JP2007535302A - 幹細胞培養培地および該培地の使用方法および幹細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 特に、本発明は、幹細胞と非幹細胞の混合物からの幹細胞の単離に関するもので、非幹細胞が分化した細胞となることができる。本発明は、液体培地において懸濁された細胞を連続的に継代培養することによって、分化した細胞の接着性とは反対の、幹細胞の非接着性を利用するものである。
【選択図】なし
Description
本発明は、非増殖性細胞を除いて増殖性細胞を濃縮、単離または培養することに関係する。より具体的な用語では、本発明は、非幹細胞を除いて幹細胞(これは多能性細胞としてさらに定義することができる)を濃縮、単離または培養することに関係する。本発明では、基質および/または別の細胞に接着する非常に分化した細胞の性質が利用される。特定の実施形態では、幹細胞が骨髄細胞から得られる。だが、幹細胞を含む任意の好適な組織が、幹細胞が単離される最初の多数の細胞を提供することができる。
幹細胞は、その組織におけるそれらの系譜の少なくともすべての分化した細胞タイプになる能力を有する細胞である。幹細胞は、幹細胞を他のタイプの細胞から区別する2つの重要な特徴を有する。第1は、幹細胞は、細胞分裂を介して長期間にわたって自身を更新する専門化していない細胞である。第2に、好適な条件のもとでは、幹細胞は、特別な機能を有する細胞(これは、分化したと見なすことができる)になるために誘導することができる。
当業者は、幹細胞が増殖し得るように、好ましくは、幹細胞が非幹細胞(例えば、分化した細胞など)から区別され得るように、好適な培養培地が本発明では使用されることを認識している。例えば、多くの好適な培地が市販されており、例えば、Invitrogen―GIBCO BRL(Carlsbad、California)またはSigma(St.Louis、MO)などから市販されている。利用される培地は血清非含有または血清含有であり得る。だが、当業者は、細胞が1つまたは複数の病原体にさらされないように血清非含有培地を使用することが好都合であり得ることを認識している。
細胞マーカーは、特定の所望される幹細胞のための有用な同定ツールである。本明細書中で使用される用語「細胞マーカー」は、目的とする幹細胞と一般に関連付けられる遺伝子または遺伝子産物を示す。遺伝子産物は細胞表面に発現される場合がある。
本発明は、研究のための、または、その必要のある動物のための治療的使用(例えば、細胞置換治療による治療的使用など)のための幹細胞およびその使用に関係する。細胞は、細胞が集められたとき、治療的であり得るか、または、その適用の前に操作され得る。そのような操作は、細胞が提供される個体についてその治療活性を高める任意の種類のものであり得る。特定の実施形態において、幹細胞はさらに、小分子、治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコード化する核酸、siRNA、アンチセンスRNA、RNAi、脂質(リン脂質、プロテオ脂質および糖脂質を含む)、またはそれらの混合物などの治療因子を含む。具体的な実施形態において、治療因子は医学的状態の少なくとも1つの症状の改善をもたらし、かつ/または、医学的状態の少なくとも1つの症状を防止する。本発明のこの局面で利用される特定の幹細胞は、その意図された目的のために好適である。例示的な適用(例えば、下記の適用など)が用いられ得る。だが、当業者は、他の好適な適用が利用され得ることを認識している。
造血系に由来する幹細胞を様々な適用のために用いることができる。そのような幹細胞は、例えば、本発明の1つまたは複数の細胞を、ダウン症候群に罹患している個体(胎児を含む)に、または、ダウン症候群に罹患しやすい個体(例えば、胎児など)に適用することによって、ダウン症候群を防止および/または処置することにおいて利用することができる。他の実施形態において、造血系は、例えば、個体が血液障害(白血病を含む)に罹患している場合などにおいて、細胞置換治療から利益を受ける。
本発明の幹細胞はまた、例えば、神経変性障害(例えば、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症(ALS)など)、発作、脊髄傷害、ハンチングトン病を有する個体をはじめとする、中枢神経系の障害に苦しんでいる個体に適用することができる。特定の実施形態において、個体自身の骨髄により、その患者の神経変性障害に対する治療的細胞置換のための幹細胞が提供される。
さらなる実施形態において、本発明の幹細胞は、糖尿病のための細胞置換治療などのために膵臓小島系において用いられる。具体的には、そのような実施形態において利用される細胞は、当然のこととしてインスリン合成を調節する。だが、一部の実施形態では、インスリン合成が、膵臓小島β細胞へのインビボ分化の後までは検出されない。さらなる実施形態において、細胞は、例えば、インスリンの発現を調節するために遺伝子操作される。これは任意の好適な手段によって達成することができ、例えば、インスリンをコード化する核酸を有することなどによって達成することができる。
本明細書中において他のところで記載されるように、本発明の幹細胞および方法は、網膜症を有する個体に対する適用のために有用である。網膜症には、網膜(CNSの一部)の欠失が含まれ、また、特定のクラスの神経細胞が失われる場合がある:例えば、光受容器が、黄斑変性(例えば、加齢性の黄斑変性など);色素性網膜炎、レーバー先天性黒内症、桿体一色型色覚および×連鎖進行性錐体ジストロフィーでは欠陥である;神経節細胞が多発性硬化症およびメタノール中毒では欠陥である;Mクラス神経節細胞が、緑内障、アルツハイマー病および水頭症では欠陥である;また、ミュラー細胞が成人の網膜分離症では欠陥である。
他の実施形態において、本発明によって包含される幹細胞は別の例示的な実施形態で利用される。例えば、筋肉のための幹細胞を、平滑筋または骨格筋であるとしても、好適な筋適用のために利用することができる。一例において、筋肉由来の幹細胞が、心臓適用に応用するために用いられ、例えば、心不全を含む心臓疾患の防止および/または処置などのために用いられる。細胞を、心臓病の診断のときに、または、心臓病の診断の後に、または、心臓疾患に罹りやすい個体に適用することができる。
VI.遺伝子治療の施与
本発明の具体的な実施形態において、本発明の幹細胞を作製および/または使用するための1つまたは複数のキットが提供される。キットの構成成分は好適な容器に収容され、また、適する場合には無菌にすることができる。キットの収容には、例えば、箱、バイアルまたはボトルが含まれ得る。
<骨髄CD34+幹細胞培養物>
骨髄を、16匹のC57Bl/6J成体マウス、4匹のSJL/J成体マウス、4匹のC3H成体マウスおよび2匹の129FVB成体マウスの大腿骨から無菌的に採取した。1つの成体マウス大腿骨に由来する細胞を、10%のウシ胎児血清を含有する10mlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(GIBCO)に、また、10mlのHybridoma Cell Defined Serun−Free Medium(GIBCO)に懸濁し、2つのT75細胞培養フラスコに分配した。両培地には、マウスインターロイキン3(IL−3)(R&D Systems)、マウスインターロイキン6(IL−6)(R&D Systems)、マウス幹細胞因子(SCF)(R&D Systems)およびβ−メルカプトエタノールが下記の最終濃度に補充された:5ng/mlのIL−3、10ng/mlのIL−6、10ng/mlのSCF、および、2.9mlのHOHにおける10μlのβ−メルカプトエタノールの1:1000希釈。マトリックス、基質またはフィーダー細胞はいずれも、組織培養フラスコ内の液体培地には添加されなかった。細胞を、加湿した10%CO2/90%空気において37℃で成長させた。細胞を観察し、必要に応じて週に2回、細胞に養分を供給したか、または、細胞を継代培養した。細胞には、それぞれのフラスコに5mlの新鮮な培地を加えることによって養分を供給した。細胞培養物が、植継ぐために十分な密度になったとき、浮遊細胞のみを集め、培養フラスコに付着した細胞を残した。これらの付着した細胞は、骨髄間質細胞、内皮細胞、マクロファージなどである。浮遊細胞を、前回の培養物からの50%の馴化培地と、50%の新鮮な培地とにおいて、2×106細胞/10mlで植継ぎした。3週間後〜4週間後、培養物は、分裂している浮遊細胞のみを含有しており、そのような細胞は、フラスコに付着するマクロファージおよび他の細胞にもはや分化しない。
RNAを、成体マウスの骨髄から、6週間〜4ヶ月間培養されたCD34+細胞から、また、出生後2日目(P2)のマウスの脳から得て、RT−PCRを、下記のDNAプライマーを使用する標準的な方法によって行った:GATA−2の順方向プライマー5’ATGGAGGTGGCGCCTGAGCAGCCT3’(配列番号1)、逆方向プライマーCTGCCGCCTTCCATCTTCATGCTC3’(配列番号2);LMO−2の順方向プライマー5’ATGTCCTCGGCCATCGAAAGGAAG3’(配列番号3)、逆方向プライマー5’GATGATCCCATTGATCTTGGTCCA3’(配列番号4);Re×−1の順方向プライマー5’CACCATCCGGGATGAAAGTGAGAT3’(配列番号5)、逆方向プライマー5’ACCAGAAAATGTCGCTTTAGTTTC3’(配列番号6);Oct−4の順方向プライマー5’CCGTGAAGTTGGAGAAGGTG3’(配列番号7)、逆方向プライマー5’TGATTGGCGATGTGATGTAT3’(配列番号8);Flk−2の順方向プライマー5’CGTACCGAATGGTGCGAGGATCCC3’(配列番号9)、逆方向プライマー5’CATGGTTCACATGGATGGCCTTAC3’(配列番号10);TAL−1の順方向プライマー5’GATGACGGAGCGGCCGCCGAGCGAGGCG3’(配列番号11)、逆方向プライマー5’CGCACTACTTTGGTGTGAGGACCA3’(配列番号12);CD34の順方向プライマー5’CAGTATTTCCACTTCAGAGATGAC3’(配列番号13)、逆方向プライマー5’GTGTAATAAGGGTCTTCACCCAGC3’(配列番号14)、神経フィラメントHの順方向プライマー5’ATTGGCTTTGGTCCGAGTCC3’(配列番号15)、逆方向プライマー5’GGGGGTTCTTTGGCTTTTAC3’(配列番号16)、神経フィラメントMの順方向プライマー5’CTTTCCTGCGGCGATATCAC3’(配列番号17)、逆方向プライマー5’TCCTCAACCTTTCCCTCAAT3’(配列番号18)、および、神経フィラメントLのプライマー順方向5’GCAGAACGCCGAAGAGTGGT3’(配列番号19)、逆方向プライマー5’CGAGCAGACATCAAGTAGGA3’(配列番号20)。PCR産物を標準的なプロトコルによりゲルでの塩基対サイズによって分離した。
培養されていないエクスビボ成体マウス骨髄細胞、ならびに、6日間、21日間、28日間、48日間、56日間および110日間の培養物に由来するインビトロ骨髄細胞を、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で15分間インキュベートし、ダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS)で3回洗浄し、細胞遠心によって顕微鏡スライドガラスに塗布し、直ちに使用するか、または、使用まで−80℃で貯蔵した。その後、細胞を0.25%のTween−20により21℃で3分間処理し、PBSで3回洗浄し、下記の抗体を使用する標準的な免疫細胞化学の方法によって分析した:一次抗体CD34(PharMingen 553731)、Sca−1(PharMingen 557403)、AA4.1(PharMingen 559158)、cKit(Cymbus CBL1359)、H−2K(PharMingen 553567)、CD45(PharMingen 553076)、F4/80(Serotec MCAP497)、Pa×−6(Santa Cruz sc−11357)、Oct−4(Santa Cruz sc−9081)、HuC/HuD(Molecular Probes A−21275)、神経フィラメントH(Sternberger Monoclonals SMI 312、Chemicon AB1989)、NeuN(Chemicon MAB377)、GAD65(Chemicon AB5082)、M2ムスカリン様アセチルコリン受容体(Chemicon AB166−50UL)、GFAP(Chemicon MAB3402、AB5040、AB5804)、CNPase(Chemicon MAB326)、MOSP(Chemicon MAB328)、NG2コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(Chemicon AB5320)、ガラクトセレブロシド(Chemicon AB142)、乏突起膠細胞マーカーのO4(Chemicon MAB345)、MAG(Chemicon MAB1567)、PLP(Chemicon MAB388)。二次抗体は、FITC−F(ab’)2ロバ抗ウサギ(JacksonImmuno 711−096−152)、TRITC−F(ab’)2ロバ抗ラット(JacksonImmuno 712−026−150)、TRITC−F(ab’)2ヤギ抗マウスIgG+IgM(JacksonImmuno 115−026−044)、TRITC−F(ab’)2ウサギ抗マウス(JacksonImmuno 315−026−045)、FITC−ヤギ抗マウスIgGl Fcγフラグメント特異的(JacksonImmuno 115−095−008)、Cy5−F(ab’)2ロバ抗ウサギ(JacksonImmuno 711−176−152)、西洋ワサビペルオキシダーゼ−ヤギF(ab’)2抗ウサギIgG(H+L)(Caltag L4300−7)、Fabフラグメントヤギ抗マウスIgG(JacksonImmuno 115−007−003)。マウスモノクローナルIgG1抗体がエクスビボのマウス骨髄細胞に結合する場合、標準的なプロトコルを改変して、固定された透過処理されている細胞をPBSにおける5%の正常ヤギ血清に室温で1時間さらし、その後、PBSにより6回洗浄し、次いで、細胞を20μg/mlのAffinipure Fabフラグメントヤギ抗マウスIgG1(JacksonImmuno 115−007−003)に1時間さらし、その後、目的の抗原に対する一次マウスモノクローナル抗体IgG1に1時間さらし、PBSで6回洗浄し、最後に二次FITC−ヤギ抗マウスIgG1 Fcγフラグメント特異的に1時間さらし、PBSにより6回洗浄した。2つのコントロールを使用した。ともに、一次抗体は使用されず、一次マウスモノクローナルIgG1抗−GFAPが使用された。
培養されたCD34+細胞から得られるタンパク質を、報告(Marty他、2002)のように、10%、12%、および4%〜20%勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブランに転写し、上記の抗体を使用して特定のタンパク質について分析した。
CD34+細胞を蛍光性色素の5−(および6)−(((4−クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(Cell Tracker Orange CMTMF)(Molecular Probes)によって下記のように標識した。CD34+細胞(2×108)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)における10mM色素の400倍ストック液からの25μMのCell Tracker Orangeの最終濃度においてインキュベートした。細胞を5mlの色素含有DMEM10において37℃で15分間インキュベートし、遠心分離によってペレット化し、15mlのDMEM10で洗浄し、37℃で30分間インキュベートし、ペレット化し、15mlのDMEM10で37℃で15分間再び洗浄し、ペレット化し、DMEM10に104細胞/μlで再懸濁した。
34匹の麻酔された成体C57Bl/6Jマウスに、1μlのDMEM10における104個のC57Bl/6JのCell Tracker Orange標識されたCD34+細胞をそれぞれの脳の海馬および線条体に定位注入した。注入された動物を1ヶ月〜14ヶ月間飼育し、その後、屠殺して、PBSで灌流し、その後、4%パラホルムアルデヒドで灌流した。脳を取り出し、30%スクロースにおいて平衡化し、凍結包埋配合物に包埋し、凍結し、厚さ30μmの断面に切断し、標準的な方法を使用して免疫組織化学のために調製し、25ng/mlの4’−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)により対比染色した。移植されたCD34+細胞を観察し、画像を、ローダミン、フルオレセイン、Cy5およびDAPIの光学を用いた通常の蛍光顕微鏡およびレーザー共焦点顕微鏡によって記録した。
以前の研究では、異なる骨髄細胞調製物が、脳に移植された後、神経系の分子を発現し得ることが観測されていた。しかしながら、MBP遺伝子の生成物について以前に示されたように(Marty他、2002)、これらの神経系分子が移植の結果であるか、または、既に骨髄中に存在しているかどうかは明らかにされていない。従って、培養されていないエクスビボ骨髄における神経マーカーの発現を調べた(図1)。神経性転写因子のPa×−6、および、調べられた4つのニューロンタンパク質の神経フィラメントH、NeuN、Huc/HuD、GAD65が、成体骨髄細胞において小さい割合で存在していた。二重免疫細胞化学標識により、Pa×−6および神経フィラメントHが同じ細胞に存在することが明らかにされた。加えて、乏突起膠細胞タンパク質のCNPaseもまた一部の骨髄細胞において発見されたが、星状膠細胞のグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)に対する抗体により検出された標識はなかった。
造血始原細胞に見出され得る抗原の1つであるCD34を産生する骨髄細胞のサブセットには、神経抗原が存在していたので、高い増殖性のCD34+細胞の培養物を作製するための方法が開発されていた。4系統のマウスの骨髄を26個の成体大腿骨から採取し、造血幹細胞増殖因子(インターロイキンIL3、インターロイキンIL6、幹細胞因子およびβ−メルカプトエタノール)を含有する液体培地で個々に培養した。非接着の浮遊細胞のみを上記のように4ヶ月を超えて継続して植え継いだ。培養の経過に伴い、接着性細胞の割合が3週間〜4週間までにゼロに減少した(図2)。30世代を超えて成長するこれらの浮遊細胞は高い増殖能力を示す。実際、4ヶ月の培養期間により、1014個の細胞が、1個のマウス大腿骨から得られた106個の骨髄細胞から生じた。骨髄細胞の3μlのペレットを、PCR(図4B)および免疫細胞化学(図5)によって明白に示されるように、純粋なCD34+細胞の300リットルのペレットに拡大培養することができる。同様の増殖率が、血清含有培地または血清非含有培地のいずれかであっても、すべての培養物で認められた(図2)。
様々な神経遺伝子が、CD34+骨髄細胞の主要でないサブセットで発現していることが見出された。従って、それらの存在を、造血始原細胞の非常に増殖性の培養物において、3週間目、および、すべての細胞がCD34+になったさらに後の時点で調べた。神経転写因子と、分化したニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞のマーカーとの両方を調べた。すべての細胞がCD34+になったとき、すべての細胞はまた、神経性転写因子のPa×−6、およびニューロンのRNA結合タンパク質のHuC/HuDについて陽性であった。その後、CD34+細胞の純粋な集団を一般的なニューロンマーカーおよび神経伝達物質の発現について評価した(図5)。神経フィラメントH、神経フィラメントMおよび神経フィラメントLについてRT−PCRによって調べられた細胞は神経フィラメントHのみを発現し、神経フィラメントMおよび神経フィラメントLを発現していないことが見出され、これに対して、CD34+細胞を調べるために使用された同じプライマーは、出生後2日目のマウスの脳において予想された産物をもたらした(示されず)。免疫細胞化学ではまた、すべての培養されたCD34+細胞が神経フィラメントHを発現するが、神経フィラメントMおよび神経フィラメントLを発現していないことが明らかにされた。さらに、ウエスタンブロット分析は神経フィラメントHを170kDaにおいて示したが、神経フィラメントMおよび神経フィラメントLについてはバンドを示さなかった。培養されたCD34+細胞の免疫細胞化学およびウエスタンブロット分析では、NeuNがすべての細胞に多量に存在し、66kDa、48kDaおよび46kDaの予想された分子量で発現されたことが示された。ニューロンの一般的マーカーがCD34+培養物に存在するので、ニューロンの機能マーカーもまた調べた。実際、GABA合成に関わる酵素であるグルタミンデカルボキシラーゼ(GAD65)が、調べられたすべての細胞で検出され、これに対して、チロシンヒドロキシラーゼおよびM2ムスカリン様アセチルコリン受容体は検出されなかった(表2)。
神経遺伝子を発現するCD34+細胞培養物の最も信頼できそうな起源は、エクスビボ骨髄に存在する低い割合のCD34+細胞を増幅することであり、これもまた神経遺伝子を発現する。これらのCD34+細胞は多能性の骨髄細胞に由来し、胎芽幹細胞にいくらか類似していることがある。従って、培養されたCD34+細胞を、初期の一般的転写因子マーカーのRe×−1およびOct−4についてPCRによってスクリーニングし、培養されたCD34+細胞が陽性であることが見出された(Re×−1、図4;Oct−4、示されず)。免疫細胞化学では、培養されたCD34+細胞の100%がそうであったように(示されず)、エクスビボ骨髄細胞の小さいサブセットがOct−4について陽性であったことが示された(図1)。このことは、実際、培養されたCD34+細胞が単なる造血幹細胞よりも大きな潜在能力を有する幹細胞であり得ることを示唆している。
これらの細胞は、神経の表現型と適合し得る分子を発現するので、本発明者らは、さらなる処置を何ら行うことなく、これらの細胞を成体マウスの脳に移植することは妥当であると考えた。6週間〜3ヶ月間培養されたCD34+細胞をCell Tracker Orangeにより標識し、34匹の成体マウスの脳の線条体および海馬に定位注入した。移植後1ヶ月〜14ヶ月で、脳を免疫組織化学および蛍光顕微鏡観察のために処理した。移植されたCell Tracker Orange標識の細胞は、動物の行動に明らかな変化を伴うことなく、線条体および海馬の両方において、最も長い試験期間で14ヶ月間にわたって多数(注入された細胞の約40%)が生存していることが見出された。脳における移植された細胞のこの高い割合の生存は、亜致死量または致死量の放射線を照射したマウスの循環血液に、また、生まれたばかりのPU.1マウスの腹膜内に細胞を注入した他の研究室とは対照的である(Brazelton他、2000;Mezey他、2000;Makar他、2002)。加えて、脳に注入されたCD34+細胞は注入部位から線条体および海馬の全体に移動し、また、線条体および海馬を超えて移動していた。移植後1ヶ月〜2ヶ月で、一部は形状が球状のままのものもあったが、一部は短い突起を伸ばし、CD34を発現し続けた(図6、最上列);6ヶ月で、これらの細胞は、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を暗示する形態学特徴を示した。移植された脳の切片を、ニューロンのマーカーである神経フィラメントHおよびNeuN、星状膠細胞のマーカーであるGFAP、ならびに、乏突起膠細胞のマーカーであるCNPaseについて免疫標識した。顕著な発見は、脳内に注入されたとき、すべてのCD34y細胞が、神経フィラメントH、NeuNおよびCNPaseを発現する一方で、移植後6ヶ月および1年では、移植された細胞の40%のみが神経フィラメントHおよび/またはNeuNを発現し、30%がCNPaseを発現することであった(図6および表3)。
例示的な骨髄幹細胞の分取を記載する。例えば、図7、図8および図9は、3つの増殖因子(IL−3、IL−6、SCF)および5つの増殖因子(IL−3、IL−6、SCF、flt3/fflk2、TPO)を含有する血清非含有(SF)培地、ならびに、10%のウシ胎児血清およびそのような増殖因子を含む培地における例示的な骨髄幹細胞の分取を例示している。3つのサンプルを利用した。細胞分画物は下記の通りであった:分取されていない成人骨髄全体;アルコールデヒドロゲナーゼ(ALDH+)Brightの分取された骨髄「幹細胞」画分;ALDH−Dimは、分取された「非幹細胞」画分を示す;ならびに、分取されていない細胞と、ALDH+Bright幹細胞との混合物。
幹細胞は、高レベルのアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)を発現することが以前に示されていた。骨髄細胞がこの蛍光基質にさらされたとき、ALDHを含有するそのような細胞は明るい蛍光を発する。ALDHを含まないか、または低レベルのALDHを含む細胞は、かすかな蛍光を発する。従って、ALDH+Bright画分は造血幹細胞について濃縮されている。ALDH(−)Dim細胞は、幹細胞を枯渇させた残りの骨髄細胞である。第3の画分は、骨髄の幹細胞およびすべての他の細胞をともに含有する分取されていない骨髄細胞全体である。
I.マウスの神経変性における細胞置換治療および遺伝子送達
A.実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)
インターフェロン−βを発現するCD34+細胞および脳由来神経栄養因子(BDNF)を発現するCD34+細胞は実験的アレルギー性脳脊髄炎の再発期を改善する。20匹のマウス(5匹/群)の予備研究において、マウスの神経保護的なインターフェロン−β(IFN−β)遺伝子により形質移入されたCD34+細胞を実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)マウスに移植した。IFN−βを発現するCD34+細胞を移植したマウスは、麻痺の5段階尺度によって測定されたとき、EAEの再発期の遅れた発症および低下した重篤を示す(図10)。具体的な実施形態において、この神経保護の神経解剖学的基礎が明らかにされる。しかしながら、少なくとも、これらの結果は、CD34+細胞が、神経保護遺伝子を成体マウスの脳に送達するための有用な媒介物であることを示している。
20匹/群のマウスを用いた120匹のマウスでのより大規模な実験において、CD34+細胞単独の保護効果、および、IFN−βを発現するCD34+細胞の保護効果、および、BDNFを発現するCD34+細胞の保護効果をEAEの症状に対して調べた。CD34+細胞単独、ならびに、IFN−βまたはBDNFを発現するCD34+細胞は少なくともEAEの初期において保護的であった(図10および図11)。BDNFが最も強い効果を示した;IFN−βは2番目であり、CD34+細胞単独では効果が最も小さかった。細胞の注入後の時間が短すぎて、細胞置換および細胞分化が保護の動因となることができないので、具体的な実施形態におけるCD34+細胞単独によるこの保護は細胞の有益なパラクリン効果である。
C.移植されたGFP−CD34+細胞はチロシンヒドロキシラーゼ(TH)をマウスの脳で発現する
正常な成体マウス脳に移植されたCD34+細胞はチロシンヒドロキシラーゼを発現する。GFP遺伝子組換えマウスのC57B1/6−Tg(UBC−GFP)30Schaに由来する、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するCD34+細胞を培養する。これらの細胞は、MPTP処理されたC57Bl/6Jマウスの脳への移植のために使用される。細胞が正常なC57Bl/6Jの脳に移植され、例えば、8週間後、移植された細胞が突起を伸長させていることが見出されている。これらの移植された細胞のサブセットはまたチロシンヒドロキシラーゼを発現する(図12)。この発見の後、培養されたCD34+/GFP細胞を、ドーパミン作動性ニューロンに対する5つの抗体を用いてインビトロでのTH発現について検定し、それらは移植前は陰性であることが見出された。5つの抗体とは、TH(Chemicon AB151およびAB152、Sigma T2928)、TH転写因子PIT×3(Chemicon AB5722)およびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ(DiaSorin 22806)をいう。
正常な成体マウス脳に移植されたCD34+/GFP細胞の一部がニューロンの形態学的特徴を発現し、また、チロシンヒドロキシラーゼを発現することが見出されたので、これらと、BDNFを発現するように操作されたCD34+/GFP細胞とが、MPTP処理されたマウスの脳に移植される。MPTPは、パーキンソン病では喪失している黒質のTH発現ドーパミン作動性ニューロンを特異的に破壊する。MPTPマウスモデルは、特異的な病変部位が存在する神経変性における治療的細胞置換および神経保護的遺伝子治療のための骨髄由来幹細胞の効力を評価するために使用される。
III.ラット骨髄幹細胞も培養物
A.成長曲線
成体Sprague Dawleyラットの大腿骨に由来する骨髄幹細胞は、ラットのIL−3、IL−6およびSCFを使用することを除いて、マウス骨髄幹細胞の培養物のために開発された培養方法を使用して成功していた。ラット細胞は、マウスおよびヒトの骨髄幹細胞が成長するように対数的に成長する(図13)。培養された骨髄幹細胞は、胎芽幹細胞、造血幹細胞および神経幹細胞、ならびに分化した神経細胞の遺伝子を発現した(表4)。
CD34+細胞における遺伝子発現が、少なくとも部分的には、細胞の存在および/または分化をモニターするために特徴付けられる。1つまたは複数の特定の遺伝子の発現が、所望の分化に基づいて選ばれる。遺伝子発現を同定するための方法には、遺伝子発現の核酸生成物(例えば、mRNAなど)または産生された遺伝子産物(例えば、タンパク質など)をモニターする方法が含まれる。具体的な実施形態において、遺伝子発現は、免疫蛍光法による手段を含めて任意の適切な手段によって同定され、だが、特定の実施形態では、免疫細胞化学が用いられる。
IV.ALDH+分取細胞および非分取細胞の成長
成人エクスビボ骨髄は、造血幹細胞、胎芽幹細胞、神経幹細胞および分化した神経の遺伝子を発現する。エクスビボ成人骨髄を調べ、骨髄細胞の4%が、造血幹細胞のマーカーCD34を発現することが見出された(図13および表5)。二重標識により、これらのCD34+幹細胞のサブセットはまた、胎芽幹細胞の遺伝子、神経幹細胞の遺伝子、ならびに、分化したニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞の遺伝子を発現することが明らかにされた。この遺伝子発現は、GFAPがマウス骨髄において検出されなかったことを除いて、成体マウス骨髄において見出された遺伝子発現と類似している。
ヒト骨髄細胞を4つの培地で培養した:ヒトのIL−3、IL−6およびSCFを含有する血清非含有培地(SFM)と、IL−3、IL−6、SCF、Flt3/Flk2およびトロンボポエチン(Tpo)を含有するSFMと、2組の増殖因子を含む血清含有培地。さらに、ヒト細胞を、1)ALDH+Bright分取細胞のみ、2)ALDH Dim分取細胞のみ、3)非分取細胞のみ、および4)非分取細胞と同時培養されたALDH+Bright細胞といった、細胞の様々な組み合わせで培養した。ALDH+Bright細胞を、第1のヒトサンプルに由来する非分取細胞と同時培養して、非分取細胞が、ALDH+Bright細胞を生存させ、かつ、成長させるために生育培地を馴化することを必要とするかを調べた。ALDH+Bright細胞が独力で良好に増殖することを考えると、これは必要ないことが明らかに示された。
本発明のこの局面の1つの実施形態において、有糸核分裂後の胎芽神経網膜細胞および胎芽網膜幹細胞が、成体の眼に移植されたとき、例えば、1)網膜に移植し;2)網膜層の正しい位置に移動し;3)適切なニューロンおよび神経膠細胞の形態学に分化し;かつ、4)適切な機能回路を確立することができるパラメーターを決定することは有益である。胎芽のヒヨコ網膜細胞が成体マウスの網膜に移植し得ることを本発明者らが見出したことを考えれば、本研究では、胎芽のマウス網膜細胞が、正常なC57Bl/6J成体マウスの眼、および、網膜欠損を有する1つのマウス系統、つまり色素性網膜炎のモデルマウスであるC57Bl/6J−Peb rd1 leに移植される。この研究は、特定のクラスの神経細胞が失われている網膜症における治療的細胞置換のために重要である。例えば、光受容器が、加齢性黄斑変性症、色素性網膜炎、レーバー先天性黒内症、桿体一色型色覚および×連鎖進行性錐体ジストロフィーでは失われる;神経節細胞が多発性硬化症およびメタノール毒性では失われる;Mクラスの神経節細胞が、緑内障、アルツハイマー病および水頭症では失われる;また、ミュラー細胞が成体の網膜分離症では失われる。さらに、CNSの一部である網膜は、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病における神経障害の処置のための脳における細胞移植および治療的細胞置換のためのモデルとして使用することができる。
神経細胞が、CNSに移植できるか、および移動して、神経障害後の細胞置換のための適切な回路を形成することができるかどうかを明らかにするために、1つの実施形態では、無傷の動物における成体CNS組織が、ヒト患者治療の模擬実験をすることが必要とされる。器官(organotypic)培養における細胞浸透、細胞移動、細胞組込みおよび細胞分化は、無傷の眼での網膜におけるこれらの過程を完全には繰り返さない。従って、15を超えるマウス系統が、色素性網膜炎および網膜変性に対するモデルである網膜ジストロフィーを有することから、マウスが使用される。本研究では、胎芽のマウス網膜細胞が、正常なC57Bl/6J成体マウスの眼および色素性網膜炎モデルのC57BL/6J−Pebrd1 leマウスの眼に移植される。
第1週:5匹のC57BL/6Jマウスの10個の眼に胎芽網膜細胞を注入する。1週間後、顕微鏡観察のために、マウスを屠殺し、眼を取り出し、網膜を調製する。
I.正常なマウスおよびパーキンソン病のMPTP処理マウスモデル
成体造血幹細胞が、脳に移植できるか、移動できるか、およびニューロン、神経膠細胞および乏突起膠細胞に分化して、神経障害後の細胞置換のための適切な回路を形成することができるかどうかを明らかにするために、無傷の動物における成体CNS組織が、ヒト患者の治療の模擬実験をすることが必要とされる。器官培養における細胞浸透、細胞移動、細胞組込みおよび細胞分化は、無傷の脳におけるこれらの過程を完全には繰り返さない。数系統より多くのマウスが神経変性疾患のモデルであることから、マウスが使用される。本研究では、成体マウス骨髄幹細胞が、正常なC57Bl/6J成体マウスおよびMPTP処理されたC57Bl/6J成体マウスの海馬および線条体に移植される。細胞移植における違い、およびニューロン、神経膠細胞および乏突起膠細胞への分化比率の違いが、正常な脳およびMPTP処理された脳での海馬および線条体において、比較される。MPTP処理された脳において、MPTPにより影響を受けた黒質/線条体および影響を受けていない海馬におけるこれらの比率の違いが明らかにされる。C57Bl/6Jマウスが、MPTPに対して最も感受性の高い系統であることから、使用される。
第1週の12日前:上記のように、MPTPを20匹の成体のC57Bl/6Jマウスに5回、毎日注射する。
「C57Bl/6マウス系統は、使用されている最も高感度かつ最も一般的なMPTP齧歯類モデルである。…マウスにおけるMPTP障害の行動上の影響は、非ヒト霊長類において認められる影響よりも顕著でない」(Tolwani他、1999、Lab. Animal Sci.、49:363−371)。MPTPの影響は摂食および水飲みについて全く見出されなかった。また、MPTP処理マウスと媒介物処理マウスとの間には「どの時点においても体重が著しく異なることはなかった」(Sundstrom他、1990、Brain Res. 528:181−188)。MPTP処理の「マウスは、過流涎、立毛および発作をはじめとする初期の短期間の毒性作用を発症し得る。マウスは、通常、すぐに回復し、24時間以内に正常な自発的行動を現す。運動低下および低下した活動を含むいくつかの短期間の行動的欠損が報告されている」(Tolwani他、1999、Lab. Animal Sci.、49:363−371)。「ポールテストおよび牽引試験によってスコア化される運動活性の低下および四肢運動の障害がMPTP投与中止後に明らかに認められる」(Arai他、Brain Res. 515:57−63)。
MPTP処置の期間中、マウスを摂食行動および水飲み行動について毎日モニターし、処置後は、マウスを体重変化について週に2回モニターする。食物ペレットがMPTP処置の期間中はケージの床に置かれる。マウスが、水飲みの低下によって脱水状態になっていると思われる場合、マウスには、流体が静脈内または皮下に与えられる。MPTP処置の初日の期間中、マウスは、痙攣がある場合にはマウスの痙攣の重篤度を調べるために獣医および動物世話係によって注意深くモニターされる。
MPTPは研究者によって手袋およびマスクを使用して計量される。MPTPを化学ドラフトチャンバー内でダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水に溶解する。MPTPを、25Gaのニードルを用いてマウスに腹腔内注射する。
大腿骨に由来する最初のC57Bl/6Jマウス(Charles River)の骨髄細胞を、注入のためのCD34+造血幹細胞の純粋な集団を作製するために、4週間〜8週間にわたって懸濁細胞を継続して継代培養することによって、規定された血清非含有培地でインビトロ培養する。無菌的に培養された細胞(104)を、成体C57Bl/6Jマウス(Charles River)に、1μlのダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水で線条体に注入し、104細胞/1μlを、線条体への注入と同じ半球の海馬に注入する。細胞は、マウスを介して継代培養されていない。
成体マウスは、脳の線条体および海馬への幹細胞の定位注入を受ける。マウスの麻酔のために、Labconco Fume Adsorberの掃気用フードにおいて、100%イソフルランから空気中のイソフルランの吸入によってイソフルランを投与する。その後、マウスには、滅菌蒸留水で1:1に希釈された50mg/mlのペントバルビタール(ネンブタールのナトリウム溶液)を、20gmマウス体重あたり0.1mlで腹腔内に注射する。手術前に、マウスの頭をベタジンにより洗い、その後、70%エタノールにより洗浄する。その後、頭骨を覆っている皮膚を70%エタノール中に浸け、皮膚の切開を頭骨側面で行う。2つの2mmの穴を、携帯型愛好家用ドリルの滅菌されたドリルの錐を用いて、線条体および海馬の上方の頭骨に開ける。その後、細胞を、David Kopfの定位固定装置によって支えられた30Gaのニードルを用いて、下記の記載のように注入する。ニードルを除き、2回の注入の後、皮膚を糸で縫合する。リドカイン(4%リドカインクリーム)を、縫合後に1回、縫合部位に局所的に塗布し、マウスを、12時間毎に48時間、不快および再塗布についてモニターする。マウスをそのケージに戻して、回復させる。マウスは速やかにイソフルラン処置から目を覚ますので、麻酔から回復する期間中、加熱ランプは使用されない。すべての手術は無菌状態(USPHSの指針)のもとで行なわれる。感染率は以前の研究では1%未満である。
30匹の正常な1ヶ月齢のメスC3Hマウスおよび30匹の1ヶ月齢のメスC3HのShivererマウスが研究のために利用される。初期の研究において、本発明者らは、培養されたCD34+骨髄幹細胞が、正常な成体マウス脳に移植されたとき、形態学的には乏突起膠細胞に分化し、乏突起膠細胞の分子マーカーを発現することを見出していた。本発明の1つの実施形態では、ミエリン鞘形成不全モデルマウスのShivererが、多発性硬化症における治療的細胞置換のためのモデルとして使用される。
第1週:15匹の正常なC3Hマウスおよび30匹のShivererマウスにCD34+骨髄細胞を注入する。
<骨髄細胞の採集>
骨髄細胞を、加圧CO2ボンベからのCO2において窒息により最初にマウスを屠殺することによって成体マウスから無菌的に採集し、死を頸椎脱臼によって確認する。その後、マウスを70%エタノールに浸ける。皮膚を、滅菌されたピンセットおよびはさみを用いて大腿部から除く。その後、筋肉を、別の一組の滅菌器具を用いて大腿骨から除く。最後に、大腿骨の末端を、さらに別の一組の滅菌器具を用いて除き、骨髄を、大腿骨の一方の末端に20Gaのニードルから滅菌DPBSを注入することによって押し出す。
純粋なCD34+造血幹細胞培養物を、本明細書中に記載されるような条件で血清非含有培地および血清含有培地で成長させる。簡単に記載すると、成体の大腿骨から得られた骨髄細胞を、IL−3、IL−6、SCFおよびβ−メルカプトエタノールの存在下での継続した培養で、10%CO2において37℃で成長させる。CD34+細胞がC3Hマウスの骨髄から培養される。
CD34+細胞を蛍光性色素の5−(および6)−(((4−クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(Cell Tracker Orange CMTMR)(Molecular Probes)によって下記のように標識する。CD34+細胞(2×108)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)における10mM色素の400倍ストック液からの、DMEM10における25μMのCell Tracker Orangeの最終濃度においてインキュベートする。細胞を5mlの色素含有DMEM10において37℃で15分間インキュベートし、遠心分離によってペレット化し、15mlのDMEM10で洗浄し、37℃で30分間インキュベートし、ペレット化し、15mlのDMEM10で再び洗浄し、0.5mlのDMEM10にて再懸濁する。標識された細胞は、成体マウスの脳への定位注入のために104個/μl血清非含有培地で懸濁される。
1ヶ月齢のC3HのShivererマウスには、1μlのPBSあたり1×104個の標識されたC3HのCD34+幹細胞が大脳および小脳に定位注入される。注入されたマウスは、動物が屠殺される前に1ヶ月間、2ヶ月間および3ヶ月間飼育され、そして免疫組織化学および蛍光共焦点顕微鏡観察のために、脳が取り出され、調製される。
神経膠細胞マーカー:グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)(Chemicon、Sigma);乏突起膠細胞マーカー:2’3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホヒドロラーゼ(CNPase)(Chemicon);ニューロンマーカー:神経フィラメント(Chemicon、Steinberger Monoclonal)、神経細胞接着分子(NCAM)(Chemicon)およびNeuN(Chemicon)。フルオレセイン標識された二次抗体(Kirkegaard & Perry)を、脳切片に対する一次抗体の結合を検出するために使用し、二次抗体だけがコントロールとして使用された。免疫組織化学がレーザー共焦点顕微鏡観察よって分析され、写真撮影された。
注入された脳を、CO2による窒息の後、マウスから取り出す。その後、脳をDPBSにおける4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で24時間懸濁する。継いで、固定液が脳から移され、DPBSにおいて4℃で24時間交換される。その後、脳を30%ショ糖液において4℃で24時間平衡化させる。平衡化した脳を凍結し、脳の断面を切断するために向きを定めて、冷凍包埋配合物とともにクリオスタット標本台に載せる。厚さ30μmの連続した断面を、Micromのクリオスタットを用いて−39℃で切断する。脳の切片を顕微鏡スライドガラスに載せ、乾燥する。脳の切片を、標準的な方法によって免疫組織化学のための抗体で処置し、その後、25ng/mlの4’,−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)細胞核色素で染色し、顕微鏡のスライドカバーガラスで覆い、マニキュアで封じる。移植されたCD34+細胞を、ローダミン、フルオレセインおよびDAPIの光学特性を用いて蛍光レーザー共焦点顕微鏡観察によって観察し、写真撮影する。移植されたCD34+細胞を細胞の形態学および神経抗原の抗体検出についてスコア化し、写真撮影する。
<移植のための幹細胞供給源>
大腿骨から得られた最初のC3Hマウス(Charles River)の骨髄細胞を、注入のためのCD34+造血幹細胞の純粋な集団を作製するために、4週間〜8週間にわたって懸濁細胞を継続して継代培養することによって、規定された血清非含有培地でインビトロ培養する。無菌的に培養された細胞(104)を、1ヶ月齢のC3Hの正常マウスおよびShivererマウス(Charles River)に、1μlのダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水で小脳に注入し、104細胞/1μlを小脳への注入と同じ半球の海馬に注入する。細胞はマウスを介して継代培養されていない。Shivererマウスについての平均余命は短いので、30匹のマウスに注入し、マウスを3群で処理する。それぞれ、注入後1ヶ月後で5匹のうちの生存体、3ヵ月後で10匹のうちの生存体、および、6ヶ月後で15匹のうちの生存体である。
1ヶ月齢のマウスは、脳の小脳および海馬への幹細胞の定位注入を受ける。マウスの麻酔のために、Labconco Fume Adsorberの掃気用フードにおいて、100%イソフルランからの空気中のイソフルランの吸入によってイソフルランを投与する。その後、マウスには、滅菌蒸留水で1:1に希釈された50mg/mlのペントバルビタール(ネンブタールのナトリウム溶液)を20gmマウス体重あたり0.1mlで腹腔内に注射する。手術前に、マウスの頭をベタジンにより洗い、その後、70%エタノールにより洗浄する。その後、頭骨を覆う皮膚を70%エタノール中に浸け、皮膚の切開を頭骨側面で行う。2つの2mmの穴を、携帯型愛好家用ドリルの滅菌されたドリルの錐を用いて、線条体および海馬の上方の頭骨に開ける。その後、細胞を、David Kopfの定位固定装置によって支えられた30Gaのニードルを用いて、下記の記載のように注入する。ニードルを除き、2回の注入の後、皮膚を糸で縫合する。リドカイン(4%リドカインクリーム)を、縫合後に1回、縫合部位に局所的に塗布し、マウスを、12時間毎に48時間、不快および再塗布についてモニターする。マウスをそのケージに戻して、回復させる。マウスは速やかにイソフルラン処置から目を覚ますので、麻酔から回復する期間中、加熱ランプは使用されない。
免疫組織化学および蛍光顕微鏡観察のために、動物を上記のように処理し、脳を調製する。
ヌードマウスのモデルを、本発明の方法を用いて脳への成人骨髄幹細胞の移植のために利用した。特定の実施形態において、十分な数の均質な幹細胞が成人の骨髄から作製される。本明細書の他のところに記載されるように、成体マウスの骨髄から成長した幹細胞は、成体マウスの脳に移植されたとき、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞のマーカーおよび形態学的特徴を発現する。ヒト細胞が、成体ヌードマウスの脳に移植されたとき、神経細胞を生じさせるその能力について特徴づけられる。本発明に基づいて、適用には、患者の神経変性障害(例えば、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、ハンチングトン病、ALSなど)に対する治療的細胞置換のために個体の骨髄から幹細胞を成長させることが含まれる。
実験1(マウス(n=30))
<時間経過の流れ図>
<ヒト骨髄細胞の採集>
正常なヒト骨髄を、例えば、StemCo Biomedicalなどから商業的に得る。代わりの方法では、骨髄が商業的に得るのではなく、従来の方法によって、例えば、患者から採集などされる。
純粋なCD34+造血幹細胞培養物を、本明細書中で記載されたような条件で、血清非含有培地および血清含有培地で成長させる。簡単に記載すると、骨髄細胞を、ヒトのIL−3、IL−6、SCFおよびβ−メルカプトエタノールの存在下での継続した培養で10%CO2において37℃で成長させる。
CD34+細胞を蛍光性色素の5−(および6)−(((4−クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(Cell Tracker Orange CMTMR)(Molecular Probes)によって下記のように標識する。CD34+細胞(2×108)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)における10mM色素400倍ストック液からの、DMEM10における25μMのCell Tracker Orangeの最終濃度においてインキュベートする。細胞を5mlの色素含有DMEM10において37℃で15分間インキュベートし、遠心分離によってペレット化し、15mlのDMEM10で洗浄し、37℃で30分間インキュベートし、ペレット化し、15mlのDMEM10で再び洗浄し、0.5mlのDMEM10に再懸濁する。標識された細胞を、成体マウス脳への定位注入のために104個/μl血清非含有培地で懸濁する。
2ヶ月齢のヌードマウスに、1μlのPBSあたり1×106個の標識されたC3HのCD34+幹細胞/が海馬および線条体に定位注入される。注入されたマウスは、動物が屠殺される前に1ヶ月間、2ヶ月間および3ヶ月間飼育され、そして免疫組織化学および蛍光共焦点顕微鏡観察のために、脳が取り出され、調製される。
神経膠細胞マーカー:グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)(Chemicon、Sigma);乏突起膠細胞マーカー:2’3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホヒドロラーゼ(CNPase)(Chemicon);ニューロンマーカー:神経フィラメント(Chemicon、Steinberger Monoclonal)、神経細胞接着分子(NCAM)(Chemicon)およびNeuN(Chemicon)。フルオレセイン標識された二次抗体(Kirkegaard & Perry)を、脳切片に対する一次抗体の結合を検出するために使用し、二次抗体だけがコントロールとして使用された。免疫組織化学がレーザー共焦点顕微鏡観察よって分析され、そして写真撮影された。
注入された脳を、CO2による窒息の後、マウスから取り出す。その後、脳をDPBSにおける4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で24時間懸濁する。続いて、固定液を脳から移され、DPBSにおいて4℃で24時間交換される。その後、脳を30%ショ糖液において4℃で24時間平衡化させる。平衡化した脳を凍結し、脳の断面を切断するために方向を定めて、冷凍包埋配合物とともにクリオスタット標本台の載せる。厚さ30μmの連続した断面を、Micromのクリオスタットを用いて−39℃で切断する。脳の切片を顕微鏡スライドグラスに載せ、乾燥する。脳の切片は、標準的な方法によって免疫組織化学のための抗体で処置し、その後、25ng/mlの4’,−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)細胞核色素で染色し、顕微鏡のスライドカバーガラスで覆い、マニキュアで封じる。移植されたCD34+細胞を、ローダミン、フルオレセインおよびDAPIの光学特性を用いて蛍光レーザー共焦点顕微鏡観察によって観察し、写真撮影する。移植されたCD34+細胞を細胞の形態学および神経抗原の抗体検出についてスコア化し、写真撮影する。
<移植のための幹細胞供給源>
ヒト成体骨髄(これはStemCo Biomedicalから得られる)を、注入のためのCD34+造血幹細胞の純粋な集団を作製するために、約4週間〜8週間にわたって懸濁細胞を継続して継代培養することによって、規定された血清非含有培地でインビトロ培養する。無菌的に培養された細胞(106)を、2ヶ月齢のヌードマウス(Jackson)に、1μlのダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水で海馬に注入し、106細胞/1μlを海馬への注入と同じ半球の線条体に注入する。細胞はマウスを介して継代培養されていない。ヌードマウスの平均余命は短いので、30匹のマウスに注入し、マウスを3群で処理する:注入後1ヶ月後で10匹のうちの生存体;3ヵ月後で10匹のうちの生存体;そして6ヶ月後で10匹のうちの生存体。
1ヶ月齢のマウスは脳の海馬および線条体への幹細胞の定位注入を受ける。麻酔のために、マウスに、滅菌蒸留水で1:1に希釈された50mg/mlのペントバルビタール(ネンブタールのナトリウム溶液)を20gmマウス体重あたり0.1mlで腹腔内に注射する。手術前に、マウスの頭をベタジンにより洗い、その後、70%エタノールにより洗浄する。その後、頭骨を覆う皮膚を70%エタノールに浸け、皮膚の切開を頭蓋側面で行う。2つの2mmの穴を、携帯型愛好家用ドリルの滅菌されたドリルの錐を用いて、海馬および線条体の上方の頭骨に開ける。その後、細胞を、David Kopfの定位固定装置によって支えられた30Gaのニードルを用いて、下記に記載されるように注入する。ニードルを除き、2回の注入の後、皮膚を糸で縫合する。リドカイン(4%リドカインクリーム)を、縫合後に1回、縫合部位に局所的に塗布し、マウスを、12時間毎に48時間、不快および再塗布についてモニターする。リドカインが痛みを抑制しない場合、他の鎮痛剤を、例えば、ブプレノルフィンを0.01mg/kg体重〜0.03mg/kg体重で投与することができる。マウスをそのケージに戻して、回復させる。マウスは速やかに処置から目を覚ますので、麻酔から回復する期間中、加熱ランプは使用されない。すべての手術は無菌状態のもとで行なわれ(USPHSの指針)、感染率は以前の研究では1%未満である。マウスを、術後毎日、行動の変化についてモニターし、動作、水飲みまたは摂食の問題が観察されるならば、そのマウスを免疫組織化学のために調製する。
免疫組織化学および蛍光顕微鏡観察のために、動物を上記のように処理し、脳を調製する。
下記の表6は、IL−3、IL−6およびSCF(3因子)、または、IL−3、IL−6、Flk−2およびTpo(5因子)を含有する血清非含有培地で成長させた、成体ヒト骨髄から得られるフローサイトメトリー分取のALDH+bright細胞に関する。培養された細胞を、培養での18日後、25日後および66日後に、造血幹細胞および神経幹細胞のマーカーについて免疫細胞化学によって検定した。幹細胞集団は、CD34、CD45、cKitおよびPa×−6の発現についてそれぞれの時点で均質であることが見出された。
ヒトのトリソミー21は、本質的には、神経系における重篤な異常によって特徴づけられる。加えて、造血細胞の欠乏がこれらの患者では非常に頻発しており、血液学的障害および免疫障害を発症する危険性が大幅に増大している。ヒトのトリソミー21のマウスモデルが、ヒトの第21染色体に対して最も相同的であるマウスの第16染色体を用いて作製されている。実際、トリソミー16のマウスでは、増大したアポトーシスが、胎児の発達期間中の神経系および胸腺における始原細胞において報告されている。本明細書中では、成体の分節性トリソミーマウスであるTs65Dnに由来する骨髄幹細胞/前駆細胞のCD34+細胞は、その二倍体同腹子と比較して増殖能力が劇的に低下している。実際、トリソミーのCD34+幹細胞/前駆細胞の大多数がエクスビボではアポトーシス性である。加えて、Ts65DnのCD34+細胞のインビトロ増殖能力は大幅に低下していた。これは、低下した有糸分裂速度および高い割合のアポトーシス細胞の結果である。それにもかかわらず、調べられた表現型形質はトリソミー細胞および二倍体細胞において類似している。神経系、胸腺および造血系から得られたこれらの結果は、共通する機構がトリソミーマウスでは幹細胞/前駆細胞において働いており、細胞の増殖および生存に影響を及ぼしていることを示している。
骨髄を成体のTs65Dnマウスおよびそれらの二倍体同腹子から採集し、以前に記載されたように(Goolsby他、2003)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、幹細胞因子(SCF)および2−メルカプトエタノールを含有する液体培地で培養した。浮遊細胞を継続して植え継ぎ、4週間後、すべての細胞が、両タイプのマウスから得られた培養物においてCD34+であった。しかしながら、数日後でさえ、それらの成長速度における大きな違いが観察された(図17)。実際、Ts65Dnマウスに由来するCD34+骨髄細胞の増殖能力は、二倍体同腹子の増殖能力と比較して、大幅に低下している。二倍体およびTs65Dnにおいて同じ数の骨髄細胞(2×106細胞)から出発する。培養物の細胞密度を、成長曲線の測定期間中、同程度のレベルで維持した。培養で80日後、Ts65Dn骨髄に由来するCD34+細胞の累積数は約109個であり、一方、同じ時点において、二倍体同腹子に由来する細胞の数は1015個に達する。これらの条件のもとで、倍加時間は、二倍体については2.5日であり、Ts65Dnについては11日であった。培養で80日での世代数は、Ts65Dnでは8であり、二倍体については33世代である。これらのデータは、別個の同腹子に由来するマウスを用いて高い再現性を有していた(2つの同腹子に由来するそれぞれの遺伝子型についてn=8)。
2つの主要な、互いに排他的でない機構により、トリソミーのCD34+細胞の非常に低い増加速度、つまり、低下した細胞成長速度またはアポトーシス細胞の高い割合を説明することができる。細胞の成長を、BrdUを5時間の暴露後に取り込む細胞の割合として、また、培養で6週間後、8週間後および10週間後におけるKi67タンパク質を発現する細胞の割合として測定した。異常な有糸分裂速度を確認するために、BrdU(チミジンアナログ)による5時間のパルス標識を調べた。純粋なTs65Dn CD34+培養物は二倍体の1/7のBrdU標識を示した(図18)。図18aは、BrdUの取り込みが、二倍体については各時点で70%であったが、トリソミーについては6%〜10%であったにすぎないことを示している。Ts65と二倍体との間での有糸分裂速度の違いは各時点で同じであった。図18bでは、Ki67(細胞増殖についてのマーカー)に対して免疫陽性であるトリソミー細胞および二倍体細胞の割合が測定された。BrdU標識の場合と同様に、70%を超える二倍体が染色され、一方で、トリソミーの10%〜20%のみが、10週間にわたる培養で、Ki67に対して免疫陽性であった。
同時に、アポトーシスの表現型を示すCD34+細胞の割合を調べた。すべての時点で、二倍体の10%より少なく、しかし、トリソミーの65%〜90%が、アポトーシスのカスケードにおける切断されたカスパーゼ3に対する免疫蛍光に基づいてアポトーシス性であると診断された(図18a)。これは核の形態学およびTUNELと一致していた。加えて、ウエスタンブロットでは、トリソミーの培養物が、二倍体を上回る増大したカスパーゼ(切断型)発現を示すことが示された(ゲルについてはMikeを参照のこと)。10週齢の培養物のウエスタンブロットでは、トリソミーの培養物において、カスパーゼ3の切断された17kDaバンドが明らかにされた(図18b)。加えて、トリソミーにおける大部分の細胞がアポトーシス性の核の形態学を明らかにした(図18b)。TUNEL染色は、培養での6週間で、10%の二倍体、しかし、50%のトリソミー細胞を示した。従って、カスパーゼ3の発現は、アポトーシスを予測するものであり、これにより、2つの遺伝子型の死のパターンがさらに確認される。
しかしながら、トリソミーCD34+細胞の低い有糸分裂速度および高いアポトーシス割合は、インビボで存在する内在性CD34+細胞によって生存のために要求されると考えられる増殖因子が培地に存在していないことであると論ずることができる。従って、有糸分裂マーカーおよびアポトーシスマーカーを発現するトリソミーマウスおよび二倍体マウスに由来するエクスビボCD34+細胞の割合を調べた。図21は、トリソミーの骨髄におけるCD34+細胞の割合が5%であり、一方、二倍体の骨髄における割合が7%であることを示している。実に興味深いことに、Ts65Dnに由来するこれらのCD34+細胞の大多数がアポトーシスマーカーを発現し、一方、少数のみが有糸分裂性のようである。対照的に、CD34+の二倍体細胞では、細胞の大多数が有糸分裂性であり、少数がアポトーシス性のようである。これらの結果は、インビトロデータが培養の人為的影響ではなく、インビボの状況を増幅しているに過ぎないことを明確に示している。
しかしながら、トリソミーのマウスに由来するCD34+細胞の遅く成長する集団が、それらの正常な同腹子のCD34+細胞の表現型と同じ表現型を示すかどうか、または、これらの細胞がCD34+細胞のサブセットに由来するかどうかを明らかにすることが重要であった。従って、トリソミーマウスに由来するCD34+細胞を、それらのコントロールと比較して、培養において種々の時点で検定した。最も明確な結果は、トリソミーCD34+細胞の表現型が二倍体同腹子の表現型と異ならないということである(表9)。
ダウン症候群(DS)の発症の一般的な特徴は、インビボおよび培養の両方での、脳および胸腺におけるアポトーシスの存在である(Sawa他、1999;Levin他、1979)。実際、BusseglioおよびYankner(1995)は、DS胎児の脳に由来する培養された皮質ニューロンが、増大した速度のアポトーシスを示すること、また、ROSの細胞内レベルが3倍〜4倍上昇したことを示している。DSの胸腺において、Levin他は、胸腺の退化に類似するリンパ球の涸渇を伴って胸腺がより小さくなることを見出していた。加えて、DSの小児は、減少した数のT細胞ならびにこれらの細胞の機能的欠損をともに有する。また、DSの新生児は、CD34+細胞の数が異常であり(Tamiolakis他、2001)、また、一過性の骨髄増殖性障害を有する(Hassle、2001)。
本発明者らは、CD34+幹細胞が、インスリンに対する順方向プライマー5’−AACCCACCCAGGCTTTTGTC−3’(配列番号21)および逆方向プライマー5’−TCCACAATGCCACGCTTCTG−3’(配列番号22)を使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によってインスリンに対するmRNAを発現することを明らかにしている。本発明者らはまた、放射性の35−イオウで標識された(35S)−システインにより細胞を代謝的に標識することによって、細胞がこのmRNAをインスリンタンパク質に翻訳することを示していた。インスリンはその51個のアミノ酸の中に6個のシステインを含む。35S−システインにより細胞を標識した後、細胞溶解物と、細胞が成長していた培養培地の両方を、細胞溶解物および培養培地に存在する可能性のある何らかのインスリンを免疫沈降させるために抗インスリン抗体カラムに通した。カラムからの溶出物をポリアクリルアミド電気泳動により分子量によって分離し、オートラジオグラフィーに感光させて、CD34+細胞における代謝的に合成されたインスリンの存在を明らかにした。さらに、35Sのカウント値の95%が、細胞溶解物においてではなく、培地に存在したので、細胞は合成されたインスリンを分泌していた。この分泌は、この細胞が糖尿病患者における細胞置換治療で使用されることを考慮すれば重要である。CD34+細胞が、インスリンを産生する正常な膵臓小島細胞が行なうように、培養培地中のグルコースの量の結果として、細胞が合成するインスリンの量を調節することができるかどうかが明らかにされる。CD34+細胞を、高レベルのグルコースおよび低レベルのグルコースを含む培養培地で成長させる。CD34+細胞がインスリン合成を調節する実施形態では、CD34+細胞は、高グルコース培地で、低グルコース培地におけるよりも多くのインスリンを発現するはずである。細胞はインスリンのmRNAを発現しており、インスリンタンパク質を産生し、分泌する。一部の実施形態において、細胞がインスリン合成を調節しないならば、細胞は、膵臓小島β−細胞にインビボで分化した後でインスリン合成を調節すると考えられ、かつ/または、細胞は発現を調節するために遺伝子操作することができる。
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が属する当業者のレベルを示している。すべての特許および出版物は、それぞれの個々の刊行物が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのようにそれと同程度に参考として本明細書中に組み込まれる。
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Claims (33)
- 多数の細胞において幹細胞を濃縮する方法であって、
幹細胞が第1の培地において実質的に懸濁状態にあり、かつ非増殖性細胞が実質的に基質に接着する条件のもとで、細胞のサンプルを第1の液体細胞培養培地に加える工程、および、
懸濁された細胞を第2の液体細胞培養培地に継代培養する工程
を含むことを特徴とする幹細胞培養培地の使用方法。 - 前記幹細胞が、多能性幹細胞としてさらに定義することができることを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記基質が、第1の液体細胞培養培地を収容する容器であることを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記懸濁された細胞が、1回より多く継代培養されることを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記懸濁された細胞の継代培養が、連続した容器において細胞を液体培地で連続して継代培養することとしてさらに定義することを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記継代培養が、1週間に約1回、1週間に1回より少なく、または1週間に1回より多い頻度で行われることを特徴とする請求項4記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記第1の細胞培養培地、第2の細胞培養培地、または、両方の培養培地が、血清を含まないことを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記培養培地が、フィーダー細胞、マトリックス、または、その両方を有しないことを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記多数の細胞が、骨髄細胞、肝臓細胞、神経細胞、膵臓小島細胞、胎芽細胞、間葉系細胞、筋細胞、皮膚細胞、毛包細胞、腸細胞、心臓細胞または骨細胞を含むとしてさらに定義されることを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記多数の細胞が骨髄細胞を含むとき、前記培地が、インターロイキン−3、インターロイキン−6、幹細胞因子、Flt−3/Flk−2、Tpo、Shh、Wnt−3a、Kirre、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項9記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記多数の細胞が神経細胞を含むとき、前記培地が、繊維芽細胞成長因子−β(FGF−β)、表皮成長因子(EGF)、フィブロネクチン、シスタチンC、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項9記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記多数の細胞が胎芽細胞を含むとき、前記培地が、FGF−β、Wnt−3a、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項9記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記多数の細胞が間葉系幹細胞を含むとき、前記培地が、FGF−β、EGF、血小板由来増殖因子(PDGF)、フィブロネクチン、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項9記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 1つまたは複数の幹細胞を個体に送達する工程を、さらに含むことを特徴とする請求項1記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 医学的状態について個体を処置する方法であって、
幹細胞が実質的に懸濁状態にあり、かつ、非増殖性細胞が実質的に基質に接着する条件のもとで、幹細胞を含む細胞サンプルを第1の液体細胞培養培地に加える工程、
第1の培地からの懸濁された細胞を第2の液体細胞培養培地に継代培養する工程、および、
1つまたは複数の幹細胞を個体に送達する工程
を含むことを特徴とする幹細胞培養培地の使用方法。 - 前記医学的状態が、多発性硬化症、パーキンソン病、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ダウン症候群、心臓疾患、ハンチングトン病、発作、脊髄傷害、白血病、形成不全症、皮膚置換または毛包置換であることを特徴とする請求項15記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記懸濁された細胞の継代培養が、細胞を連続した容器において液体培地で継続して継代培養することとしてさらに定義されることを特徴とする請求項15記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記1つまたは複数の細胞を固体に送達する工程が、注射または移植を含むことを特徴とする請求項15記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記1つまたは複数の細胞の個体への送達に先立ち、1つまたは複数の治療因子を幹細胞に送達する工程を、さらに含むことを特徴とする請求項15記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記治療因子が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、小分子、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項19記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記個体が、多発性硬化症を有しており、前記治療因子が、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNV)またはIFN−βを含むことを特徴とする請求項19記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記個体が、パーキンソン病を有しており、治療因子が、BDNFまたはGDNFを含むことを特徴とする請求項19記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記個体が、糖尿病を有しており、治療因子が、インスリンを含むことを特徴とする請求項19記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 1個または複数の哺乳動物幹細胞を単離する方法であって、
1個また複数の幹細胞を含む多数の細胞を備える工程、
多数の細胞を、液体培養培地を含む容器での培養工程に提供すること、つまり、懸濁された細胞と容器に接着した細胞とを産生する培養の工程、
多数の懸濁された細胞を、液体細胞培地を含む別の容器に移送する工程、ならびに、
前記提供および移送を少なくとも1回繰り返す工程
を含むことを特徴とする幹細胞培養培地の使用方法。 - 前記培養工程における懸濁細胞対接着細胞の比率が、前回の培養工程における懸濁細胞対接着細胞の比率よりも大きいことを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記哺乳動物幹細胞が、多能性細胞としてさらに定義されることを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記接着細胞が、分化した細胞としてさらに定義されることを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記移送する工程が、培地の少なくとも一部を移送することをさらに含むことを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記培地が、血清を有しないことを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 前記培地が、フィーダー細胞、マトリックス、またはその組合せを有しないことを特徴とする請求項24記載の幹細胞培養培地の使用方法。
- 1つまたは複数の単離された幹細胞であって、
幹細胞が第1の培地において実質的に懸濁状態にあり、かつ、非増殖性細胞が実質的に基質に接着する条件のもとで、細胞サンプルを第1の液体細胞培養培地に加える工程、および、
懸濁された細胞を第2の液体細胞培養培地に継代培養する工程
によって産生されることを特徴とする幹細胞。 - 医学的状態について個体を処置する方法であって、
幹細胞が実質的に懸濁状態にあり、かつ、非増殖性細胞が実質的に基質に接着する条件のもとで、幹細胞を含む細胞サンプルを第1の液体細胞培養培地に加える工程、
懸濁された細胞、つまり1つまた複数の幹細胞を含む懸濁された細胞を、第1の培地から少なくとも1つの第2の液体細胞培養培地に継代培養する工程、
1つまたは複数の治療因子を、治療因子がその条件に適合する幹細胞の1つまたは複数に送達する工程、および、
治療因子を含む1つまたは複数の幹細胞を個体に送達する工程
を含むことを特徴とする幹細胞培養培地の使用方法。 - 治療因子が、治療ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項32記載の幹細胞培養培地の使用方法。
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