ES2246085T3 - Celulas de medula osea como fuente de neuronas util para reparar la medula espinal y el cerebro. - Google Patents

Abstract

Un método para producir células con fenotipo neuronal a partir de células de médula ósea, comprendiendo dicho método las etapas de: a) provisión de células de médula ósea; b) selección de una pluralidad de células estromales de médula ósea a partir de la médula ósea; c) incubación de las células estromales en un medio de crecimiento con un mitógeno seleccionado de entre EGF, PDGF o una combinación de los mismos; y d) incubación de las células procedentes de la etapa (c) en un medio de crecimiento neuronal que incluya al menos un ácido retinoico y al menos un agente diferenciador seleccionado de entre BDNF, GDNF o NGF, produciendo de este modo células con fenotipo neuronal.

Description

Células de médula ósea como fuente de neuronas útil para reparar la médula espinal y el cerebro.

Campo de utilización

Esta solicitud se refiere a métodos para cultivar células de médula ósea de tal manera que expresen un fenotipo neuronal para ser utilizadas en trasplantes.

Información sobre los antecedentes

Los neurobiólogos han considerado desde hace tiempo que las neuronas del cerebro adulto son como unos ahorros muy valiosos: un legado que se reduce con el tiempo y la enfermedad y que es difícil, si no imposible, de reconstruir. La Enfermedad de Parkinson y la Enfermedad de Alzheimer son ejemplos de enfermedades neurodegenerativas cuya cura espera que los científicos superen la dificultad de reconstruir las neuronas del cerebro humano adulto. La Enfermedad de Parkinson (EP), es un trastorno que aparece en la madurez o en la edad tardía con una progresión muy gradual y un curso prolongado. HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, Vol. 2, 23ª ed., editado por Isselbacher, Braunwald, Wilson, Martin, Fauci y Kasper, McGraw-Hill Inc., New York City, 1994, pág. 2275. Los cambios observados de manera más regular han tenido lugar en los agregados de células nerviosas que contienen melanina en el tronco cerebral (sustancia nigra, locus cerúleo), donde hay grados variables de pérdida de células nerviosas con gliosis reactiva (más pronunciada en la sustancia nigra) junto con inclusiones intracitoplásmicas eosinofílicas características. (Id. en 2276).

En su forma totalmente desarrollada, la EP es fácilmente reconocida. La postura encorvada, la rigidez y la lentitud de movimientos, la fijeza de la expresión facial, el temblor rítmico de las extremidades, que disminuye con el movimiento activo voluntario o la relajación completa, son familiares a todos los médicos. De manera general, acompañando a las demás características de la enfermedad totalmente desarrollada está el paso acelerado, mediante el cual el paciente, que no puede realizar los ajustes reflejos apropiados requeridos para caminar eficazmente debido a la anormalidad del tono postural, avanza con pisadas rápidas arrastrando los pies en un paso acelerado como para recuperar el centro de gravedad del cuerpo. (Id. en 2276).

Aunque el tratamiento moderno de la EP tiene más éxito que cualquiera de los que estaban disponibles antes de la introducción de la levodopa, incluyendo la cirugía estereotáxica, existen todavía muchos problemas. (Id. en 2277). Subyacente a muchas de las dificultades está indudablemente el hecho de que ninguna de estas medidas terapéuticas tiene efecto sobre el proceso de la enfermedad subyacente, que consiste en una degeneración neuronal. Finalmente, parece alcanzarse un punto en el que la farmacología no puede ya compensar la pérdida de dopamina de los ganglios basales. (Id.).

La Enfermedad de Alzheimer (EA) es debida a un proceso degenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de células del cerebro anterior basal, de la corteza cerebral y de otras áreas del cerebro. Se ven particularmente afectadas las neuronas transmisoras de acetilcolina y sus nervios diana. Están presentes placas seniles y marañas neurofibrilares. La Enfermedad de Pick tiene un cuadro clínico similar a la Enfermedad de Alzheimer excepto un curso clínico y una atrofia limitada algo más lentos, afectando principalmente a los lóbulos frontal y temporal. Un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer y de otras demencias muestra una tendencia hereditaria a la formación de tales placas. Se cree que si un fármaco tiene efecto en el modelo, podría ser también beneficioso en al menos algunas formas de la Enfermedad de Alzheimer y de la Enfermedad de Pick. Actualmente existen tratamientos paliativos pero no hay ningún medio para restaurar la función.

Un grupo de enfermedades degenerativas se caracteriza por ataxia progresiva debido a la degeneración del cerebelo, el tronco cerebral, la médula espinal y los nervios periféricos y, ocasionalmente, los ganglios basales. Muchos de estos síndromes son hereditarios; otros aparecen esporádicamente. Las degeneraciones espinocerebelares han sido distribuidas de manera lógica en tres grupos: ataxias predominantemente vertebrales, ataxias cerebelares y degeneraciones de múltiples sistemas. Hasta la fecha no existen tratamientos. La Ataxia de Friedrich es la ataxia vertebral prototípica cuya herencia es autosómica recesiva. El gen responsable ha sido encontrado en el Cromosoma 9. Los síntomas comienzan entre las edades de 5 y 15 años con un caminar inestable, seguido por ataxia de las extremidades superiores y disartria. Los pacientes son arrefléjicos y pierden las modalidades sensoriales de fibras grandes (sentido de la vibración y de la posición). Otras dos enfermedades tienen síntomas similares: el Síndrome de Bassen-Kornzweig (alipoproteinemia beta y deficiencia de vitamina E) y la Enfermedad de Refsom (enfermedad de almacenamiento del ácido fitánico). Las degeneraciones corticales cerebelares tienen lugar generalmente entre las edades de 30 y 50 años. Clínicamente, solamente pueden detectarse signos de disfunción cerebelar, con cambios patológicos restringidos al cerebelo y ocasionalmente a las olivas inferiores. Se ha informado de casos heredados y de casos esporádicos. Una degeneración similar puede estar asociada también con el alcoholismo crónico.

En las degeneraciones de múltiples sistemas, la ataxia se presenta en el periodo comprendido entre la juventud y la edad madura adulta en combinaciones variables, con espasticidad y disfunción de las neuronas autónomas y motoras inferiores, sensoriales, extrapiramidales. En algunas familias puede haber también atrofia óptica, retinitis pigmentosa, oftalmoplejia y demencia.

Otra forma de degeneración cerebelar es la degeneración cerebelar paraneoplásica que tiene lugar en ciertos cánceres, tales como el cáncer de pulmón de células en grano de avena, el cáncer de mama y el cáncer de ovario. En algunos casos, la ataxia puede preceder al descubrimiento del cáncer en semanas o años. Las células de Purkinje se pierden permanentemente, teniendo como resultado la ataxia. Incluso si el paciente sana del cáncer de manera permanente, su capacidad para funcionar puede estar inhabilitada profundamente por la pérdida de células de Purkinje. No existe un tratamiento específico.

Los derrames cerebrales tienen también como resultado la degeneración neuronal y la pérdida de sinopsis funcionales. Actualmente no existe una reparación del daño y se llevan a cabo solamente cuidados paliativos y rehabilitación.

Se ha utilizado el neurotrasplante para explorar el desarrollo del sistema nervioso central y para la reparación del tejido dañado en condiciones tales como la Enfermedad de Parkinson y otras enfermedades neurodegenerativas. Se ha llevado a cabo la sustitución experimental de neuronas mediante el injerto directo de tejido fetal en el cerebro en un pequeño número de pacientes en varias universidades de investigación (incluyendo nuestra University of South Florida); pero hasta ahora, el injerto experimental de neuronas fetales humanas ha estado limitado por la escasez de fuentes de tejido apropiadas, por problemas logísticos, por restricciones legales y éticas y por la pobre supervivencia de las neuronas trasplantadas en el cerebro huésped humano.

Un método sustituye neuronas mediante la utilización de células estromales de médula como células madre para tejidos no hematopoyéticos. Las células estromales de médula pueden ser aisladas de las demás células de la médula por su tendencia a adherirse al plástico para cultivo de tejidos. Las células tienen muchas de las características de las células madre de tejidos que pueden ser definidos en líneas generales como mesenquemáticos, ya que pueden diferenciarse en cultivo en osteoblastos, condrocitos, adipocitos e incluso mioblastos. Por tanto, las células estromales de médula presentan un modelo fascinante para estudiar la diferenciación de células madre. Además, tienen varias características que las convierten en potencialmente útiles para terapia celular y génica. Prockop, D.J. Science 26: 71-74 (1997). Esta población de células de la médula ósea (BMSC) ha sido también utilizada para preparar células dendríticas (K. Inaba y col., J. Experimental Med. 176: 1693-1702 (1992)) que, como su nombre implica, tienen una morfología que podría ser confundida con la de las neuronas. Las células dendríticas comprenden un sistema de células presentadoras de antígeno implicadas en el inicio de las respuestas de células T. Se ha informado que el factor de crecimiento específico, que estimula la producción de células dendríticas, es el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF). K. Inaba y col., J. Experimental Med. 176: 1693-1702 (1992).

La presencia de células madre para células no hematopoyéticas en médula ósea fue sugerida por vez primera por las observaciones del patólogo alemán Cohnheim hace 130 años. J. Cohnheim, Arch. Path. Anat. Physiol. Klin. Med. 40: 1 (1867). Cohnheim estudió la reparación de heridas mediante la inyección de un colorante anilina insoluble en las venas de animales y la búsqueda posterior de la aparición de células que contenían el colorante en heridas que él había originado en un lugar distal. Concluyó que la mayoría de las células, si no todas, que aparecían en las heridas procedían de la corriente sanguínea y, por implicación, de la médula ósea. Las células teñidas incluían no solamente células inflamatorias sino también células que tenían una morfología similar a fibroblastos y que estaban asociadas con fibrillas finas. Por tanto, el trabajo de Cohnheim planteaba la posibilidad de que la médula ósea pudiera ser la fuente de fibroblastos que depositaban fibras de colágeno como parte del proceso normal de reparación de heridas. El origen de los fibroblastos en la reparación de heridas ha sido examinado en más de 40 publicaciones desde el informe de Cohnheim de 1867. Ver, por ejemplo, R. Ross, N.B. Everett, R. Tyler, J. Cell Biol. 44: 645 (1970); J.K. Moen, J. Exp. Med. 61: 247 (1935); N.L. Petrakis, M. Davis, S.P. Lusia, Blood 17: 109 (1961); S.R.S. Rangan, Exp. Cell Res. 46: 477 (1967); J.M. Davidson, en INFLAMMATION: BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL CORRELATES, J.I. Gallin, I.M. Goldstein, R. Snyderman, Eds. (Raven, New York City, ed. 2, 1992, pp. 809-19); R. Bucala, L.A. Spiegel, J. Chesney, N. Hogan, A. Cerami, Mol. Med. 1: 71 (1994). La mayoría de los datos sugieren que los fibroblastos son de origen local, pero el asunto no ha sido resuelto y está siendo estudiado todavía. Prockop, D.J., Science 26: 71-74 (1997).

Aunque la tesis de Cohnheim no ha sido todavía confirmada, la prueba definitiva de que la médula ósea contiene células que pueden diferenciarse en fibroblastos así como en otras células mesenquimales ha estado disponible desde el trabajo pionero de Friedenstein, que comenzó a mitad de los años 70. A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976). Friedenstein colocó muestras de médula ósea completa en placas de cultivo de plástico y eliminó por vertido las células que no eran adherentes. La característica más sorprendente de las células adherentes era que tenían la capacidad de diferenciarse en colonias que se asemejaban a pequeños depósitos de hueso o de cartílago. Las observaciones iniciales de Friedenstein fueron ampliadas por varios investigadores durante los años 80, particularmente por Piersma y colaboradores (A.H. Piersma, R.E. Ploemacher, K.G.M. Brockbank, Br. J. Haematol. 54: 285 (1983); A.H. Piersma y col., Exp. Hematol. 13: 237 (1985)) y Owen y colaboradores. C.R. Howlett y col., Clin. Orthop. Relat. Res. 213: 251 (1986); H.J. Mardon, J. Bee, k. von der Mark, M.E. Owen, Cell Tissue Res. 250: 157 (1987); J.N. Beresford, J.H. Bennett, C. Devlin, P.S. Leboy, M.E. Owen, J. Cell Sci. 102: 341 (1992). Estos y otros estudios (M.E. Owen y A.J. Friedenstein, en Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, R.U., 1988, pp. 42-60; S.L. Cheng y col., Endocrinology 134: 277 (1994); A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D.J. Richard y col., Dev. Biol. 161: 218 (1994). S. Wakitani, T. Saito y A.J. Caplan (Muscle Nerve 18: 1412 (1995)) demostraron que las MSCs se diferenciaban en mioblastos y miotubos mediante tratamiento con 5-azacitidina y anfotericina B (Fungasome, Gibco). D. Phinney (Prockop, D.J., Science 26: 71-74 (1997)), observó recientemente que las células se diferenciaban en mioblastos y miotubos después del tratamiento con anfotericina B (1 \mug/ml) sola; A.J. Friedenstein, R.K. Chailakahyan, U.V. Gerasimov, Cell Tissue Kinet 20: 263 (1987); A. Keating, W. Horsfall, R.G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B.R. Clark y A. Keating, Ann. N.Y. Acad. Sci. 770: 70 (1995)) establecieron que las Células Estromales de Médula (MSCs) aisladas por el procedimiento relativamente bruto de Friedenstein eran multipotentes y se diferenciaban fácilmente en osteoblastos, condroblastos, adipocitos e incluso mioblastos.

Aunque las propiedades multipotentes de las MSCs han sido reconocidas durante varias décadas, existen sorprendentemente grandes huecos en nuestra información acerca de las propias células. Las células, aisladas por su adherencia al plástico según fue descrito por Friedenstein (A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976)), son inicialmente heterogéneas y difíciles de clonar. La fracción de células hematopoyéticas es relativamente elevada en los cultivos iniciales de médula de ratón pero es menor del 30% en médula humana (M.E. Owen y A.J. Friedenstein, en Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, R.U., 1988, pp. 42-60; S.L. Cheng y col., Endocrinology 134: 277 (1994); A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D.J. Richard y col., Dev. Biol. 161: 218 (1994); A. Keating, W. Horsfall, R.G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B.R. Clark y A. Keating, Ann. N.Y. Acad. Sci. 770: 70 (1995)). La mayoría de las células hematopoyéticas fácilmente identificables se pierde a medida que las células son mantenidas como cultivos primarios durante 2 ó 3 semanas. Las MSCs cultivadas sintetizan una matriz extracelular que incluye colágeno intersticial de tipo I, fibronectina y colágeno de tipo IV y laminina de las membranas basales (M.E. Owen y A.J. Friedenstein, en Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symp. 136, Wiley, Chichester, R.U., 1988, pp. 42-60; S.L. Cheng y col., Endocrinology 134: 277 (1994); A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9: 641 (1991); D.J. Richard y col., Dev. Biol. 161: 218 (1994); A. Keating, W. Horsfall, R.G. Hawley, F. Toneguzzo, Exp. Hematol. 18: 99 (1990); B.R. Clark y A. Keating, Ann. N.Y. Acad. Sci. 770: 70 (1995)). Una pequeña fracción de las células cultivadas sintetiza antígeno asociado al factor VII y son por tanto probablemente endoteliales. Las células secretan citoquinas, pareciendo ser las más importantes de las mismas interleuquina-7 (IL-7), IL-8, IL-11, y el factor de células madre (ligando de c-kit). Las condiciones para la diferenciación de las células son de algún modo dependientes de la especie y están influenciadas por variables no completamente definidas, tales como el lote de suero de ternera fetal utilizado. Sin embargo, las MSCs de ratón, rata, conejo y humano se diferencian fácilmente en colonias de osteoblastos (que depositan mineral en forma de hidroxiapatita), condrocitos (que sintetizan una matriz de cartílago) y adipocitos en respuesta a dexametasona, 1,25-dihidroxivitamina D_{3} o citoquinas tales como BMP-2 (A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976); 5-11). En respuesta a 5-azacitidina con anfotericina B (Fungasome, Gibco) o anfotericina B sola, S. Wakitani, T. Saito y A.J. Caplan (Muscle Nerve 18: 1412 (1995)) demostraron que las MSCs se diferenciaban en mioblastos y miotubos por tratamiento con 5-azacitidina y anfotericina B. D. Phinney (datos no publicados) observó recientemente que las células se diferencian en mioblastos y miotubos después del tratamiento con anfotericina B (1 \mug/ml) sola, y que se diferenciaban en mioblastos que se fusionaban para dar lugar a miotubos que latían rítmicamente.

La mayoría de los experimentos sobre la diferenciación de MSCs han sido llevados a cabo con cultivos de MSCs según fue descrito por Friedenstein (A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina, Exp. Hematol. 4: 276 (1976)). Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4,714.680, publicada el 22 de Diciembre de 1987, describe un método para recoger médula de donantes. Se proporcionan anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno específico del estadio o células de médula humana inmaduras. Estos anticuerpos son útiles en métodos para aislar una suspensión celular de sangre y médula humanas que puede ser empleada en trasplantes de médula ósea. Se proporcionan también suspensiones celulares que contienen células madre linfo-hematopoyéticas pluripotentes humanas, así como métodos terapéuticos que emplean las suspensiones celulares.

Varios grupos de investigadores han intentado desde 1990 preparar poblaciones más homogéneas. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.087.570, publicada el 11 de Febrero de 1992, describe cómo aislar composiciones de células madre hematopoyéticas de mamífero homogéneas. Las composiciones de células madre hematopoyéticas concentradas estaban sustancialmente libres de células hematopoyéticas diferenciadas o especializadas. Las células deseadas son obtenidas por sustracción de otras células que tenían marcadores particulares. La composición resultante puede ser utilizada para proporcionar linajes hematopoyéticos individuales o grupos de linajes hematopoyéticos, para reconstituir las células madre del huésped y para identificar ensayos para la determinación de una amplia variedad de factores de crecimiento hematopoyéticos.

La Patente de EE.UU. Nº 5.633.426, publicada el 27 de Mayo de 1997, es otro ejemplo de la diferenciación y producción de células hematopoyéticas. A ratones quiméricos inmunocomprometidos se les administra médula ósea humana de al menos 4 semanas desde el momento del implante. La médula ósea asumió la población normal de médula ósea excepto eritrocitos. Estos ratones con médula ósea humana pueden ser utilizados para estudiar el efecto de diferentes agentes sobre la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas humanas.

La Patente de EE.UU. Nº 5.665.557, publicada el 9 de Septiembre de 1997, se refiere a métodos para obtener células madre hematopoyéticas concentradas por separación de una fracción enriquecida de células que expresan el marcador CDw109. Se proporcionan también métodos para obtener composiciones enriquecidas en células progenitoras megacariocíticas hematopoyéticas. Son proporcionadas también por la invención composiciones enriquecidas en células madre y poblaciones de células obtenidas de las mismas. Se incluyen también métodos para utilizar las células.

La Patente de EE.UU. Nº 5.753.505, publicada el 5 de Junio de 1995, es otro método más de diferenciación. Tejido primordial es introducido en huéspedes inmunodeficientes en los que el tejido primordial se desarrolla y se diferencia. El huésped quimérico permite la investigación de los procesos y el desarrollo de tejido xenogénico, el análisis de los efectos de varios agentes sobre el crecimiento y la diferenciación del tejido, así como la identificación de agentes implicados en el crecimiento y en la diferenciación.

La Patente de EE.UU. Nº 5.753.505, publicada el 19 de Mayo de 1998, proporciona una composición celular aislada que contiene más de un 90% aproximadamente de células progenitoras neuronales de mamífero, no derivadas de un tumor, que expresan un marcador específico de neuronas y que pueden dan lugar a una progenie que puede diferenciarse en células neuronales. Se proporcionan también métodos para el tratamiento de enfermedades neuronales utilizando esta composición celular.

La Patente de EE.UU. Nº 5.759.793, publicada el 6 de Agosto de 1996, proporciona un método para la selección positiva y negativa de al menos una población de células de mamífero a partir de una mezcla de poblaciones celulares utilizando un lecho fluidificado estabilizado magnéticamente. Una aplicación de este método es la separación y la purificación de células hematopoyéticas. Las poblaciones de células diana incluyen células madre humanas.

La Patente de EE.UU. Nº 5.789.148, publicada el 4 de Agosto de 1998, describe un kit, una composición y un método para la separación celular. El kit incluye un recipiente que puede ser centrifugado y una suspensión para la separación celular basada en partículas de sílice organosilanizado adecuada para la separación en gradiente de densidad, que contiene una polilactama y que es esterilizada mediante tratamiento con radiación ionizante. La composición incluye una suspensión basada en partículas de sílice silanizado para la separación celular que contiene al menos un 0,05% de una polilactama, y es tratada preferiblemente con radiación ionizante. Se describe también un método para aislar células sanguíneas poco frecuentes de una mezcla de células sanguíneas.

En los últimos años, las MSCs han sido analizadas como vehículos para terapia celular y terapia génica. Las células son relativamente fáciles de aislar de pequeños aspirados de médula ósea que pueden ser obtenidos bajo anestesia local; son también relativamente fáciles de expandir en cultivo y de ser transfectadas con genes exógenos. Prockop, D.J., Sciencie 26: 71-74 (1997). Por tanto, las MSCs parecen tener varias ventajas sobre las células madre hematopoyéticas (HSCs) para su utilización en terapia génica. El aislamiento de un número adecuado de HSCs requiere grandes volúmenes de médula (1 litro o más) y las células son difíciles de expandir en cultivo. (Prockop, D.J. (ibid.)).

Existen varias fuentes para obtener el tejido de médula ósea, incluyendo la propia médula ósea del paciente, la de parientes de sangre o de otros con coincidencias de MHC, bancos de médula ósea y bancos de sangre de cordón umbilical. Hay varias patentes que incluyen esta fuente. La Patente de EE.UU. Nº 5.476.997, publicada el 17 de Mayo de 1994, describe un método para producir un equivalente de médula ósea humana. Se proporciona un sistema hematopoyético humano en un huésped mamífero inmunocomprometido, en el que el sistema hematopoyético es funcional durante extensos periodos de tiempo. En particular, tejido de hígado fetal humano y timo fetal humano son introducidos en un ratón joven inmunocomprometido en un lugar provisto de un sistema vascular, por lo que el tejido fetal tiene como resultado la formación de tejido de médula ósea humana funcional.

Una fuente de neuronas implantables que es la más controvertida desde el punto de vista ético, es la de tejido fetal humano. La Patente de EE.UU. Nº 5.690.927, publicada el 25 de Noviembre de 1997, utiliza también tejido fetal humano. Líneas celulares neuroderivadas de fetos humanos son implantadas en tejidos huésped. Los métodos permiten el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos y de otras enfermedades. Una línea celular preferida es SVG.

La Patente de EE.UU. Nº 5.753.491, publicada el 19 de Mayo de 1998, describe métodos para el tratamiento de un huésped mediante la implantación en el huésped de células no relacionadas genéticamente. Más particularmente, la presente invención proporciona líneas celulares neuroderivadas de fetos humanos y métodos para el tratamiento de un huésped mediante la implantación en el huésped de estas células neuroderivadas de fetos humanos inmortalizadas. Una fuente es el ratón, que se incluye en la Patente de EE.UU. Nº 5.580.777, publicada el 3 de Diciembre de 1996. Esta patente describe un método para la producción in vitro de líneas de células precursoras neurales inmortalizadas, incluyendo líneas celulares que tienen características de células neuronales y/o gliales, y comprende la etapa de infectar células del neuroepitelio o de la cresta neural con un vector retrovírico portador de un miembro de la familia de oncogenes myc.

La Patente de EE.UU. Nº 5.753.506, publicada el 19 de Mayo de 1998, revela un procedimiento in vitro mediante el cual una población homogénea de células precursoras multipotentes procedentes de neuroepitelio embrionario de mamífero (células madre del SNC) fue expandida en cultivo hasta 10^{9} veces mientras mantenía su capacidad multipotente para diferenciarse en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos. Se presentan las condiciones químicas para la expansión de un gran número de neuronas a partir de las células madre. Además, se han identificado cuatro factores -PDGF, CNTF, LIF y T3- que, individualmente, generan proporciones significativamente mayores de neuronas, astrocitos u oligodendrocitos. Estos procedimientos están destinados a permitir la preparación a gran escala de células madre del SNC, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos de mamífero. Estas células han sido propuestas como una herramienta importante para muchas terapias de enfermedades neurológicas basadas en células y genes.

Otra fuente de células madre es la de células madre embrionarias de primates. La Patente de EE.UU. Nº 5.843.780, publicada el 1 de Diciembre de 1998, utiliza estas células madre. Se describe una preparación purificada de células madre. Esta preparación está caracterizada por los marcadores de superficie celular siguientes: SSEA-1 (-); SSEA-3 (+); TRA-1-60 (+); TRA-1-81 (+); y fosfatasa alcalina (+). En una realización, las células de la preparación tienen cariotipos normales y continúan proliferando en un estado indiferenciado después del cultivo continuo durante once meses. Las líneas de células madre embrionarias son descritas también como conservadoras de la capacidad para formar trofoblastos y para diferenciarse en tejidos derivados de las tres capas germinales embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo). Se describe también en la patente un método para aislar una línea de células madre embrionarias de primate.

En resumen, existe una evidencia sustancial en modelos animales y en pacientes humanos de que el trasplante neural es un procedimiento científicamente factible y clínicamente prometedor para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y del derrame cerebral así como para la reparación de lesiones traumáticas del cerebro y de la médula espinal. No obstante, se necesitan fuentes celulares alternativas y nuevas estrategias para la diferenciación con el fin de solventar las numerosas restricciones éticas y técnicas que limitan actualmente el uso generalizado del trasplante neural.

Resumen de la descripción

Esta invención proporciona una fuente de tejido neuronal que puede ser utilizada para la realización de injertos en el propio cerebro o en la propia médula espinal de un paciente (autoinjerto). Esta invención evita de este modo el asunto siempre delicado de la utilización de tejido fetal agrupado y obvia también la necesidad de inmunosupresión. Esta invención será también utilizada para aloinjertos (trasplante de células neuronales derivadas de médula ósea de un individuo a otro) y para xenoinjertos (trasplante de células neuronales derivadas de médula ósea de una especie a otra). Explicado de manera sencilla, células de médula ósea pueden ser inducidas in vitro e in vivo para que se conviertan en neuronas. Ni el concepto ni la técnica han sido previamente descritos o llevados a cabo.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para producir células con fenotipo neuronal a partir de células de médula ósea, comprendiendo dicho método las etapas de

a) provisión de células de médula ósea;

b) selección de una pluralidad de células estromales de médula ósea a partir de la médula ósea;

c) incubación de las células estromales en un medio de crecimiento con un mitógeno seleccionado de entre EGF, PDGF o una combinación de los mismos; y

d) incubación de las células de la etapa (c) en un medio de crecimiento neuronal que incluya al menos un ácido retinoico y al menos un agente diferenciador seleccionado de entre BDNF, GDNF o NGF, produciendo de este modo células con fenotipo neuronal.

En una realización, se describen células neuronales derivadas de médula ósea, no fetales, no tumorigénicas, adecuadas para ser injertadas en cerebro o médula espinal de mamífero.

Por tanto, se describe un método para la obtención de células similares a neuronas a partir de médula ósea, comprendiendo dicho método las etapas de a) obtención de células de médula ósea; b) selección de células estromales de médula ósea y c) incubación de las células estromales con un agente diferenciador durante un tiempo suficiente para cambiar el fenotipo de las células a un fenotipo neuronal. El método puede incluir una etapa adicional de separación y eliminación de las células madre hematopoyéticas. El método para seleccionar las células estromales de médula ósea puede incluir la colocación de las células de médula ósea y de un medio de cultivo adecuado en un recipiente de plástico de medio de cultivo, permitiendo que las células estromales de médula ósea se adhieran al plástico, y la eliminación de las demás células por sustitución del medio. El método proporciona también la utilización de ácido retinoico, factores de crecimiento, células neuronales fetales o una combinación de los mismos como agente diferenciador. Los factores de crecimiento incluyen BDNF, GDNF y NGF. El ácido retinoico es ácido retinoico 9-cis, ácido retinoico todo trans o una combinación de los mismos.

Un método para la obtención de neuronas para autotrasplante a partir de la propia médula ósea de un individuo, incluye las etapas de a) recogida de la médula ósea; b) selección de células estromales de la médula ósea; c) incubación de las células estromales de médula ósea en un medio que incluya un mitógeno hasta que haya células suficientes para el trasplante; d) incubación de las células estromales de la etapa c) con un agente diferenciador durante un tiempo suficiente para cambiar el fenotipo de las células a un fenotipo neuronal y/o glial. El mitógeno es EGF, PDGF o una combinación de los mismos. El método puede incluir una etapa adicional de separación y eliminación de las células madre hematopoyéticas. El método para seleccionar las células estromales de médula ósea puede incluir la colocación de las células de médula ósea y de un medio de cultivo adecuado en un recipiente de plástico de medio de cultivo, permitiendo que las células estromales de médula ósea se adhieran al plástico, y la eliminación de las demás células por sustitución del medio. El agente diferenciador es seleccionado de entre ácido retinoico, factores de crecimiento, células neuronales fetales o una combinación de los mismos. Los factores de crecimiento son BDNF, GDNF y NGF, o una combinación de los mismos. El ácido retinoico es ácido retinoico 9-cis, ácido retinoico todo trans o una combinación de los mismos.

Se describe también una línea celular de células estromales de médula ósea desarrollada por uno de los métodos anteriores, de tal manera que las células tienen la capacidad de migrar y situarse en regiones neuroanatómicas específicas en las que se diferencian en células neuronales típicas de la región y se integran en los patrones arquitectónicos característicos.

Se describe también un kit para el trasplante de células neuronales con una jeringa adecuada para la obtención de médula ósea, un matraz de plástico con medio de cultivo deshidratado y células madre de médula ósea.

Se describe también un método para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que incluye la administración de una cantidad suficiente de las células producidas por uno de los métodos anteriores a un individuo con dicha enfermedad neurodegenerativa. Las enfermedades neurodegenerativas específicas incluyen la Enfermedad de Parkinson, la Enfermedad de Alzheimer, isquemia, lesiones de la médula espinal, ataxia y alcoholismo.

Otra realización es un método de selección de sustancias por sus efectos sobre células neuronales humanas. El método requiere la provisión de un mamífero con células neuronales humanas implantadas, habiendo migrado dichas células hacia al menos una posición específica en el cerebro del mamífero; la administración de la sustancia al mamífero y la observación del mamífero para encontrar un efecto de la sustancia.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico de barras. BMSC adherentes a las placas de cultivo fueron tratadas con EGF (10 ng/ml), AR (0,5 \muM) o AR más BDGF (10 ng/ml) durante 7 días. Cada barra representa el número de la media (\pm ESM) de células inmunorreactivas para fibronectina por campo visual (objetivo 20X) determinado en 20 campos por placa en 4 placas de cultivo. * = p<0,05, test t de dos colas.

Las Figuras 2A a 2F muestran BMSC de ratones lacZ que habían sido cocultivadas con células de cerebro medio fetal de ratón durante 2 semanas en medio N5 suplementado con ácido retinoico 9-cis (0,5 \muM) y BDNF (10 ng/ml).

Las Figuras 3A a 3F ilustran la migración y la integración de BMSC en cerebro medio de rata. La Figura 3A (barra de escala = 500 \mum) muestra la distribución simétrica a pesar del injerto unilateral en el estriado. La Figura 3B es una región del núcleo paraventricular (barra de escala = 100 \mum). Ninguna de las células \beta-gal+ están marcadas con TH-ir. Las Figuras 3A (barra de escala = 500 \mum), 3B (barra de escala = 100 \mum) y 3C (barra de escala = 50 \mum) representan células con \beta-gal y TH-ir. Las Figuras 3D (barra de escala = 50 \mum) y 3E (barra de escala = 25 \mum) ilustran secciones del núcleo rojo que han sido teñidas doblemente para \beta-gal y NeuN-ir. La Figura 3F (barra de escala = 25 \mum) ilustra células \beta-gal+ del núcleo rojo también doblemente teñidas para MAP2-ir.

Las Figuras 4A a 4F muestran lóbulo cerebelar de rata y la distribución laminar de células \beta-gal+ en una distribución de células de Purkinje. Las células \beta-gal+ estaban comarcadas con inmunorreactividad de calbindina en las Figuras 4A, 4B y 4C. (Barra de escala = 100 \mum en 4A, 50 \mum en 4B y 25 \mum en 4C). La Figura 4D muestra células de Purkinje \beta-gal+ comarcadas con GAD-ir (barra de escala = 50 \mum). La Figura 4E ilustra fibras MADP2-ir densas que envuelven a las células de Purkinje \beta-gal+ (barra de escala = 25 \mum). La Figura 4F ilustra células \beta-gal+ comarcadas con NeuN-ir en el núcleo cerebelar profundo (barra de escala = 25 \mum).

Las Figuras 5A a 5D muestran los marcadores de fibronectina (Figura 5A) y BMSC diferenciadas con marcadores de células nerviosas (Figuras 5B, 5C y 5D).

La Figura 6 es una Transferencia Western de los lisados de BMSC condicionadas con cuatro tratamientos diferentes y marcadas con GFAP-ir, nestina y NeuN. BDNF + AR + N5 inducían la expresión más potente de los marcadores de células nerviosas, mientras que los marcadores de células gliales se expresaban muy potentemente después de N5 solo.

Las Figuras 7A a 7F muestran BMSC humanas que habían sido cocultivadas con células estriatales fetales de rata en una formulación de N5 con BDNF + AR. Estas figuras muestran que BMSC humanas (blancas en las Figuras 7C y 7D y grises en las Figuras 7E y 7F) pueden ser inducidas para que expresen los marcadores neurales NeuN (Figuras 7A y 7E) y GFAP (Figuras 7B y 7F).

La Figura 8 muestra cerebro de rata en el que BMSC de ratón marcadas con PKH26 gris expresan también el marcador neuronal NeuN-ir (blancas). Además, la morfología de las células doblemente marcadas es la de neuronas.

La Figura 9 muestra cerebro de rata con una célula glial doblemente marcada. El trazador gris la identifica como derivada de una BMSC, y el sombreado blanco de la célula es debido a GFAP-ir. Observar que la morfología es la de una célula glial.

Descripción de las realización preferida

La antigua máxima de la medicina china "el cerebro es un mar de médula" (W.R. Morse, Chinese Medicine, Paul Hoeber, Inc., New York, 1938) resuena con los recientes hallazgos de investigación concernientes a la capacidad de una población de células de médula ósea para diferenciarse en neuronas bajo condiciones experimentales.

En la medicina occidental, la existencia de células madre no hematopoyéticas en la médula ósea fue sugerida hace más de 100 años, pero el aislamiento y la diferenciación de células estromales de médula en osteoblastos, condroblastos, adipocitos y mioblastos han sido demostrados recientemente. D.J. Prockop, Science 26: 71-74 (1997). En la literatura médica, los precursores no hematopoyéticos del estroma de médula ósea han sido referidos como fibroblastos unidad formadores de colonias, células madre mesenquimáticas o células estromales de médula ósea (BMSC). Aunque puede esperarse naturalmente que las BMSC sean una fuente de tejido circundante de hueso, cartílago y grasa, varios informes recientes demuestran que estas células, bajo condiciones experimentales específicas, pueden migrar y diferenciarse en células musculares o gliales. La infusión sistémica de BMSC a ratones de 3 semanas de edad irradiados ha tenido como resultado la aparición de la progenie de las células del donante en una variedad de tejidos no hematopoyéticos, incluyendo el cerebro. R.F. Pereira y col., Proc. Natl. Acad. Med. (U.S.A.) 95: 1142-1147 (1998). Se ha descrito que el trasplante de células de médula ósea marcadas genéticamente en ratones inmunodeficientes tuvo como resultado la migración de células de médula a una región de degeneración muscular inducida químicamente. G. Ferrari y col., Science 279: 1528-1530 (1998). Estas células derivadas de médula experimentaron una diferenciación miogénica y participaron en la regeneración de las fibras musculares dañadas. Además, la infusión de BMSC humanas en estriado de rata tuvo como resultado el prendimiento, la migración y la supervivencia de las células. S.A. Azizi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95: 3908-3913 (1998). Después del prendimiento, estas células perdieron los marcadores típicos de las BMSC, tales como la inmunorreactividad con anticuerpos frente a colágeno y fibronectina. Las BMSC desarrollaron muchas de las características de los astrocitos, y su prendimiento y migración contrastaban notablemente con los fibroblastos que continuaban produciendo colágeno y experimentaban gliosis después del implante. Después del trasplante de médula ósea en ratas irradiadas letalmente, se encontró que las células derivadas de médula ósea sustituían a entre el 60% y el 80% de los macrófagos del huésped en los ganglios sensoriales y autónomos así como en los nervios periféricos. K. Vass, W.F. Hickey, R.E. Schmidt, H. Lassman, Laboratory Investigation 69: 275-282 (1993). En ese estudio, no se hizo ningún intento para determinar si las células de médula se diferenciaban en células gliales o en células neuronales.

Nuestro laboratorio ha conseguido con éxito recientemente la diferenciación de BMSC en células con un fenotipo similar a neuronas, utilizando una combinación de ácido retinoico, factores de crecimiento y entornos neuronales fetales. Además, hemos injertado BMSC en estriado de rata desnervado y hemos encontrado que las BMSC migran hacia regiones neuroanatómicas específicas en las cuales se diferencian en células que expresan marcadores de las células vecinas. En esas regiones, las células se integran en los patrones arquitectónicos característicos.

Definiciones

"Células neuronales" son aquéllas que tienen al menos un indicio de fenotipo neuronal, tal como la tinción de uno o más marcadores neuronales. Ejemplos de marcadores neuronales incluyen, pero no se limitan a, proteína nuclear específica de la neurona, hidroxilasa de tirosina, proteína asociada a microtúbulos y calbindina.

"No tumorigénicas" se refiere al hecho de que las células no dan lugar a un neoplasma ni a un tumor.

Según se utiliza en la presente, "no fetal" se refiere al hecho de que la fuente ha nacido. No excluye sangre del cordón umbilical.

La selección de células estromales de médula ósea puede ser realizada de varias formas. Clásicamente, las células estromales son disgregadas y cultivadas en un recipiente de plástico. Las células estromales son separadas por su supervivencia en un medio específico y por su adherencia al plástico.

Las células de médula ósea pueden ser inducidas para que adopten varios fenotipos neuronales diferentes, según se demuestra más adelante por observaciones in vitro e in vivo. Pueden adaptarse técnicas adicionales de diferenciación in vitro mediante la utilización de diferentes factores de crecimiento celular y de técnicas de cocultivo conocidas en el oficio. Además del cocultivo con células mesencefálicas o estriatales fetales (según se demuestra con éxito más adelante), puede utilizarse una variedad de otras células incluyendo, pero sin limitarse a, células accesorias, células de Sertoli y células procedentes de otras porciones del sistema nervioso central fetal y maduro.

Métodos Generales

Se siguen de manera general las técnicas estándar de biología molecular conocidas en el oficio y no descritas específicamente tal como en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992) y en Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo generalmente según PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, California (1990). Las reacciones y manipulaciones que implican otras técnicas de ácidos nucleicos, a no ser que se indique de otro modo, son realizadas según está descrito de manera general en Sambrook y col., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press y en la metodología presentada en las Patentes de Estados Unidos N^{os} 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057. Puede utilizarse PCR in situ en combinación con Citometría de Flujo para la detección de células que contengan secuencias específicas de ADN y ARNm (Testoni y col., Blood 87: 3822 (1996)).

Se siguen de manera general los métodos estándar de inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente según Stites y col. (eds.), BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8ª Ed., Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); y Mishell y Shigi (eds.), SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, W.H. Freeman y Co., New York (1980).

Inmunoensayos

En general se emplean inmunoensayos para determinar un espécimen tal como marcadores de la superficie celular o similares. Los ensayos inmunocitoquímicos son bien conocidos por los expertos en la técnica. En los ensayos pueden utilizarse anticuerpos policlonales y monoclonales. Cuando sea apropiado pueden utilizarse otros inmunoensayos tales como ensayos sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISAs) y radioinmunoensayos (RIAs), según son conocidos por los expertos en la técnica. Los inmunoensayos disponibles están descritos extensamente en la literatura de patentes y en la literatura científica. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876;
4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521, así como Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Producción de Anticuerpos

Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o recombinantes. Oportunamente, los anticuerpos pueden ser preparados contra el inmunógeno o contra una porción del mismo, por ejemplo contra un péptido sintético basado en la secuencia, o pueden ser preparados complementariamente mediante técnicas de clonare, o bien el producto fénico natural y/o porciones del mismo pueden ser aislados y utilizados como inmunógeno.

Los alucinógenos pueden ser utilizados para producir anticuerpos mediante la tecnología estándar de producción de anticuerpos bien conocida por los expertos en la técnica, según está descrita de manera general en Marlotes y Lance, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988) y Arrebatador, ANTIBODY ENGINEERING - A PRACTICAL GUIDE, W.H. Freeman and Co. (1992). Pueden prepararse también fragmentos de anticuerpo a partir de los anticuerpos, e incluyen Fa y F(aba')_{2}, por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Para la producción de anticuerpos policlonales, un huésped, tal como un conejo o una cabra, es inmunizado con el inmunógeno o con el fragmento del inmunógeno, generalmente con un adyuvante y, si es necesario, acoplado a un transportador; los anticuerpos hacia el inmunógeno son recogidos del suero. Además, el anticuerpo policlínica puede ser absorbido de tal manera que sea mono específico. Esto es, el suero puede ser expuesto a alucinógenos relacionados de tal manera que los anticuerpos reactivos de manera cruzada son eliminados del suero, convirtiéndolo en mono específico.

Para la producción de anticuerpos monoclonales, un donante apropiado es hiperinmunizado con el inmunógeno, generalmente un ratón, y se aíslan las células esplénicas productoras de anticuerpos. Estas células son fusionadas con células inmortales, tales como células de mieloma, para proporcionar una célula híbrida fusionada que es inmortal y secreta el anticuerpo requerido. Las células son cultivadas posteriormente y los anticuerpos monoclonales recogidos del medio de cultivo.

Para la producción de anticuerpos recombinantes, ARN mensajero procedente de linfocitos B productores de anticuerpos de animales o de hibridomas es transcrito de manera inversa con el fin de obtener ADNs complementarios (ADNcs). El ADNc del anticuerpo, que puede ser de longitud completa o de longitud parcial, es amplificado y clonado en un fago o en un plásmido. El ADNc puede ser una longitud parcial de ADNc de las cadenas pesada y ligera, separada o conectada por un adaptador. El anticuerpo, o el fragmento del anticuerpo, es expresado utilizando un sistema de expresión adecuado. Puede obtenerse también ADNc de anticuerpos mediante la selección de bibliotecas de expresión pertinentes.

El anticuerpo puede ser unido a un sustrato soporte sólido o conjugado a un resto detectable, o bien puede ser unido y conjugado, como es bien conocido en la técnica. (Para una discusión general de la conjugación de restos fluorescentes o enzimáticos, ver Johnstone y Thorpe, IMMUNOCYTOCHEMISTRY IN PRACTICE , Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982). La unión de anticuerpos a un sustrato soporte sólido es también bien conocida en la técnica (ver, para una discusión general, Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, NY, 1988 y Borrebaeck, ANTIBODY ENGINEERING - A PRACTICAL GUIDE, W.H. Freeman and Co., 1992). Los restos detectables contemplados en la presente invención, pueden incluir, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos y radiactivos. Ejemplos incluyen biotina, oro, ferritina, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, peroxidasa, ureasa, fluoresceína, rodamina, tritio, ^{14}C, yodación y proteína fluorescente verde.

Terapia Génica

Terapia génica, según se utiliza en la presente, se refiere a la transferencia de un material fénico de interés (por ejemplo, ADN o ARN) a un huésped con el fin de tratar o prevenir una enfermedad o una condición genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido, ARN funcional, antisentido) cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés codifica una hormona, un receptor, un enzima, un polipéptido o un péptido con valor terapéutico. Alternativamente, el material genético de interés codifica un gen suicida. Para una revisión, ver "Gene Therapy" en ADVANCES IN PHARMACOLOGY 40, Academic Press, San Diego, California, 1997.

Administración de Células

Las células de la presente invención son administradas y dosificadas de acuerdo con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica del paciente individual, el lugar y el método de administración, el programa de administración, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente y otros factores conocidos por los profesionales médicos. La "cantidad farmacéuticamente eficaz" para los fines de la presente es determinada por tanto mediante tales consideraciones, según es conocido en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para conseguir una mejora, incluyendo, pero sin limitarse a, una tasa de supervivencia mejorada o una recuperación más rápida, o bien la mejora o la eliminación de los síntomas y otros indicadores seleccionados como medidas apropiadas por los expertos en la técnica.

En el método de la presente invención, las células de la presente invención pueden ser administradas de varias formas, según sea apropiado para su implante en el sistema nervioso central, incluyendo, pero sin limitarse a, administración parenteral, administración intratecal, administración intraventricular y administración intranigral.

Ejemplos

Ejemplo 1

Diferenciación In Vitro

La médula ósea fue obtenida de fémures de ratón o de aspirados de médula ósea humana. La médula ósea humana fue diluida 1:1 con Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) (GIBCO/BRL) y un 10% de suero bovino fetal (FBS) y centrifugada a través de un gradiente de densidad (Ficoll-Paque Plus, 1,077 g/ml, Pharmacia) durante 30 minutos a 1.000 g. El sobrenadante y la interfase fueron combinados, diluidos hasta aproximadamente 20 ml con MEM con un 10% de suero de ternera fetal (FCS) y sembrados en matraces de plástico revestidos con polietilenimina. La médula ósea de ratón fue colocada en 10 ml de PBS y un 5% de albúmina bovina. Las células fueron lavadas en este medio y centrifugadas a 2000 rpm durante 5 minutos. Las células fueron resuspendidas en medio de crecimiento que constaba de DMEM suplementado con glutamina 2 mM, un 0,001% de \beta-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y un 10% de suero de caballo. Las células fueron incubadas en los matraces durante 2 días, después de lo cual las células no adherentes fueron eliminadas por sustitución del medio. Una vez que los cultivos alcanzaron la confluencia, las células fueron levantadas mediante la aplicación de tripsina (0,25%) y EDTA 1 mM e incubación a 37ºC durante 3-4 minutos. Algunas de las células fueron congeladas para un uso posterior. Con el fin de expandir la población celular, otras células fueron resembradas después de una dilución 1:2 ó 1:3 con la adición de un mitógeno tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) a una concentración de 10 ng/ml o el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a una concentración de 5 ng/ml. Este procedimiento se repitió durante 3-5 pases.

La diferenciación de las células BMSC en células similares a neuronas era la etapa siguiente. Las células que habían sido extraídas del fondo del matraz de plástico según se describió anteriormente fueron resembradas en placas de cultivo de 35 mm en presencia de un medio de crecimiento neuronal (N5) (Kaufman y Barrett, Science 220: 1394, 1983), suplementado con BSA 5%, FBS 1%, transferrina (100 g/ml), putrescina (60 \muM), insulina (25 g/ml), progesterona (0,02 \muM), selenio (0,03 \muM), ácido retinoico 9-cis o ácido retinoico todo trans (0,5 \muM) y alguno de varios factores de crecimiento neuronal a una concentración de 1-10 ng/ml. Los factores de crecimiento analizados fueron el factor de crecimiento derivado de cerebro (BDNF), el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y el factor de crecimiento nervioso (NGF). Después de 7-14 días, una pequeña proporción de BMSC cambió su morfología y expresó proteínas tales como nestina (un marcador de células destinadas a ser células neurales), antígeno nuclear específico de neuronas (NeuN), hidroxilasa de tirosina (TH) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Hasta un 4% de las células desarrollaron una morfología de células similares a neuronas o de células gliales cuando se visualizaron inmunohistoquímicamente. Estas células no se habían diferenciado a "células dendríticas", según se puso en evidencia por la falta de tinción para CD40.

Características de Tinción de las Células Derivadas de BMSC

	NeuN	GFAP	TH	CD40
BDNF	+++	+	++	-
GDNF	++	+	+	-
NGF	+	+	+	-

Ejemplo 2

Las células de médula ósea fueron inducidas in vitro para que se convirtieran en células similares a neuronas empleando métodos similares a los utilizados para estimular la diferenciación de células madre embrionarias (ES). J. Dinsmore y col., Cell Transplantation 5: 131-143 (1996). La médula ósea fue obtenida de ratones adultos y dividida en dos fracciones utilizando separación magnética de células. En primer lugar, se recogieron células de médula ósea de fémures y tibias de ratón mediante lavado abundante de la caña del hueso con tampón (PBS suplementado con un 0,5% de BSA, pH 7,2) utilizando una jeringa con una aguja de #26G. Las células fueron disgregadas mediante pipeteo suave varias veces. Las células fueron pasadas a través de una malla de nailon de 30 \mum para eliminar los grumos restantes de tejido. Las células fueron lavadas mediante la adición de tampón, centrifugación durante 10 minutos a 200Xg y eliminación del sobrenadante. La pella celular fue resuspendida en 800 \mul de tampón por cada 10^{8} células. Con un kit de separación magnética de células (Milteny Biotec, Inc., Auburn TX), las células de médula ósea hematopoyéticas fueron marcadas con microesferas Sca1+. Las células de médula ósea marcadas fueron colocadas en una columna MS+ para la selección positiva de las células Sca1+.

Específicamente, 200 \mul de microesferas Sca1 Multi-Sort fueron añadidos por 10^{8} células totales, mezclados e incubados durante 15 minutos a 6-12ºC. Una fracción fue enriquecida con células portadoras del marcador para el antígeno de células madre hematopoyéticas de ratón (Sca1) y la segunda fracción estaba compuesta por todas las demás células de la médula (incluyendo la fracción BMSC). Las células fueron lavadas mediante la adición de 5-10X el volumen de marcaje de tampón y centrifugadas durante 10 minutos a 200Xg, y se retiró el sobrenadante. La pella celular fue resuspendida en 500 \mul de tampón. La columna MS+/RS+ fue lavada con 500 \mul de tampón. La suspensión celular fue aplicada a la columna y las células negativas pasaron a través de la misma. La columna fue lavada posteriormente con 500 \mul de tampón tres veces. La columna fue retirada del separador (que contenía el imán) y colocada sobre un tubo de recogida adecuado. Se pipeteó 1 ml de tampón sobre la columna y la fracción positiva fue extraída mediante lavado con el émbolo proporcionado con la columna. Las células marcadas para Sca1 fueron colocadas en 10 ml de PBS y BSA 5%. Las células fueron lavadas en este medio y centrifugadas (2000 rpm durante 5 minutos). Las células fueron resuspendidas en medio de crecimiento que constaba de DMEM suplementado con glutamina 2 mM, un 0,001% de \beta-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y un 10% de suero de caballo. Las células fueron incubadas en matraces de polietileno durante 2 días, y las células no adherentes fueron eliminadas por sustitución del medio. Una vez que los cultivos alcanzaron la confluencia, las células fueron despegadas por incubación con tripsina (0,25%) y EDTA 1 mM a 37ºC durante 3-4 minutos. Posteriormente fueron congeladas para su uso posterior o bien resembradas después de una dilución 1:2 ó 1:3 con la adición del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), 10 ng/ml. La población de células que se adhería fuertemente al fondo de los matraces de cultivo tenía principalmente el aspecto de fibroblastos. La mayoría de estas células se teñían con anticuerpos hacia fibronectina. Estas células habían sido referidas como células madre mesenquimáticas, debido a su aspecto mesenquimático o fibroblástico, o bien como células estromales de médula ósea (BMSC) ya que parecían proceder de la compleja matriz de estructuras de soporte encontradas en la médula. D.J. Prockop, Sciencie 26: 71-74 (1997).

Los hallazgos preliminares de nuestro laboratorio no pudieron encontrar pruebas de la existencia de células dendríticas en las BMSC cultivadas con ácido retinoico (AR) y un factor de crecimiento (BDNF, GDNF o NGF) (Ejemplo 1). Además, el número de células inmunorreactivas para fibronectina disminuía como función del tratamiento con AR y el factor de crecimiento, demostrando que el ácido retinoico y el factor de crecimiento inducían la diferenciación de BMSC en un fenotipo lejano al fibroblástico (ver la Figura 1).

Con el fin de determinar si el entorno celular tenía influencia sobre la diferenciación de estas células, BMSC fueron cocultivadas con células mesencefálicas fetales. Las BMSC fueron obtenidas de ratones transgénicos lacZ (Jackson Labs.) que expresan \beta-galactosidasa (\beta-gal) en células de médula ósea. Las BMSC de lacZ fueron sembradas en igual proporción con células mesencefálicas fetales preparadas según estaba previamente descrito (J.R. Sanchez-Ramos, P. Michel, W.J. Weiner, F. Hefti, Journal of Neurochemistry 50: 1934-1944 (1988)) a partir de ratones de otra cepa (C57 bl6; Jackson Labs.) en medio de cultivo que contenía ácido retinoico 9-cis (0,5 \muM) y BDNF (10 ng/ml). Después de 2 semanas, los cultivos fueron fijados y procesados para histoquímica de \beta-gal e inmunocitoquímica para determinar marcadores neuronales. Las BMSC \beta-gal+ de lacZ fueron claramente identificadas por un producto de reacción azul visualizado bajo microscopía de campo brillante (células marcadas de oscuro en las Figuras 2A, 2C y 2E) y las neuronas fueron identificadas por la inmunorreactividad de la proteína nuclear específica de neuronas (NeuN-ir) utilizando un anticuerpo secundario unido a fluoresceína. Las Figuras 2B, 2D y 2F son las imágenes de NeuN-ir correspondientes de 2A, 2C y 2E, respectivamente (células marcadas de blanco). En la Figura 2A, las células numeradas 1, 2 y 3 son células \beta-gal+ y están comarcadas con NeuN-ir, según se muestra en la Figura 2B. Muchas células con forma de huso con procesos similares a neuronas presentaban tinción de \beta-gal y NeuN-ir, pero las neuronas procedentes de las células mesencefálicas fetales eran distinguibles ya que eran más grandes y no eran \beta-gal+. Por ejemplo, en la Figura 2E, la célula encima del número 1 no muestra tinción de \beta-gal pero muestra NeuN-ir en la Figura 2F, y por tanto es una neurona mesencefálica fetal. En contraste, en la Figura 2E las células numeradas de 2 a 6 eran células derivadas de BMSC \beta-gal+ que presentaban NeuN-ir (Figura 2F) y por tanto se habían convertido en células similares a neuronas. Estos resultados indicaban que el entorno neuronal, además de los factores de diferenciación/crecimiento apropiados, inducía la transformación de la mayoría de BMSC en un fenotipo neuronal.

Ejemplo 3

Diferenciación In Vivo

Con el fin de determinar si la diferenciación de las células BMSC en neuronas tendría lugar in vivo, BMSC procedentes de ratones lacZ fueron injertadas en estriado de rata desnervado o normal. Antes del injerto, las BMSC fueron tratadas durante 2 días con ácido retinoico 9-cis (0,5 \muM) y BDNF (10 ng/ml). Tres semanas antes del injerto, el lugar del injerto del caudado/putamen de las ratas fue tratado con inyecciones intranigrales unilaterales de 6-hidroxidopamina (6-OH DA). Se realizó una única inyección de 6-OH DA (Sigma; 2,5 \mul, 3,6 \mug/\mul para una dosis total de 9 \mug en ácido ascórbico 0,2%) en el sistema dopaminérgico mesoestriatal ascendente derecho (4,4 mm posteriores al bregma, -1,2 mm lateralmente y -7,8 mm ventrales a la dura, con la barra de cremallera fijada a -2,4 mm). La 6-OH DA fue administrada a una velocidad de 1 \mul/minuto. Las jeringas fueron mantenidas en su lugar durante 5 minutos adicionales antes de retirarlas lentamente.

Alícuotas de una suspensión de BMSC fueron depositadas en el estriado a lo largo del tracto de una sola aguja en el mismo lugar de la lesión nigral con 6-OH DA en 6 animales. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico y colocadas en un marco estereotáxico. Alícuotas de la suspensión celular fueron depositadas en dos lugares separados del estriado a lo largo del tracto de una sola aguja. Las coordenadas de las inyecciones fueron 1,2 mm anteriores al bregma, +2,7 mm lateralmente y -5,2 mm y -4,7 mm ventrales a la dura, con la barra de cremallera fijada en cero. Cada inyección de 2 \mul fue administrada a una velocidad de 1 \mul/minuto. El número de células madre inyectadas en el estriado fue de 20.000 células/\mul en un total de 80.000 células. En dos ratas, se realizó una segunda inyección de células en el estriado en el lado no lesionado, teniendo como resultado un total de 160.000 células por rata.

Uno, dos y tres meses después del injerto, se sacrificaron pares de animales, se perfundieron con solución salina heparinizada y paraformaldehído tamponado con fosfato. Se cortaron con el criostato secciones seriadas de 30 \mum de espesor a lo largo de la longitud completa del cerebro. Las secciones fueron teñidas primeramente para determinar la actividad \beta-gal seguido por el procesamiento inmunohistoquímico con anticuerpos hacia la proteína nuclear específica de neuronas (NeuN), varios agentes bloqueantes para disminuir el inmunomarcaje no específico y un segundo anticuerpo acoplado a peroxidasa y un cromógeno marrón rojizo (Histomouse Kit, Zymed). Otros marcadores neuronales determinados inmunohistoquímicamente incluían hidroxilasa de tirosina (TH), glutamato descarboxilasa (GAD), calbindina y proteína asociada a microtúbulos (MAP2).

Los animales se comportaban y se movían normalmente hasta el momento del sacrificio. Como este experimento estaba diseñado específicamente para determinar si los injertos sobrevivían y se diferenciaban, los animales no fueron desafiados con apomorfina o con anfetamina para determinar si la lesión por 6-OH DA y el injerto posterior habían alterado el comportamiento rotatorio. El examen de secciones tisulares de cerebro reveló células \beta-gal+ derivadas de BMSC en múltiples regiones del cerebro distantes del lugar de implantación en el cuerpo estriado. Se encontró una acumulación ordenada de células \beta-gal+ en las regiones específicas del cerebro siguientes: zona de células mitrales del bulbo olfativo, núcleos paraventricular y supraóptico del hipotálamo, hipocampo, habénula, núcleo óculomotor, núcleo rojo, S. nigra, abducens, núcleos de los nervios craneales facial e hipogloso, oliva inferior de la médula, asta ventral de la médula espinal y la capa de células de Purkinje cerebelares. La distribución de células \beta-gal+ era bilateral y casi simétrica en todas las regiones excepto en la S. nigra, en la cual el lado no lesionado presentaba un mayor número de células \beta-gal+ (Figura 3A, las células negras, y la Tabla I). Las células BMSC \beta-gal+ estaban distribuidas en el cerebelo con un patrón laminar idéntico al de las células de Purkinje (Figura 4A, 4B, 4C). Se observó una distribución laminar similar, aunque menos densa, de células BMSC en la capa de células mitrales del bulbo olfativo. La corteza cerebral y el cuerpo estriado, incluso en el lugar del injerto, no acumulaban un número significativo de células \beta-gal+, aunque estas células se observaban comúnmente en los canales capilares de esas regiones.

Las células BMSC \beta-gal+ asumían múltiples fenotipos, incluyendo células cuboidales semejantes a epiteliales en el plexo coroideo, pequeñas células similares a células oligodendrogliales en el quiasma óptico y en la sustancia blanca subcortical, células grandes similares a neuronas en el núcleo rojo, en la S. nigra y en los núcleos motores del tronco cerebral.

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TABLA I Recuentos Celulares en Regiones del Cerebro Medio

1 Mes Después del Injerto de BMSC (media de los recuentos de 2 ratas)
Regiones del Cerebro Medio	Células Totales comarcadas	Células \beta-gal	% de células \beta-gal
	con NeuN-ir y \beta-gal	totales en la región	marcadas con NeuN-ir
Núcleo rojo (D)	3502	3938	88,9
Núcleo rojo (I)	3405	4410	77,2
Núcleo del III^{er} n. (D)	575	696	82,6
Núcleo del III^{er} n. (I)	494	769	64,2
S. nigra (D)	1534	1907	80,4
S. nigra (I)	2326	3347	69,5

TABLA I (continuación)

3 Meses Después del Injerto (media de los recuentos de 2 ratas)
Núcleo rojo (D)	4658	6092	76,4
Núcleo rojo (I)	4535	6171	73,5
Núcleo del III^{er} n. (D)	554	944	58,6
Núcleo del III^{er} n. (I)	686	1056	64,9
S. nigra (D)**	0	0	0
S. nigra (I)**	3745	4372	85,6
VTA (D)**	0	0	0
VTA (I)**	3459	6918	50,0
** \begin{minipage}[t]{154mm} el marcador neuronal en estas regiones era hidroxilasa de tirosina (TH). Solamente el lado izquierdo (no lesionado) contenía células derivadas de BMSC. \end{minipage}

Se determinaron recuentos estereológicos de células \beta-gal+ (totales y comarcadas con un marcador neuronal) en regiones del cerebro medio de cuatro ratas, cada una de las cuales fue previamente lesionada con 6-OH DA inyectada en la S. nigra derecha, seguido por el injerto de BMSC 3 semanas después en el cuerpo estriado derecho. Dos ratas fueron sacrificadas 1 mes después del injerto y 2 ratas fueron sacrificadas 3 meses después del injerto. El recuento de células TH-ir en la S. nigra y en el área tegmental ventral (VTA) fue determinado solamente en un animal.

Las células \beta-gal+ cerebelares, igual que las verdaderas células de Purkinje, expresaban calbindina (negro auténtico en las Figuras 4A, 4B y 4C) pero no expresaban el marcador neuronal NeuN. Y lo que es más interesante, las células de Purkinje normales (que no son \beta-gal+) no expresan tampoco NeuN. Muchas células de Purkinje \beta-gal+ estaban también comarcadas con GAD-ir (negro auténtico en la Figura 4D). GAD es un marcador del ácido \gamma-aminobutírico (GABA), que es sintetizado normalmente en las células de Purkinje y liberado en los núcleos cerebelares profundos. El GABA es también el neurotransmisor utilizado por las neuronas de los circuitos locales de la corteza cerebelar. Los núcleos cerebelares profundos contenían también células \beta-gal+, muchas de las cuales estaban comarcadas con NeuN-ir (negras en la Figura 4F). En el hipocampo se observó una débil tinción \beta-gal+ de las células, pero estas células parecían no expresar NeuN-ir.

Las células \beta-gal+ con fenotipo neuronal en el núcleo rojo estaban enredadas en fibras inmunorreactivas para MAP-2 (Figura 3F). No fue posible determinar con microscopía óptica si estas fibras eran eferentes de o aferentes a las células \beta-gal+. De manera similar, las células \beta-gal+ de la capa de células de Purkinje del cerebelo parecían estar enredadas en fibras MAP-2-ir (Figura 4E), dando la impresión de que estas células se habían integrado en el sistema de circuitos neuronales del cerebelo. La falta de tinción inmunocitoquímica de fibronectina, un marcador de las células estromales de médula ósea dentro de la médula, indicaba la pérdida del fenotipo nativo de las BMSC en las regiones de diferenciación específica del lugar uno y tres meses después del injerto.

El número total de células \beta-gal+ y la proporción de células \beta-gal+ que expresaban el marcador neuronal NeuN fue calculado utilizando técnicas estereológicas en tres núcleos discretos del cerebro medio (el núcleo rojo, los núcleos óculomotores y la S. nigra) en 4 animales (ver la Tabla I). El cálculo de las neuronas derivadas de BMSC fue determinado utilizando el método del Disector Óptico en secciones crioconservadas de 30 \mum. Las células derivadas de BMSC (\beta-gal+) fueron contadas directamente en un pequeño número de secciones a intervalos uniformes predeterminados para el conjunto completo de secciones que incluía el núcleo rojo, la S. nigra y el núcleo óculomotor. Dentro de cada sección que iba a ser contada, el campo de visión fue enfocado en la parte superior de la sección utilizando un objetivo 40X. El foco fue desplazado posteriormente a través de la sección, y se contó el número de perfiles neuronales derivados de BMSC que estaban enfocados en la parte superior (altura del disector = 9,25 \mum). El recuento de células de lacZ totales y las células doblemente marcadas totales (NeuN + lacZ) en cada región se determinaron utilizando el cálculo: N=N_{v} X V (ref) = \SigmaQ/(\SigmaP X v(dis)) X V (ref); donde \SigmaQ es el número total de neuronas contadas en todos los disectores en el volumen de referencia, y v(dis) es el volumen del disector que es igual al área del marco de ensayo multiplicado por la altura del disector (9,25 \mum) que es la distancia entre los planos focales.

Con la excepción de la S. nigra y el área tegmental ventral (VTA), el número de células \beta-gal+ en todas las regiones estaba distribuido simétricamente, a pesar de una lesión nigral derecha unilateral y un injerto ipsilateral en el estriado. El número total de células \beta-gal+ en la s. nigra y en el VTA del lado derecho era menor que el del lado izquierdo no lesionado un mes y tres meses después del injerto. El porcentaje de células \beta-gal+ que coexpresaban NeuN-ir variaba desde un 58,6% en el núcleo óculomotor hasta un 89% en el núcleo rojo. El cálculo de células \beta-gal+ comarcadas con TH-ir en la S. nigra y en el VTA se realizó solamente en un animal 3 meses después del injerto. El porcentaje de células \beta-gal+ que coexpresaban TH en la s. nigra fue del 12,9% en el lado de la lesión con 6-OH DA y de un 69,7% en la lado no lesionado. Se observó un patrón similar en el VTA, donde el porcentaje de células \beta-gal+ comarcadas con TH fue del 19,8% en el lado de la lesión y del 50% en el lado no lesionado. El cálculo del número total de células en el cerebro medio se incrementó ligeramente a los tres meses cuando se comparó con el recuento celular un mes después del injerto. La suma de todas las células \beta-gal+ en las regiones del cerebro medio contadas a un mes daba un promedio de 15.067, lo que representa un 18% de las 80.000 células originales injertadas en el estriado. A los 3 meses, el número total de células \beta-gal+ en las regiones del cerebro medio era de una media de 18.635 (un 23% del número total de células injertadas). El ligero incremento del número de células \beta-gal+ es poco probable que represente una división celular continuada, ya que no se detectó inmunorreactividad para el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA-ir) en aquellas regiones en las que las BMSC habían asumido la morfología neuronal. El análisis de los dos animales que habían recibido injertos bilaterales, reveló distribuciones bilaterales y patrones de diferenciación similares de las BMSC dos meses después del injerto. Sin embargo, no se realizaron cálculos estereológicos en estos animales.

Estos resultados indican que nuestras BMSC tratadas contienen células pluripotentes que se diferencian en neuronas, según está indicado por varios marcadores neuronales, las características morfológicas y la integración en capas o regiones arquitectónicas específicas. Nosotros proporcionamos un estímulo (lesionando el sistema nigro-estriado) con el que pensamos inducir la diferenciación de BMSC. Sin embargo, la lesión nigral tuvo una influencia negativa sobre el prendimiento local del injerto en el lugar de implantación. En lugar de ello, las células BMSC \beta-gal+ migraron extensamente y se diferenciaron en una distribución simétrica bilateral dependiente del sitio en todas las partes del cerebro, con la excepción de la S. nigra y el VTA. En el lugar de la lesión nigral con 6-OH DA, había menos BMSCs \beta-gal+ y una menor proporción de las mismas coexpresaba TH cuando se comparó con el lado no lesionado. Esto podía haber sido afectado por la edad de la lesión (tres semanas). Comúnmente, existe un tiempo óptimo para el injerto de células en modelos de neurodegeneración e hipoxia-isquemia. Se ha demostrado que otras células neurales "similares a células madre" injertadas en el cerebro migraban preferencialmente hacia el lugar de la isquemia en el hemisferio lesionado de un modelo de rata hipóxica-isquémica, pero la migración óptima y el prendimiento óptimo del injerto se consiguieron cuando las células fueron implantadas 3-7 días después de la lesión. E.Y. Snyder y col., ADVANCES IN NEUROLOGY, VOL. 72: NEURONAL REGENERATION, REORGANIZATION, AND REPAIR (ed. F.J. Seil) Lippincott Raven, Philadelphia, 1997.

Como era poco probable que la lesión tuviera una diferenciación dependiente del sitio afectada en regiones remotas del sistema nigro-estriado, la explicación más probable del neurotropismo o afinidad de las BMSC por poblaciones neuronales específicas era que esto se debía al pretratamiento de las BMSC con ácido retinoico y BDNF antes del injerto. En contraste, se ha demostrado que BMSC humanas no tratadas trasplantadas en estriado de rata normal no se distribuían diferencialmente ni se diferenciaban por el lugar, a pesar de su migración generalizada. S.A. Azizi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95: 3908-3913 (1998).

No deseando estar ligados a ninguna teoría, nosotros proponemos no obstante que el pretratamiento de BMSC con ácido retinoico y BDNF induce la expresión de proteínas o receptores en la superficie celular con una afinidad por los factores tróficos correspondientes, citoquinas o moléculas de adhesión celular producidas normalmente por poblaciones neuronales específicas. Éste parece ser un modelo útil para estudiar el mecanismo de la afinidad de BMSC por regiones específicas del cerebro. Esta afinidad de las BMSC pretratadas por regiones específicas del cerebro, permitirá la vectorización de poblaciones neuronales para terapias celulares que varían desde terapias génicas hasta la reconstrucción neural en enfermedades neurodegenerativas, derrame cerebral y trauma.

Con el fin de asegurarnos de que las células \beta-gal+ derivaban verdaderamente de BMSC, se emprendieron otros dos experimentos utilizando BMSC marcadas con otros marcadores (Ejemplos 7 y 8 posteriores). Esto era necesario porque algunas poblaciones de neuronas de rata normales no injertadas expresan una actividad \beta-galactosidasa endógena. Con la presencia de otros varios marcadores de BMSC de ratón, determinamos que las células \beta-gal+ derivaban en efecto de ratón y no eran neuronas de rata endógenas.

Ejemplo 4

Tratamiento de la Ataxia

Los ratones "tambaleantes" (JAX Labs.) expresan una mutación en la que las células de Purkinje del cerebelo degeneran rápidamente a las 3-4 semanas de edad. La pérdida de células de Purkinje parece ser el efecto predominante de la mutación, y no degeneran otras neuronas que no sean las células mitrales del bulbo olfativo y una cuantas neuronas talámicas. La pérdida de células de Purkinje se correlaciona con el comienzo de un paso atáxico "tambaleante" que persiste durante toda la vida pero que no afecta de otro modo a la salud de los animales.

BMSC precondicionadas (según se describió anteriormente) fueron injertadas en el cerebro de estos animales a la edad de seis semanas. Un total de 12 animales mutantes y 12 animales normales fueron estudiados en cada experimento. La mitad de los animales recibió BMSC precondicionadas de ratones lacZ y la mitad fueron sometidos a cirugía ficticia. Aunque el objetivo era sustituir las células de Purkinje cerebelares, el injerto fue colocado en el estriado debido a que habíamos demostrado (Ejemplo 3) que el cerebelo parecía ser una región preferida para la migración y la diferenciación específica de sitio en neuronas similares a células de Purkinje. Los sitios de injerto alternativos fueron la inyección en el ventrículo lateral y directamente en el cerebelo, cuidadosamente para evitar la inducción de ataxia traumática.

Con el fin de determinar si los injertos tenían como resultado la mejora funcional del déficit neurológico, se cuantificaron los pasos espontáneos basales prequirúrgicos registrando las huellas que las patas impregnadas en tinta dejaban sobre una tira de papel estrecha de 36 pulgadas de longitud en el fondo de una pasarela cerrada (36'' de largo, 3'' de ancho y 6'' de alto). Además, se midió el comportamiento sobre un astil de balanza (capacidad y tiempo requerido para cruzar una barra suspendida entre dos plataformas). Estas medidas de locomoción y coordinación se realizaron en los ratones mutantes y en el grupo control de ratones normales con el mismo fondo genético a los puntos de tiempo siguientes: 1 semana antes de la cirugía y 1 semana, 1 mes, 2 meses y 3 meses después de la
cirugía.

En el punto de tiempo en el que había una mejora significativa de la locomoción y la coordinación, los animales fueron sacrificados y los cerebros fueron examinados para determinar la distribución y el grado de diferenciación de las BMSC injertadas. El origen BMSC de las células fue determinado mediante tinción de \beta-gal. El marcador de las células de Purkinje fue la inmunorreactividad de la calbindina. La proporción de células \beta-gal+ que estaban comarcadas con calbindina se determinó utilizando la técnica estereológica.

Ejemplo 5

Diferenciación de Células de Médula Ósea Humana (BMSC) In Vitro

Para resumir brevemente, BMSC fueron separadas de la médula ósea completa de ratón, ternera y humano. Los cultivos de BMSC fueron incubados con a) factor de crecimiento epidérmico (EGF), b) ácido retinoico (AR), c) medio neuronal N5 y d) factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) más AR.

Las BMSC fueron aisladas del material residual de médula ósea (astillas de hueso con células estromales adherentes, tejido graso y desechos) que quedó retenido en los filtros de malla de nailon utilizados rutinariamente en el filtrado de médula humana recién obtenida para ser utilizada en el trasplante de médula ósea. El filtrado contiene la mayoría de los elementos hematopoyéticos de la médula ósea que son procesados posteriormente para la sustitución de la médula ósea humana. Nosotros utilizamos los filtros que eran normalmente desechados. Los filtros fueron lavados de nuevo cinco veces con PBS. La solución de PBS fue centrifugada para depositar las astillas de hueso más pesadas. El sobrenadante fue resuspendido de medio de cultivo y sembrado en matraces de cultivo de tejidos (igual que en el Ejemplo 1). Las BMSC fueron separadas por su adherencia a los matraces de cultivo de plástico, mientras que las células madre hematopoyéticas más pequeñas permanecían suspendidas en el medio y fueron eliminadas cuando se sustituyó el medio de cultivo por medio fresco. La fracción de médula ósea humana para la siembra fue diluida 1:1 con Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM, GIBCO/BRL) y un 10% de FBS, centrifugada a través de un gradiente de densidad (Ficoll-Paque Plus, 1,077 g/ml, Pharmacia) durante 30 minutos a 1.000Xg. El sobrenadante y las interfase fueron combinados, diluidos hasta aproximadamente 20 ml con MEM con un 10% de suero de ternera fetal (FCS) y sembrados en matraces de plástico revestidos con polietilenimina.

La médula ósea de ratón fue colocada en 10 ml de PBS y un 5% de BSA. Las células fueron lavadas en este medio, centrifugadas (2000 rpm durante 5 minutos). Las células fueron resuspendidas en medio de crecimiento que constaba de DMEM suplementado con glutamina 2 mM, un 0,001% de \beta-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y un 10% de suero de caballo. Las células fueron incubadas en los matraces durante 2 días y las células no adherentes fueron eliminadas por sustitución del medio. Una vez que los cultivos alcanzaron la confluencia, las células fueron levantadas mediante incubación con tripsina (0,25%) y EDTA 1 mM a 37ºC durante 3-4 minutos. Posteriormente fueron congeladas para un uso posterior o bien resembradas después de una dilución 1:2 ó 1:3 con la adición de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), 10 ng/ml, o de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), 5 ng/ml. Este procedimiento puede ser repetido durante 3-5 pases.

Las células de médula ósea completa humana se dejaron adherir al fondo del matraz de cultivo durante 2 días y, después de su extracción de los matraces, fueron resembradas en medio que contenía el mitógeno, factor de crecimiento epidérmico (EGF). Esto tuvo como resultado la proliferación de las células, sin una inducción significativa de diferenciación. Las células fueron posteriormente extraídas del fondo del matraz y resembradas (o congeladas para su uso posterior) en placas de cultivo de 35 mm en presencia de un medio de crecimiento neuronal (N5) suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS), ácido retinoico (AR) y uno de varios factores de crecimiento (BDNF, GDNF o NGF). Las células estromales habituales de la médula eran ricas en fibronectina (blancas en la Fig. 5A). Después de 7 a 14 días, una pequeña proporción (<2%) de las BMSC humanas desarrolló un fenotipo similar al de las neuronas y marcadores similares a los de las neuronas característicos. El análisis inmunocitoquímico de los cultivos reveló la presencia de células nestina-ir (Fig. 5B), células NeuN-ir (Fig. 5C) y células GFAP-ir (Fig. 5D). Las BMSC incubadas con AR y BDNF tuvieron como resultado la expresión del marcador neuronal NeuN, mientras que la cantidad de fibronectina expresada había disminuido en comparación con los cultivos condicionados con
EGF solo.

Después de 7 días, la expresión de los marcadores neuronales (Nestina, Proteína Nuclear Específica de Neuronas o NeuN y GFAP) y de un marcador de células estromales de médula ósea (fibronectina) fue analizada mediante análisis de transferencia Western e inmunocitoquímica (Figura 6). Para el análisis de transferencia Western, los cultivos fueron lavados tres veces en PBS frío, raspados en PBS enfriado en hielo y lisados en un tampón de lisis enfriado en hielo que contenía Tris 20 nM/HCl (pH=8,0), EDTA 0,2 mM, Nonidet P-40 3%, ortovanadato 2 mM, NaF 50 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, NaCl 100 mM y 10 \mug de cada de aprotinina y leupeptina por ml. Después de la incubación sobre hielo durante 10 minutos, las muestras fueron centrifugadas a 14.000Xg durante 15 minutos y se recogieron los sobrenadantes. Se retiró una alícuota para el cálculo de proteínas totales (ensayo de Bio-Rad). Una alícuota correspondiente a 30 \mug de proteína total de cada muestra fue separada mediante SDA/PAGE bajo condiciones reductoras y transferida electroforéticamente a filtros de nitrocelulosa. La unión no específica de anticuerpo fue bloqueada por incubación con BSA al 3% durante 2 horas. La inmunotransferencia se llevó a cabo con anti-receptor trk A de conejo (o con el anticuerpo apropiado para el receptor del factor de crecimiento de interés), seguido por anticuerpos anti-inmunoglobulina secundarios conjugados a peroxidasa, y las transferencias fueron reveladas mediante el método de quimioluminiscencia incrementada (ECL, Amersham). Las transferencias Western de los lisados de los cultivos celulares (Fig. 6) proporcionaron pruebas preliminares de que BDNF + AR + N5 (columna 4) tenían como resultado la máxima expresión de nestina-ir y NeuN-ir en BMSC humanas.

Además, las células extraídas del fondo del matraz igual que anteriormente (BMSC), o separadas mediante separación magnética de células, fueron resembradas en placas de cultivo de 35 mm en presencia de un medio de crecimiento neuronal (N5) suplementado con un 5% de suero de caballo, un 1% de FBS, transferrina (100 \mug/ml), putrescina (60 \muM), insulina (25 \mug/ml), progesterona (0,02 \muM), selenio (0,03 \muM), ácido retinoico 9-cis o ácido retinoico todo trans (AR) (0,5 \muM) y alguno de varios factores de crecimiento neuronal a una concentración de 1-10 ng/ml (Factor de Crecimiento Derivado de Cerebro - BDNF, Factor Neurotrófico Derivado de la Glía - GDNF o Factor de Crecimiento Nervioso - NGF). Después de 7 a 14 días, algunas de las BMSC habían cambiado su morfología y habían desarrollado el fenotipo de neuronas, glía y fibroblastos.

Ejemplo 6

Efectos del Cocultivo de BMSC Humanas con Cultivos de Estriado Fetal de Rata

BMSC de ratón condicionadas con AR y BDNF fueron cocultivadas con células mesencefálicas neuronales primarias preparadas a partir de ratas fetales E15. Las BMSC humanas fueron establecidas utilizando los métodos anteriormente descritos. Las células fueron marcadas con una concentración 10 \muM del "rastreador celular" verde fluorescente (diacetato de 5-clorometil fluoresceína, Molecular Probes, Inc.) y sembradas sobre un lecho celular de células estriatales fetales de rata preparadas tres días antes. Los cultivos fueron alimentados con AR (0,5 \muM) + BDNF (10 ng/ml) en medio N5. Después de 10 días en cultivo, las células fueron procesadas por inmunocitofluorescencia utilizando anticuerpos primarios contra NeuN, GFAP, nestina y fibronectina, seguido por un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente con Rojo Texas. Esto permitía un doble marcaje de las células para determinar si una célula que presentaba marcadores específicos de neuronas, glía o neuroectodermo tenía también un origen de médula ósea. Ver las Figuras 7A-7F. La Fig. 7A muestra células inmunorreactivas para el marcador neuronal (NeuN). La Fig. 7B muestra el marcador de células gliales (GFAP). Las Figuras 7C y 7D muestran el área correspondiente con las células marcadas de blanco (BMSC marcadas con el Rastreador Celular). Las Figuras 7E y 7F muestran células que estaban doblemente marcadas. Y lo que es más interesante, dos de las células NeuN-ir eran de origen BMSC, y una de las células GFAP-ir era de origen BMSC. Estos datos proporcionan una evidencia adicional de que las BMSC de origen humano así como de origen murino eran capaces de diferenciarse en células que tenían fenotipos
neurales.

BMSC de lacZ marcadas cocultivadas con cultivos primarios de mesencéfalo de rata se diferenciaban en células similares a neuronas comarcadas con NeuN-ir y \beta-gal.

Ejemplo 7

In Vivo

BMSC de ratón lacZ fueron injertadas en el cuerpo estriado desnervado de ratas previamente lesionadas con 6-OH dopamina y en ratas no lesionadas. Uno y tres meses después, las ratas fueron sacrificadas y los cerebros fueron procesados para histoquímica e inmunocitoquímica. Las células derivadas de BMSC fueron visualizadas por la tinción \beta-gal+ o por anticuerpos anti-ratón dirigidos contra el antígeno de tipo I del complejo principal de histocompatibilidad de ratón. La expresión de marcadores neuronales en las células derivadas de BMSC fue determinada por su inmunorreactividad con anticuerpos contra el antígeno nuclear específico de neuronas (NeuN-ir), contra la hidroxilasa de tirosina (TH), contra la proteína asociada a microtúbulos (MAP2), contra el neurofilamento (NF) y contra calbindina (CB).

Las células derivadas de BMSC injertadas en el estriado no permanecían localizadas en el estriado donde fueron injertadas, sino que fueron encontradas en el cerebro medio, en el tálamo y raramente en el cerebelo cuando se identificaron por el anticuerpo anti-ratón. Algunas de estas BMSC de ratón coexpresaban NeuN-ir o TH-ir. Las ratas injertadas y las ratas control (no injertadas) presentaban ambas células \beta-gal+ en distribuciones similares y características. Se encontraron células \beta-gal+ en el bulbo olfativo, en el hipotálamo supraóptico y paraventricular, en el núcleo rojo, en el núcleo del tercer nervio, en la S. nigra, y estaban distribuidas en el cerebelo con un patrón idéntico al de las células de Purkinje en ratas no injertadas.

BMSC, condicionadas con AR y BDNF, expresaban marcadores neuronales y tenían una expresión disminuida de los marcadores estromales y fibroblásticos. Cuando BMSC de lacZ condicionadas fueron cocultivadas con neuronas mesencefálicas primarias, muchas células derivadas de BMSC coexpresaban NeuN-ir y \beta-gal. Cuando fueron injertadas en el estriado desnervado, las BMSC condicionadas expresaban varios marcadores neuronales y migraban desde el lugar del injerto hacia ambos lados del tálamo y, en un menor grado, hacia el hipocampo y hacia la S. nigra no lesionada. La tinción positiva de la actividad \beta-gal en las ratas no injertadas dio lugar a un artefacto que podría ser fácilmente confundido con BMSC \beta-gal. Sin embargo, un segundo marcador de BMSC confirmó que estas células migraban y se diferenciaban en células similares a neuronas.

Ejemplo 8

Datos In Vivo que Muestran que las BMSC se Diferencian en Células Neurales (Neuronas o Glía) Utilizando un Tercer Marcador de BMSC

Los ejemplos previos utilizaban BMSC \beta-gal+ de ratones y anticuerpos específicos para ratones. En este experimento, BMSC de ratón fueron premarcadas con PKH26 rojo fluorescente (Sigma, Inc.) o con Cell Tracker Orange (Rastreador Celular Naranja) (Molecular Probes, Inc.) antes de ser injertadas en estriado de rata desnervado según se describió anteriormente. Dos semanas después del injerto, las BMSC fluorescentes habían migrado desde el lugar del injerto (algunas hacia la corteza cerebral del lado contralateral). Después de solamente dos semanas, una pequeña proporción de las células injertadas había comenzado a expresar marcadores neurales tales como NeuN-ir y GFAP-ir (Figuras 8 y 9). Las BMSC de ratón marcadas con PKH26 rojo expresaban también el marcador neuronal NeuN (blancas en la Figura 8). Además, la morfología de las células doblemente marcadas era la de neuronas. La imagen fue producida con un microscopio de barrido confocal Zeiss LSM510. En la Figura 9, hay una célula glial doblemente marcada con el trazador rojo fluorescente (gris) que la identifica como una célula derivada de BMSC y con la fluorescencia verde (blanca) debida a GFAP-ir. Observar que la morfología es la de una célula
glial.

Aplicabilidad Industrial

El examen de secciones de tejido cerebral de los experimentos anteriores reveló la regeneración de células \beta-gal+ derivadas de BMSC en múltiples regiones del cerebro distantes del lugar de implantación en el cuerpo estriado. La migración de las BMSC tratadas incluye, pero no se limita a, las siguientes regiones cerebrales: zona de células mitrales del bulbo olfativo, núcleos paraventricular y supraóptico del hipotálamo, hipocampo, habénula, núcleo óculomotor, núcleo rojo, S. nigra, abducens, núcleos de los nervios craneales facial e hipogloso, oliva inferior de la médula, asta ventral de la médula espinal y la capa de células de Purkinje del cerebelo. Las células BMSC \beta-gal+ asumían múltiples fenotipos, incluyendo el de células cuboidales similares a epiteliales en el plexo coroideo; células pequeñas similares a la oligodendroglía en el quiasma óptico y en la sustancia blanca subcortical; células grandes similares a neuronas en el núcleo rojo, la S. nigra y los núcleos motores del tronco cerebral. Este nuevo método de trasplante neural es un procedimiento científicamente factible y clínicamente prometedor para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y del derrame cerebral, así como para la reparación de lesiones traumáticas del cerebro y de la médula espinal.

Existen numerosas utilizaciones de las BMSC en los laboratorios de investigación universitarios y farmacéuticos. Las BMSC humanas que migran al cerebelo en el modelo de rata y asumen las características de las células de Purkinje pueden ser utilizadas para analizar los efectos (terapéuticos y tóxicos) de fármacos sobre células cerebelares humanas. De igual modo, BMSC humanas implantadas en otras áreas del cerebro que asumen las características de esas células pueden ser también utilizadas para analizar la toxicidad y la eficacia terapéutica de fármacos en una amplia variedad de enfermedades. Antes de la implantación, las células pueden ser manipuladas genéticamente para que lleven los genes que han sido implicados en diferentes enfermedades cerebrales y del sistema nervioso.

Un uso potencial de la naturaleza migradora y regenerativa de las BMSCs es el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson. Las BMSCs pretratadas pueden sustituir a las neuronas fetales que han sido utilizadas para el trasplante en esa condición. Se ha demostrado que las BMSCs tratadas con ácido retinoico y BDNF migran a la sustancia nigra, en la que un déficit de neuronas dopaminérgicas causa la EP. La administración de BMSCs a la sustancia nigra podría regenerar las neuronas de la nigra y devolver el flujo de dopamina a esa región.

La regeneración de la capa de células de Purkinje del cerebelo puede ayudar a mejorar el movimiento coordinado del paciente. La restauración del cerebelo sería útil en tumores cerebelares, típicamente un meduloblastoma que tiene lugar en la infancia. En los adultos, puede observarse un síndrome similar en el alcoholismo crónico, que produce la degeneración del vermis. El paciente tiene un paso inestable, asombrosamente atáxico; él o ella camina sobre una base ancha y se balancea de lado a lado. Barr, M.L. y Kiernan, J.A., THE HUMAN NERVOUS SYSTEM, AN ANATOMICAL VIEWPOINT, 6ª ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia (1993).

Otra utilización de la migración y regeneración de BMSCs es en la zona de células mitrales del bulbo olfativo. Los impulsos procedentes del bulbo olfativo son transportados a las áreas olfativas para la apreciación subjetiva de los olores y aromas. Barr, M.L. y Kiernan (ibid.). La migración y regeneración de BMSCs en esta región del cerebro podría tratar la pérdida de gusto derivada de agentes químicos tóxicos, del envejecimiento y de lesiones.

La administración de BMSCs puede ser utilizada en la regeneración de los núcleos de los nervios craneales facial e hipogloso y en la restauración del movimiento de los músculos faciales después de un derrame cerebral o de otra lesión.

La administración de las BMSCs podría ayudar a la regeneración del asta ventral de la médula espinal y a la restauración de las capacidades motoras perdidas por un trauma de la columna vertebral.

La administración de las BMSCs podría ayudar a la regeneración de una región lesionada del hipocampo.

Claims (5)

1. Un método para producir células con fenotipo neuronal a partir de células de médula ósea, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) provisión de células de médula ósea;

b) selección de una pluralidad de células estromales de médula ósea a partir de la médula ósea;

c) incubación de las células estromales en un medio de crecimiento con un mitógeno seleccionado de entre EGF, PDGF o una combinación de los mismos; y

d) incubación de las células procedentes de la etapa (c) en un medio de crecimiento neuronal que incluya al menos un ácido retinoico y al menos un agente diferenciador seleccionado de entre BDNF, GDNF o NGF, produciendo de este modo células con fenotipo neuronal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende además la eliminación por separación de las células madre hematopoyéticas.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la etapa (b) comprende además la colocación de las células de médula ósea y de un medio de cultivo adecuado en un recipiente de plástico de medio de cultivo, permitiendo que las células estromales de la médula ósea se adhieran al plástico, y la eliminación de las demás células por sustitución del medio.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que además del agente diferenciador se añaden células neuronales fetales.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido retinoico es ácido retinoico 9-cis, ácido retinoico todo trans o una combinación de los mismos.