬 더 빠른 형태학적 변화와 함께 뉴런 특이 에놀라아제(neuron-specific enolase, NSE), 신경미세섬유(neurofilament, NF), 뉴론날 핵(Neuronal Nuclei, NeuN) 등과 같은 신경원 표지자들의 발현을 유도한다. 그러나 이러한 변화와 더불어 유도 24 시간 내에 50% 이상의 세포가 자연사(apoptosis)하는 것으로 알려져 있으며, 더구나 화학물질들은 신경원과 유사한 형태로 세포의 물리적 수축을 일으키는 세포 스트레스를 유발시키고 이는 또한 신경원 마커 발현은 유도하지 않는 것으로 알려지기도 한다. 이러한 현상은 유해물질을 다른 종류의 일차세포 또는 형질전환세포에 처리했을 때도 비슷하게 발생하는 현상에 해당하며, 이러한 결과를 종합해 보면 항산화제 처리는 신경세포로의 교차분화를 유도하는 것이 아닌 단순 환경적 스트레스를 유발하는 것이다.

성장인자 또는 싸이토카인 분화법은 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유모세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 뇌유래 신경영양성 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 등을 처리하여 신경세포로 분화시키는 방법으로 환경적 스트레스나 세포자연사 등을 일으키지 않고 분화시킬 수 있지만 분화시간이 4주 이상의 많은 시간이 소요되고, 이로 인해 분화에 들어가는 비용이 상당히 상승하게 된다. 그럼에도 불구하고 신경원으로의 분화율이 현저히 낮고 신경원 표지자들의 발현양상이 성숙 신경원과는 다르다는 문제점이 존재한다.

한편, 리포익산(lipoic acid)은 하기 화학식 1로 표시되는 황을 함유한 지방산으로, 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)로 알려져 있으며 포도당을 에너지로 전환시키는 에너지 대사에도 작용하여 모든 진핵세포의 내부에 존재한다. 그리고 기본적으로 항산화능(anti-oxidation activity)이 있어서 항자연사능(anti-apoptotic activity)도 함께 지니고 있는 것으로 보고되고 있어, 인체세포의 무혈청 배양시에 많이 첨가되고 있으나 2 mM 이상에서는 세포자연사를 유발하는 것으로 알려져 대게 25-100 uM의 낮은 농도에서 이용되고 있다.

이에 본 발명자들은 리포익산과 이 물질의 높은 농도에서의 독성을 반감시켜주고 배양조건하에서 서서히 방출되도록 조절할 수 있는 알부민을 이용한 신규 화학적 신경분화방법을 개발하고 포스콜린이 추가적인 신경 분화 상승효과를 나타내는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법, 및 신경세포 분화 유도용 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명은

(a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 줄기세포에 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양 첨가물을 처리하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 (b) 단계에서 배양첨가물에 포스콜린 또는 신경성장인자를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 유래 신경 세포 제조의 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 배양첨가물을 유효성분으로 포함하는 신경 세포 유도용 조성물을 제공한다.

도 1은 지방조직(adipose tissue, AT)으로부터 분리하여 배양한 중간엽 줄기세포의 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 중간엽 줄기세포의 CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45 등 표면항원발현에 대한 유세포 분석(FACS) 결과를 나타낸 도이다.
도 3는 중간엽 줄기세포가 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화한 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 중간엽 줄기세포에 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양첨가물을 처리한 화학적 신경 분화법에 따른 세포형태에 대한 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 중간엽 줄기세포에 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양첨가물에 추가적으로 포스콜린을 처리한 화학적 신경 분화법에 따른 세포형태에 대한 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 6은 중간엽 줄기세포에 리포익산 처리시 각 화학적 신경 분화법에 대한 세포생존율을 나타낸 도이다 [(A) 4mM 리포익산, (B) 8mM 리포익산].
도 7은 중간엽 줄기세포에 리포익산 처리 후 화학적 신경 분화법에 따른 신경특이 유전자 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 중간엽 줄기세포에 리포익산 처리 후 각 화학적 신경 분화법에 따른 신경 특이 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 중간엽 줄기세포에 리포익산 처리 후 각 화학적 신경 분화법에 따른 신경 특이 단백질 발현을 면역형광염색으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은

(a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계에서 배양된 줄기세포에 리포익산, 알부민 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양첨가물을 처리하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 신경세포의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 분화될 수 있는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정 세포로의 분화능을 갖는 세포는 모두 적용될 수 있다. 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포, 신경줄기세포, 및 중간엽줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 중간엽줄기세포이다.

줄기세포는 인간의 골수, 제대혈 또는 지방조직으로부터 분리하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 골수에서 단핵세포를 분리한 후 이들을 1 내지 2주간 배양하면 분화되기 쉬운 조혈 줄기세포는 모두 분화되어 성숙한 혈구 세포들을 만들기 때문에 남아 있는 무한 증식 세포인 줄기세포만을 분리하는 방법에 의하여 손쉽게 중간엽 줄기세포만을 얻을 수 있다. 아울러, 골수에서 분리한 단핵세포에서 중간엽 줄기세포를 분리해내지 않고, 중간엽 줄기세포를 포함하는 단핵세포들 전체를 본 발명의 방법에 따라 배양하여도 신경세포의 대량 생산이라는 동일한 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 지방 조직으로부터 얻어진 중간엽 줄기세포를 배양하여 사용하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "신경세포(neural cell)"는 중추 신경계 또는 말초신경계의 뉴론 및/또는 글리아, 예를 들면 성상세포, 희돌기교세포 및/또는 슈반세포를 의미하며, 본 발명에서는 신경세포로의 분화는 형태학적 특징 및 분자생물학적 특징을 이용하여 확인하였다.

본 발명에 따른 배양에 있어서, 기본 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, F-12, Mc Coy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E) 또는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지가 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 무혈청의 DMEM/F-12가 바람직하다.

상기의 배지에는 항생제, 성장인자, 아미노산, 저해제 또는 그 유사물질 뿐만 아니라 우아 혈청(fetal calf serum, FCS) 또는 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 등이 첨가될 수 으며, 본 발명에서는 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 리포익산은 알파-리포익산(alpha-lipoic acid)로 알려져 있으며 포도당을 에너지로 전환시키는 에너지 대사에도 작용하여 모든 진핵세포의 내부에 존재한다. 상기 리포익산은 배양 배지 중3mM 내지 15mM를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 4mM 내지 8mM로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 알부민으로서는, 혈청 알부민, 난백 알부민 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 혈청 알부민이다. 알부민의 유래는 특별히 한정되지 않으며, 예컨대, 인간 또는 다른 온혈 동물(예컨대, 소, 원숭이, 돼지, 말, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 닭, 메추리 등)에게서 유래하는 것을 들 수 있지만, 의약, 혹은 의약 화합물의 캐리어로서의 이용을 고려하면, 바람직하게는 인간 알부민, 보다 바람직하게는 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 당업자라면, 본 명세서의 기재 및 공지된 다른 알부민의 서열 정보에 기초하여, 같은 식으로 당쇄 함유 알부민을 제조하여, 이용할 수 있다. 상기 알부민은 배양 배지 총 중량에 대해 0.1% 중량 내지 5%중량, 바람직하게는 1중량%의 양으로 포함된다.

상기 하이드로코르티손은 4-tert-부틸-4-히드록시아니솔과 3-tert-부틸-4-히드록시아니솔, 두 이성체의 유기 화합물로 산화방지제의 특성을 지니고 있다. 하이드로코르티손는 nuclear factor-kB 활성과 같은 활성산소에 의해 조절되는 세포내 신호경로를 억제하는 것으로 알려져 있다. 하이드로코르티손(hydrocortisone)은 배양 배지 중 0.01uM 내지 10uM, 바람직하게는 1uM의 농도로 포함될 수 있다.

상기 인슐린은 이자의 랑게르한스섬의 β세포에서 분비되는 호르몬으로 혈액 속의 포도당의 양을 일정하게 유지시키는 호르몬을 의미한다. 본 발명의 배양첨가물에서 인슐린은 배양 배지 중 1mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 10mg/ml의 양으로 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법에서, 신경세포 분화시 배양첨가물에 포스콜린 또는 신경성장인자를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 포스콜린(Forskolin, 7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha, 6 beta, 9 alpha-trihydroxy-labd-14-ene-11-one)은 아데닐사이클라제(adenylcyclase)를 활성화하고 순환 AMP의 양을 증가시킴으로 세포 수용체를 자극한다. cAMP는 중요한 신호 전달체로서 호르몬에 대한 세포의 적절한 반응에 필요하고, 세포 생존과 분화에 필요한 단백질 전사를 활성화시키는 기전에도 중요한 역할을 한다. 발명에서 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양첨가제를 이용한 신경 세포 제조 방법은 포스콜린을 추가적으로 처리하여 신경 세포의 분화를 더욱 촉진시킬 수 있다. 포스콜린 처리 농도는 0.1uM 내지 10uM, 바람직하게는 1uM이다.

상기 신경성장인자는 신경세포와 신경조직의 분화,성장을 유도하는 사이토카인성의 펩티드 인자를 말한다. BDNF (brain-derived neurotrophic factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), NGF (nerve growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) 및 PDGF (platelet-derived growth factor)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 신경성장인자의 처리 농도는 배양 배지 중 5ng/ml 내지 20ng/ml, 바람직하게는 10ng/ml이다.

또한 본 발명은 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손 및 인슐린을 포함하는 신경세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 생체 외에서 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 용도로 사용된다. 상기 조성물을 이용하여 생체 외에서 증식시킨 신경세포는 추후 병변이 있는 부위에 이식함으로써 세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 조성물은 생체 내에서 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 용도로 사용된다. 상세하게는, 중간엽 줄기세포를 병변부위로 이식 후, 상기 조성물을 이식 부위로 지속적으로 주입하여 생체 내에서 신경세포를 효과적으로 생성되도록 할 수 있다. 이는 분화에 앞서 신경세포가 필요한 병변 부위에 중간엽 줄기세포를 이식하고 이를 신경세포로 분화시키는 방법이므로 난치성

신경계 질환에 중간엽 줄기세포 이식 치료를 통한 신경 재생 및 기능 회복을 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 제조한 신경세포는 정상적인 성숙 신경원(뉴런)과 유사한 네스틴(nestin), 뉴로디원(NeuroD1), 뉴런특이 에놀라아제(neuron-specific enolase, NSE), 신경미세섬유(neurofilament, NF), 타우(tau), 미세소관결합단백질 2(microtubule-associated protein 2, MAP2), 더블코르틴(doublecortin, DCX) 등에 대한 유전자 및 단백질을 발현하므로, 다양한 신경세포 치료제, 생체 외 평가 시스템의 세포원으로 활용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 지방조직으로부터 중간엽 줄기세포의 배양

지방조직으로부터 얻어진 중간엽 줄기세포는 Invitrogen 사의 StemPro Adipose-derived Stem Cell(Product no. R7788-110)을 구입하여 이용하였다. 냉동보존된 앰플을 37℃에서 해동한 후 DMEM 배지를 넣어 세척한 후 800 RPM에서 5분 동안 원심분리 후 10% 우태아 혈청이 포함된 저농도 글루코오스(1000 ㎎/L)의 DMEM 배지에 넣어 배양하였다. 배양된 세포를 관찰하였으며, 관찰결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 배양된 세포는 섬유모세포와 유사한 형태로, 증식능의 감소 없이 10세대까지 유지되었다. 따라서, 배양된 세포는 중간엽 줄기 세포의 형태학적 특징을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 중간엽 줄기세포의 확인

상기 실시예 1에서, 배양된 세포가 중간엽 줄기세포인지 확인하기 위하여, 유세포 분석(Fluorescence activated cell sorter, FACS)과 연결조직세포 분화능 실험을 하기와 같이 수행하였다.

1. 유세포 분석

중간엽 줄기세포의 표지자인 CD90, CD73 및 CD105를 사용하여 유세포 분석(FACS, BD Bioscience)한 결과 모두 양성을 나타내었고, 조혈세포 계통 표지자인 CD14, CD34, CD45에 대해서는 음성을 나타내었다. 따라서 배양된 세포들 모두 중간엽 줄기세포의 표면항원발현 특성을 나타내었다.

결과를 도 2 에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기 세포에서 볼 수 있는 표면 항원 발현 유세포가 고르게 분포하는 것을 확인할 수 있다.

2. 연결 조직 세포 분화능

상기 실시예 1에서 배양된 세포를 골세포로 분화시키기 위해, 밀집 배양한 후 고농도 포도당(4000 ㎎/ℓ)이 포함된 DMEM 배지에 100 nM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산 2-포스페이트(ascorbic acid 2-phosphate), 10 mM 베타-글리세로포스페이트(Sigma-Aldrich Co.)와 10% 우태아 혈청을 첨가하여 4주 동안 배양하였다.

상기 실시예 1에서 배양된 세포를 연골세포로 분화시키기 위해, 2x10⁵ 세포를 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 제조한 후 고농도 포도당(4000 ㎎/ℓ)이 포함된 DMEM 배지에 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 아스코르브산 2-포스페이트, 10^-7 M 덱사메타손, 5 μg/ml 인슐린, 5 μg/ml 트랜스페린, 0.5 ng/ml 셀레니움(ITS; Sigma-Aldrich Co.), 10 ng/ml 전환성장인자(transforming growth factor-β, TGF-β, R&D Systems Inc.,)를 첨가하여 4주 동안 배양하였다.

상기 실시예 1에서 배양된 세포를 지방세포로 분화시키기 위해, 밀집 배양된 세포에 고농도 포도당이 포함된 DMEM 배지에 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 메틸 이소부틸잔틴(methyl-isobutylxanthine), 10 ㎍/ml 인슐린, 100 μM 인도메타신(Sigma-Aldrich Co.) 및 10% 우태아 혈청이 첨가된 배지에서 3일, 10 ㎍/ml 인슐린과 10% 우태아 혈청이 첨가된 배지에서 1일 동안 번갈아 가며 4주 동안 배양하였다.

상기 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화한 세포를 각각 알카라인 포스파테이즈 염색(alkaline phosphatase staining), 톨루이딘 블루 염색(toluidine blue staining), 오일 레드 오 염색(oil red O staining)으로 확인하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 배양된 세포는 골세포, 연골세포와 지방세포 각각의 형태학적 특징을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 신경세포로의 분화

중간엽줄기세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 LG-DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 5x10³ 세포수/cm²의 농도로 접종하였다. 접종 24시간 후 하이드로코르티손(hydrocortisone, 1 uM), 인슐린(insulin, 10 mg/ml), 우혈청알부민(bovine serum albumin, 1%), 그리고 리포익산(lipoic acid) (0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8 mM)이 함유된 DMEM/F-12(1:1 혼합배지)로 교체하여 신경세포의 분화를 유도하였다. 또한 포스콜린(forskolin, 1 uM)을 추가적으로 첨가하여 신경세포로의 분화를 유도하였다. 그리고, 신경세포의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 현미경으로 관찰한 신경세포의 형태학적 변화에서 5일째에 2 mM 이상의 리포익산에서는 수지상 돌기(dendrite)들이 잘 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 0, 1 mM의 리포익산에서는 전혀 변화가 없었다. 이러한 현상은 2 mM 이상의 리포익산에서는 세포사를 유발한다는 기존 보고와 달리 1% 알부민의 서방성 효과에 의해 세포생존율이 유지되면서 수지상 돌기를 잘 형성하는 것으로 확인할 수 있었으며, 부틸하이드록시아니솔 처리시 나타났던 신경세포 형태가 24시간 후에 사라지는 것과 달리, 리포익산은 5일째까지도 잘 유지되는 것을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 1ug의 포스콜린을 추가적으로 처리할 경우 신경세포로의 분화율이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 1: 신경 세포의 세포생존율 측정

세포생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 법을 이용하였다. 구체적으로, MTT 용액(0.0333 g/ml DMEM)을 상기 실시예 3에서 배양된 신경 세포에 넣고 37℃에서 90분 간 반응시킨 후 제거하였다. 그 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 넣고 10분간 방치한 후 이 용액을 모아 분광광도 분석기(Spectrum Analyzer)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 중간엽줄기세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 LG-DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 5x10³ 세포수/cm²의 농도로 접종하였다. 접종 24시간 후 하이드로코르티손(hydrocortisone, 1 ug), 인슐린(insulin, 10 mg/ml), 우혈청알부민(bovine serum, albumin, 1%), 그리고 리포익산(lipoic acid, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8 mM)이 함유된 DMEM/F-12(1:1 혼합배지)로 교체하여 신경세포 분화를 유도하였다. 그리고 신경세포 분화율을 향상시키기 위하여 포스콜린(forskolin, 1 ug) 또는 신경성장인자(nerve growth factor, NGF)를 10 ng/ml 농도로 더 추가할 수 있다. 그리고 200uM 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)를 넣은 조건을 대조군으로 하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 1% 알부민이 첨가되지 않은 4, 8 mM 리포익산 조건과 200ug 부틸하이드록시아니솔 조건은 5일째 세포생존율이 너무 낮아서 이 조건들로는 세포분화에 이용할 수 없었다. 그러나 1% 알부민이 첨가된 리포익산 조건은 5일째에도 각각 61.4%, 65.5%(+신경성장인자), 51.4%, 50.9%(+신경성장인자)로 세포생존율이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 이는 알부민에 의한 세포생존율 향상효과로, 알부민이 리포익산의 전달체(carrier)로 작용하면서 서서히 방출하는 서방성 효과(sustained release effect)를 나타내는 것으로 판단된다.

실험예 2: 신경세포의 역전사 중합효소 연쇄반응( reverse transcription -polymerase chain reaction , RT - PCR )

총 RNA는 Trizol 용액(Invitrogen, USA)을 이용하여 회수 및 분리하였고, 다음 1 ug RNA를 RT-PCR 키트(Clontech, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음 분석대상은 MAP2, DCX, Tau, Neuro D1, NSE, Nestin and NF-L이었고 이 때 사용된 프라이머들(primers)은 하기 표 1에 나타내었다. 결과는 도 7에 나타내었다.

역전사 중합효소 연쇄반응 분석을 위한 프라이머들(primers)

유전자	방향	염기배열
MAP2	정방향(서열번호1)	5'-CTCAACAGTTCTATCTCTTCTTCA-3'
MAP2	역방향(서열번호2)	5'-TCTTCTTGTTTAAAATCCTAACCT-3'
DCX	정방향(서열번호3)	5'-GGAAGGGGAAAGCTATGTCTG-3'
DCX	역방향(서열번호4)	5'-TTGCTGCTAGCCAAGGACTG-3'
Tau	정방향(서열번호5)	5'-GTAAAAGCAAAGACGGGACTGG-3'
Tau	역방향(서열번호6)	5'-ATGATGGATGTTGCCTAATGAG-3'
NeuroD1	정방향(서열번호7)	5'-CCGACAGAGCCCAGATGTAGTTCTT-3'
NeuroD1	역방향(서열번호8)	5'-GCCCCAGGGTTATGAGACTATCACT-3'
NSE	정방향(서열번호9)	5'-GGCGGGCAGTGGAAGAAAA-3'
NSE	역방향(서열번호10)	5'-AAGTGGAAAGTGCGGAACCC-3'
Nestin	정방향(서열번호11)	5'-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3'
Nestin	역방향(서열번호12)	5'-GACGCTGACACTTACAGAAT-3'
NF-L	정방향(서열번호13)	5'-GCCAAGAACATGCAGAACGC-3'
NF-L	역방향(서열번호14)	5'-CAGCTTTAATGCGGAACGCC-3'
GAPDH	정방향(서열번호15)	5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
GAPDH	역방향(서열번호16)	5'-TTCACCACCCTGTTGCTGTA-3'

도 7에 나타난 바와 같이, 리포익산을 처리한 세포의 신경세포관련 유전자(mRNA) 발현을 분화 5일째에 검사한 결과, 4mM 및 8 mM 리포익산을 처리한 경우에서 모두 대조군에 비하여 신경관련 유전자의 발현이 증가하였으며, 특히 4 mM의 리포익산을 처리한 조건에서 더 많이 신경관련 유전자의 발현이 증가하였다.

실험예 3: 신경 세포의 웨스턴 블롯 ( Western blot ) 분석

상기 실시예 3에서 배양된 신경세포를 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척하고 단백분해효소 저해제가 포함된 RIPA(radioimmunoprecipitation) 완충용액으로 회수하였다. 총 단백질양은 BCA Protein Assay 키트(Pierce, USA)로 측정하였고, 10 ug의 단백질은 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 녹여 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 다음 5% 탈지우유와 0.5% Tween 20이 함유된 TBS(Tris-buffered saline)로 30분간 상온에서 블록시킨 후, anti-NSE, anti-Nestin, Anti-NF-L(Cell Signaling, USA), β-actin(Sigma, USA) 항체들로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 다음 anti-mouse 또는 anti-rabbit 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 ECL(Pierce Biotechnology, USA)에 노출시킨 다음 ChemiDoc XRS+ Imaging System(Bio-RAD, USA)로 검사하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 리포익산을 처리한 세포의 신경세포관련 단백질 발현을 분화 5일째에 검사한 결과, 4mM 및 8 mM 리포익산을 처리한 경우에서 모두 대조군에 비하여 신경관련 단백질의 발현이 증가하였으며, 특히 4 mM 리포익산을 처리한 조건에서 더 많이 신경관련 단백질의 발현이 증가하였다.

실험예 4: 신경 세포의 면역형광염색( immunofluorescence , IF )

유리 커버슬립 위에 상기 실시예 3에서 배양된 신경세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 고정한 후, 1.5% BSA(bovine serum albumin)가 함유된 PBS로 블록시킨 다음 0.5% Triton X-100이 함유된 PBS로 세포막을 투과시켰다. 그 다음 일차항체들-anti-NF-L, anti-MAP2, anti-GFAP, anti-NeuroD1(Cell Singaling, USA), anti-tau(Biosource, USA)-을 넣고 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그리고 PBS로 10분간 세척한 후, 종특이적 이차항체들-anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 488 또는 anti-mouse IgG-Alexa Fluor 555 conjugate-을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음 DAPI를 함유하고 있는 Vectashield mount 용액을 도포하여 고정과 함께 대조염색하였다. 그리고 Confocal Laser Scanning Microscope(LSM510-meta, Germany)로 검사하였다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 리포익산을 처리한 세포의 신경세포관련 단백질 발현을 분화 5일째에 검사한 결과, 리포익산을 처리한 경우에서 모두 대조군에 비하여 신경관련 단백질 발현이 증가한 것을 현미경 상으로 확인할 수 있었다.

<110> Dongguk University Industry-Acadecmic Cooperation Foundation <120> Method for differentiating stem cell into neural cell <130> p170 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of MAP2 <400> 1 ctcaacagtt ctatctcttc ttca 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of MAP2 <400> 2 tcttcttgtt taaaatccta acct 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of DCX <400> 3 ggaaggggaa agctatgtct g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of DCX <400> 4 ttgctgctag ccaaggactg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Tau <400> 5 gtaaaagcaa agacgggact gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Tau <400> 6 atgatggatg ttgcctaatg ag 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of NeuroD1 <400> 7 ccgacagagc ccagatgtag ttctt 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of NeuroD1 <400> 8 gccccagggt tatgagacta tcact 25 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of NSE <400> 9 ggcgggcagt ggaagaaaa 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of NSE <400> 10 aagtggaaag tgcggaaccc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Nestin <400> 11 ctctgacctg tcagaagaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Nestin <400> 12 gacgctgaca cttacagaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of NF-L <400> 13 gccaagaaca tgcagaacgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of NF-L <400> 14 cagctttaat gcggaacgcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GAPDH <400> 15 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of GAPDH <400> 16 ttcaccaccc tgttgctgta 20

Claims

(a) 줄기세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 줄기세포에 리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 배양 첨가물을 처리하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포, 배아종양세포, 신경줄기세포, 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간의 골수, 제대혈, 및 지방조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 줄기세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, F-12, Mc Coy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E), 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 리포익산은 배양 배지 중 3mM 내지 15mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 알부민은 배지 총 중량에 대해 1%중량 내지 5%중량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 하이드로코르티손은 배양 배지 중 0.01uM 내지 10uM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 인슐린은 배양 배지 중 1mg/ml 내지 50mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 포스콜린 또는 신경성장인자를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 신경 성장 인자는 BDNF (brain-derived neurotrophic factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), NGF (nerve growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) 및 PDGF (platelet-derived growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 포스콜린은 배양 배지 중 0.1uM 내지 10uM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 신경성장인자는 배양 배지 중 5ng/ml 내지 20ng/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래 신경세포의 제조방법.
리포익산, 알부민, 하이드로코르티손, 및 인슐린을 포함하는 신경세포 분화 유도용 조성물.