MXPA06008932A - Composiciones y metodos que se refieren al cultivo de las celulas madre neurales con celulas estromales de medula osea. - Google Patents

Abstract

La presente invencion comprende metodos y composiciones para mejorar el crecimiento de las celulas madre neurales; tambien se incluyen en la invencion los metodos para modular la expresion de la molecula del MHC en una celula madre neural (NSC).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS QUE SE REFIEREN AL CULTIVO DE LAS CÉLULAS MADRE NEURALES CON CÉLULAS ESTROMALES DE MEDULA OSEA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La médula ósea contiene al menos dos tipos de células madre, células madre hematopoiéticas y células madre de tejidos no hematopoiéticos referidas de diversas maneras como células madre mesenquimatosas o células estromales de la médula (MSCs) o células estromales de la médula ósea (BMSCs). Estos términos se utilizan de manera intercambiable a lo largo de la presente invención. Las MSCs son de interés debido a que se aislan fácilmente a partir de un pequeño aspirado de médula ósea y luego se generan fácilmente colonias derivadas a partir de una célula particular. Las colonias derivadas a partir de una célula particular se pueden expandir tanto como la duplicación de 50 veces la población en aproximadamente 10 semanas, y se pueden diferenciar hacia osteoblastos, adipocitos, condrocitos (A. J. Friedenstein et al. 1970 Cell Tissue Kinet. 3: 393-403; H. Castro-Malaspina et al. 1980 Blood 56: 289-301 ; N. N. Beresford et al. 1992 J. Cell Sci. 102: 341-351 ; D. J. Prockop 1997 Science 276: 71-74), miocitos (S. Wakitani et al. 1995 Muscle Nerve 18: 1417-1426), astrocitos, oligodendrocitos, y neuronas (S. A. Azizi et al. 1998 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913; G. C. Kopen et al. 1999 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 10711-10716; M. Chopp et al. 2000 Neuroreport II, 3001-3005; D. Woodbury et al. 2000 Neuroscience Res. 61 : 364-370). Además, las MSCs dan lugar a las células de las tres capas germinales (Kopen, G. C. et al. 1999 Proc. Nati. Acad. Sci. 96: 10711-10716; Liechty, K. W. et al. 2000 Nature Med. 6: 1282-1286; Kotton, D. N. et al. 2001 Development 128: 5181-5188; Toma, C. et al. 20002 Circulation 105: 93-98; Jiang, Y. et al. 2002 Nature 418: 41-49). La evidencia in vivo indica que las células no fraccionadas derivadas de médula ósea así como las poblaciones puras de MSCs dan lugar a tipos celulares epiteliales incluyendo aquellos del pulmón (Krause, et al. 2001 Cell 105: 369-377; Petersen, et al. 1999 Science 284: 1168-1170) y varios estudios recientes han mostrado que el injerto de las MSCs se mejora por la lesión tisular (Ferrari, G. et al. 1998 Science 279: 1528-1530; Okamoto, R. et al. 2002 Nature Med. 8: 1101-1017). Por estas razones, las MSCs son continuamente evaluadas por su uso potencial en terapia celular y terapia génica de numerosas enfermedades de humano (Horwitz et al., 1999 Nat. Med. 5: 309-313; Caplan, et al. 2000 Clin. Orthoped. 379: 567-570). Las MSCs constituyen una fuente alternativa de células madre pluripotenciales. Bajo condiciones fisiológicas éstas mantienen la arquitectura de la médula ósea y regulan la hematopoiesis con la ayuda de diferentes moléculas de adhesión celular y la secreción de citoquinas, respectivamente (Clark, B. R. & Keating, A. 1995 Ann NY Acad Sci 770: 70-78). Las MSCs que crecen fuera de la médula ósea por su unión selectiva al plástico para cultivo de tejidos se pueden expandir eficientemente (Azizi, S. A., et al. 1998 Proc Nati Acad Sci USA 95: 3908-3913; Colter, D. C, et al. 2000 Proc Nati Acad Sci USA 97: 3213-218) y se manipulan genéticamente (Schwarz, E. J., et al. 1999 Hum Gene Ther 10: 2539-2549). Las MSCs también se refieren como células madre mesenquimatosas debido a que son capaces de diferenciarse hacia múltiples tejidos mesodérmicos, incluyendo hueso (Beresford, J. N., et al. 1992 J Cell Sci 102: 341-351 ), cartílago (Lennon, D. P., et al. 1995 Exp Cell Res 219: 211- 222), grasa (Beresford, J. N., et al. 1992 J Cell Sci 102: 341- 351) y músculo (Wakitani, et al. 1995 Muscle Nerve 18: 1417-1426). Además, se ha reportado la diferenciación hacia células semejantes a neurona que expresan marcadores neuronales (Woodbury, D. et al. 2000 J Neurosci Res 61 : 364-370; Sánchez-Ramos, J., et al. 200 Exp Neurol 164: 247-256; Deng, W., et al. 2001 Biochem Biophys Res Común 282: 148-152), sugiriendo que MSC puede se capaz de superar el compromiso de la capa germinal. Las células madre son progenitores multipotenciales auto-renovadoras con el potencial de desarrollo más amplio en un tejido dado a un tiempo dado (Morrison et al. 1997 Cell 88: 287-298). Recientemente se ha generado un mayor crecimiento en el interés a partir de los estudios de las células madre en el sistema nervioso, no solamente debido a su importancia para el entendimiento del desarrollo neural sino también por su potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Los métodos actuales para el aislamiento y mantenimiento de líneas celulares embrionarias y otras líneas celulares madre dependen del uso de fibroblastos embrionarios de murino (MEF) como una capa alimentadora. Se ha observado que la frecuencia de las clonas de célula madre embrionaria se incrementa varias veces con el uso de reemplazadores de suero en el medio de cultivo (Amit el at. 2000 Dev Biol 227: 271-278). La presencia del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) se requiere para la proliferación no diferenciada continua de las células madre embrionarias clónales. Los métodos actuales para el aislamiento, cultivo y expansión de las células madre embrionarias de humano están limitados por su dependencia de una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de murino. Aún queda por demostrarse que una célula madre puede ser mantenida indefinidamente en un estado indiferenciado en la ausencia de células alimentadoras. Para mejorar la velocidad de crecimiento de las células madre de cerebro fetal, se han utilizado varios métodos diferentes y factores de crecimiento por numerosos grupos diferentes durante la última década. Se ha mostrado que el bFGF y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) son necesarios para la expansión y mantenimiento de las células madre neurales fetales de humano (hNSCs). Estos cultivos de NSC de humano normalmente crecen como agrupamientos flotantes libres de células (neuroesferas), pero las neuroesferas no pueden proliferar indefinidamente en la presencia de bFGF y EGF solo. Se mostró que el factor inhibidor de la leucemia (LIF) incrementa la velocidad de crecimiento y prolonga la longevidad de las NSCs que responden a FGF y EGF (Carpenter et al., 1999 y Wright et al., 2003). Además para regular la velocidad de crecimiento LIF regula dinámicamente varios genes incluyendo moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las NSCs (Wright et al., 2003). Las células madre de cerebro fetal de humano son consideradas como candidatos atractivos para el transplante de célula madre para la regeneración de tejidos dañados. Las células madre derivadas a partir de donantes embrionarios o fetales requieren transplante alogenéico. El transplante de células entre individuos genéticamente dispares invariablemente está asociado con el riesgo de rechazo del injerto por el hospedero. Casi todas las células expresan productos del complejo mayor de histocompatibilidad, la molécula clase I del MHCs. Además, muchos tipos celulares pueden ser inducidos para expresar la molécula clase II del MHCs cuando se exponen a citoquinas inflamatorias. El rechazo de aloinjertos es mediado principalmente por las células T de ambas subclases CD4 y CD8 (Rosenberg et al. 1992 Annu. Rev. Immunol. 10: 333). Las células T CD4 aloreactivas producen citoquinas que exacerban la respuesta citolítica de CD8 a un antígeno. Dentro de estas subclases, las subpoblaciones competentes de células que se desarrollan después de la estimulación con el antígeno son caracterizadas por las citoquinas que producen. Las células Th1 , las cuales producen IL-2 e IFN-?, participan principalmente en el rechazo del aloinjerto (Mossmann et al., 1989 Annu. Rev. Immunol. 7: 145). Las células Th2, las cuales producen IL-4 e IL-10, pueden subregular las respuestas de Th1 a través de la IL-10 (Fiorentino et al. 1989 J. Exp. Med. 170: 2081 ). De hecho, se ha realizado un gran esfuerzo desviar las respuestas indeseables Th1 hacia la ruta de Th2. Las respuestas indeseables de la célula T aloreactiva en pacientes en contra de un transplante típicamente son tratadas con fármacos inmunosupresores tales como prednisona, azatioprina, y ciclosporina A. Desafortunadamente estos fármacos generalmente necesitan ser administrados por toda la vida del paciente y tienen una multitud de efectos laterales peligrosos incluyendo inmunosupresión generalizada. Las células madre neurales expresan niveles bajos o insignificantes de los antígenos de MHC clase I y/o clase II (McLaren et al. 2001 J. Neuroimmunol. 112: 35), pero estas células usualmente son rechazadas después del implante dentro de recipientes alogenéicos a menos que se utilicen fármacos inmunosupresores. El rechazo se puede iniciar después de que las moléculas del MHC son sobre-reguladas en las membranas celulares después de la exposición a citoquinas inflamatorias de la familia del IFN. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de estandarización de las condiciones de cultivo para maximizar la proliferación y multipotencialidad de las NSCs para uso terapéutico. Además, habitualmente se cree que un transplante exitoso de las NSCs es dependiente de la prevención y/o reducción de una respuesta inmune no deseable en contra de las NSCs mediada por las células efectoras inmunes para prevenir el rechazo del hospedero de las NSCs. Por lo tanto, existe una necesidad desde hace largo tiempo por métodos para suprimir o prevenir de otra manera una respuesta inmune no deseada asociada con el transplante de las NSCs entre los individuos genéticamente dispares. La presente invención satisface esta necesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención incluye composiciones y métodos para cultivar células madre neurales (NSCs). La invención también incluye una célula producida mediante dichas composiciones y métodos. La invención incluye una composición que comprende una célula estromal de médula ósea aislada (BMSC) y un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para crecimiento de la célula madre neural (NSC) y factores secretados por dicha BMSC. En un aspecto, el medio de cultivo no contiene factor inhibidor de la leucemia exógeno (LIF). En otro aspecto, los factores secretados por las BMSCs se seleccionan a partir del grupo que consiste de factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas. En incluso otro aspecto, los factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1 ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de las metaloproteinasas (T1MP-1), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromaI-1 (SDF-1 ), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1 ) y TGFß-3. La invención también incluye co-cultivar BMSCs con NSCs en un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para crecimiento de célula madre neural (NSC). En un aspecto, las BMSCs y las NSCs se cultivan de manera dependiente del contacto, en donde las BMSCs se ponen en contacto físicamente con las NSCs. En otro aspecto, las BMSCs y las NSCs se cultivan de manera independiente del contacto, caracterizado además porque las BMSCs no se encuentran físicamente en contacto con las NSCs. En un aspecto adicional, las NSCs se derivan a partir del sistema nervioso central de un humano.

En incluso otro aspecto, las BMSCs se derivan a partir de un humano. En otro aspecto, el material genético exógeno ha sido introducido dentro de las células de la presente invención. La presente invención también incluye un medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM) que comprende un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para el crecimiento de la célula madre neural (NSC) y factores secretados por una BMSC aislada. En un aspecto, el BMSC-CM no contiene LIF exógeno. En otro aspecto, el BMSC-CM está esencialmente libre de BMSCs. En incluso otro aspecto de la presente invención, el BMSC-CM comprende factores seleccionados a partir del grupo que consiste de factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas. En un aspecto adicional, el BMSC-CM comprende factores seleccionados a partir del grupo que consiste de LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (1GFBP-2), IGFBP-6, lL-1 ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), neurofactores tróficos (NT3), inhibidor tisular de las metaloproteinasas (T1MP-1), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), TL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1) y TGFß-3. La presente invención también incluye un método para modular la expresión de la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en una NSC aislada. En un aspecto, el co-cultivo de una BMSC aislada con una NSC aislada modula la expresión de la molécula del MHC en la NSC. En otro aspecto, la expresión de la molécula del MHC en una NSC se puede modular mediante el cultivo de las NSCs con BMSC-CM. La presente invención incluye una NSC aislada preparada a partir del co-cultivo de las BMSCs con las NSCs. En un aspecto de la invención una NSC producida mediante los métodos de la presente invención exhibe una expresión reducida de la molécula clase I del MHC. En otro aspecto, una NSC producida mediante los métodos de la presente invención exhibe un nivel de línea basal de la molécula clase II del MHC.

La presente invención también incluye un dispositivo para cultivo de célula neural que comprende una NSC aislada, una BMSC aislada, un medio para crecimiento de la NSC, y un medio para conservar a la NSC y la BMSC sin contacto físico entre sí. En otro aspecto, el dispositivo comprende adicionalmente un filtro o membrana que conserva a las NSCs y BMSCs sin contacto físico entre sí. En incluso otro aspecto, el filtro o membrana tiene poros para permitir que los factores secretados a partir de dicha BMSC crucen dicho filtro o membrana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para el propósito de ¡lustrar la invención, se ilustran en los dibujos ciertas modalidades de la invención. No obstante, la invención no se limita a los arreglos precisos y orquestación de las modalidades ¡lustradas en los dibujos. La figura 1 es una gráfica que ¡lustra la proliferación de las BMSCs en medio de BMSC (DMEM-baja glucosa, 10% suero de bovino fetal porción evaluada (FBS)), o medio de NSC (DMEM-F12, Suplemento N2, EGF 20 ng/ml, bFGF 10 ng/ml, Heparina 8 µg/ml, Penicilina-Estreptomicina (P/S)). Las figuras 2A-2C son una serie de imágenes que ilustran las NSCs crecidas como neuroesferas. Las figuras 2B y 2C ilustran a las NSCs crecidas en la presencia del factor exógeno inhibidor de la leucemia (LIF). La figura 2A ilustra las neuroesferas crecidas en la ausencia de LIF exógeno. Las figuras 3A-3D son una serie de imágenes que ¡lustran los co- cultivos de las BMSCs y las NSCs en la presencia de LIF exógeno (figuras 3C y 3D) y en la ausencia de LIF exógeno (figuras 3A y 3B). Las figuras 4A-4H son una serie de imágenes que ilustran la expresión de nestina y de proteína acida fibrilar glial (GFAP) por NSCs en co- cultivo con BMSCs, pre-diferenciación (figuras 4A-4F). Las figuras 4G y 4H ¡lustran la ausencia de expresión de nestina y GFAP por las BMSCs cultivadas solas. Las figuras 5A-5D son una serie de imágenes que demuestran que las NSCs crecidas sobre las BMSCs retienen su potencial para diferenciarse hacia neuronas y astrocitos. Las figuras 5A hasta la figura 5D ilustran la tinción con MAP2-GFAP-DAPI de co-cultivos diferenciados. La MAP2 es una proteína citoesquelética neuronal. DAPI es clorhidrato de 4',6'-diamidino-2-fenilindol el cual tiñe para el núcleo. La figura 6 es una imagen que ilustra la tinción con nestina-GFAP de co-cultivos diferenciados que muestran expresión insignificante de nestina después de la diferenciación. La figura 7 es una imagen que ilustra la tinción de MAP2-GFAP de las NSCs diferenciadas.

Las figuras 8A-8B son una serie de imágenes que ilustran la tinción con MAP2-GFAP-DAPI de BMSCs diferenciadas que muestran expresión insignificante de marcadores neuronales y de astrocito. Las figuras 9A-9B son una serie de gráficas de análisis FACS que ilustran el fenotipo de las NSCs después de la eliminación de las BMSC.

La figura 9A demuestra que menos del 2% de las células fueron CD-105 positivas (marcador para BMSC). La figura 9B demuestra que más del 90% de las células fueron CD-133 positivas. Las figuras 10A-10B son una serie de gráficas de análisis FACS que ilustran la ausencia de expresión de nestina por las BMSCs (figura 10A) y la expresión de nestina por las NSCs aisladas a partir de co-cultivos con BMSC alimentadoras (figura 10B). La figura 11 es una imagen que demuestra que las NSCs crecidas sobre BMSCs retienen su multipotencialidad para diferenciarse hacia neuronas y astrocitos. La figura 12 es una gráfica que ilustra el crecimiento de las NSCs en Transwell™ en la presencia o ausencia de BMSCs. Las figuras 13A-13B son una serie de imágenes que ilustran las NSCs crecidas sobre placas no revestidas en la presencia de las BMSCs en un Transwell™ (figura 13A) y en la ausencia de las BMSCs (figura 13B). Las figuras 14A-14D son una serie de imágenes que ilustran las NSCs cultivadas con medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM) (figuras 14A y 14B) y las NSCs cultivadas en medio NSC en la presencia de LIF exógeno (figura 14C) y en la ausencia de LIF exógeno (figura 14D). La figura 15 es una gráfica que ¡lustra los efectos de BMSC-CM en comparación con el medio NSC estándar con o sin LIF exógeno sobre el crecimiento de las NSCs. BMSC-CM1 es un medio a partir de las BMSCs cultivadas en medio NSC en la presencia de EGF y FGF. BMSC-CM2 es un medio a partir de las BMSCs cultivadas en medio NSC en la ausencia de EGF y FGF. Las figuras 16A-16D son una serie de gráficas de análisis FACS que ilustran el perfil fenotípico de las NSCs aisladas a partir del co-cultivo con 2 donantes diferentes de las BMSCs (figuras 16A y 16B). La figura 16C y la figura 16D es una serie de gráficas que ilustran el perfil fenotípico de las NSCs cultivadas sin las BMSCs en medio NSC, o el medio NSC en la presencia de LIF exógeno, respectivamente. Las figuras 17A-17D son una serie de gráficas de análisis FACS que ilustran el fenotipo de las NSCs después de cultivar en medio NSC en la presencia y ausencia de LIF exógeno, y el fenotipo de las NSCs después de cultivar en BMSC-CM en la presencia y ausencia de factores de crecimiento. La figura 17A hasta la figura 17D ilustran el perfil de CD56, CD 133, las moléculas clase II del MHC y las moléculas clase I del MHC, respectivamente. Las figuras 18A-18D son una serie de gráficas de análisis FACS que ilustran el fenotipo de las NSCs después de cultivar en medio NSC en la presencia (figura 18B) y ausencia de LIF exógeno (figura 18A), y el fenotipo de NSC después de co-cultivar con las BMSCs en medio completo de NSC (figuras 18C y 18D). Las figuras 18A-18D ilustra la expresión de las moléculas del MHC clase I y clase II por las NSCs cultivadas bajo las diversas condiciones (negro = isotipo control; gris = clase I o clase II).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende composiciones y métodos para inducir y/o mejorar la proliferación de células madre neurales (NSCs) mientras que se preserva su multipotencialidad. También se comprenden en la presente invención composiciones y métodos para modular la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs. La presente invención se refiere al descubrimiento de que las células estromales de la médula ósea (BMSCs) pueden servir como una capa alimentadora para mantener la proliferación de las NSCs. Como tal, la presente invención comprende composiciones y métodos para inducir y/o mejorar la proliferación de las NSCs mientras que se preserva su multipotencialidad utilizando a las BMSCs como una capa alimentadora para cultivar a las NSCs. Además, la presente descripción demuestra que el co-cultivo de las NSCs sobre una capa de BMSC alimentadoras reduce la sobre-regulación y/o inducción de la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs en comparación con la expresión de las moléculas del MHC por una NSC de otra manera idéntica cultivada en la ausencia de una capa BMSC alimentadora en medio de célula madre neural (medio NSC) sumplementado con LIF exógeno para la expansión incrementada. Por lo tanto, la presente invención comprende composiciones y métodos para reducir y/o prevenir la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs utilizando a las BMSCs como una capa alimentadora para cultivar y expandir a las NSCs. Los datos descritos en la presente invención también demuestran que las BMSCs secretan entre otros, factores de crecimiento, factores tróficos, y/o citoquinas útiles para la proliferación de las NSCs mientras que preserva su multipotencialidad. Los factores secretados por las BMSCs se pueden recolectar por medio del cultivo de las BMSCs en un medio por un período de tiempo y cosechando el medio condicionado para uso en un momento posterior. Por lo tanto, la presente invención también comprende un medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM) útil para la proliferación de las NSCs a la vez que preserva su multipotencialidad. La presente invención también se refiere al descubrimiento de que los factores secretados a partir de las BMSCs que están presentes en el BMSC-CM reducen la sobre-regulación y/o inducción de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. Como tal, la presente invención comprende composiciones y métodos para expandir las NSCs utilizando BMSC-CM en la ausencia y/o reducción de la sobre-regulación de la molécula del MHC sobre las NSCs.

Por consiguiente, la presente invención comprende métodos y composiciones para la generación de NSCs útiles para uso terapéutico. Por lo tanto, la presente invención comprende composiciones y métodos para generar NSCs útiles para el tratamiento de pacientes afectados por una enfermedad, trastorno, o condición del sistema nervioso central. El método comprende los pasos de cultivar y expandir las NSCs y administrar las NSCs dentro del paciente.

Definiciones Como se utiliza en la presente invención, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con éste en esta sección. Los artículos "un" y "una" como se utilizan en la presente invención se refieren a uno o a más de uno (por ejemplo al menos uno) del objetivo gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. El término "aproximadamente" será entendido por personas expertas en la técnica y variará en cierto grado en el contexto en el cual se utiliza. Como se utiliza en la presente invención, el término "autólogo" se pretende que se refiera a cualquier material derivado a partir del mismo individuo al cual es re-introducido.

Como se utiliza en la presente invención, el término "alogenéico" se refiere a cualquier material derivado a partir de un animal diferente de la misma especie. Como se utiliza en la presente invención, el término "células estromales de la médula ósea", "células estromales", "células mesenquimatosas madre" o "MSCs" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a la pequeña fracción de células en la médula ósea la cual puede servir como precursores semejantes a célula madre de los osteocitos, condrocitos y adipocitos, y los cuales se aislan a partir de la médula ósea por su capacidad para adherirse a los platos plásticos. Las células estromales de la médula se pueden derivar a partir de cualquier animal. En algunas modalidades, las células estromales se derivan a partir de primates, preferiblemente humanos. "Diferenciada" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula que ha alcanzado un estado de maduración terminal de manera que la célula se ha desarrollado completamente y demuestra especialización biológica y/o adaptación a un ambiente específico y/o función. Típicamente, una célula diferenciada se caracteriza por la expresión de genes que codifican proteínas asociadas diferenciadas en una célula dada. Por ejemplo, la expresión de las proteínas mielina y la formación de la cubierta de mielina en la célula glial es un ejemplo típico de la célula glial terminalmente diferenciada. Cuando se dice que una célula está "diferenciada", como se utiliza ese término en la presente invención, la célula se encuentra en el proceso de diferenciarse. "Medio para diferenciación" se utiliza en la presente invención para referirse a un medio para crecimiento de célula que comprende un aditivo o la carencia de un aditivo de manera que una célula madre, célula madre embrionaria, célula semejante a ES, neuroesfera, NSC u otra célula progenitura, que no está completamente diferenciada cuando se incuba en el medio, se desarrolla hacia una célula con algunas o todas las características de una célula diferenciada. "Capacidad de expandirse" se utiliza en la presente invención para referirse a la capacidad de una célula para proliferar, por ejemplo, para expandirse en número o en el caso de una población celular para llevar a cabo la duplicación de la población. "Capa de alimentación" se pretende que signifique células que producen factores de crecimiento, citoquinas, otros productos derivados de célula y soporte físico a través del contacto necesario en co-cultivo para mejorar la proliferación y mantener a las células madre multipotenciales no diferenciadas. "Células alimentadoras" se utiliza en la presente invención para describir células de un primer tipo de tejido que son co-cultivadas con células de un segundo tipo de tejido, para proveer un ambiente en el cual las células del segundo tipo de tejido pueden crecer.

Como se utiliza en la presente invención, el término "medio de crecimiento" se pretende que se refiera a un medio de cultivo que promueve el crecimiento de las células. Un medio de crecimiento generalmente contendrá un suero animal. En algunos casos, el medio de crecimiento puede no contener un suero animal. Como se utiliza en la presente invención, el término "medio de NSC" se pretende que se refiera a un medio de cultivo para el cultivo y expansión de las NSCs. Típicamente, el medio de NSC comprende DMEM/F12, Suplemento N2, EGF, bFGF y Heparina. En algunos casos, el medio de NSC puede no contener factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y bFGF). "Medio condicionado de célula estromal de médula ósea" (BMSC-CM) se utiliza en la presente invención para referirse a un medio que ha sido condicionado mediante el cultivo de las BMSCs. Basándose en la presente descripción, el BMSC-CM se obtiene mediante el cultivo de las BMSCs en medio de NSC a través del cual el medio ha sido condicionado por las BMSCs en cultivo al tener a las BMSCs secretando factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas entre otros compuestos dentro del medio de NSC. El BMSC-CM se puede utilizar para cultivar las NSCs para mejorar la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs. Además, el BMSC-CM se puede utilizar para cultivar las NSCs de una manera en la cual se puede modular la expresión de la molécula del MHC.

El "factor inhibidor de leucemia" (LIF) se utiliza en la presente invención para referirse a una proteína de 22 kDa miembro de la familia de la citoquina interleucina-6 que tiene numerosas funciones biológicas. Se ha demostrado que LIF tiene la capacidad de inducir la diferenciación terminal en las células leucémicas, inducir la diferenciación hematopoiética en células normales y células leucémicas mieloides, y estimular la síntesis de proteína de fase aguda en los hepatocitos. También se ha mostrado en la presente invención que el LIF mejora la proliferación de las NSCs en un estado no diferenciado a la vez que se mantiene la multipotencialidad de las NSCs. "LIF exógeno" se refiere al LIF introducido a partir de o producido fuera de un organismo, célula, o sistema. Como se utiliza en la presente invención, el término "multipotencial" o "multipotencialidad" se pretende que se refiera a la capacidad de una célula madre del sistema nervioso central para diferenciarse hacia más de un tipo de célula. Por ejemplo, una célula madre multipotencial del sistema nervioso central es capaz de diferenciarse hacia pero no se limita a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. "Neuroesfera" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula madre neural/célula progenitora caracterizada además porque la expresión de la nestina se puede detectar, incluyendo, entre otros, mediante ¡nmunotinción para detectar la proteína nestina en la célula. Las neuroesferas son agregados de células madre neurales en proliferación y la formación de la neuroesfera es una característica básica de células madre neurales en cultivo in vitro. "Célula madre neural" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula neural no diferenciada, multipotente, auto-renovadoras. Una célula madre neural es una célula madre multipotente clonogénica la cual es capaz de dividirse y, bajo condiciones adecuadas, tiene capacidad auto- renovadora y puede diferenciarse terminalmente hacia neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Por lo tanto, la célula madre neural es "multipotente" debido a que la progenie de la célula madre tiene múltiples rutas de diferenciación. Una célula madre neural es capaz de auto mantenimiento, significando que con cada división celular, una célula hija también será, en promedio, una célula madre. "Célula neural" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula que exhibe una morfología, una función, y una característica fenotípica similar a aquella de las células guales y neuronas derivadas a partir del sistema nervioso central y/o el sistema nervioso periférico. "Célula semejante a neurona" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula que exhibe una morfología similar a aquella de una neurona y expresa de manera detectable un marcador específico de neurona, tales como, pero no limitados a, MAP2, neurofilamento de 200 kDa, neurofilamento-L, neurofilamento-M, sinaptofisina, ß-tubulina III (TUJ1), Tau, NeuN, una proteína de neurofilamento, y una proteína sináptica.

"Célula semejante a astrocito" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula que exhibe un fenotipo similar a aquel de un astrocito y la cual expresa el marcador específico de astrocito, tal como, pero no limitado a, GFAP. "Célula semejante a oligodentrocito" se utiliza en la presente invención para referirse a una célula que exhibe un fenotipo similar a aquel de un oligodendrocito y la cual expresa el marcador específico de oligodendrocito, tal como, pero no limitado a, O-4. "Progresión de o a través del ciclo celular" se utiliza en la presente invención para referirse al proceso por medio de la cual una célula se prepara para y/o entra a la mitosis y/o meiosis. La progresión a través del ciclo celular incluye la progresión a través de la fase G1 , la fase S, la fase G2, y la fase M. "Proliferación" se utiliza en la presente invención para referirse a la reproducción o multiplicación de formas similares, especialmente de células. Es decir, la proliferación comprende la producción de un mayor número de células, y se puede medir mediante, entre otras cosas, simplemente contando el número de células, midiendo la incorporación de 3H-timidina dentro de la célula, y los similares. Como se utiliza en la presente invención, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido a partir de o producido fuera de un organismo, célula, o sistema.

"Que codifica" se refiere a la propiedad inherente de las secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tales como un gen, un ADNc, o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas que resultan a partir de éstos. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm corresponde a aquel gen que produce la proteína en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, la secuencia nucleotídica la cual es idéntica a la secuencia de ARNm y usualmente se provee en los listados de secuencia, como la cadena no codificante, utilizada como el molde para transcripción de un gen o ADNc, se pueden referir como que codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique de otra manera, una "secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias nucleotídicas que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias nucleotídicas que codifican proteínas y ARN pueden incluir íntrones. Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un segmento de ácido nucleico o fragmento el cual ha sido separado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado que se presenta de manera natural, por ejemplo, un fragmento de ADN el cual ha sido removido a partir de las secuencias las cuales son normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el cual éste se presenta de manera natural. El término también se aplica a los ácidos nucleicos los cuales han sido sustancialmente purificados a partir de otros componentes los cuales acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas, las cuales naturalmente los acompañan en la célula. Por lo tanto el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante el cual se incorpora dentro de un vector, dentro de un plásmido que se replica de manera autónoma o virus, o dentro del ADN genómico de un procarionte o eucarionte, o el cual existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un ADN genómico o fragmento de ADNc producido por PCR o digestión por enzima de restricción) independiente de otras secuencias. Este también incluye un ADN recombinante el cual es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional. En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que se presentan más comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina, y "U" se refiere a uridina. Un "vector" es una composición de materia la cual comprende un ácido nucleico aislado y la cual se puede utilizar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Numerosos vectores se conocen en la técnica incluyendo, pero no limitados a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o amfifílicos, plásmidos, y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido o un virus que se replica de manera autónoma. También se debe considerar que el término incluye compuestos no-plásmidos y no-virales los cuales facilitan la transferencia del ácido nucleico dentro de las células, tales como, por ejemplo, compuestos polilisina, liposomas, y los similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores virales adeno-asociados, vectores retrovirales, y los similares. "Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias para el control de la expresión operativamente asociadas con una secuencia nucleotídica a ser expresada. Un vector de expresión comprende elementos adecuados que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión se pueden abastecer por la célula hospedera o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos aquellos conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.

MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye un método para mejorar la proliferación a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs. El método comprende aislar a las NSCs utilizando métodos conocidos en la técnica y co-cultivar a las NSCs con las BMSCs para mejorar la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs. Los cultivos de los dos tipos celulares pueden ser de una manera dependiente del contacto por lo cual las NSCs se encuentran en contacto físico con las BMSCs, o de una manera independiente del contacto por lo cual las NSCs no se encuentran en contacto físico con las BMSCs. La invención se refiere al descubrimiento de que la capacidad de expansión de las NSCs (la capacidad de las NSCs para replicarse a sí mismas múltiples veces) se puede incrementar mediante el co-cultivo de estas células con las BMSCs. Es decir, una modalidad de la presente invención se refiere al descubrimiento de que las BMSCs pueden servir como células de soporte en un sistema de co-cultivo para la expansión de las NSCs. Un experto en la técnica podría ser capaz de reconocer, basádose en la presente descripción, que las BMSCs pueden servir como una capa alimentadora para las NSCs y proveer factores incluyendo, pero no limitados a factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas para sostener el cultivo de las NSCs a la vez que se mantiene la multipotencialidad de las NSCs. La capa alimentadora de BMSC también puede servir como una monocapa sobre la cual las NSCs pueden crecer. Un experto en la técnica podría reconocer, basándose en la presente descripción, que las BMSCs y las NSCs también pueden ser co-cultivadas en la presencia de otros factores de crecimiento conocidos en la técnica para mejorar la proliferación de la NSCs.

En la presente invención, las BMSCs y las NSCs pueden ser co- cultivadas en la ausencia de LIF exógeno para mejorar la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs. La presente descripción demuestra que las NSCs proliferaron y se expandieron a niveles que fueron significativamente mayores que el nivel de expansión de las NSCs cultivadas solas sobre placas revestidas (por ejemplo placas revestidas de poliornitina/fibronectina) en la presencia de LIF exógeno. Por lo tanto, la presente invención provee un método para cultivar las NSCs sin el requerimiento del uso de placas revestidas y/o LIF exógeno. Una modalidad adicional de la presente invención comprende un método para eliminar o separar a las BMSCs a partir de las NSCs en un co-cultivo de BMSCs y NSCs. La invención se refiere al descubrimiento de que las BMSCs pueden ser eliminadas a partir de dicho co-cultivo mediante la incubación de un anticuerpo que se une a las BMSCs dentro del co-cultivo seguido por un paso de separación incluyendo pero no limitado a separación magnética. Un ejemplo de un anticuerpo que se une a las BMSCs es el anticuerpo anti-CD13. El proceso de separación magnética se logra mediante el uso de glóbulos magnéticos, incluyendo pero no limitados a Dynabeads® (Dynal Biotech, Brown Deer, Wl). Adicionalmente al uso de los Dynabeads®, se pueden utilizar los reactivos de separación MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) para eliminar a las BMSCs del co-cultivo. Como un resultado del paso de separación, se puede obtener una población de NSCs purificadas. FACS también se puede utilizar para eliminar a las BMSCs, o alternativamente, para seleccionar positivamente a las NSCs. En el método de cultivo/expansión de NSC de la invención, las NSCs retienen su multipotencialidad (su capacidad para diferenciarse en uno de varios tipos celulares, tales como neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y los similares). En una modalidad adicional de la presente invención, las NSCs se expanden utilizando los métodos de la presente invención reteniendo su capacidad para diferenciarse en un mayor grado (por ejemplo, en mayor proporción) en comparación con las NSCs expandidas o cultivadas utilizando los métodos de la técnica precedente. Los métodos de cultivo/expansión de la NSC descritos en la presente invención resuelven un problema esencial en el uso de las NSCs para el tratamiento de las enfermedades de humano. Es decir, antes de la descripción provista en la presente invención, las NSCs eran difíciles de aislar y expandir ¡n cultivo (por ejemplo, era difícil inducirlas para que proliferaran en números adecuados). La descripción provista en la presente invención demuestra que las NSCs se pueden crecer y aislar en grandes números para usos terapéuticos. La presente invención también se refiere al descubrimiento de que la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs se puede modular mediante el co-cultivo de las BMSCs con las NSCs. La descripción presentada en la presente invención demuestra que además de mejorar la proliferación de las NSCs a la vez que preservan sus capacidades multipotenciales, el co- cultivo de las BMSCs con las NSCs también reduce la sobre-regulación y/o inducción de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs en comparación con la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs cultivadas utilizando métodos estándares conocidos en la técnica. Es decir, la presente invención provee un método para cultivar las NSCs en una manera que provee beneficios adicionales en comparación con los métodos estándares utilizados para mejorar la proliferación de las NSCs en cultivo. El sistema de co-cultivo provee un método para cultivar las NSCs de manera que provee beneficios que son significativamente mejores que el cultivo de las NSCs solas sobre una placa revestida o sobre una placa revestida en la presencia de LIF exógeno. Como se discutió en otro lugar en la presente invención, el sistema de co-cultivo provee por primera vez un método para la producción de un gran número de NSCs de manera que no requiere el uso de placas revestidas o LIF exógeno. Además, el sistema de co-cultivo provee un método para la obtención de beneficios adicionales y/o beneficios en un nivel mayor en comparación con los métodos de la técnica previa para cultivar a las NSCs solas utilizando medio NSC estándar. Estos beneficios incluyen, pero no se limitan a mejoría en la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs y modulación de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. En incluso otra modalidad de la presente invención, las NSCs pueden ser co-cultured con BMSCs en la ausencia de LIF exógeno para reducir la sobre-regulación y/o inducción de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. Es decir, la presente invención provee un método para cultivar las NSCs sin el requerimiento del uso de LIF exógeno. La descripción en la presente invención demuestra que las BMSCs en el sistema de co- cultivo pueden servir como una capa alimentadora que provee factores incluyendo, pero no limitados a factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas, a las NSCs co-cultivadas. Se cree que los factores abastecidos por las BMSCs proveen efectos benéficos a las NSC co-cultivadas a un nivel por encima de los beneficios del cultivo de las NSCs solas sobre placas revestidas con medio NSC en la presencia de LIF exógeno con respecto a la expansión de las NSCs y la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs. El descubrimiento de que la expresión de la molécula del MHC se puede modular utilizando los métodos descritos en la presente invención provee un método para la generación de una población de NSCs es decir útil para usos terapéuticos, diagnósticos, experimentales y los similares. Por ejemplo, la expresión disminuida de las moléculas del MHC por las NSCs utilizando los métodos descritos en la presente invención en comparación con los métodos conocidos en la técnica provee un método para la disminución de la inmunogenicidad de las NSCs. Preferiblemente, la expresión disminuida de las moléculas del MHC por las NSCs provee un método para incrementar el éxito del transplante de las NSCs dentro de un recipiente. El co-cultivo de las NSCs con BMSCs provee un método para modular la expresión de la molécula del MHC por las NSCs de manera dependiente del contacto o independiente del contacto con respecto a los dos tipos celulares. En una modalidad de la presente invención, las NSCs pueden ser co-cultivadas con BMSCs de una manera dependiente del contacto. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, la interacción física entre las BMSCs y las NSCs activa efectos benéficos para la proliferación y expansión de las NSCs. La interacción física entre los dos tipos celulares también contribuye a la modulación de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. Preferiblemente, el co-cultivo de las NSCs con las BMSCs de una manera dependiente del contacto con respecto a los dos tipos celulares reduce la sobre-regulación y/o inducción de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs en comparación con la expresión de las moléculas de MHC por las NSCs de otra manera idéntica que son cultivadas en la ausencia de BMSCs sobre placas revestidas utilizando medio NSC estándar suplementado con LIF exógeno. En incluso otra modalidad de la presente invención, las NSCs pueden ser co-cultivadas con las BMSCs de una manera independiente del contacto para modular la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. La presente invención se refiere al descubrimiento de que las NSCs y las BMSCs pueden ser co-cultivadas en un Transwell™ Costar, por medio del cual un filtro de membrana permeable separa los dos tipos celulares y previene que las NSCs y las BMSCs lleven a cabo contacto físico entre sí. El filtro de membrana permeable permite que los factores secretados por las BMSCs pasen a través de la membrana y por lo tanto estén disponibles para contribuir al fenotipo de las NSCs, por ejemplo mejorando la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs y modulando la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. Como se demuestra por los experimentos utilizando Transwell™, la presente descripción indica que las BMSCs son capaces de sostener el crecimiento y expansión de las NSCs en un sistema de co-cultivo en la ausencia de contacto directo entre los dos tipos celulares al tener a las BMSCs suplementando el medio de cultivo con factores secretados por las BMSCs dentro del medio de cultivo. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, los factores secretados por las BMSCs contribuyen al fenotipo de las NSCs. Por lo tanto, la presente invención provee un método para co-cultivar las BMSCs con las NSCs sin el requerimiento de tener a las BMSCs siendo una capa alimentadora sobre la cual las NSCs se crecen directamente. La presente invención provee un método para co-cultivar a las BMSCs y a las NSCs de una manera independiente del contacto por lo que las NSCs reciben beneficios a partir de las BMSCs en el sistema de co-cultivo por medio de la recepción de factores secretados a partir de las BMSCs. Un experto en la técnica basándose en la presente descripción podría reconocer que cualquier método para mantener a las NSCs y las BMSCs sin contacto físico entre sí se puede utilizar para el sistema de co-cultivo. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier sistema/dispositivo diferente al Transwell™ para tener las células co-cultivadas de manera independiente del contacto. Dichos sistemas/dispositivos incluyen, pero no se limitan a filtros y membranas que tienen un tamaño de poro que podría prevenir el contacto directo entre los dos tipos celulares, pero podría permitir que los factores crucen el filtro/membrana. Un beneficio del uso de dicho sistema/dispositivo para el co-cultivo de las BMSCs y las NSCs permite un método para cultivar a las NSCs en un sistema que tienen una fuente continua de factores para la expansión de las NSCs. Como tal, la presente invención incluye una composición que comprende un dispositivo de cultivo de célula madre neural que comprende una NSC aislada, una BMSC aislada, a medio para crecimiento de NSC y factores secretados por dicha BMSC aislada; y un medio para mantener a las NSCs y las BMSCs sin contacto físico entre sí. Basándose en el descubrimiento de que las BMSCs pueden sostener el crecimiento de las NSCs en un sistema de co-cultivo de una manera independiente del contacto por medio de la provisión de factores secretados a partir de las BMSCs dentro del medio de cultivo, se evaluó si un medio condicionado por las BMSCs podría sostener el crecimiento de las NSCs en una manera que mejora la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs y modula la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. La presente descripción demuestra que un medio condicionado por las BMSCs fue capaz de sostener el crecimiento de las NSCs y tuvo un efecto benéfico significativo, aunque menos eficiente que el co-cultivo dependiente de contacto. Por lo tanto, la presente invención provee un método para el uso de un medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM) para cultivar las NSCs sin el uso de un sistema de co-cultivo. El uso de BMSC-CM para cultivar las NSCs también provee otro método para la generación de una población de NSCs que tiene propiedades equivalentes a una población de NSCs cultivada utilizando el sistema de co-cultivo. Además, la presente descripción demuestra que el BMSC-CM se puede sustituir por el uso de medio NSC suplementado con LIF exógeno para cultivar a las NSCs. La presente descripción demuestra que el número de células generadas después del cultivo de las NSCs en BMSC-CM fue comparable con el número de células generadas utilizando el medio NSC suplementado con LIF exógeno. Por lo tanto, la presente invención provee un método para el uso del BMSC-CM como una fuente de factores benéficos para inducir la proliferación de las NSCs a velocidades ¡guales a o superiores a aquellas para el uso del medio NSC suplementado con LIF exógeno. También se demostró que las BMSC-CM se pueden sustituir por el uso de placas revestidas, por ejemplo placas revestidas con poliornitina/fibronectina, para el cultivo y expansión de las NSCs utilizando medio NSC. La descripción en la presente invención demuestra que las NSCs fueran capaces de expandirse utilizando BMSC-CM sobre placas no revestidas. Se observó que la expansión de las NSCs utilizando BMSC-CM sobre placas no revestidas fue al menos equivalente a o mayor que la expansión de las NSCs cultivadas solas sobre placas revestidas en medio NSC incluso en la presencia de LIF exógeno. Por lo tanto, la presente invención incluye un método para cultivar a las NSCs utilizando BMSC-CM sin el requerimiento de placas revestidas y LIF exógeno.

El uso de BMSC-CM también provee un método para cultivar las NSCs en una manera que permite beneficios a las NSCs sin el uso de BMSCs en un sistema de co-cultivo. La presente descripción demuestra que el BMSC- CM puede sostener el cultivo de las NSCs y provee beneficios a las NSCs equivalentes a aquellos observados cuando se utiliza el sistema de co-cultivo que comprende a las BMSCs y a las NSCs. Como tal, la presente invención incluye un método para cultivar a las NSCs utilizando el BMSC-CM para mejorar la proliferación de las NSCs a la vez que se mantienen las capacidades multipotenciales de las NSCs y modulando la expresión de la molécula del MHC por las NSCs. Como se demuestra en la presente invención, las BMSCs se pueden utilizar para generar medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM). El BMSC-CM es un medio que ha sido condicionado por las BMSCs en cultivo por medio del cultivo de las BMSCs en medio NSC y teniendo a las BMSCs secretando entre otros, factores de crecimiento, factores tróficos, y/o citoquinas dentro del medio NSC. BMSC-CM comprende factores de crecimiento, factores tróficos, y/o citoquinas secretadas a partir de las BMSCs, e incluye pero no se limita a, LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL- 1 ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de las metaloproteínasas (TIMP-1), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1 ), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1 ) y TGFß-3. El BMSC-CM es útil para la proliferación y expansión de las NSCs a la vez que mantiene la capacidad multipotencial de las NSCs. El uso de BMSC-CM provee un método para la introducción de entre otros, factores de crecimiento, factores tróficos, y/o citoquinas secretadas por las BMSCs a las NSCs para la proliferación y expansión de las NSCs. El uso de BMSC-CM provee un método para inducir la proliferación de las NSCs a velocidades iguales a o superiores a aquellas que cuando se utiliza medio NSC suplementado con LIF exógeno incluso sobre superficies no revestidas. Por lo tanto, la presente invención provee composiciones y métodos para generar grandes cantidades de NSCs para uso terapéuticos utilizando BMSC-CM. Además del uso de BMSC-CM para mantener la proliferación de las NSCs a la vez que se mantiene su multipotencialidad, la presente descripción también demuestra que el cultivo de las NSCs en BMSC-CM provee un método para modular la expresión de las moléculas de MHC por las NSCs. Preferiblemente, el cultivo de las NSCs en BMSC-CM reduce la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs en comparación con la expresión de las moléculas de MHC por una NSC de otra manera idéntica que fue cultivada en medio NSC en la presencia de LIF exógeno. Es decir, el cultivo de las NSCs en BMSC-CM reduce y/o previene la sobre-regulación de la expresión de la molécula del MHC. El uso de BMSC-CM para modular la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs se basa en el descubrimiento de que las NSCs que crecen en la presencia de BMSC-CM no expresan las moléculas clase II del MHC bajo las condiciones utilizadas para detectar a las moléculas clase II del MHC y exhibieron niveles más bajos de la molécula clase I del MHC en comparación con una NSC de otra manera idéntica que fue cultivada en medio NSC en la presencia de LIF exógeno. Esta observación fue consistente con la observación de que la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs se redujo después del co-cultivo de las BMSCs con las NSCs ya sea de manera dependiente de contacto o independiente de contacto. En cualquier caso, ya sea de manera dependiente de contacto o independiente de contacto, la reducción de la expresión de la molécula del MHC por las NSCs utilizando ya sea a las BMSCs como una capa alimentadora o el cultivo de las NSCs en BMSC-CM provee un método para reducir la expresión de las moléculas del MHC por la NSC. El descubrimiento de que la expresión de la molécula del MHC se puede modular utilizando los métodos descritos en la presente invención provee un método para la generación de una población de NSCs que es útil para usos terapéuticos. La expresión disminuida de las moléculas de MHC por las NSCs utilizando los métodos descritos en la presente invención también provee un método para incrementar el éxito para el transplante de las NSCs dentro de un recipiente. Basándose en la presente descripción, la presente invención comprende el uso de BMSC-CM para cultivar y expandir a las NSCs a la vez que se reduce la expresión de las moléculas de MHC por la NSC. Es decir, la presente invención se basa en el descubrimiento de que el uso del BMSC-CM para la expansión de las NSCs reduce y/o previene la sobre-regulación de la expresión de la molécula del MHC sobre las NSCs en comparación con una NSC de otra manera idéntica cultivada en medio NSC en la presencia de L1F exógeno. Como tal, la presente invención comprende un método para la generación de células útiles para uso terapéutico. Se ha establecido ampliamente que el transplante de células entre individuos genéticamente dispares (alogenéicos) invariablemente está asociado con el riesgo de rechazo del injerto. Casi todas las células expresan productos del complejo mayor de histocompatibilidad, las moléculas clase I del MHC. Además, muchos tipos celulares pueden ser inducidos para expresar las moléculas clase II del MHC cuando se exponen a citoquinas inflamatorias. El rechazo de aloinjertos es mediado principalmente por las células T de ambas subclases CD4 y CD8 que reconocen a las moléculas clase I y clase II del MHC. Un objetivo principal en el transplante es el injerto permanente del injerto del donante sin inducir una respuesta inmune para rechazo del injerto generada por el recipiente. Como tal, la presente invención comprende métodos para la reducción y/o eliminación de una respuesta inmune por las células del recipiente en contra de las NSCs injertadas en el recipiente mediante el cultivo de las NSCs antes del transplante utilizando los métodos descritos en la presente invención, con el objeto de reducir la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, una reducción en la expresión de las moléculas del MHC por las NSCs utilizando los métodos descritos en la presente invención sirve para reducir la cantidad de las moléculas de MHC presentes en la membrana celular de las NSCs reduciendo así la inmunogenicidad de las NSCs en el recipiente. La presente invención también es útil para obtener las NSCs que expresan un gen exógeno, de manera que las NSCs se pueden utilizar, por ejemplo, para terapia celular o terapia génica. Es decir, la presente invención permite la producción de grandes cantidades de NSCs las cuales expresan un gen exógeno. El gen exógeno puede ser, por ejemplo, una versión exógena de un gen endógeno (por ejemplo, una versión de tipo silvestre del mismo gen se puede utilizar para reemplazar un alelo defectuoso que comprende una mutación). El gen exógeno podría incluir factores tróficos para la regeneración del SNC o un gen citotóxico para dirigirlo al cáncer. El gen exógeno usualmente está, pero no necesariamente, covalentemente enlazado con (por ejemplo, "fusionado con") uno o más genes adicionales. Los genes "adicionales" ejemplares incluyen un gen utilizado para la selección "positiva" para seleccionar células que tienen incorporado el gen exógeno, y un gen utilizado para selección "negativa" para seleccionar células que tienen incorporado el gen exógeno dentro del mismo locus cromosomal como el gen endógeno o ambos. Las NSCs obtenidas mediante los métodos de la presente invención se pueden inducir para diferenciarse hacia neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y los similares mediante la selección de las condiciones de cultivo conocidas en la técnica para llevar a la diferenciación de las NSCs hacia las células de un tipo seleccionado. Las NSCs cultivadas o expandidas como se describe en esta descripción, se pueden utilizar, antes o después de la diferenciación hacia tipos celulares seleccionados, para tratar una variedad de trastornos conocidos en la técnica que se pueden tratar utilizando las NSCs. Las NSCs que son útiles en estos métodos de tratamiento pueden incluir a aquellas que tienen, y a aquellas que no tienen un gen exógeno insertado en éstas. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen pero no se limitan a trauma cerebral, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, cáncer, enfermedades por almacenamiento lísosomal en el SNC y trauma del cráneo.

Aislamiento de las NSCs y las BMSCs Las NSCs se pueden obtener a partir del sistema nervioso central de un mamífero, preferiblemente un humano. Estas células se pueden obtener a partir de una variedad de tejidos incluyendo pero no limitados a, cerebro frontal, cerebro posterior, cerebro total y médula espinal. Las NSCs se pueden aislar y cultivar utilizando los métodos detallados en otro lugar en la presente invención o utilizando los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la Patente E.U.A. 5,958,767 incorporados en la presente invención en su totalidad como referencias. Otros métodos para el aislamiento de las NSCs se conocen bien en la técnica, y se pueden emplear fácilmente por el experto en la técnica, incluyendo métodos a ser desarrollados en el futuro. La presente invención no se limita de ninguna forma a éstos o a cualesquiera otros métodos, para la obtención de una célula de interés. Las NSCs se pueden aislar a partir de muchos tipos diferentes de tejidos, por ejemplo, a partir de tejido del donante mediante la disociación de las células individuales a partir de la matriz extracelular para conexión del tejido o a partir de fuentes comerciales de las NSCs. En un ejemplo, el tejido a partir del cerebro se remueve utilizando procedimientos estériles, y las células se disocian utilizando cualquier método conocido en la técnica incluyendo el tratamiento con enzimas tales como tripsina, colagenasa y las similares, o mediante el uso de métodos físicos para disociación tales como fragmentación o tratamiento con un instrumento romo. La disociación de las células neurales, y otras células madre multipotentes, se puede llevar a cabo en un medio estéril para cultivo de tejido. Las células disociadas se centrifugan a baja velocidad, entre 200 y 2000 rpm, usualmente entre 400 y 800 rpm, el medio para suspensión se aspira, y las células se resuspenden entonces en medio para cultivo. Las fuentes de las BMSCs y los métodos para la obtención de las BMSCs a partir de esas fuentes han sido descritos en la técnica. Las BMSCs se pueden obtener a partir de sustancialmente cualquier médula ósea incluyendo, por ejemplo, médula ósea obtenida mediante la aspiración de la cresta ilíaca de donantes humanos. Los métodos para ia obtención de médula ósea a partir de donantes se conocen bien en la técnica y se describen por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,653,134 y en la Publicación Internacional No. WO 96/30031 incorporada en la presente invención en su totalidad. Las células madre mesenquimatosas de humano se pueden obtener a partir de Cambrex, Inc., Walkersville, MD.

Uso de las células madre neurales aisladas Las células madre neurales aisladas son útiles en una variedad de formas. Estas células pueden ser utilizadas para reconstituir a las células en un mamífero cuyas células han sido perdidas debido a la enfermedad o debido a una lesión. Las enfermedades genéticas pueden ser tratadas mediante la modificación genética de células madre neurales autólogas o alogenéicas para corregir un defecto genético o para proteger en contra de la enfermedad. Las enfermedades relacionadas con la ausencia de un producto particular secretado tales como una hormona, una enzima, un factor de crecimiento, o los similares también se pueden tratar utilizando las NSCs. Los trastornos del SNC comprenden numerosos males tales como enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson), lesión aguda del cerebro (por ejemplo accidente cerebrovascular, lesión del cráneo, ataque cerebral, resección oncológica, cuidado de apoyo para terapia quimioterapéutica y radiación) y una gran cantidad de disfunciones del SNC (por ejemplo depresión, epilepsia, y esquizofrenia). Las enfermedades incluyendo pero no limitadas a enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple (MS), corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), y enfermedad de Parkinson, han sido asociadas todas a la degeneración de células neurales de ubicaciones particulares del SNC, llevando a la incapacidad de estas células o de una región del cerebro para llevar a cabo su función pretendida. Las NSCs aisladas y cultivadas como se describe en la presente invención se pueden utilizar como una fuente de células progenitoras y de células comprometidas para el tratamiento de estas enfermedades. Las NSCs pueden ser utilizadas como una fuente de factores tróficos para estimular a las células madre endógenas y la regeneración del SNC. Las NSCs cultivadas como se describe en la presente invención pueden ser congeladas a temperaturas de nitrógeno líquido y se almacenan por períodos de tiempo largos, siendo descongeladas y capaces de ser reutilizadas. Las células usualmente se almacenan en DMSO al 10% y medio NSC al 90%. Una vez descongeladas, las células se pueden expandir utilizando los métodos descritos en otro lugar en la presente invención.

Modificación genética Las células de la presente invención pueden estar genéticamente modificadas al tener material genético exógeno introducido dentro de las células, para producir moléculas tales como factores tróficos, factores de crecimiento, citoquinas, neurotrofinas, y los similares, los cuales son benéficos para el cultivo de las NSCs. Por ejemplo, las BMSCs pueden ser genéticamente modificadas para expresar y secretar EGF a un nivel mayor en comparación con las BMSCs que no han sido genéticamente modificadas para expresar dicho factor. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, una BMSC que ha sido genéticamente modificada para expresar y secretar EGF lo podría hacer a un nivel incrementado en comparación con una BMSC de otra manera idéntica que no han sido genéticamente modificada para expresar dicho factor. Un beneficio del uso de BMSCs genéticamente modificadas en el sistema de co-cultivo es tener a las BMSCs diseñadas continuamente proveyendo factores exógenos al sistema de co-cultívo. El factor exógeno sirve para proveer beneficios a la BMSC o NSC cultivadas o a ambas. Ef material genético exógeno introducido dentro de la BMSC también puede contribuir a la secreción de otros factores endógenos a partir de las BMSC diseñadas. Además, la BMSC genéticamente modificada puede contribuir a la secreción de factores endógenos a partir de las células vecinas. Por lo tanto, la presente invención comprende el uso de BMSCs genéticamente modificadas para proveer un abastecimiento continuo de factores exógenos al sistema de co-cultivo, y en algunos casos, el material genético exógeno introducido dentro de la BMSC contribuye a la secreción de factores endógenos a partir de la BMSC genéticamente modificada y/o células vecinas. En cualquier caso, los factores exógenos y/o los factores endógenos secretados a partir de las BMSCs proveen factores benéficos para el cultivo y expansión de las NSCs. Además, las BMSCs genéticamente modificadas para expresar y ' secretar un factor, por ejemplo EGF, también se pueden utilizar para generar BMSC-CM que tiene niveles incrementados de EGF. Además de proveer un nivel incrementado del factor exógeno al BMSC-CM, la BMSC genéticamente modificada también puede contribuir a la secreción de factores endógenos a partir de la BMSC diseñada y/o células vecinas. Los factores influyen, pero no se limitan a, LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1 ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de las metaloproteínaasas (TIMP-1 ), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1 ), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1 ) y TGFß-3. Un beneficio para el uso de una BMSC genéticamente modificada para la generación de BMSC-CM es el incremento de los niveles de un factor exógeno, por ejemplo EGF al tener EGF secretado a partir de las BMSCs diseñadas dentro del medio de cultivo en comparación con un BMSC-CM generado a partir de otra BMSC de otra manera idéntica no genéticamente modificada. Con el nivel incrementado de EGF secretado a partir de la célula genéticamente modificada, más EGF está presente en el BMSC-CM. Además, el nivel incrementado de EGF secretado a partir de la BMSC diseñada puede contribuir a la secreción de otros factores endógenos a partir de la BMSC diseñada y/o células vecinas. El BMSC-CM que tiene un nivel incrementado de EGF y/u otros factores puede ser útil para cultivar y expandir las NSCs. Un beneficio para el uso de una BMSC genéticamente modificada para la generación de BMSC-CM es el incremento en los niveles de un factor exógeno, por ejemplo, EGF al tener EGF secretado a partir de las BMSCs diseñadas dentro del medio de cultivo en comparación con un BMSC- CM generado a partir de una BMSC de otra manera idéntica no genéticamente modificada. Con el nivel incrementado de EGF secretado a partir de la célula genéticamente modificada, más EGF está presente en el BMSC-CM. Además, el nivel incrementado de EGF secretado a partir de la BMSC diseñada puede contribuir a la secreción de otros factores endógenos a partir de la BMSC diseñada y/o células vecinas. El BMSC-CM que tiene un nivel incrementado dé EGF y/u otros factores puede ser útil para cultivar y expandir las NSCs. En otro aspecto, las BMSCs pueden estar genéticamente modificadas para expresar un gen tales como HSV-timidina cinasa o proteína fluorescente verde (GFP) los cuales podrían ser utilizados para su remoción después de la expansión de las NSCs en co-cultivos de BMSC mediante tratamiento con Gancyclovir o separación en un citómetro de flujo respectivamente. Además para modificar genéticamente a las BMSCs, la presente invención comprende NSCs genéticamente modificadas. Las NSCs genéticamente modificadas se pueden utilizar para reemplazar células que están defectuosas en un individuo. La invención también se puede utilizar para expresar proteínas deseadas que son secretadas. Es decir, las NSCs pueden ser aisladas, introducidas con un gen para una proteína deseada e introducidas dentro de un individuo dentro del cual se podría producir e inducir la proteína deseada o de otra manera producir un efecto terapéutico. Este aspecto de la invención se refiere a la terapia génica en la cual las proteínas terapéuticas se administran a un individuo mediante la introducción de una NSC genéticamente modificada dentro de un individuo. Las NSCs genéticamente modificadas se cultivan utilizando los métodos descritos en la presente invención, aislamiento e implante dentro de un individuo el cual se beneficiará cuando la proteína sea expresada y secretada por la NSC en el cuerpo. De conformidad con la presente invención, las construcciones génicas las cuales comprenden secuencias nucleotídicas que codifican proteínas heterólogas se introducen dentro de las NSCs. Es decir, las células son genéticamente alteradas para introducir un gen cuya expresión tiene un efecto terapéutico en el individuo. De conformidad con algunos aspectos de la invención, las NSCs a partir de un individuo o a partir de otro individuo o a partir de un animal no humano se pueden alterar genéticamente para reemplazar un gen defectuoso y/o para introducir un gen cuya expresión tiene un efecto terapéutico en el individuo. En todos los casos en los cuales una construcción géníca se transfiere dentro de una célula, el gen heterólogo está operativamente asociado a las secuencias reguladoras requeridas para lograr la expresión del gen en la célula. Dichas secuencias reguladoras incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Preferiblemente la construcción génica se provee como un vector de expresión que incluye la secuencia codificante para una proteína heteróloga operativamente asociada a las secuencia reguladoras esenciales de tal manera que cuando el vector se transfecta dentro de la célula, la secuencia codificante será expresada por la célula. La secuencia codificante está operativamente asociada a los elementos reguladores necesarios para la expresión de la secuencia en las células. La secuencia nucleotídica que codifica la proteína puede ser un ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido del mismo o una molécula de ARN tal como un ARNm. La construcción génica incluye la secuencia nucleotídica que codifica la proteína benéfica operativamente asociada a los elementos reguladores y puede permanecer presente en la célula como una molécula citoplásmica en funcionamiento, una molécula episomal en funcionamiento o se puede integrar dentro del ADN cromosomal de la célula. El material genético exógeno se puede introducir dentro de las células en donde permanece como un material genético separado en la forma de un plásmido. Alternativamente, el ADN lineal el cual se puede integrar dentro del cromosoma se puede introducir dentro de la célula. Cuando el ADN se introduce dentro de la célula, se pueden añadir los reactivos que promueven la integración del ADN dentro de los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también se pueden incluir en la molécula de ADN. Alternativamente, el ARN se puede introducir dentro de la célula. Los elementos reguladores para la expresión del gen incluyen: un promotor, un codón de inicio, un codón de paro, y una señal de poliadenilación. Se prefiere que estos elementos sean operables en las células de la presente invención. Además, se prefiere que estos elementos estén operativamente asociados a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de tal manera que la secuencia nucleotídica se puede expresar en las células y por lo tanto se pueda producir la proteína. Los codones de inicio y el codón de paro generalmente se consideran parte de una secuencia nucleotídica que codifica la proteína. No obstante, Se prefiere que estos elementos sean funcionales en las células. De manera similar, los promotores y señales de poliadenilación utilizados deben ser funcionales dentro de las células de la presente invención. Los ejemplos de promotores útiles para la práctica de la presente invención incluyen pero no se limitan a promotores que son activos en muchas células tales como el promotor del citomegalovirus, los promotores SV40 y los promotores retrovirales. Otros ejemplos de promotores útiles para la práctica de la presente invención incluyen pero no se limitan a promotores específicos de tejido, por ejemplo promotores que funcionan en algunos tejidos pero no en otros; también, los promotores de genes que normalmente se expresan en las células con o sin secuencias potenciadoras específicas o generales. En algunas modalidades, se utilizan promotores los cuales expresan constitutivamente genes en las células con o sin secuencias potenciadoras. Las secuencias potenciadoras se provee en dichas modalidades cuando es apropiado o deseable. Las células de la presente invención se pueden transfectar utilizando técnicas bien conocidas fácilmente disponibles a aquellos expertos en la técnica. Los genes exógenos que se puede introducir dentro de las células mediante métodos estándares se emplean para la introducción de construcciones génicas dentro de la célula las cuales expresarán las proteínas codificadas por los genes. En algunas modalidades, las células se transfectan mediante la transfección por precipitación con fosfato de calcio, transfección por DEAE dextrán, electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposoma, transferencia mediada por reactivo químico, transferencia mediada por ligando o transferencia mediada por vector viral recombinante. En algunas modalidades, los vectores recombinantes de adenovirus se utilizan para introducir el ADN con secuencias deseadas dentro de la célula. En algunas modalidades, los vectores retrovirales recombinantes se utilizan para introducir el ADN con secuencias deseadas dentro de las células. En algunas modalidades, se emplean técnica estándares de transfección con CaPO , DEAE dextrán o vehículo lipídico para incorporar el ADN deseado dentro de las células en división. Las técnicas estándares para selección de resistencia al antibiótico se pueden utilizar para identificar y seleccionar células transfectadas. En algunas modalidades, el ADN se introduce directamente dentro de las células mediante microinyección. De manera similar, las técnicas bien conocidas de electroporación o bombardeo de partícula se pueden utilizar para introducir el ADN externo dentro de las células. Un segundo gen usualmente se co-transfecta o se asocia con el gen terapéutico. El segundo gen frecuentemente es un gen para resistencia a un antibiótico para selección. Las células transfectadas se pueden seleccionar mediante el crecimiento de las células en un antibiótico que eliminará a las células que no han tomado el gen de selección. En la mayoría de los casos en donde los dos genes no están alineados y no fueron co-transfectados, las células que sobreviven al tratamiento con antibiótico tienen ambos genes en éstas y los expresan a ambos. Los siguientes ejemplos se presentan con el objeto de ¡lustrar más completamente las modalidades preferidas de la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención, como se define por las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 BMSCs como células alimentadoras para el crecimiento y expansión de las NSCs El cultivo de las NSCs es un prueba debido a que requieren factores de crecimiento y un sustrato específico para mejorar su velocidad de crecimiento y expansión. En términos de factores de crecimiento, la adición de LIF exógeno al medio de crecimiento definido libre de suero que contiene FGF y/o EGF mejora significativamente la expansión de las NSCs. Como se discutió en otro lugar en la presente invención, la combinación de LIF exógeno y el revestimiento de los platos de cultivo incrementan adicionalmente el nivel de expansión de las NSCs a la vez que se mantiene su multipotencialidad. Las células estromales de la médula ósea (BMSCs) se pueden obtener fácilmente y expandir en cultivo hasta una población substancialmente homogénea de células. Además, las BMSCs secretan varios factores tróficos que pueden promover el crecimiento de la NSC. Por lo tanto, el presente ejemplo demuestra que las BMSCs pueden servir como células de soporte en un sistema de co-cultivo para la expansión de las NSCs. A continuación se describen los materiales y métodos utilizados en los experimentos presentados en este ejemplo.

Establecimiento, mantenimiento y caracterización de células madre neurales de feto de humano (NSCs) El cerebro de humano (a partir de fetos de 11-14 semanas de edad) se recibió a partir de Advanced Bioscience Resources Inc. (Alameda, CA). El tejido cerebral se trituró en PBS frío. Las células se concentraron mediante centrifugación y se resuspendieron en 10 ml de medio para crecimiento de NSC (DMEM/F12, glucosa 8 mM, glutamina, bicarbonato de sodio 20 mM, HEPES 15 mM, Heparina 8 µg/ml, suplemento N2, 10 ng/ml de bFGF, 20 ng/ml de EGF). Las células se sembraron en una botella T-25 cm2 revestida con poliornitina y fibronectina y se crecieron en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C. Los cultivos se alimentaron mediante el reemplazo del 0% del medio con medio recientemente preparado cada tercer día y se sometieron a pasajes mediante tripsinización cada 14 días. Las células fueron criopreservadas en medio NSC con 10% de DMSO en una fase de vapor de N2 líquido. Las células se descongelaron y sembraron en medio de crecimiento completo suplementado con 10 ng/ml de LIF después de crecerlas inicialmente por aproximadamente 1-2 pasajes en la presencia de bFGF y EGF. Otro medio de crecimiento para NSC se puede utilizar para los métodos descritos en la presente invención. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en medio neurobasal suplementado con L-glutamina, bFGF, EGF, y B27 sin ácido retinóico (Invitrogen, Carlsbad, CA). Otro medio para crecimiento de NSC es NeuroCult suplementado con factores de crecimiento (StemCell Technologies, Vancouver BC, Canadá). Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, se puede utilizar cualquier medio para cultivar las NSCs. No obstante, un medio adecuado permite que las las células crezcan y se expandan a la vez que se mantiene su potential para diferenciarse hacia múltiples tipos celulares. Para la caracterización, la NSCs se sembraron sobre portaobjetos revestidos en una cámara en diferentes pasajes, fijados con 4% de paraformaldehído y se tiñeron para nestina y para proteína acida fibrilar glial (GFAP). Las NSCs se diferenciaron por aproximadamente 14 días mediante la remoción de bFGF, EGF y LIF, y tratamiento de las NSCs con medio Neurobasal, suplemento B27 y BDNF. Se pueden utilizar otras condiciones para diferenciación para dirigir a las células hacia linajes más específicos. Las células se fijaron y se tiñeron para proteína asociada a micro túbulo (MAP2; un marcador para las neuronas) y GFAP (un marcador para los astrocitos). Para identificar los subtipos neuronales, las células se tiñeron con anti-ácido ?-amino butírico (GABA), anti-tirosina hidroxilasa (TH). Los anticuerpos primarios utilizados fueron nestina específica de humano, 1 :10 (R & D Systems); MAP2, 1 :500 (Sigma); GFAP, 1 :1000 (DAKO); O4, 1 :100; NG-2 (1 :200) (Chemicon). Los anticuerpos secundarios utilizados en estos experimentos fueron Alexa Fluor 488 pollo anti-ratón, 1 :500 (Molecular Probes) y Alexa Fluor 594 pollo anti-conejo 1 : 500 (Molecular Probes). Las NSCs se analizaron mediante cítometría de flujo para la expresión de diversos marcadores incluyendo marcadores de la célula hematopoiética CD45 y CD14, marcadores de la célula madre CD34 y CD133, CD56 y marcadores inmunogénicos/estimulantes CD80, CD86, MHC clase I y MHC clase II. El análisis cuantitativo de las células que expresan nestina también se determinó mediante citometría de flujo. Este análisis se llevó a cabo con anti-nestina (R & D) y anti Ig de cabra para ratón conjugado a Alexa-fluor 488. Las NSCs se fijaron y se permeabilizaron utilizando el equipo Cytofix/Cytoperm y las instrucciones a partir de Becton-Dickinson con modificaciones menores.

Establecimiento, mantenimiento y caracterización de células estromales de la médula ósea de humano (BMSCs) Las BMSCs se produjeron mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la médula ósea de humano se recolectó mediante aspirado con una aguja. Se llevó a cabo un conteo de células nucleadas en la médula ósea. La médula ósea se diluyó con PBS y se mezcló con Hespan. La mezcla en suspensión de Hespan/células se dejó reposar sin perturbaciones por aproximadamente 45 minutos a una hora. Durante este período, los eritrocitos (RBCs) se asentaron lo cual permitió la recolección de las células nucleadas presentes en la capa de sobrenadante. Las células nucleadas se lavaron y se contaron después de eliminar a las RBCs. Las células nucleadas se cultivaron en recipientes tratados para cultivo de tejidos, por ejemplo poliestireno, en DMEM-baja glucosa, con 10% de FBS. Se observó que un cultivo primario duraba de aproximadamente 12 a 17 días con cambios de medio cada 3 ó 4 días. Cuando se encontraba un número adecuado de células adherentes, con forma de huso, el cultivo se sometía a un pasaje utilizando tripsina para remover las células adherentes. Las células fueron re-sembradas y se mantuvieron en cultivo por aproximadamente una semana, con un cambio de medio por cada pasaje subsecuente. Las células se evaluaron para pureza utilizando marcadores específicos mediante citometría de flujo. Las BMSCs de los pasajes 1 ó 2 (P1 o P2) que eran CD45 negativas y que fueron más de 90% positivas a CD90 y CD 13 se utilizaron en los experimentos de co-cultivo.

Cultivo de las BMSCs en medio de crecimiento para NSC Las BMSCs se sembraron a diferentes densidades en placas de 6 pozos y se dejaron adherir durante toda la noche en medio BMSC (DMEM- baja glucosa, 10% de FBS porción evaluada). Al siguiente día, el medio a partir de una placa se reemplazó con medio NSC (DMEM-F12, suplemento N2, EGF, 20 ng/ml, bFGF, 10 ng/ml, 8 µg/ml de Heparina, P/S). La otra placa recibió medio BMSC recientemente preparado. Las células se alimentaron con medio BMSC recientemente preparado o con medio NSC cada tercer día. Una serie de cultivos se tripsinizó y las células se contaron después de 7 días. Otra serie de células se cosechó y se contó después de 12 días. Como se muestra en el cuadro 1 y en la figura 1 , las BMSCs proliferaron mucho más en medio BMSC en comparación con su proliferación en medio NSC. En medio NSC, las células exhibieron un incremento inicial en el número de células que fue comparativamente menor que aquel observado en el medio BMSC. No obstante, después de 7 días de cultivo en medio NSC, no se observó un incremento significativo en el número de células BMSC. En el medio de cultivo BMSC, las células continuaron proliferando durante el período de 12 días y fueron altamente confluentes al término de este tiempo. En el medio de cultivo NSC, las BMSCs no formaron ningún remolino de células confluentes pero aparecieron morfológicamente normales sin muerte celular visible. Esto estuvo en contraste con la morfología de las células observadas en medio BMSC.

CUADRO 1 Estos resultados demuestran que cuando las NSCs se crecieron juntas con BMSCs en medio NSC, las BMSCs no compitieron con y mostraron exocrecimiento de las NSCs.

Co-cultivos de las BMSCs y las NSCs; supervivencia y expansión de las NSCs en las BMSCs contra placas revestidas Las BMSCs de humano (hBM-03-016, P1 ) se descongelaron, lavaron, contaron y sembraron en dos placas de 12 pozos a 75,000 células por pozo. En paralelo, otras placas de 12 pozos se revistieron con 15 µg/ml de poliornitina seguido por 10 µg/ml de fibronectina de humano durante toda la noche. Al día siguiente, hNSCs que habían crecido en el cultivo se cosecharon y resuspendieron en medio NSC que contenía EGF y FGF. Las NSCs utilizadas fueron hHB-007, P7 las cuales se cultivaron en medio NSC que contenía EGF, FGF y LIF. La mayoría de estas células crecieron como neuroesferas. En el momento de la siembra de estas células sobre las BMSCs o sobre pozos revestidos, las neuroesferas se rompieron tanto como fue posible en células particulares. Las NSCs se sembraron por triplicado bajo las siguientes condiciones ya sea sobre las BMSCs o sobre las placas revestidas. 1. 25,000 NSCs + medio NSC, sin LIF 2. 25,000 NSCs + medio NSC + LIF 3. 50,000 NSCs + medio NSC, sin LIF 4. 50,000 NSCs + medio NSC + LIF Los cultivos se alimentaron cada tercer día mediante el reemplazo del 50% de medio gastado con medio recientemente preparado. Se tomaron imágenes en contraste de fases de las células a diferentes tiempos. Después de 12-13 días en cultivo,- las células se cosecharon utilizando tripsina. Brevemente, las células se incubaron con 0.05% de tripsina por 5 minutos o hasta que todas las células se habían desprendido del plato. Posteriormente la tripsina se neutralizó con inhibidor de tripsina de frijol de soya (SBTI). Las células se lavaron con solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) y luego se contaron utilizando colorante de azul tripán en un hemocitómetro. Se observaron dos tamaños diferentes de células bajo el microscopio, las BMSCs más grandes y las NSCs más pequeñas. Las dos poblaciones se contaron separadamente. La primera cuenta se calculó al día 12 mediante la agrupación de dos de los tres cultivos 3 por duplicado.

Las NSCs se sembraron sobre las BMSCs adheridas y se extendieron como monocapas en áreas concentradas. El cambio de medio en estas células no fue difícil. Por otra parte, las NSCs especialmente aquellas que crecieron a en la presencia de LIF exógeno como neuroesferas (figuras 2A-2C) no se encontraban muy adheridas, y por lo tanto se tuvo que tener cuidado extremo cuando se cambiaba el medio. La centrifugación del medio aspirado algunas veces se requirió con el objeto de prevenir la pérdida de las neuroesferas. También cuando las NSCs se sembraron a densidades bajas, éstas no sobrevivieron a menos que estuvieran co-cultivadas con las BMSCs. Morfológicamente las NSCs crecen en co-cultivo formando una red de células pequeñas redondas a ovales en la parte superior de las BMSCs planas más grandes. Las NSCs formando colonias aisladas de NSCs, algunas veces rodeadas por un anillo de BMSCs fibroblásticas (figuras 3A-3D). Con el tiempo en el cultivo, las colonias de NSC se volvieron más grandes con un número incrementado de las de NSCs dentro de cada colonia. Las NSCs que crecieron solas sobrevivieron y proliferaron solamente en la presencia de LIF exógeno y a densidad de siembra mayores; no obstante, en los co-cultivos, la expansión significativa de las NSCs se presentó incluso en la ausencia de LIF exógeno. Por lo tanto, las BMSCs parecen servir como una capa alimentadora y proveen soporte trófico a las NSCs. La expansión significativa de las NSCs se obtuvo en co-cultivos misma que fue comparable con el crecimiento de las NSCs sobre platos revestidos (por ejemplo poliornitina/fibronectina) con la adición de LIF exógeno. El cuadro 2 ilustra el número de las NSCs y las BMSCs cosechadas después de 12 días en cultivo.

CUADRO 2 Expansión de NSCs crecidas en co-cultivo con las BMSCs Caracterización de las NSCs cultivadas sobre las BMSCs: expresión de nestina Con el objeto de evaluar la expresión de la nestina de las NSCs en co-cultivo con las BMSCs mediante ¡nmunotinción, los cultivos se crecieron sobre cubreobjetos. Los cubreobjetos (10 mm) que se colocaron en platos de 24 pozos se revistieron con poliornitina seguido por fibronectina de humano como se describió en otro lugar en la presente invención. Una serie de cubreobjetos se sembró con BMSCs, (35,000/cubreobjeto) y las células se dejaron adherir durante toda la noche. Al siguiente día, las NSCs crecidas en cultivo (THD-015 + LIF, P12) se cosecharon y contaron. Se sembraron veinticinco mil NSCs/pozo ya sea en la parte superior de las BMSCs o directamente en la parte superior de los cubreobjetos revestidos. Algunos pozos con las BMSCs se cultivaron solos sin las NSCs. Todos los diferentes cultivos se crecieron ya sea en medio NSC o en medio NSC + LIF. Las células se alimentaron con 50% de medio recientemente preparado cada tercer día por 10 días. Después de 10 días, algunos cultivos se fijaron y se prepararon para tinción con nestina. Otros cultivos se dejaron diferenciar por dos semanas. Con el objeto de fijar los cultivos, los cultivos se lavaron con con PBS una vez. Posteriormente se añadió paraformaldehído al 4% y los cultivos se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos seguido por 3 lavados con PBS. En este momento, los cultivos fijados se almacenaron en PBS a 4°C o se tiñeron inmediatamente. La tinción con nestina de los siguientes cultivos se logró mediante la tinción con anticuerpo anti-nestina + anticuerpo anti-GFAP. Los cultivos incluyeron BMSC + NSC, BMSC + NSC + LIF, BMSC sola, BMSC + LIF, NSC sola y NSC + LIF. Se utilizó una muestra por duplicado como control (sin anticuerpos primarios). Las NSCs cultivadas solas en medio NSC con o sin LIF exógeno expresaron nestina. Cuando se cultivaron en medio NSC + LIF, además de expresar nestina las NSCs co-expresaron GFAP. Todos los co-cultivos exhibieron numerosas células positivas a nestina extendidas en la parte superior de las BMSCs (figuras 4A-4F). Las BMSCs mismas exhibieron solamente una ligera tinción de fondo (figuras 4G-4H). La morfología de las células positivas a nestina fue heterogénea. Muchas de las células positivas a nestina también fueron positivas para la GFAP mientras que otras fueron positivas a nestina y negativas a GFAP. Algunas de las células positivas a nestina fueron pequeñas, redondas o elípticas con o sin una o dos extensiones filamentosas. Algunas de las células doblemente positivas a nestina-GFAP fueron más grandes, planas y se parecían a los astrocitos. No se presentaron diferencias evidentes en los co-cultivos que crecieron con o sin la adición del LIF exógeno.

Diferenciación de co-cultivos Después de crecer en medio NSC por 10 días, el co-cultivo se sometió a un programa de diferenciación por dos semanas. El programa de diferenciación comprendía dos tipos de alimentación cada una de 1 ) DMEM/F12 con suplemento N2 pero sin EGF o FGF, 2) DMEM/F12 + suplemento B27 y 3) DMEM/F12 + B27 + BDNF. Los cultivos diferenciados se fijaron en paraformaldehído y luego se tiñeron con la siguiente combinación de anticuerpos: por ejemplo nestina/GFAP, MAP2/GFAP y O4/GFAP. En todos los casos, se detectó la GFAP con fluorescencia roja (Alexa 594) mientras que la nestina, MAP2 u 04 se detectaron con fluorescencia verde (Alexa 488). Los cultivos en contra- tíñeron con DAPI para marcar todos los núcleos con fluorescencia azul. Las NSCs crecidas sobre BMSCs retuvieron su potencial para diferenciarse hacia neuronas y astrocitos (figuras 5A-5D). Después del crecimiento en medio para diferenciación, varias células expresaron el marcador neuronal MAP-2. Estas fueron células pequeñas con núcleos elípticos y cuerpos celulares bipolares o multipolares. Los procesos fueron extensivos y formaron redes intrincadas de neuronas en la parte superior de las BMSCs o en la parte superior de las células que tiñeron para GFAP. Los astrocitos positivos a GFAP también estuvieron presentes a lo largo del cultivo. Estos fueron más grandes, poligonales y planos en comparación con las neuronas. Mediante aproximación, éstos fueron ya sea ¡guales o más neuronas que los astrocitos, puesto que una determinación precisa no fue posible debido a las redes extensas de neuronas que formaban una malla tridimensional de células. Todas las diluciones utilizadas, que parece que se tiñen con el anticuerpo 04 revelaron que las células no se diferenciaban hacia oligodendrocitos. Un período más largo de diferenciación se puede requerir para generar oligodendrocitos. No obstante, cuando la presencia de células oligodendrocíticas se ensayaba utilizando NG2 (un proteoglucano condroitin sulfato encontrado en la superficie de los precursores oligodendrocíticos) como un marcador para la diferenciación oligodendrocítica, se observó que pocas células eran positivas para NG2. La tinción de los co-cultivos diferenciados para nestina reveló algunas células astrocíticas positivas a GFAP que fueron débilmente positivas para la nestina, pero estas parecieron ser morfológicamente diferentes en comparación con las células filamentosas más pequeñas observadas antes de la diferenciación (figura 6). La presencia o ausencia de LIF exógeno durante el crecimiento no produjo ninguna diferencia en la diferenciación de las NSCs en los co-cultivos. Cuando las NSCs se cultivaron solas éstas se diferenciaron como se describió anteriormente, y se observó que éstas se volvían neuronas (positivas a MAP2) y astrocitos (positivas a GFAP) (figura 7). Cuando las BMSCs solas se sometieron a las mismas condiciones de diferenciación, éstas mostraron una tinción débil y difusa para la nestina y GFAP con GFAP siendo de alguna manera más intensa en las células cultivadas con LIF exógeno adicional. La morfología de las células permaneció siendo la misma que (as BMSCs y no fue astrocítica. Se observaron algunas células en el cultivo que eran altamente positivas a nestina o MAP2 sugiriendo cierta diferenciación hacia los linajes de NSC o neuronales (figuras 8A-8B).

EJEMPLO 2 Eliminación de las BMSCs a partir de los co-cultivos de BMSCs y NSCs Las células a partir de los co-cultivos de BMSCs y NSCs se pueden separar mediante la incubación de los co-cultivos con anticuerpo de ratón anti-CD 13 de humano (positivo en BMSCs y negativo en NSCs). Utilizando glóbulos magnéticos asociados a pan IgG de ratón, las BMSCs se pueden separar a partir de las NSCs. Las células no unidas que representan a las NSCs se analizan entonces mediante FACS o se colocan de vuelta en el cultivo. Para el análisis FACS, se utilizó un anticuerpo marcador diferente de BMSC (ratón anti-CD105 de humano) para detectar las BMSCs contaminantes mientras que las NSCs se detectaron con ratón anti-CD133 de humano.

Las BMSCs se sembraron en platos con 6 pozos a 150,000 células/pozo y se dejaron adherir durante toda la noche en medio BMSC. Las NSCs, THD-hWB-015 + LIF P17, crecidas en cultivo se cosecharon y re- suspendieron para romper las neuroesferas. El medio BMSC se removió a partir de los cultivos de BMSC y las NSCs cosechadas (75, 000 células/pozo) se colocaron en la parte superior de las BMSCs en medio NSC que contenía EGF y FGF, con o sin LIF exógeno. Los co-cultivos se mantuvieron por 13 días en el medio NSC. Las células se alimentaron cada tercer día o durante la semana mediante el reemplazo de la mitad del medio gastado con medio recientemente preparado. Al día 13, los co-cultivos se cosecharon con tripsina seguida por inhibidor de tripsina de frijol de soya. La mezcla celular se re-suspendió en PBS que contenía 0.1 % de BSA. La mezcla celular se incubó con anticuerpo anti-CD13 por 30 minutos sobre hielo. Posteriormente las células se lavaron con PBS/0.1% de BSA mediante centrifugación. Simultáneamente los complejos de glóbulos Dynal-Pan IgG de ratón se lavaron 3X con PBS/0.1 % de BSA mediante la separación de estos cada vez en un concentrador de partículas magnéticas (Dynal-MPC). Las células lavadas se incubaron con los glóbulos magnéticos lavados en PBS/0.1% de BSA a 4°C en un aparato giratorio/rotatorio (mezclador de muestra Dynal) por 30 minutos. El tubo que contenía la mezcla de célula-glóbulo se colocó en el MPC por 2-3 minutos. Los glóbulos con células unidas adheridas al lado del tubo se acercaron más al magneto. En sobrenadante se recolectó y se colocó en un tubo separado.

Una porción de las células en el sobrenadante se utilizó para análisis FACS y una porción de las células se sembraron en un portaobjetos revestido en una cámara con poliornitina y fibronectina. El análisis FACS se llevó a cabo con anti-CD105 (reconoce BMSCs) y anti-CD133 (reconoce a las NSCs). Las células sembradas sobre el portaobjetos revestido en una cámara se cultivaron por 1-2 días en medio NSC y que se fijaron para propósitos de inmunotinción para la tinción con nestina/GFAP. Durante el período de dos semanas, las NSCs se expandieron sobre la capa de las BMSCs. Algunas colonias grandes se observaron previamente y presumiblemente se originaron a partir de neuroesferas pequeñas. Otras NSCs que empezaron como células particulares o grupo de unas pocas células crecieron hacia varias colonias pequeñas de NSCs durante el período de dos semanas. Después de la eliminación magnética de las BMSCs, las NSCs separadas se analizaron mediante FACS. Más del 90% de las células fueron positivas a CD133 (figura 9B). Menos de 2% fueron positivas a CD105- (figura 9A). Las células que se sembraron en el portaobjetos revestido en una cámara se adhirieron al plato y morfológicamente se parecían a las NSCs. La inmunotinción para nestina se utilizó para verificar la presencia de las NSCs. La mezcla de BMSC-glóbulos la cual se colocó en cultivo fue morfológicamente parecida a BMSCs y se adhirió a la botella para cultivo de tejido con numerosos glóbulos magnéticos unidos. Los resultados indican que las BMSCs se pueden eliminar exitosamente a partir de los co-cultivos mediante la incubación simple con un anticuerpo que se une a las BMSCs seguido por la separación magnética dejando una población enriquecida en NSCs.

EJEMPLO 3 Escalación del co-cultivo y expansión mejorada de las NSCs utilizando BMSCs mínimas para la capa alimentadora En este experimento los co-cultivos se expandieron a botellas para cultivo de tejidos de T-75. Las BMSCs (donantes BM-022, P1 y BM-024, P1) se sembraron a dos densidades diferentes para siembra de aproximadamente 2.5e5 o 5.0e5 por botella en el medio BMSC. Dos días después, las células se lavaron con medio NSC y 5.0e5 de NSCs (THD-015, P14) se sembraron en 15 ml de medio NSC completo en la parte superior de las BMSCs. Las células se co-cultivaron por 15 días mediante la alimentación cada tercer día o tercer día mediante el reemplazo de la mitad del medio con medio NSC recientemente preparado. Después de 15 días, las células se cosecharon mediante tripsinización. Las BMSCs más grandes y las NSCs más pequeñas se contaron en hemocitómetro. Las BMSCs se eliminaron como se describió en otro lugar en la presente invención, por ejemplo, en el ejemplo 2.

Las células se re-suspendieron a aproximadamente 5 x10e7/ml y se incubaron con anticuerpo Anti-CD13 de humano sobre hielo por 15 minutos. Las células se lavaron una vez y luego se incubaron con Pan-ratón lgG-glóbulos Dyna lavado por 30 minutos. Las células unidas a los glóbulos se separaron posteriormente en un concentrador de partículas magnéticas. El sobrenadante que contenía las NSCs se lavó con medio NSC y el número de NSCs recuperadas se contó. Algunas de las células se analizaron mediante FACS, otras se sometieron a diferenciación e inmunocitoquímica. La descripción presentada en la presente invención demuestra que el cultivo de las NSCs sobre capas alimentadoras de unas pocas células BMSCs en lugar de un gran número de células BMSCs genera una mayor expansión de la NSC. Mediante el cambio de la proporción de las densidades para siembra de BMSC a NSC, se descubrió que cuando las BMSCs se siembran a una baja confluencia de aproximadamente 30%, se observó una mayor expansión en número de veces de las NSCs en comparación con las BMSCs cuando se siembran a 50-60% o a una mayor confluencia. Por ejemplo a densidades de siembra de las BMSCs de alrededor de 2.5e5 y NSCs a 5.0e5 en una botella T-75 como se muestra en el cuadro 3, se observó que se presentó una expansión tan grande como de 82 veces de las NSCs en comparación con 47 veces cuando se sembró un número similar de NSCs en el doble de número de las BMSCs. En comparación, se alcanza la expansión máxima de NSCs en otros experimentos cuando las NSCs se cultivan en la ausencia de BMSCs sobre platos revestidos en medio NSC estándar suplementado con LIF exógeno que fue de aproximadamente 20-25 veces. Después de la expansión de las NSCs en la presencia de BMSC, las BMSCs se eliminaron eficientemente a partir de los co-cultivos utilizando anticuerpos anti-BMSC y glóbulos inmuno-magnéticos a proporciones de recuperación de 83-93% (cuadro 3).

CUADRO 3 Expansión de hNSCs sobre las células alimentadoras BMSC Las NSCs en el co-cultivo expandido y aisladas se observaron que continúan expresando los marcadores de células progenítoras, incluyendo pero no limitados a, nestina (figuras 10A-10B). Las NSCs aisladas también retienen su potencial para diferenciarse hacia neuronas y astrocitos (figura 11 ). Un experto en la técnica basándose en la presente descripción podría ser capaz de reconocer que este método para la expansión de las NSCs se podría escalar además y adaptar a un procedimiento de elaboración en sistema cerrado que ha sido validado para la producción de las BMSCs.

EJEMPLO 4 Co-cultivo de las BMSCs y las NSCs en Transweils™ (co-cultivo independiente del contacto) Se ha demostrado en la presente invención que las BMSCs son capaces de servir como una capa alimentadora/de soporte excelente para la proliferación y expansión de células madre neurales de humano (hNSCs). En este ejemplo, se diseñaron experimentos para discernir si se requiere el contacto físico entre los dos tipos celulares o si las BMSCs podrían sostener la proliferación y expansión de las NSCs de una manera independiente del contacto por medio de la provisión de factores tróficos solubles para sostener la proliferación y expansión de la NSC. Las BMSCs, designadas hBM-03-016-P1 y hBM-012-P2, se descongelaron, se lavaron en medio BMSC y se sembraron en Transweils. Los experimentos en Transweils™ se llevaron a cabo en platos Costar de 6 pozos. Las BMSCs se sembraron en los Transweils™ mientras que las NSCs se colocaron en el pozo inferior. Ambos tipos de celulares se incubaron en el mismo medio NSC. El uso de Transweils™ permite los cultivos de diferentes tipos celulares, por ejemplo, BMSCs y NSCs, sin que los dos tipos celulares se pongan en contacto físico entre sí. Aproximadamente 30,000 BMSCs se colocaron en la parte superior de filtro poroso removible, del Transwell™. Después de permitir que las células se adhieran a la superficie del Transwell™ durante toda la noche en medio BMSC, las células se enjuagaron con medio libre de suero y se alimentaron en medio NSC completo (DMEM/F12 + suplemento N2 + EGF + FGF). Las NSCs (designadas THD-hWB-015-P13) se descongelaron, se lavaron y se sembraron a una densidad de aproximadamente 40,000 células/pozo sobre platos de 6 pozos revestidos con poliornitina/fibronectina. Los Transweils™ que contenían las BMSCs se colocaron posteriormente en los platos de 6 pozos que contenían las NSCs. Los controles incluyeron NSCs sin BMSC en los Transweils™. Se añadió medio suficiente para ambos, el Transwell™ y el pozo inferior. Se llevó a cabo el cambio de aproximadamente 50% del medio para tercer día. Después de dos semanas de cultivo, las NSCs se cosecharon a partir de cada pozo y se contaron. Las células se analizaron mediante citometría de flujo mediante la expresión de los marcadores de NSC. Los resultados demuestran que las NSCs crecieron sobre los pozos revestidos junto con las BMSCs en Transweils™ que proliferaron mejor que las NSCs cultivadas sobre pozos revestidos sin BMSCs (figura 12). Se observó que las BMSCs sostienen el crecimiento y la expansión de las NSCs incluso en la ausencia de contacto directo entre los dos tipos celulares. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, se cree que los factores secretados a partir de las BMSCs sirven para suplementar el medio de NSC y por lo tanto ayudan a sostener la proliferación y expansión de las NSCs. El análisis FACS de las NSCs que crecieron en la presencia de las BMSCs en Transweils™ o que crecieron solas en la ausencia de BMSC demostró que las NSCs fueron similares en su fenotipo. Por ejemplo, se observó que las NSCs que crecieron en ambas condiciones eran aproximadamente 100% positivas a CD133. Los experimentos se repitieron excepto que los platos con 6 pozos no se revistieron con poliornitina/fibronectina. Se sembraron aproximadamente 50,000 BMSCs en Transwell™. Las NSCs (designadas THD-hWB-015-P12) se descongelaron y se sembraron en cualesquiera platos Falcon o Costar de 6 pozos. Las BMSC crecidas sobre los Transweils™ se colocaron en los platos de 6 pozos y los cultivos se mantuvieron por dos semanas. Como controles, las NSCs se cultivaron solas en medio NSC con o sin LIF exógeno. Las NSCs que se crecieron con BMSCs en Transweils™ se expandieron de manera similar a las NSCs que se crecieron solas en medio NSC en la presencia de LIF exógeno, pero se expandieron significativamente mejor que las NSCs cuando se crecieron solas en la ausencia de LIF exógeno (figuras 13A-13B). También se observó que los platos Costar proveyeron mejores resultados que los platos Falcon con respecto a la cantidad de proliferación celular.

EJEMPLO 5 Crecimiento de las NSCs en medio condicionado por BMSC Los resultados de los experimentos presentados en el ejemplo 4 demostraron que las BMSCs produjeron factores solubles que sostienen el crecimiento de NSC. La siguiente serie de experimentos se llevó a cabo con medio condicionado a partir de BMSCs cultivadas para elucidar además los efectos de los factores secretados a partir de las BMSCs sobre el crecimiento de NSC. Los experimentos descritos en la presente invención se emplearon para discernir si el factor de crecimiento secretado y/u otros factores a partir de las BMSCs podrían sostener y mejorar el crecimiento y la expansión de NSC. Los experimentos se diseñaron para evaluar 1) si el medio condicionado por las BMSCs en cultivo podría sustituir el medio NSC suplementado con LIF exógeno para proveer efectos promotores del crecimiento a las NSCs en cultivo y 2) si el medio condicionado por las BMSCs en cultivo podría proveer efectos benéficos al cultivo de las NSCs similares a aquellos del cultivo de las NSCs sobre platos revestidos con poliornitina/fibronectína. Con el objeto de generar BMSC-CM, las BMSCs se sembraron inicialmente en botellas T-80 y se cultivaron en medio BMSC. Después de un período de tiempo en cultivo, el medio de cultivo de BMSC se reemplazó con medio NSC. Por lo tanto, se obtuvo el BMSC-CM a partir de las BMSCs ya sea con medio NSC completo incluyendo bFGF y EGF (BMSC-CM1 ) o con medio NSC sin EGF y bFGF (BMSC-CM2). Las BMSCs se alimentaron con medio NSC recientemente preparado cada 48 horas. En este momento, el medio se removió, se centrifugó para remover la materia en forma de partículas y se utilizó para alimentar a las NSCs o se congeló a -80°C para la evaluación de las citoquinas. Para los experimentos con BMSC-CM, las NSCs se alimentaron con medio para crecimiento de NSC que comprende aproximadamente 25-50% de BMSC-CM que fue ya sea recientemente recolectado a partir de las BMSCs o se almacenó a 4°C por un período tan largo como de 2 semanas. El BMSC-CM también se analizó con arreglos de citoquina (Cytokine Arrays - RayBiotech Inc.) o mediante ELISA para presencia de diversas citoquinas. Para evaluar si las NSCs se podrían expandir en BMSC-CM, las NSCs se sembraron sobre platos revestidos con poliornitina/fibronectina y se alimentaron cada tercer día con un cambio de 50% en el medio con a) BMSC- CM1 , b) BMSC-CM2, c) medio NSC completo en la presencia de LIF exógeno, o d) medio NSC completo, en la ausencia de LIF exógeno. Para los dos cambios iniciales en BMSC-CM1 y BMSC-CM2, se añadió EGF y FGF recientemente preparado a cada uno de los BMSC-CM, pero la adición de EGF y FGF al BMSC-CM se detuvo posteriormente. Los resultados demuestran que NSCs creció igualmente bien en BMSC-CM o en medio NSC completo. Las figuras 14A-14D ilustra campos representativos de las NSCs cultivadas bajo las diferentes condiciones. En la presencia de BMSC-CMI, se observó que las NSCs formaron neuroesferas grandes adherentes, con las neuroesferas teniendo células que crecen por fuera de las neuroesferas. También se observó que algunas de las NSCs cultivadas en la presencia de BMSC-CMI formaron una monocapa. En el caso en donde las NSCs se cultivaron en BMSC-CM2, también se observó que las neuroesferas se formaban a partir de las NSCs. No obstante, se formaron menos neuroesferas grandes y aparecieron menos monocapas en comparación con las NSCs cultivadas en la presencia de BMSC-CM1. En la presencia de medio NSC completo, las NSCs crecieron como varias neuroesferas conectadas entre sí y exhibieron células creciendo por fuera de las neuroesferas. En cualquier caso, las células en cada cultivo se cosecharon después de 10 días en cultivo y se contaron para el número de células para comparar los efectos de las diferentes condiciones de cultivo sobre la proliferación de las NSCs. El número de células cosechadas a partir de BMSC-CM1 (aproximadamente 3.4e6 células) fue similar al número de células cosechadas en medio NSC completo en la presencia de LIF exógeno (aproximadamente 3.3e6). El número de células obtenidas en BMSC-CM2 fue de aproximadamente 2.85e6. La siguiente serie de experimentos evaluó si las NSCs se podrían expandir en BMSC-CM incluso sobre platos no revestidos. Los cuatro grupos de NSC son como sigue:1) NSCs cultivadas en BMSC-CMI; 2) NSCs cultivadas en BMSC-CM2; 3) NSCs cultivadas en medio NSC completo en la presencia de LIF exógeno; y 4) NSCs cultivadas en medio NSC completo en la ausencia de LIF exógeno. Las células se cultivaron por 2 semanas, se sometieron a pasajes mediante tripsinización y se trataron con las mismas condiciones por otras 2 semanas. La mayor expansión de las NSCs se observó en BMSC-CM1 seguido por BMSC-CM2 y luego en medio NSC + LIF por las primeras 2 semanas (barras representadas por P1 , figura 15). Después de pasaje, BMSC-CM1 produjo una expansión similar de las NSCs en comparación con el medio NSC + LIF (representado por P2 en la figura 15). Las células tratadas con BMSC-CM2 continuaron su proliferación y tuvieron un mejor desempeño que las células tratadas con el medio NSC sin LIF. Por lo tanto, los datos actuales indican que BMSC-CM es una buena fuente de factores de crecimiento para hNSCs y es capaz de inducir la proliferación de las NSCs a velocidades iguales a o velocidades superiores a aquella que con el medio NSC suplementado con LIF exógeno. Además, las NSCs cultivadas con BMSC-CM pueden ser sometidas a pasajes mediante tripsinización y además se expanden para incrementar los números celulares.

Análisis de arreglo de citoquina de BMSC-CM Las BMSCs se cultivaron en medio NSC completo. El medio se recolectó a las 48 horas y se determinó el perfil de citoquina utilizando ensayos para citoquina. Se obtuvo el anticuerpo para citoquina de humano RayBio arreglo en serie C 1000 (combinación de los arreglos VI y Vil) obtenido a partir de RayBiotech, Inc (Norcross, GA). Las membranas del arreglo se trataron con las muestras como se describe en el manual de instrucciones del fabricante. La detección final de las citoquinas se llevó a cabo utilizando el sistema ECL-Plus (Amersham, Piscataway, NJ). Las señales se visualizaron sobre una película para rayos X (Amersham, Piscataway, NJ). Los resultados a partir del perfil de citoquina demostraron que diversas citoquinas/factores estuvieron presentes en el BMSC-CM basándose en la intensidad de la señal por encima de los controles negativos en el mismo arreglo. Las citoquinas/factores incluyen, pero no se limitan a LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF- 6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (1GFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de las metaloproteínaasas (TIMP-1), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1 ) y TGFß-3. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular, el BMSC-CM comprende varios factores los cuales incluyen factores ya presentes en el medio de cultivo incluyendo EGF y bFGF además de los factores que son ya sea secretados por las BMSCs o que fueron inducidos por el medio. Los factores listados en la presente invención se basan en la evaluación de las señales control negativas anteriormente mencionadas en los arreglos para 120 citoquinas que estuvieron presentes en los arreglos evaluados. Algunas de las citoquinas que se detectaron por arriba del nivel del fondo incluyeron, pero no se limitan a EGF y bFGF. Otras citoquinas claramente expresadas fueron HGF (factor de crecimiento de hepatocito), M- CSF (factor estimulante de la colonia de macrófago) y TIMP-1 y TIMP-2 (inhibidores tisulares de la metaloproteinasa 1 y 2, respectivamente). Los neurofactores tróficos incluyeron, pero no se limitan a BDNF, NT3, GDNF y CNTF. Las IGFBPs, y FGF-6 estuvieron presentes. Muchas quimocinas, citoquinas pro inflamatorias y factores angiogénicos, por ejemplo, también se produjo VEGF. También se produjo el LIF por las BMSCs el también se confirmó con ELISA. En el ensayo de ELISA, la cantidad real de cada factor secretado evaluado a partir de las BMSCs se evaluó para sustraer los niveles del medio control a partir de los niveles observados en BMSC-CM. A partir de la descripción presentada en la presente invención, se puede concluir que las BMSCs producen factores solubles que promueven el crecimiento de NSC. El contacto directo de las NSCs con BMSC no es necesario, puesto que el BMSC condicionado también puede sostener el crecimiento y expansión de las NSCs. La presente descripción muestra que el co-cultivo dependiente de contacto produce la mayor expansión de las NSCs sugiriendo un efecto sinergístico del contacto físico con las BMSCs o de los productos de BMSC y de los factores solubles producidos por las BMSCs con NSCs para la expansión de las NSCs.

EJEMPLO 6 NSCs cultivadas sobre las BMSCs o en BMSC-CM exhibieron niveles de expresión reducidos de las moléculas del MHC pero retuvieron el mismo perfil fenotípico de las NSCs crecidas solas en condiciones estándar Las NSCs expandidas en el ejemplo 3 se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de diversos marcadores de BMSC y de NSC. Las NSCs co-cultivadas con BMSC retuvieron el mismo perfil fenotípico (por ejemplo positiva para CD56 y CD133 y negativa para CD105) que las NSCs cultivadas sin las BMSCs en medio para crecimiento de NSC suplementado con LIF exógeno, con la excepción de que la NSC co-cultivada con BMSC no exhibió una expresión detectable de las moléculas clase II del MHC (figuras 16A-16D). Se observó que las moléculas clase II del MHC se indujeron sobre las NSCs cuando se añadió LIF exógeno al medio para crecimiento de NSC. En contraste, no se observó que las NSCs co-cultivadas con las BMSCs expresaran las moléculas clase II del MHC por arriba de la línea basal lo cual puede servir de manera ventajosa para el transplante. Además, las NSCs aisladas a partir de co-cultivos no expresan el marcador de BMSC CD105 por arriba de la línea basal demostrando una eliminación eficiente de las BMSCs a partir de los co-cultivos. De manera similar las NSCs cultivadas con BMSC-CM también retuvieron el mismo perfil fenotípico de las NSCs cultivadas con medio NSC estándar + LIF excepto que mostraron niveles de línea basal del MHC clase II y niveles reducidos del MHC clase I (figuras 17A-17D). Cuatro grupos de NSC se sometieron a análisis FACS para la expresión de CD 133, las moléculas clase II del MHC, las moléculas clase I del MHC, y CD56 (figuras 17A-17D). Los resultados confirmaron las observaciones previas con respecto a que las NSCs que crecen en la presencia de LIF exógeno expresan las moléculas clase II del MHC y exhibieron una fluorescencia media incrementada de las moléculas clase I del MHC. No obstante no se observó que las NSCs crecidas en BMSC-CM expresaran las moléculas clase II del MHC y tuvieron niveles bajos de expresión de la molécula clase I del MHC. La expresión de CD133 fue similar en los cuatro casos. Todas las células evaluadas expresaron CD56 aunque las células cultivadas en la presencia de LIF exógeno exhibieron una fluorescencia media reducida de CD56.

EJEMPLO 7 Regulación de la expresión de la clase I y de la clase II del MHC en las NSCs mediante la expansión sobre las BMSCs Se llevaron a cabo experimentos adicionales para evaluar la expresión de ambas moléculas clase I y clase II del MHC por las NSCs co-cultivadas. Las NSCs se aislaron a partir de cerebro fetal y se cultivaron por 13 pasajes en medio NSC (THD-WB-015, P13). Posteriormente las NSCs se cultivaron en las siguientes 4 condiciones por 12 días con cambio de medio cada tercer día: 1. 62,500 NSCs solas en una botella T25 revestida con medio NSC completo 2. 62,500 NSCs solas en una botella T25 revestida con medio NSC completo + LIF 3. 62,500 NSCs en la parte superior de 250,000 BMSCs (donante-012) como capa alimentadora en medio NSC completo 4. NSCs en la parte superior de 250,000 BMSCs (donante-016) como capa alimentadora en medio NSC completo Después de 12 días las células se cosecharon mediante tripsinización. Las células se contaron y se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de CD133, CD105, MHC clase I y MHC clase II. En el caso de los co-cultivos, todas las células se adquirieron y las NSCs fueron seleccionadas basándose en su dispersión mediante luz y expresión de CD133. Las figuras 18A-18D muestran la expresión de las moléculas del MHC clase I y clase II por las NSCs cultivadas bajo las diversas condiciones (negro= isotipo control; gris = clase I o clase II). Los resultados muestran que todas las NSCs expresan la clase I del MHC. No obstante cuando las NSCs se cultivaron en la presencia de LIF exógeno, se presentó un incremento significativo en la expresión de la clase I del MHC sobre las células, como se refleja por el incremento en la intensidad Log de la fluorescencia media en comparación con las NSCs cultivadas en la ausencia de LIF exógeno. Las NSCs co-cultivadas expresaron niveles significativamente más bajos de la clase I del MHC en comparación con las NSCs expandidas con LIF (cuadro 4).

CUADRO 4 Las NSCs no expresan las moléculas clase II del MHC de manera constitutiva. No obstante, LIF indujo la expresión de las moléculas clase II del MHC en un 38% de las células. Las NSCs cultivadas con BMSCs fueron similares a las NSCs cultivadas en la ausencia de LIF y no expresan la clase II del MHC por arriba de la línea basal. Los resultados demuestran que una ventaja de la expansión de las NSCs sobre las BMSCs es reducir y/o prevenir la expresión de las moléculas inmuno-reguladoras clase I y II del MHC sobre las NSCs lo cual la hace más adecuadas para transplante clínico. La descripción de todas y cada una de las patentes, solicitud de patente, y publicación citada en la presente invención se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad. Será evidente a aquéllos expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en los métodos y composiciones de la presente invención sin apartarse del espíritu o alcance de la invención. Por lo tanto, se pretende que la presente invención abarque las modificaciones y variaciones de la presente invención provistas a partir del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes.

Claims (43)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende: (a) una célula estromal de médula ósea aislada (BMSC); y (b) un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para crecimiento del célula madre neural (NSC) y factores secretados por dicha BMSC.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho medio de cultivo no contiene factor inhibidor de leucemia exógeno (LIF).

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1 ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP-1 ), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1 ) y TGFß-3.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende una NSC aislada.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha NSC se encuentra en contacto físico con dicha BMSC.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha NSC no se encuentra físicamente en contacto con dicha BMSC.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha NSC se deriva a partir del sistema nervioso central de un humano.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha BMSC se deriva a partir de un humano.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha NSC.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha BMSC.

12.- Un medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM) que comprende un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para crecimiento de la célula madre neural (NSC) y factores secretados por una BMSC aislada.

13.- El BMSC-CM de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho BMSC-CM no contiene LIF exógeno.

14.- El BMSC-CM de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas.

15.- El BMSC-CM de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1 ), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP-1 ), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1 ), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1) y TGFß-3.

16.- Un método para modular la expresión de la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en una NSC aislada, dicho método que comprende co-cultivar las células que comprenden una BMSC aislada y una NSC aislada.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dichas células se co-cultivan en la ausencia de LIF exógeno.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha NSC está físicamente en contacto con dicha BMSC.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha NSC no se encuentra físicamente en contacto con dicha BMSC.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha NSC se deriva a partir del sistema nervioso central de un humano.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha BMSC se deriva a partir de un humano.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha NSC.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha BMSC.

24.- Un método para modular la expresión de la molécula del MHC en una NSC aislada, dicho método comprende cultivar dicha NSC con medio condicionado de célula estromal de médula ósea (BMSC-CM), en donde dicho BMSC-CM comprende medio para crecimiento de NSC y factores secretados por dicha BMSC.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho BMSC-CM no contiene LIF exógeno.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho BMSC-CM está esencialmente libre de BMSCs.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de factores de crecimiento, factores tróficos y citoquinas.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dichos factores se seleccionan a partir del grupo que consiste de LIF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), FGF-6, factor neurotrófico derivado de glia (GDNF), factor estimulante de la colonia de granulocito (GCSF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), IFN-?, proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-2), IGFBP-6, IL-1ra, IL-6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1), factor estimulante de la colonia de fagocito mononuclear (M-CSF), factores neurotróficos (NT3), inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP-1 ), TIMP-2, factor de necrosis tumoral (TNF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-D, receptor del activador de plasminógeno uroquinasa (uPAR), proteína morfogenética de hueso 4 (BMP4), IL1-a, IL-3, leptina, factor de célula madre (SCF), factor derivado de célula estromal-1 (SDF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGFBB), factor de crecimiento transformante beta (TGFß-1) y TGFß-3.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha NSC se deriva a partir del sistema nervioso central de un humano.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterízado además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha NSC.

31.- Una NSC aislada preparada a partir del método de co- cultivar una BMSCs aislada con una NSC aislada.

32.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicha NSC exhibe una expresión reducida de la molécula clase I del MHC.

33.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicha NSC exhibe un nivel de línea basal de la molécula clase II del MHC.

34.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicha NSC se deriva a partir del sistema nervioso central de un humano.

35.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha NSC.

36.- Una NSC aislada prepared mediante el cultivo de una NSC aislada en BMSCCM, en donde dicho BMSC-CM comprende un medio de cultivo químicamente definido que comprende medio para crecimiento de NSC y factores secretados por una BMSC aislada.

37.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicha NSC exhibe una expresión reducida de la molécula clase I del MHC.

38.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicha NSC exhibe un nivel de línea basal de la molécula clase II del MHC.

39.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicha NSC se deriva a partir del sistema nervioso central de un humano.

40.- La NSC aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque el material genético exógeno ha sido introducido dentro de dicha NSC.

41.- Un dispositivo para cultivo de célula neural que comprende: (a) una NSC aislada; (b) una BMSC aislada; (c) un medio para crecimiento de la NSC, en donde dicho medio para crecimiento de la NSC comprende factores secretados a partir de dicha BMSC aislada; y (d) un medio para conservar a dicha NSC y dicha BMSC sin contacto físico entre sí.

42.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un filtro o membrana que conserva a dicha NSC y dicha BMSC sin contacto físico entre sí.

43.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho filtro o membrana tiene poros para permitir que los factores secretados a partir de dicha BMSC crucen dicho filtro o membrana.