CN102176919A

CN102176919A - 用胎盘细胞群治疗骨缺损的方法和组合物

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Publication number: CN102176919A
Application number: CN2009801402875A
Authority: CN
Inventors: 萨沙·道恩·阿布拉门逊; 马里安·古拉基斯; 穆罕默德·A·黑德兰; 克利斯登·拉巴左; 施缪尔·雅科比
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2009-08-24
Publication date: 2011-09-07
Also published as: CA2734446C; US20160151425A1; CA2734446A1; IL211273A; DK2331109T3; CA2965883A1; WO2010021756A1; RU2011110736A; MX339068B; HK1158931A1; EP2331109B1; US20100047214A1; JP2012500792A; SI2331109T1; KR20110050688A; IL211273A0; HK1187252A1; EP2331109A1; US20140322177A1; HRP20130812T1

Abstract

本发明提供了成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)，使用OPAC和OPAC群的方法，以及培养、增殖、扩增或分化OPAC的方法。本发明进一步提供了使用OPAC配制适合对个体施用的可植入或可注射的组合物的方法。本发明更进一步提供的是，提供了用OPAC和包含OPAC的组合物治疗骨缺损的方法。本发明也提供了在多发性骨髓瘤的治疗和控制中使用OPAC的方法，例如，在患有多发性骨髓瘤的个体中对多发性骨髓瘤的一种或多种症状降低其进展、停止其进展、或改善其，该方法包含对个体施用大量OPAC。

Description

用胎盘细胞群治疗骨缺损的方法和组合物

本申请主张2008年8月22日提交的美国临时专利申请号61/090,898和2008年8月22日提交的美国临时专利申请号61/090,897的权益，其公开内容全文在此通过引用并入本发明。

1.技术领域

本发明提供了成骨贴壁胎盘细胞(OPAC)的分离群的使用方法，和在例如多发性骨髓瘤的治疗中和在降低、停止或反转与多发性骨髓瘤相关或由其引起的骨量损失的治疗中使用OPAC的方法。

2.发明背景

多发性骨髓瘤(也称作MM、骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、或Kahler′s疾病)是一类浆细胞癌症，浆细胞是产生抗体的免疫系统细胞。多发性骨髓瘤的症状包括骨痛、感染、肾衰竭、贫血和骨损伤。该疾病被认为是不可治愈的，而且仅有几种治疗例如来那度胺(REVLIMID)可供使用且显示希望。因而，对多发性骨髓瘤的新治疗存在需求。

3.发明概述

本发明提供了分离的成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)、OPAC群和包含OPAC的细胞群，其中OPAC存在于绒毛膜中并从中分离。在某些实施方案中，OPAC不是从绒毛膜裙分离的(无绒毛的)。OPAC显示一种或多种干细胞或多能细胞特征(例如，显示干细胞或多能细胞的相关标记，在培养中在未分化状态复制至少10-20次，分化成代表三个胚层至少之一的成体细胞等)，而且可以附着到组织培养底物上(例如，组织培养塑料制品例如组织培养皿或多孔板表面)。本发明进一步提供了在骨缺损的治疗和骨相关癌症例如多发性骨髓瘤的治疗中使用OPAC的方法，以及使用OPAC来降低、停止或反转与多发性骨髓瘤相关或由其引起的骨量损失的方法。

在一方面，本发明提供了分离的OPAC，即分离的成骨胎盘贴壁细胞，其附着在组织培养塑料制品上，是成骨的，而且是从不具有绒毛膜裙的绒毛膜分离的(无绒毛的)。OPAC不是本领域已知和了解的滋养层、细胞滋养层、胚胎干细胞、或胚胎生殖细胞。

在一个实施方案中，OPAC是分离的CD200^-或CD200^dim细胞，例如从绒毛膜但不是从绒毛膜裙分离的那些(无绒毛的)。在一个具体的实施方案中，OPAC是成骨的。在一个具体的实施方案中，OPAC是骨保护素(OPG)分泌阳性的，这通过例如流式细胞术检测。骨保护素是成骨细胞分泌的诱饵受体，其与破骨细胞分化因子(ODF)特异性结合并抑制破骨细胞成熟。因此，OPAC促进骨形成并降低破骨细胞介导的骨量损失。在另一个具体的实施方案中，OPAC不表达RANKL(核因子κB配体的受体活化剂；参见例如，GenBank登录号AAB86811.1)，这通过例如定量RT-PCR检测。RANKL是激活破骨细胞的蛋白，破骨细胞参与骨吸收。因此，OPAC不促进骨吸收。在另一个具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim，且CD105⁺的。在另一个具体的实施方案中，OPAC是α-平滑肌肌动蛋白(参见例如，GenBank登录号NP_001604)表达阴性、RANKL阴性、或NG2(神经/神经胶质细胞2硫酸软骨素蛋白聚糖)表达阳性的，这通过例如抗体染色确定。在某些实施方案中，与CD200⁺(非dim)组织培养塑料制品贴壁胎盘干细胞(NG2在其中的染色是集中的)相比，所述NG2在OPAC中的染色是弥漫的。在另一个具体的实施方案中，OPAC是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性且骨保护素分泌阳性的。在另一个具体的实施方案中，OPAC显示可诱导的碱性磷酸酶活性，这通过例如比色测定确定。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim，CD105⁺的，这通过流式细胞术检测，而且α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim，CD105⁺的，而且α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性，并显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在另一个具体的实施方案中，OPAC是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-、CD105⁺、SSEA3⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-、CD105⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-、CD105⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在某些实施方案中，当胎盘细胞群在允许矿化基质形成的条件下培养时，OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群在所述群中促进矿化基质的形成。

本发明也提供了包含OPAC的细胞群，其中该细胞群是CD200^-或CD200^dim的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的分离的细胞群，其中所述细胞群不是从绒毛膜裙分离的(无绒毛的)，而且其中所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的。在一个具体的实施方案中，该细胞群基本由OPAC组成。在一个具体的实施方案中，所述细胞群是成骨的。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-且CD105⁺的，这通过流式细胞术检测。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^dim且CD105⁺的，这通过流式细胞术检测。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、NG2的表达阳性、或骨保护素分泌阳性的。在某些实施方案中，与CD200⁺(非dim)组织培养塑料制品贴壁胎盘干细胞(NG2在其中的染色是集中的)相比，所述NG2在OPAC中的染色是弥漫的。在另一个实施方案中，所述细胞群是RANKL表达阴性的，这通过例如定量RT-PCR检测。在另一个实施方案中，所述细胞群是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、NG2的表达阳性且骨保护素分泌阳性的。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，所述群是CD200^-、CD105⁺或CD200^dim、CD105⁺的，而且满足α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性中的一项或多项。在一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-、CD105⁺或CD200^dim、CD105⁺的；是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性的；并显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。在又一个实施方案中，所述群细胞是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。在又一个实施方案中，所述细胞群是CD200^-、CD105⁺或CD200^dim、CD105⁺的、SSEA3⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的，是CD105⁺且SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的；是CD105⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺的，α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性和/或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在另一个具体的实施方案中，包含OPAC的细胞群在成骨培养基中与相等数目的CD200⁺非dim贴壁胎盘干细胞相比，以可检测的较高水平表达基质金属肽酶9(MMP9)，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在其他具体的实施方案中，当OPAC和所述CD200⁺胎盘干细胞在生长培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的CD200⁺非dim贴壁胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP3(骨形态发生蛋白3)、CDH11(钙粘蛋白11型)、COL10A1(胶原X型，α1)、COL14A1(胶原，XIV型，α1)、COL15A1(胶原，XV型，α1)、DMP1(牙本质基质酸性磷蛋白1)、DSPP(牙本质涎磷蛋白)、ENAM(釉蛋白)、FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)、MMP10(基质金属蛋白酶10(基质分解素2))、TGFB3(转化生长因子，β3)、和/或TGFBR1(转化生长因子β，受体1)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，当OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的CD200⁺非dim贴壁胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN(成釉蛋白(釉基质蛋白))、BMP2(骨形态发生蛋白2)、CALCR(降钙素受体)、CDH11、COL11A1(胶原，XI型，α1)、COL14A1、COL15A1、COL2A1(胶原，II型，α1)、CSF2(集落刺激因子2(粒细胞-巨噬细胞))、CSF3(集落刺激因子3(粒细胞))、DMP1、DSPP、ENAM、FGF3(成纤维细胞生长因子3)、GDF10(生长分化因子10)、IGF1(胰岛素样生长因子1)、ITGA1(整联蛋白，α1(CD49))、ITGA2(整联蛋白，α2(CD49B))、MMP8(基质金属蛋白酶8(中性粒细胞胶原酶))、MMP9(基质金属肽酶9(明胶酶B，92kDa明胶酶，92kDa IV型胶原酶))、MMP10、PDGFA(血小板源生长因子A)、SMAD1(SMAD家族成员1)、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2(转化生长因子β，受体2)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，不管OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，包含OPAC的细胞群与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CDH11、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、MMP10、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG(α-2-HS-糖蛋白)、ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏)、EGF(表皮生长因子)、FLT1(fms相关的酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体))、IGF2、ITGA2、ITGAM(整联蛋白，αM(补体成分3受体3亚基))、SCARB1(清道夫受体B类，成员1)、SOX9(SRY(性别决定区Y)-盒9)、TNF(肿瘤坏死因子)、TWIST1(扭曲同系物1；以前称作睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂3、尖头并指趾畸形3)、VCAM1(血管细胞粘附分子1)和/或VDR(维生素D(1，25-二羟基维生素D3)受体)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估

在另一个具体的实施方案中，当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BGN(双糖链蛋白多糖)、COL11A1、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、FGF1和/或VCAM1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，包含OPAC的细胞群与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达VCAM1，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估

在另一个具体的实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在生长培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、CALCR、CD36、CDH11、COL12A1、COL14A1、COL15A1、COL3A1、COL5A1、DMP1、DSPP、FLT1、MSX1、PDGFA、TGFB3、TGFBR1和/或TUFT1(釉丛蛋白1)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

在另一个具体的实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在成骨培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、CALCR、COL14A1、COL15A1、CSF3、DMP1、DSPP、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP9、MSX1、PDGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CALCR、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、MSX1、PDGFA、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

在另一个具体的实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在生长培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP(骨γ-羧基谷氨酸(gla)蛋白)、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1和/或SOX1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在成骨培养基中培养时，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、BGLAP、BGN、BMP3、BMP5、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL2A1、COL4A3、COMP、EGF、FGF1、FGFR2、IGF2、MMP8、PHEX(磷酸盐调节的肽链内切酶同系物，X连锁)、RUNX2(runt-相关转录因子2)、SCARB1、SOX1、VCAM1和/或VEGFB中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个具体的实施方案中，不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，包含OPAC的细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、SCARB1和/或SOX9中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。在以上各个实施方案的一个更加具体的实施方案中，OPAC和所述CD200⁺胎盘干细胞或间充质干细胞经历了相等数目的传代或细胞倍增。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中编码基质金属肽酶9(MMP9)的基因在所述OPAC中在成骨培养基中被诱导时与MMP9在生长培养基中的表达的比值，和所述MMP9在胎盘干细胞(例如CD34^-、CD10⁺、CD105⁺组织培养贴壁多能胎盘细胞)中在所述成骨培养基中被诱导时与MMP9在所述生长培养基中表达的比值相比，至少大2、3、4或5个数量级，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中编码基质金属肽酶9(MMP9)的基因在所述OPAC中在成骨培养基中被诱导时与MMP9在生长培养基中的表达的比值，和所述MMP9在骨髓源间充质干细胞(MSC)中在所述成骨培养基中被诱导时与MMP9在所述生长培养基中表达的比值相比，至少大2、3、4或5个数量级，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中编码基质金属肽酶9(MMP9)的基因在所述OPAC中在成骨培养基中被诱导时与MMP9在生长培养基中的表达的比值，和所述MMP9在成纤维细胞中在所述成骨培养基中被诱导时与MMP9在所述生长培养基中表达的比值相比，至少大2、3、4或5个数量级，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在具体的实施方案中，包含OPAC的细胞群中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是CD200^-和/或CD200^dim的。在其他具体的实施方案中，包含OPAC的细胞群中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的OPAC是CD200^-和/或CD200^dim的。

本发明进一步提供了分离的OPAC群，其中，通过如下步骤获得所述群：从胎盘中分离绒毛膜组织，其中所述绒毛膜组织不是绒毛膜裙组织(无绒毛的)；用组织破裂酶消化分离的绒毛膜组织，以获得包含OPAC的绒毛膜细胞群；和从所述绒毛膜细胞中分离所述OPAC。在一个具体的实施方案中，组织破裂酶是胰蛋白酶、分散酶或胶原酶。在各种实施方案中，消化绒毛膜组织获得的细胞群内包含的OPAC占所述绒毛膜细胞群的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。

本发明提供的OPAC和包含OPAC的细胞群包括已被培养例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多代，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次群倍增的OPAC和包含OPAC的细胞群。OPAC群也包括例如培养中的两种或多种OPAC的群，以及在容器(例如袋子)中的群。

另一方面，本发明提供了生产具有矿化基质能力的成骨细胞的方法，包括在所述OPAC分化成成骨细胞的条件下，培养大量本发明提供的OPAC或本发明提供的分离的OPAC群，所述培养持续的时间足以让所述成骨细胞产生可检测量的包含钙和/或磷酸盐的矿化基质，或促进该基质的产生。在某些实施方案中，OPAC产生骨或促进骨的产生。

在另一方面，本发明提供了包含OPAC的组合物，例如可植入的组合物。在一个具体的实施方案中，可植入的组合物包含基质。在一个更加具体的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一个更加具体的实施方案中，基质是羊膜或羊膜源生物材料。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含细胞外膜蛋白。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含合成的化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5,000道尔顿的有机分子。在某些实施方案中，基质是合成的可降解的聚合物，例如聚乳酸或聚乙醇酸。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙底物、β-磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、或陶瓷底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙-胶原底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是胶原底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是磷酸钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是矿化的人胎盘胶原底物。

在另一方面，本发明提供了在个体中治疗骨缺损的方法，包括向有此需要的个体施用包含本发明提供的OPAC群的可植入或可注射的组合物，从而在该个体中治疗骨缺损。在某些实施方案中，骨缺损是与癌症、骨折或脊柱例如需要融合的脊柱相关的溶骨性损害。在某些实施方案中，溶骨性损害与多发性骨髓瘤、骨癌、或转移性癌相关。在某些实施方案中，骨折是骨不连骨折。在某些实施方案中，可植入的组合物是手术植入的，例如在骨缺损位点手术植入。在某些实施方案中，对骨缺损区域手术施用可注射的组合物。在某些实施方案中，可注射的组合物是全身施用的。

在另一方面，本发明提供了生产成骨细胞的方法，包括在所述OPAC分化成成骨细胞的条件下培养大量OPAC或分离的OPAC群，所述培养持续的时间足以让所述OPAC生产可检测量的矿化的钙、骨组织、或骨，或促进该生产。

在某些实施方案中，本发明提供了配制可注射的组合物的方法，包括将OPAC群与可注射的透明质酸或胶原组合。在某些实施方案中，组合物包含可注射的透明质酸。在某些实施方案中，组合物包含可注射的胶原。本发明也提供了包含OPAC群和可注射的透明质酸或胶原的组合物。

在另一方面，本发明提供了治疗患有骨相关癌症的个体的方法，例如，多发性骨髓瘤、骨癌、乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、Ewing′s肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、骨的纤维肉瘤、转移性癌、多发性骨髓瘤、以及特征是骨转移的任何形式的转移性癌。在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有骨相关癌症的个体的方法，包含对所述个体施用分离的OPAC，例如包含OPAC的分离的细胞群，其中所述OPAC从绒毛膜获得，并附着到组织培养塑料制品上，而且其中所述OPAC是CD200阴性的或是CD200^dim的，且CD105阳性，而且其中所述施用可检测地降低所述多发性骨髓瘤的一种或多种症状的进展，停止其进展或使其改善。在一个具体的实施方案中，所述OPAC是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。在另一个具体的实施方案中，OPAC是CD200^-、CD105⁺、SSEA3⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-和/或CD200^dim、CD105⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-和/或CD200^dim、CD105⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在其他具体的实施方案中，OPAC包含下面5.1部分中列举的任意特征或特征组合。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当所述OPAC和所述CD200⁺胎盘干细胞在生长培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的CD200⁺非dim贴壁胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP3、CDH11、COL10A1、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、FGFR2、MMP10、TGFB3、和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、BMP2、CALCR、CDH11、COL11A1、COL14A1、COL15A1、COL2A1、CSF2、CSF3、DMP1、DSPP、ENAM、FGF3、GDF10、IGF1、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP8、MMP9、PDGFA、SMAD1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CDH11、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、MMP10、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、EGF、FLT1、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1、SOX9、TNF、TWIST1、VCAM1或VDR中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BGN、COL11A1、COMP、FGF1和/或VCAM1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平表达VCAM1，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在生长培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、CALCR、CD36、CDH11、COL12A1、COL14A1、COL15A1、COL3A1、COL5A1、DMP1、DSPP、FLT1、MSX1、PDGFA、TGFB3、TGFBR1和/或TUFT1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在成骨培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、CALCR、COL14A1、COL15A1、CSF3、DMP1、DSPP、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP9、MSX1、PDGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CALCR、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、MSX1、PDGFA、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在生长培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP(骨γ-羧基谷氨酸(gla)蛋白)、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1和/或SOX1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，当OPAC和间充质干细胞在成骨培养基中培养时，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、BGLAP、BGN、BMP3、BMP5、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL2A1、COL4A3、COMP、EGF、FGF1、FGFR2、IGF2、MMP8、PHEX、RUNX2、SCARB1、SOX1、VCAM1和/或VEGFB中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、SCARB1和/或SOX9中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在治疗多发性骨髓瘤的方法的另一个具体实施方案中，所述OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CD36、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、CSF2、CTSK、FGF2、FGFR1、FLT1、ITGA1、MINPP1、MMP9、MSX1、PDGFA、SERPINH1、TGFB3和TGFBR1中的一个或多个，其中所述OPAC和所述间充质干细胞经历了相等数目的传代或细胞倍增；或与相等数目的成纤维细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、FLT1、IGF1R、ITGA1、MINPP1、PDGFA、SERPINH1、SMAD3、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TNF、TUFT1、VCAM1和VEGFA中的一个或多个，而且其中所述成纤维细胞经历了相等数目的传代或细胞倍增。

在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的另一个具体实施方案中，所述OPAC分泌一种或多种如下蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2 Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5或TIMP-2。在一个更加具体的实施方案中，所述OPAC分泌如下蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2 Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5和TIMP-2。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，所述多发性骨髓瘤的一种或多种症状是骨痛、骨细胞损害(例如，通过X射线或磁共振成像(MRI)可见)、骨质疏松症、贫血、高钙血症或由高钙血症引起的症状、或肾衰竭。在另一个具体的实施方案中，所述施用在所述个体中引起骨矿物质密度或骨矿物质含量的可检测增加，或减轻其降低。在另一个具体的实施方案中，所述施用包含对所述个体施用至少1×10⁸个OPAC/kg。在其他具体的实施方案中，所述个体从未被治疗过多发性骨髓瘤；所述个体已被治疗过多发性骨髓瘤而且对非OPAC治疗应答；所述个体已被治疗过多发性骨髓瘤而且对非OPAC治疗无应答，但所述个体中多发性骨髓瘤的进程无进展；或所述个体患有进行性多发性骨髓瘤。

在又一方面，本发明提供了在个体中治疗骨缺损的方法，包括向有此需要的个体施用包含OPAC群的可植入或可注射的组合物，从而在该个体中治疗骨缺损。在某些实施方案中，骨缺损是(a)与癌症相关的溶骨性损害、(b)骨折、(c)需要融合的脊柱、(d)骨不连骨折、或(e)骨质疏松症。在某些实施方案中，溶骨性损害与多发性骨髓瘤、骨癌、或转移性癌相关。在某些实施方案中，骨折是骨不连骨折。在某些实施方案中，对个体施用包含OPAC群的可植入的组合物。在某些实施方案中，可植入的组合物被手术植入。在某些实施方案中，对个体施用包含OPAC群的可注射的组合物。在某些实施方案中，对骨缺损区域手术施用可注射的组合物。在某些实施方案中，可注射的组合物是全身施用的。

在又一方面，本发明提供了在个体中治疗骨缺损的方法，包括向有此需要的个体施用包含OPAC群的可植入或可注射的组合物，其中所述OPAC在该个体中引起或促进骨或骨组织的形成，从而在该个体中治疗骨缺损。在某些实施方案中，骨缺损是(a)与癌症相关的溶骨性损害、(b)骨折、(c)需要融合的脊柱、(d)骨不连骨折、或(e)骨质疏松症。在某些实施方案中，溶骨性损害与多发性骨髓瘤、骨癌、或转移性癌相关。在某些实施方案中，骨折是骨不连骨折。在某些实施方案中，对个体施用包含OPAC群的可植入的组合物。在某些实施方案中，可植入的组合物被手术植入。在某些实施方案中，对个体施用包含OPAC群的可注射的组合物。在某些实施方案中，对骨缺损区域手术施用可注射的组合物。在某些实施方案中，可注射的组合物是全身施用的。

3.1 定义

在包含OPAC的细胞群的上下文中，本发明使用的“基本由...组成”指该细胞群含例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少95％或至少95.5％的OPAC。

本发明使用的术语“OPAC”指下面5.1部分中描述的细胞。

当提及细胞时，本发明使用的“CD200^dim”，指该细胞在流式细胞术中对CD200显示高于同种型对照不超过20-30％的荧光强度。如果群中的至少60％的细胞不表达CD200或者是CD200^dim的，而且细胞群作为一个整体在流式细胞计数测试中显示高于同种型对照不超过40-60％的CD200荧光强度，那么本发明使用的细胞群是CD200^dim的。应注意CD200^dim群可以包含CD200⁺(非dim)细胞。

本发明使用的术语“SH2”指与标记CD105上的表位结合的抗体。因此，被称作SH2⁺的细胞是CD105⁺的。

本发明使用的术语“SH3”和“SH4”指与标记CD73上存在的表位结合的抗体。因此，被称作SH3⁺和/或SH4⁺的细胞是CD73⁺的。

本发明使用的术语“分离的OPAC”指基本与OPAC源自的组织例如绒毛膜中的其它非OPAC分离的OPAC。如果在例如OPAC的收集和/或培养期间，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的与OPAC天然有联系的非OPAC从OPAC中被去除，那么该OPAC是“分离的”。

本发明使用的术语“分离的细胞群”指基本与细胞群源自的组织例如胎盘中的其它细胞分离的细胞群。如果在例如收集和/或培养期间，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的与OPAC群或OPAC群源自的细胞天然有联系的细胞从OPAC群中被去除，那么该OPAC群是“分离的”。

本发明使用的术语“胎盘干细胞”指源自哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞，无论其形态学、细胞表面标记、或原代培养后传代数目如何。但是，本发明使用的术语“胎盘干细胞”并不指滋养层。如果细胞保持干细胞的至少一种特性，例如，与一种或多种类型的干细胞相关的标记或基因表达谱；在培养中复制至少10-40次的能力，分化成全部三个胚层的细胞的能力；缺乏成体(即分化的)细胞特征等，那么细胞被认为是“干细胞”。术语“胎盘干细胞”和“胎盘源干细胞”可以交换使用。

当特定标记可检测到时，本发明使用的细胞对该标记是“阳性的”。例如，OPAC对例如CD105是阳性的，因为对胎盘干细胞，CD105是可检测到的，其量可检测地高于背景(与例如同种型对照比较)。当某个标记可以用来将细胞与至少一种其它细胞类型区分开来时，或当它存在或被细胞表达时可以用来筛选或分离该细胞时，细胞对该标记也是阳性的。类似的，当例如群中的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞表达某个标记时，细胞群对该标记是阳性的。

本发明使用的“成骨细胞”是能够沉积羟磷灰石(骨的主要成分)或分化成能够沉积羟磷灰石的细胞的细胞。“成骨细胞”被特异性预期为包含通常称作成骨细胞或骨细胞的细胞。成骨胎盘贴壁细胞可以分化成可以沉积羟磷灰石的细胞的示范条件，参见下面5.1.6部分。

本发明使用的“基质”指特征是分散遍布在物质中的孔的三维物质。孔适合例如基质内的细胞生长，例如干细胞、OPAC、和/或成骨细胞。示范的基质包括但不限于β-磷酸三钙底物、β-磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、和陶瓷底物。优选地，基质可以被基质的孔中存在的成骨细胞矿化。

4.附图简要描述

图1：通过选择性附着获得的OPAC的基因表达。X轴：log₁₀相对定量碱性磷酸酶基因表达。X轴：实验条件。

图2：通过针对CD34、CD105和CD200的选择性附着，获得的OPAC的免疫表型。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。COL：胶原。10：10％胎牛血清。20：20％胎牛血清。Ctrl：OPAC在指明的表面涂层上培养6天。

图3：通过选择性附着获得的OPAC的成骨标记的免疫表型。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。COL：胶原。10：10％胎牛血清。20：20％胎牛血清。Ctrl：OPAC在指明的表面涂层上培养6天。星号：与CD10⁺、CD34^-、CD105⁺胎盘干细胞对照(水平线)相比的显著差异。

图4：通过选择性附着获得的OPAC的胚胎干细胞标记的免疫表型。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。COL：胶原。10：10％胎牛血清。20：20％胎牛血清。Ctrl：OPAC在指明的表面涂层上培养6天。上水平线：SSEA-3的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺胎盘干细胞表达；下水平线：SSEA-4的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺胎盘干细胞表达。

图5：通过选择性附着获得的OPAC的碱性磷酸酶(AP)活性。

图6：培养扩增的OPAC的免疫表型。

图7：培养扩增的OPAC的碱性磷酸酶活性。基本：生长培养基。OS：成骨培养基。m1：培养基1-20％FBS(Hyclone)/α-MEM，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺。m2：培养基2-间充质干细胞生长培养基(MSCGM；Lonza)。m3：培养基3-10％FBS(间充质干细胞限定FBS，Stem Cell Technologies)/α-MEM，包含100单位/mL、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。

图8：磁激活细胞分选后OPAC的免疫表型(CD200，CD105)。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。m1：培养基1-20％FBS(Hyclone)/α-MEM，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺。m3：培养基3-10％FBS(间充质干细胞限定FBS，Stem Cell Technologies)/α-MEM，包含100单位/mL、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。

图9：磁激活细胞分选后CD200⁺群和流过部分(包含CD200^-细胞)的碱性磷酸酶活性。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。m1：培养基1-20％FBS(Hyclone)/α-MEM，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺。m3：培养基3-10％FBS(间充质干细胞限定FBS，StemCell Technologies)/α-MEM，包含100单位/mL、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。基本：在生长培养基中的AP表达。诱导的：在成骨培养基中的AP表达。

图10：集落形成单位-磁激活细胞分选后绒毛膜源的干细胞群的碱性磷酸酶(CFU-AP)活性。LN：层粘连蛋白。VN：玻连蛋白。FN：纤连蛋白。m1：培养基1-20％FBS(Hyclone)/α-MEM，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺。m3：培养基3-10％FBS(间充质干细胞限定FBS，Stem Cell Technologies)/α-MEM，包含100单位/mL、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。CD200⁺情况是AP表达基本为零。

图11：磁激活细胞分选后OPAC部分的总克隆形成。FN：纤连蛋白。m1：培养基1-20％FBS(Hyclone)/α-MEM，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺。m3：培养基3-10％FBS(间充质干细胞限定FBS，Stem Cell Technologies)/α-MEM，包含100单位/mL、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。PDAC：CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺的组织培养塑料制品贴壁胎盘多能细胞。

图12：成骨刺激后，OPAC的可诱导的骨保护素分泌。

图13：使用RayBiotech 507蛋白RayBio

生物素标记基抗体阵列在OPAC、PDAC^TM、MSC和成纤维细胞中鉴定出的分泌的蛋白的列表。蛋白表达相对于内部阳性对照被分类为：+(低)、++(中)、+++(高)。显示了骨形成蛋白标记(↑)或骨吸收蛋白标记(↓)。

图14：治疗组的骨组织形成的平均量，计分为0-4，4为最大量。

图15：治疗组的头盖骨缺陷位点的骨矿物质密度。

图16：在处死时通过用X-射线测量剩余缺陷得到的具有＞50％缺陷封闭的动物分布。

图17：OPAC和MSC对破骨细胞分化的影响。OC：破骨细胞。对照：没有OPAC或MSC的OPAC和MSC。

图18：OPAC和MSC对多发性骨髓瘤细胞的增殖的影响。OB：由MSC或PDAC在成骨条件下获得的成骨细胞或成骨细胞样细胞。MTT OD：MTT测试中的光学密度；较高的值表明多发性骨髓瘤细胞存活的程度较高。Con MM：来自27位人多发性骨髓瘤患者的多发性骨髓瘤细胞。

图19：OPAC在原代骨髓瘤SCID-rab小鼠中对骨矿物质密度的影响。对照：仅PBS。Pre-Rx：OPAC施用前的骨矿物质密度(BMD)。最终：注射后8-16星期后的骨矿物质密度。使用PIXImus DEXA(GE Medical Systems LUNAR，Madison，WI)，测定植入的骨的骨矿物质密度(BMD)变化。

图20：OPAC在原代骨髓瘤小鼠中对人免疫球蛋白(hIg)水平的影响。Ig：小鼠血清中的人免疫球蛋白。

图21：OPAC在原代骨髓瘤SCID-rab小鼠中对骨量的影响。BMD：骨矿物质密度。BMC：骨矿物质含量。

5.详细描述

5.1 成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)

5.1.1 特征

5.1.1.1 物理和形态学特征

本发明提供的成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)，当在原代培养或细胞培养中培养时，附着到组织培养底物上，例如组织培养容器表面(例如组织培养塑料制品)。培养中的OPAC一般呈现成纤维样星形外观，伴有许多胞质突起从中央细胞体延伸出来。但是，OPAC从形态学上可以与相同条件下培养的成纤维细胞区分开来，因为OPAC一般比成纤维细胞显示更多数量的这样的突起。形态学上，OPAC也可以与造血干细胞区分开来，造血干细胞在培养中一般呈现更圆的或鹅卵石的形态。

5.1.1.2 细胞表面、分子和遗传标记

在一个实施方案中，本发明提供了分离的OPAC(成骨胎盘贴壁细胞)，即分离的细胞，其是贴壁的、成骨的、和从绒毛膜分离的。在一个实施方案中，OPAC不是从绒毛膜裙分离的(无绒毛的)。本发明提供的OPAC和OPAC群表达了大量细胞和遗传标记，它们可以被用来识别和/或分离OPAC或包含OPAC的细胞群。本发明提供的OPAC和包含OPAC的细胞群包括直接从绒毛膜获得的OPAC和含OPAC的细胞群，例如原代培养物。OPAC群也包括例如培养中的两种或多种OPAC的群、在单细胞悬浮液中的OPAC群、和容器例如袋子中的群。在一个具体的实施方案中，OPAC群是细胞培养中的大量OPAC。OPAC不是本领域已知和了解的滋养层、细胞滋养层、胚胎干细胞、或胚胎生殖细胞。

本发明提供了分离的OPAC，其中OPAC是CD200^-或CD200^dim的。在一个具体的实施方案中，OPAC是成骨的。在一个具体的实施方案中，OPAC是骨保护素(OPG；参见例如，GenBank登录号AAB53709)分泌阳性的。骨保护素是成骨细胞分泌的诱饵受体，其与破骨细胞分化因子特异性结合并抑制破骨细胞成熟。因此，OPAC促进骨形成并降低破骨细胞介导的骨量损失。在另一个具体的实施方案中，OPAC是RANKL(核因子κB的受体活化剂)表达阴性的。RANKL是激活破骨细胞的蛋白，破骨细胞参与了骨吸收。因此，OPAC不促进骨吸收。在另一个具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim、且CD105⁺的。在另一个具体的实施方案中，OPAC是α-平滑肌肌动蛋白表达阴性的，这通过例如免疫荧光染色确定。注意到来自胎盘的其它细胞群，例如，在美国专利申请公开号2005/0058631中描述的细胞，是α-平滑肌肌动蛋白阳性的。在另一个具体的实施方案中，OPAC满足α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、或NG2(神经/神经胶质细胞2硫酸软骨素蛋白聚糖)的表达阳性中的一项或多项。在另一个具体的实施方案中，OPAC是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、且骨保护素分泌阳性的。在另一个具体的实施方案中，OPAC显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim、且CD105⁺的，而且满足α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性、或显示可诱导的碱性磷酸酶活性中的一项或多项。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim、且CD105⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性、并显示可诱导的碱性磷酸酶活性。OPAC的CD200表达缺乏或低表达，把OPAC从其它组织培养塑料制品贴壁的胎盘源多能细胞中区分开来，例如PDAC^TM，例如，在Edinger等，美国专利申请公开号2007/0275362中描述的胎盘多能细胞。

在另一个具体的实施方案中，OPAC是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim，且CD105⁺、SSEA3⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性，和/或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim、且CD105⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，OPAC是CD200^-或CD200^dim、CD105⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。OPAC的SSEA3和SSEA4表达提供了OPAC与其它胎盘源细胞的区别，例如，在Hariri，美国专利号7,468,276中描述的组织培养塑料制品贴壁胎盘干细胞。

在某些实施方案中，当胎盘细胞群在允许矿化基质形成的条件下培养时，OPAC在所述群中促进矿化基质的形成。

本发明也提供了包含OPAC的细胞群，其中该细胞群是CD200^-或CD200^dim的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的分离的细胞群，其中所述细胞群不是从绒毛膜裙分离的(无绒毛的)，而且其中所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。在一个具体的实施方案中，所述细胞群是成骨的。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-且CD105⁺的，这通过流式细胞术检测。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^dim且CD105⁺的，这通过流式细胞术检测。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、和/或骨保护素分泌阳性的。在另一个实施方案中，所述细胞群是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、且骨保护素分泌阳性的。在另一个具体的实施方案中，所述细胞群显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在一个更加具体的实施方案中，所述群是CD200^-、CD105⁺的或CD200^dim、CD105⁺的，而且满足α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性中的一项或多项。在一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-、CD105⁺的或CD200^dim、CD105⁺的；是α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性的；并显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在另一个具体的实施方案中，所述细胞群是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。在又一个实施方案中，所述群细胞是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。在又一个实施方案中，所述细胞群是CD200^-和/或CD200^dim、CD105⁺、CD105⁺、SSEA3⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的，是CD105⁺且SSEA4⁺的，而且同时α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。在另一个更加具体的实施方案中，所述细胞群是CD200^-或CD200^dim的；是CD105⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺的，α-平滑肌肌动蛋白的表达阴性、RANKL的表达阴性、NG2的表达阳性、骨保护素的表达阳性，和/或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

在具体的实施方案中，所述群中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是CD200^-的。

本发明进一步提供了分离的OPAC群，其中通过如下步骤来生产所述群：从胎盘中分离绒毛膜组织，其中所述绒毛膜组织不是绒毛膜裙组织(无绒毛的)；用组织破裂酶消化分离的绒毛膜组织，以获得包含OPAC的绒毛膜细胞群；和从所述绒毛膜细胞中分离所述OPAC。在一个具体的实施方案中，组织破裂酶是胰蛋白酶、分散酶或胶原酶。在各种实施方案中，消化绒毛膜组织获得的细胞群内包含的绒毛膜干细胞占所述绒毛膜细胞群的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。

包含OPAC的分离的细胞群，例如OPAC群，可以与其它细胞区分开来，例如，CD200⁺非dim胎盘源贴壁细胞(本发明称作PDAC^TM)，如在例如美国专利号7,468,276和7,255,879以及美国专利公开号2007/02753621中描述的，其公开内容全文在此通过引用并入本发明，这通过例如基因谱显示。PDAC^TM被识别为例如来自胎盘或脐带的CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺非dim细胞，其附着到组织培养表面上，例如组织培养塑料制品上。PDAC^TM可以进一步表征为来自胎盘或脐带的CD10⁺、CD34^-、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺且CD200⁺的细胞，其附着到组织培养表面上，例如组织培养塑料制品上。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

本发明描述的OPAC可以基于一个或多个基因的表达与PDAC^TM区分开来，这些基因的表达或表达程度相对于PDAC^TM对OPAC是特异性的。在一个实施方案中，例如，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述胎盘干细胞在相等条件下生长时，所述细胞群与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞(PDAC^TM)相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP6(骨形态发生蛋白6；参见例如，GenBank登录号NM_001718)、CDH11(钙粘蛋白11，2型，成骨细胞钙粘蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_001797)、COL10A1(胶原，X型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_000493)、COL14A1(胶原，XIV型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_021110)、COL15A1(胶原，XV型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_001855)、COL1A1(胶原，I型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_000088)、COL1A2(胶原，I型，α2；参见例如，GenBank登录号NM_000089)、COL3A1(胶原，III型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_000090)、COL4A3(胶原，IV型，α3；参见例如，GenBank登录号NM_000091)、COL5A1(胶原，V型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_000093)、CSF3(集落刺激因子3(粒细胞)；参见例如，GenBank登录号NM_000759)、CTSK(组织蛋白酶K；参见例如，GenBank登录号NM_000396)、IGF1R(胰岛素样生长因子1受体；参见例如，GenBank登录号NM_000875)、MINPP1(多重肌醇多磷酸组氨酸磷酸酶1；参见例如，GenBank登录号NM_004897)、MMP2(基质金属蛋白酶2(也称作明胶酶A，72kDa明胶酶，72kDaIV型胶原酶)；参见例如，GenBank登录号NM_004530)、MMP9(基质金属肽酶9(也称作明胶酶B，92kDa明胶酶，92kDa IV型胶原酶)；参见例如，GenBank登录号NM_004994)、MSX1(msh同源框1；参见例如，GenBank登录号NM_002448)、SMAD1(SMAD家族成员1；参见例如，GenBank登录号NM_001003688)、SMAD3(SMAD家族成员3；参见例如，GenBank登录号NM_005902)、TGFB3(转化生长因子，β3；参见例如，GenBank登录号NM_003239)、TGFBR1(转化生长因子，β受体1；参见例如，GenBank登录号NM_004612)和VEGFB(血管内皮生长因子B；参见例如，GenBank登录号XM_001128909)中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，所述细胞群与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP3(骨形态发生蛋白3；参见例如，GenBank登录号NM_001201)、CDH11、COL10A1、COL14A1、COL15A1、DMP1(牙本质基质酸性磷蛋白1；参见例如，GenBank登录号NG_008988)、DSPP(牙本质涎磷蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_014208)、ENAM(釉蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_031889)、FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2；参见例如，GenBank登录号NM_000141)、MMP10(基质金属蛋白酶10(基质分解素2)；参见例如，GenBank登录号NM_002425)、TGFB3、和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述生长培养基是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN(成釉蛋白(釉基质蛋白)；参见例如，GenBank登录号NM_031889)、BMP2(骨形态发生蛋白2；参见例如，GenBank登录号NM_001200)、CALCR(降钙素受体；参见例如，GenBank登录号NM_001742)、CDH11、COL11A1(胶原XI型，α1；NM_001854)、COL14A1、COL15A1、COL2A1(胶原II型，α1；参见例如，GenBank登录号NM_001844)、CSF2(集落刺激因子2；NM_000758)、CSF3、DMP1、DSPP、ENAM、FGF3、GDF10(生长分化因子10；参见例如，GenBank登录号NM_004962)、IGF1(胰岛素样生长因子1；参见例如，GenBank登录号NM_000618)、ITGA1(整联蛋白，α1(CD49)；参见例如，GenBank登录号NM_181501)、ITGA2(整联蛋白，α2(CD49B)；参见例如，GenBank登录号NM_002203)、MMP10、MMP8(基质金属蛋白酶8(中性粒细胞胶原酶)；参见例如，GenBank登录号NM_002424)、MMP9、PDGFA(血小板源生长因子A；参见例如，GenBank登录号XM_001126441)、SMAD1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2(转化生长因子β，受体2；参见例如，GenBank登录号NM_001024847)中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述成骨培养基是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、和100nM地塞米松。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述细胞群例如OPAC与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CDH11、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、MMP10、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG(α-2-HS-糖蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_001622)、ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏；参见例如，GenBank登录号NM_000478)、EGF(表皮生长因子；参见例如，GenBank登录号NM_001963)、FLT1(fms相关的酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体)；参见例如，GenBank登录号NM_002019)、IGF2、ITGA2、ITGAM(整联蛋白，αM(补体成分3受体3亚基)；参见例如，GenBank登录号NM_000632)、SCARB1(清道夫受体B类，成员1；参见例如，GenBank登录号NM_005505)、SOX9(SRY(性别决定区Y)-盒9；参见例如，GenBank登录号NM_000346)、TNF、TWIST1(扭曲同系物1；以前称作睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂3，尖头并指趾畸形3；参见例如，GenBank登录号NM_000474)、VCAM1(血管细胞粘附分子1；参见例如，GenBank登录号NM_001078)和/或VDR中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述生长培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BGN、COL11A1、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、FGF1和/或VCAM1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述成骨培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、和100nM地塞米松。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述细胞群例如OPAC与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达VCAM1，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

基因谱也显示，包含OPAC的分离细胞群例如OPAC群，可以与间充质干细胞例如骨髓源间充质干细胞区分开来。在一个实施方案中，例如，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述干细胞在相等条件下生长时，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CD36、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、CSF2、CTSK、FGF2、FGFR1、FLT1、ITGA1、MINPP1、MMP9、MSX1、PDGFA、SERPINH1、TGFB3和TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述间充质干细胞在生长培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、CALCR、CD36、CDH11、COL12A1、COL14A1、COL15A1、COL3A1、COL5A1、DMP1、DSPP、FLT1、MSX1、PDGFA、TGFB3、TGFBR1和/或TUFT1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述生长培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述间充质干细胞在成骨培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、CALCR、COL14A1、COL15A1、CSF3、DMP1、DSPP、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP9、MSX1、PDGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述成骨培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、和100nM地塞米松。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CALCR、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、MSX1、PDGFA、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在另一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述间充质干细胞在生长培养基中培养时，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1和/或SOX1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述生长培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述间充质干细胞在成骨培养基中培养时，所述细胞群与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、BGLAP、BGN、BMP3、BMP5、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL2A1、COL4A3、COMP、EGF、FGF1、FGFR2、IGF2、MMP8、PHEX、RUNX2(runt-相关转录因子2；参见例如，GenBank登录号NM_001015051)、SCARB1、SOX1、VCAM1和/或VEGFB中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，所述成骨培养基是成骨培养基，是αMEM/20％胎牛血清，包含100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、和100nM地塞米松。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中不管所述OPAC和所述间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述细胞群例如OPAC与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较低水平(例如至少低两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、SCARB1和/或SOX9中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在另一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中不管所述OPAC、所述胎盘干细胞、和所述骨髓源间充质干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，所述细胞群例如OPAC与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞和相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括COL14A1、COL14A2、DMP、DSPP、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在另一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

基因谱也确认，包含OPAC的分离的细胞群例如OPAC群可以与人真皮成纤维细胞区分开来。在一个实施方案中，例如，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中当OPAC和所述成纤维细胞在相等条件下生长时，所述细胞群与相等数目的真皮成纤维细胞相比以可检测的较高水平(例如至少高两倍的水平)表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、FLT1、IGF1R、ITGA1、MINPP1、PDGFA、SERPINH1、SMAD3、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TNF、TUFT1、VCAM1和VEGFA中的一个或多个，或全部，其中这些基因在OPAC中的表达比在成纤维细胞中要高，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基的表达的增加，比在相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少高十倍，其中所述贴壁CD200⁺胎盘干细胞不是滋养层或细胞滋养层，而且其中所述一个或多个基因包括BMP2、CSF3、ITGA2、MMP9、MMP10、和/或TGFB2中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，比在相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少低十倍，其中所述贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞不是滋养层或细胞滋养层，而且其中所述一个或多个基因包括COL1A1、COL11A1、COL4A3、COL5A1、COMP(软骨寡聚基质蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_000095)、CTSK、FGF1(成纤维细胞生长因子1；参见例如，GenBank登录号NM_000800)、和/或FGFR2中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，比在相等数目的骨髓源间充质干细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少高十倍，而且其中所述一个或多个基因包括CSF3、IGF2、ITGA2、ITGA3、MMP9、MMP10、和/或TGFB2中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，比在相等数目的骨髓源间充质干细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少低十倍，而且其中所述一个或多个基因包括ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏)、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL1A1、COL4A3、COMP、CTSK、FGF1、和/或FGFR2中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，比在相等数目的成纤维细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少高十倍，而且其中所述一个或多个基因包括BMP2、CSF2、CSF3、IGF1、ITGA2、MMP9和/或MMP10中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，其中在所述细胞群中，例如在OPAC中，一个或多个基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，比在相等数目的成纤维细胞中所述一个或多个所述基因在成骨培养基中的表达相对于在生长培养基中的表达的增加，至少低十倍，而且其中所述一个或多个基因包括BMP4、COL12A1、COMP、FGF1、和/或MMP8中的一个或多个，或全部。在一个具体的实施方案中，细胞群基本由OPAC组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中编码基质金属肽酶9(MMP9)的基因在所述OPAC中在成骨培养基中被诱导时与MMP9在生长培养基中的表达的比值，和所述MMP9在所述成骨培养基中被诱导时与MMP9在所述生长培养基中的表达的比值相比，至少大2、3、4或5个数量级，这通过例如来自实时定量PCR的Ct值来评估。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中所述群与相等数目的贴壁CD200⁺非dim胎盘干细胞相比至少高十倍地表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因是CHRD(腱蛋白；参见例如，GenBank登录号NM_003741)、GDF7(生长分化因子7；参见例如，GenBank登录号NM_182828)、IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3；参见例如，GenBank登录号NM_000598)、和/或INHA(抑制素α；参见例如，GenBank登录号NM_002191)。在另一个实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中所述群与相等数目的贴壁CD200⁺(非dim)胎盘干细胞相比以至少低十倍的水平表达TGFB2。

在其他实施方案中，本发明提供了包含OPAC的细胞群，例如OPAC群，其中OPAC表达α-平滑肌肌动蛋白，这通过免疫荧光染色可检测到，而且其中所述细胞与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以大约相同水平或增加的水平表达纤连蛋白-1基因(FN1)和/或TGF-β2基因(TGFB2)。

这些基因的表达水平可以用来确认OPAC群的身份，以识别包含至少大量OPAC的细胞群等。OPAC群可以是无性系的，例如由单一OPAC扩增的OPAC群，或混合的OPAC群，例如仅包含由多个OPAC扩增的OPAC的细胞群，或包含OPAC和至少一种其它细胞类型的细胞群。

这些基因的表达水平可以用来筛选OPAC的群。例如，如果在来自细胞群的样本中这些基因中的一个或多个的表达比在相等间充质干细胞群中的表达显著升高，那么可以筛选细胞例如克隆扩增的细胞的群。这样的筛选可以对来自大量胎盘干细胞或绒毛膜干细胞群的群，来自大量其身份未知的细胞群的群等。

OPAC和包含OPAC的细胞群，可以根据一个或多个这样的基因的表达水平与所述一个或多个基因在间充质干细胞对照中的表达水平相比较来筛选。在一个实施方案中，所述一个或多个基因在包含相等数目间充质干细胞的样本中的表达水平被用作对照。在另一个实施方案中，对在某些条件下测试的OPAC，对照是代表所述条件下所述一个或多个基因在间充质干细胞中的表达水平的数值。

OPAC和包含OPAC的细胞群也可以根据一种或多种分泌的蛋白的表达与对照(例如胎盘干细胞、间充质干细胞或成纤维细胞)中的表达水平相比较来筛选。在一个实施方案中，根据核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2 Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-β R1/ALK5和TIMP-2中的一种或多种的分泌，OPAC可以与胎盘干细胞、间充质干细胞或成纤维细胞区分开来，与贴壁CD200⁺(非dim)胎盘干细胞、间充质干细胞或成纤维细胞相比，它们是OPAC所独有的。在另一个实施方案中，由OPAC但不由PDAC^TM分泌的蛋白包括一种或多种组织因子、卵泡抑素样1、IGF-IIR、sFRP-4和TSG-6。

上面描述的OPAC的分离的群和OPAC群一般可以包含大约、至少、或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的OPAC。

5.1.1.3 在培养中生长

OPAC的生长，和任意哺乳动物细胞一样，部分取决于选择供生长的特定培养基。在最适条件下，OPAC典型地在1-3天中数目倍增。在培养期间，本发明提供的OPAC在培养中附着到底物上，例如组织培养容器表面(例如，组织培养皿塑料制品、纤连蛋白涂层的塑料制品等)上，并形成单层。

5.1.2 获得OPAC的方法

5.1.2.1 细胞收集组合物

本发明进一步提供了收集和分离OPAC的方法。一般地，OPAC是使用生理学可接受的溶液例如细胞收集组合物从绒毛膜获得的。细胞收集组合物在美国申请公开号2007-0190042中详细描述，其公开内容全文通过引用并入本发明。

细胞收集组合物可以包含任何适合收集和/或培养细胞例如OPAC的生理学可接受的溶液，例如盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、Kreb′s溶液、改良的Kreb′s溶液、Eagle′s溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如DMEM、H.DMEM等)等。

细胞收集组合物可以包含一种或多种成分，其有利于贮存OPAC，即从收集的时间到培养的时间防止OPAC死亡、或延迟OPAC的死亡、降低细胞群中死亡的OPAC数目等。这样的成分可以是例如凋亡抑制剂(例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药物、心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或载氧全氟化碳(例如，全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。

细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶、或脱氧核糖核酸酶等。这样的酶包括但不限于胶原酶(例如，胶原酶I、II、III或IV，来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶等。

细胞收集组合物可以包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方案中，抗生素是大环内酯类(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在一个特定的实施方案中，抗生素对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌，例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有活性。

细胞收集组合物也可以包含一种或多种以下化合物：腺苷(约1mM到约50mM)；D-葡萄糖(约20mM到约100mM)；镁离子(约1mM到约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方案中，以足以保持内皮完整和细胞生存能力的量存在(例如，合成的或天然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，以约25g/l到约100g/l、或约40g/l到约60g/l存在)；抗氧化剂(例如，丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM到约100μM存在)；还原剂(例如，N-乙酰半胱氨酸，以约0.1mM到约5mM存在)；防止钙进入细胞的药剂(例如，异搏定，以约2μM到约25μM存在)；硝酸甘油(例如，约0.05g/L到约0.2g/L)；抗凝剂，在一个实施方案中，以足以帮助防止残留血凝结的量存在(例如，肝素或水蛭素，以浓度约1000单位/l到约100,000单位/l存在)；或包含氨氯吡咪的化合物(例如，氨氯吡咪、乙基异丙基氨氯吡咪、六亚甲基氨氯吡咪、二甲基氨氯吡咪或异丁基氨氯吡咪，以约1.0μM到约5μM存在)。

5.1.2.2 胎盘的收集和处理

一般地，人类胎盘在产后排出不久后回收。在一个优选的实施方案中，胎盘在患者知情同意后，且在取得患者的完整病史并与胎盘相关联后，从患者处回收。优选地，病史延续到分娩以后。这样的病史可以用来协调由其分离的绒毛膜或OPAC的后续应用。例如，根据病史，OPAC可以作为个体化药物，用于与获得绒毛膜的胎盘相关联的婴儿，或婴儿的双亲、兄弟姐妹或其它亲属。

在某些实施方案中，在回收OPAC前，从将要去除绒毛膜的胎盘中去除脐带血和胎盘血。在某些实施方案中，分娩后，回收胎盘中的脐带血。胎盘可以提交给常规脐带血回收程序。典型地使用针或插管，在重力的帮助下将胎盘放血(参见例如，Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等，美国专利号5,415,665)。针或插管通常放置在脐静脉中，而且胎盘可以被轻揉以帮助从胎盘中排出脐带血。这样的脐带血回收可以被商业执行，例如，LifeBank USA，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选地，胎盘被重力排空，不需要进一步操作，使得脐带血回收期间，组织破坏最小化。

典型地，将胎盘从分娩或生育室运输到另一场所，例如实验室，以回收脐带血和收集细胞。胎盘优选在无菌隔热的运输设备中运输(将胎盘温度保持在20-28℃之间)，例如，将夹紧了近端脐带的胎盘放置在无菌的带拉链锁的塑料袋中，然后将其放置在隔热容器中。在另一个实施方案中，在脐带血收集试剂盒中运输胎盘，基本如2005年9月19日提交的未决的美国专利申请号11/230,760中所述。优选地，在分娩四到二十四小时后，将胎盘送达实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前将近端脐带夹紧，优选地，将插入到胎盘面内4-5cm(厘米)处夹紧。在其它实施方案中，在脐带血回收后、胎盘的进一步处理前，夹紧近端脐带。

在OPAC收集前，胎盘可以在室温或5℃到25℃(摄氏度)温度下，在无菌条件下贮存。在灌注胎盘以去除任何残留的脐带血前，胎盘可以贮存比四十八小时更长的时间，而且优选地贮存四到二十四小时的时间。胎盘优选地在抗凝溶液中贮存，温度5℃到25℃(摄氏度)。适合的抗凝溶液是本领域熟知的。例如，肝素或华法林钠溶液可以被使用。在一个优选的实施方案中，抗凝溶液包含肝素溶液(例如，1％w/w，1∶1000溶液中)。放过血的胎盘优选地在OPAC收集前贮存不超过36小时。

5.1.2.3 绒毛膜组织的物理破坏和酶消化

在一个实施方案中，通过器官的物理破坏，例如酶消化，从哺乳动物胎盘收集OPAC。例如，当与本发明提供的细胞收集组合物接触时，绒毛膜或其一部分可以被例如压碎、剪切、剁碎、切丁、切块、浸渍等，并将得到的组织随后用一种或多种酶消化。绒毛膜或其一部分也可以被物理破坏并用一种或多种酶消化，并然后将得到的材料浸入细胞收集组合物中，或与其混合。可以使用任何物理破坏方法，只要该破坏方法让所述器官中留下大量、更加优选地大多数、而且更加优选地至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％的存活细胞，这通过例如台盼蓝排除法确定。典型地，OPAC可以通过破坏小块绒毛膜获得，例如，体积约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米的胎盘组织块。

优选的细胞收集组合物包含一种或多种组织破裂酶。绒毛膜的酶消化优选地使用酶的组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如胶原酶和分散酶的组合。在其他实施方案中，绒毛膜组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和供消化透明质酸的粘液分解酶的组合，例如胶原酶、分散酶、和透明质酸酶的组合，或LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合。可以用来破坏绒毛膜组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以被血清中的α2微球蛋白抑制，因此消化使用的介质通常不含血清。EDTA和脱氧核糖核酸酶一般在酶消化程序中被使用，以增加细胞回收的效率。消化物(由酶消化得到的组织和细胞)优选地被稀释，以避免OPAC被捕获在粘性消化内。

组织消化酶的典型浓度包括例如，胶原酶I和胶原酶IV：50-200U/mL，分散酶：1-10U/mL，弹性蛋白酶：10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即两种或多种蛋白酶在同一个消化反应中使用，或者可以相继使用，以释放OPAC。例如，在一个实施方案中，绒毛膜组织首先用适量的2mg/ml胶原酶I消化30分钟，接着用0.25％胰蛋白酶消化，37℃，10分钟。丝氨酸蛋白酶优选地在其它酶使用后连续地使用。

在一个具体的实施方案中，OPAC如下获得：从绒毛膜组织中分离羊膜；剁碎绒毛膜组织，例如剁碎成大约1mm³的块；在分散酶II中，例如约1、2、3、4或5U/mL，例如2.4U/mL，消化组织足够时间，例如约1小时；用约100、200、300、400或500U/mL胶原酶II，例如约270U/ml，消化足够时间，例如约1小时，接着是酶中和，收集单一细胞，并在合适的培养基中培养绒毛膜细胞，例如20％FBS/αMEM。

在另一个实施方案中，在用细胞收集组合物分离干细胞之前，可以通过向包含干细胞的细胞收集组合物中、或向破坏和/或消化组织的溶液中添加螯合剂，例如，乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N，N，N′N′-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)进一步破坏组织。

应该理解，当完整绒毛膜或绒毛膜的一部分包含胎儿和母体双方的细胞时，收集到的OPAC可以包含源自胎儿和母体双方来源的OPAC的混合。当绒毛膜的一部分不包含或包含可以忽略数目的母体细胞(例如羊膜)时，收集到的OPAC将包含几乎专属于胎儿的胎盘细胞。

在一个实施方案中，OPAC如下从绒毛膜组织分离。获得并剁碎绒毛膜组织，例如剁碎成大约1-2mm³的块。剁碎的组织用分散酶II消化，浓度例如约1U/mL到约10U/mL，例如2.4U/mL，直到消化完成，例如，在37℃消化1小时。消化的组织然后用胶原酶II消化，例如约100U/mL到约1000U/mL，例如约27U/mL，直到消化完成，例如，在37℃消化约1小时。通过离心收集细胞，洗涤，在玻连蛋白涂层或层粘连蛋白涂层的组织培养容器上培养，在10％FBS/DMEM或20％FBS/αMEM中培养大约6天。在6天的培养中，去除未贴壁的细胞，让贴壁细胞增殖。当细胞达到约80％到90％的融合时，使用例如胰蛋白酶，移走细胞并转移到玻连蛋白涂层或层粘连蛋白涂层的组织培养容器中。当细胞在层粘连蛋白涂层的容器上初代培养时，转移到层粘连蛋白涂层的培养容器中是优选的；类似地，当细胞在玻连蛋白涂层的容器上初代培养时，转移到玻连蛋白涂层的培养容器中是优选的。细胞在转移到第二块板前任选地冷冻贮存。细胞通过例如流式细胞术分析，并确定为例如CD34^-、CD105⁺、CD200^-和/或CD200^dim的，碱性磷酸酶(AP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨保护素(OP)阳性的。

因此，一方面，本发明提供了分离成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)的方法，包括连续地用分散酶II然后用胶原酶II消化绒毛膜组织，以产生细胞群；在第一个玻连蛋白涂层的表面或层粘连蛋白涂层的表面培养所述细胞群约六天，其中所述细胞群包含贴壁细胞和未贴壁细胞；和去除未贴壁细胞；将贴壁细胞转移到第二个玻连蛋白涂层的表面或层粘连蛋白涂层的表面，其中所述贴壁细胞是OPAC。在具体的实施方案中，所述OPAC是CD34^-、CD105⁺、CD200^dim、AP⁺、α-SMA⁺和OP⁺中的一项或多项的。在其他实施方案中，OPAC具有任意本发明别处描述的细胞或遗传特征。

5.1.3 OPAC的培养

5.1.3.1 培养基

分离的OPAC或OPAC群可以用来起始或接种细胞培养。细胞一般被转移到无菌组织培养容器中。容器优选地用玻连蛋白、纤连蛋白或两者同时涂层。在某些其它的实施方案中，组织培养容器是未涂层的，或涂层了细胞外基质或配体例如层粘连蛋白、胶原(例如天然的或变性的)、明胶、鸟氨酸、和/或细胞外膜蛋白(例如，MATRIGEL(BD Discovery Labware，Bedford，Mass.))。

优选地，OPAC如下获得。通过消化绒毛膜组织，例如用分散酶II和胶原酶II如上文所述消化，获得的包含OPAC的绒毛膜细胞在用胶原、玻连蛋白、或层粘连蛋白涂层的组织培养表面上初代培养，例如在20％FBS/αMEM中约1-6天，接着或同时去除未贴壁的细胞；未贴壁的细胞可以去除数次，例如培养3小时、1天和6天后，或去除一次，例如培养6天后。选择性附着后，筛选OPAC，通过例如使用对CD200的抗体去除CD200⁺(非dim)细胞，留下CD200^dim/CD200^-细胞的群。

OPAC可以在本领域公认的干细胞培养可接受的任何培养基中和任何条件下培养。优选地，培养基包含血清。OPAC可以在例如DMEM-LG(Dulbecco′s改良的必需培养基，低葡萄糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基本培养基)，包含ITS(胰岛素-铁传递蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1、和青霉素/链霉素；DMEM-HG(高葡萄糖)，包含10％胎牛血清(FBS)；DMEM-HG，包含15％FBS；IMDM(Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基)，包含10％FBS、10％马血清、和氢化可的松；M199，包含10％FBS、EGF、和肝素；α-MEM(最低必需培养基)，包含10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素；DMEM，包含10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素；等培养基中培养。优选的培养基是DMEM-LG/MCDB-201，包含2％FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、和青霉素/链霉素。

可以用来培养OPAC的其它培养基包括DMEM(高或低葡萄糖)、Eagle′s基本培养基、Ham′s F10培养基(F10)、Ham′s F-12培养基(F12)、Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz′s L-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高级DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)、和CELL-GRO FREE。

培养基可以补充一种或多种成分，包括例如血清(例如，胎牛血清(FBS)，优选地约2-15％(v/v)；马(马)血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选地约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，以控制微生物污染，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素、和制霉菌素，单独或组合添加。

OPAC可以在标准组织培养条件下培养，例如，在组织培养皿或多孔板中。OPAC也可以使用悬滴法培养。在这一方法中，OPAC在约5mL培养基中悬浮，浓度约1×10⁴个细胞/mL，而且一滴或数滴培养基被放置到组织培养容器例如100mL培养皿的盖子内部。液滴可以是例如单滴或来自例如多通道移液管的多滴。盖子被小心地翻转，放置到包含一体积液体例如无菌PBS的皿底顶部，并培养细胞，该液体足以保持皿环境中的水分含量。

5.1.3.2 OPAC的扩增和增殖

一旦获得了分离的OPAC，或分离的OPAC群(例如，OPAC或OPAC群与至少约50％的在体内OPAC或OPAC群通常与其关联的绒毛膜细胞分离)，该OPAC或OPAC群可以在体外增殖和扩增。例如，OPAC群可以在组织培养容器例如培养皿、烧瓶、多孔板等中培养足够的时间，让细胞增殖到70-90％融合，即，直到细胞及其后代占据了组织培养容器的70-90％的培养表面面积。

OPAC可以在允许细胞生长的密度接种到培养容器中。例如，细胞可以在低密度(例如，约1,000到约5,000个细胞/cm²)到高密度(例如，约50,000个或更多细胞/cm²)接种。在一个优选的实施方案中，细胞在约0到约5％体积比CO₂的空气中培养。在一些优选的实施方案中，细胞在约2％到约25％O₂的空气中，优选地在约5％到约20％O₂的空气中培养。细胞优选地在约25℃到约40℃培养，优选地在37℃。细胞优选地在培养箱中培养。培养基可以是静止或搅拌的，例如使用生物反应器。OPAC优选地在低氧化应激下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)生长。

一旦获得70％-90％融合，细胞可以传代。例如，细胞可以使用本领域熟知的技术被酶处理，例如胰蛋白酶处理，将它们从组织培养表面分离。通过移液移走细胞并计数细胞后，将约20,000-100,000个细胞，优选地约50,000个细胞，传代到包含新鲜培养基的新培养容器中。典型地，新培养基和细胞转移前的培养基是同一类型的。本文提供的是已传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、或20次或更多的胎盘细胞群。

5.1.3.3 OPAC群

本发明进一步提供了OPAC群。OPAC可以直接从来自一个或多个胎盘的绒毛膜分离。本发明提供的分离的OPAC也可以被培养和扩增，以产生OPAC群。包含OPAC的绒毛膜细胞群也可以被培养和扩增，以产生OPAC群。

本发明提供的OPAC群包含OPAC，例如本发明描述的OPAC。在各种实施方案中，分离的细胞群中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是OPAC。即OPAC群可以包含例如差不多1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非OPAC细胞。

本发明提供了通过例如从绒毛膜筛选表达特定标记和/或特定培养或形态学特征的细胞以生产OPAC的分离群的方法。在一个实施方案中，例如，本发明提供了生产细胞群的方法，包括筛选附着到底物上并表达CD105但不表达CD200的绒毛膜细胞；和将所述细胞与其它绒毛膜细胞分离，以形成细胞群，例如OPAC群。在一个具体实施方案中，将同时是NG2⁺、骨保护素⁺、α平滑肌肌动蛋白阴性、和/或显示可诱导的碱性磷酸酶活性的CD105⁺、CD200^-绒毛膜细胞与其它绒毛膜细胞分离。

在以上实施方案中，底物可以是任何可以在其上实现细胞例如OPAC的培养和/或筛选的表面。典型地，底物是塑料制品，例如组织培养皿或多孔板塑料制品。组织培养塑料制品可以用生物分子涂层，例如层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原或纤连蛋白涂层。

OPAC和OPAC群可以通过任何本领域已知的细胞筛选手段来筛选。例如，可以使用针对一个或多个细胞表面标记的抗体或抗体组合来筛选细胞，例如，在流式细胞术或FACS中筛选。可以使用抗体与磁珠结合来实现筛选。特异性针对某些干细胞相关标记的抗体是本领域已知的。例如，CD200(Abeam)或CD105(Abeam；BioDesign International，Saco，ME)等可以用来筛选OPAC或OPAC群。

OPAC群可以包含并非OPAC的绒毛膜细胞，或并非绒毛膜细胞或OPAC的细胞。

分离的OPAC群可以与一个或多个非OPAC细胞或非绒毛膜细胞群组合。例如，分离的OPAC群可以与血(例如胎盘血或脐带血)、血液源干细胞(例如，源自胎盘血或脐带血的干细胞)、血液源有核细胞群、骨髓源间充质细胞、骨来源干细胞群、未处理的骨髓、成体(身体的)干细胞、组织内包含的干细胞群、培养的干细胞、完全分化的细胞(例如、软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌肉细胞、心脏细胞等)的群等组合。分离的OPAC群中的细胞可以与另一类型的多种细胞组合，与各个群中的总有核细胞数目相比比率为约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1；1∶2；1∶5；1∶10；1∶100；1∶200；1∶500；1∶1,000；1∶2,000；1∶5,000；1∶10,000；1∶20,000；1∶50,000；1∶100,000；1∶500,000；1∶1,000,000；1∶2,000,000；1∶5,000,000；1∶10,000,000；1∶20,000,000；1∶50,000,000；或约1∶100,000,000。分离的OPAC群中的细胞也可以与多种细胞类型的多种细胞组合。

在一个实施方案中，分离的OPAC群与多种造血干细胞组合。这样的造血干细胞可以包含在例如未处理的胎盘血、脐带血或外周血内；来自胎盘血、脐带血或外周血的总有核细胞中；来自胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34⁺细胞群中；未处理的骨髓中；来自骨髓的总有核细胞中；来自骨髓的分离的CD34⁺细胞群中，等等。

5.1.4 OPAC和胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞的组合

本发明提供了胎盘灌注液与分离的胎盘灌注液细胞和/或本发明提供的OPAC的组合。在一个实施方案中，例如，本发明提供了一定体积的补充了大量胎盘灌注液细胞和/或大量OPAC的胎盘灌注液。在具体的实施方案中，例如，每毫升胎盘灌注液补充了约1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶或更多的胎盘灌注液细胞或OPAC。在另一个实施方案中，多种胎盘灌注液细胞补充了胎盘灌注液和/或OPAC。在另一个实施方案中，多种OPAC补充了胎盘灌注液和/或大量胎盘灌注液细胞。在某些实施方案中，当灌注液用来补充时，灌注液的体积是细胞(在溶液中)+灌注液总体积的约、大于约、或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。当胎盘灌注液细胞用来补充多种OPAC时，胎盘灌注液细胞一般包含胎盘灌注液细胞+OPAC总数目的约、大于约、或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。类似地，当OPAC用来补充大量胎盘灌注液细胞时，OPAC一般包含胎盘灌注液细胞+OPAC总数目的约、大于约、或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。当OPAC或胎盘灌注液细胞用来补充胎盘灌注液时，悬浮细胞在的溶液(例如，盐水溶液、培养基等)的体积，包含灌注液+细胞总体积的约、大于约、或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％，其中在补充前OPAC被悬浮为约1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸或更多个细胞每毫升。

本发明进一步提供了由两个或多个来源获得的合并胎盘灌注液，例如，来自两个或多个胎盘并组合例如合并。这样的合并灌注液可以包含来自每个来源的大约等体积的灌注液，或可以包含来自每个来源的不同体积。来自每个来源的相对体积可以被随机选择，或可以基于例如一种或多种细胞因子例如细胞因子、生长因子、激素等的浓度或量；来自每个来源的灌注液中胎盘细胞的数目；或来自每个来源的灌注液的其它特征来选择。来自同一胎盘的多次灌注的灌注液可以类似地被合并。

类似地，本发明提供了从两个或多个来源，例如两个或多个胎盘和/或绒毛膜获得并合并的胎盘灌注液细胞和OPAC。这样的合并细胞可以包含来自两个或多个来源的大约相等数目的细胞，或来自一个或多个合并来源的不同数目的细胞。来自每个来源的细胞的相对数目可以基于例如将要合并的细胞中一个或多个特定细胞类型的数目来选择，例如CD34^-干细胞数目等。

合并物可以包含，例如，补充了胎盘灌注液细胞的胎盘灌注液；补充了OPAC的胎盘灌注液；补充了胎盘灌注液细胞和OPAC的胎盘灌注液；补充了胎盘灌注液的胎盘灌注液细胞；补充了OPAC的胎盘灌注液细胞；补充了胎盘灌注液和OPAC的胎盘灌注液细胞；补充了胎盘灌注液的OPAC；补充了胎盘灌注液细胞的OPAC；或补充了胎盘灌注液细胞和胎盘灌注液的OPAC。

在某些实施方案中，胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞、和OPAC作为药物级可施用单位提供。这样的单位可以以离散体积，例如100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等提供。这样的单位可以被提供成使得其包含指定数目的例如胎盘灌注液细胞、胎盘灌注液源中间体自然杀伤细胞、或两者，例如，1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸或更多细胞每毫升，或1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多细胞每单位。这样的单位可以被提供为包含指定数目的胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞、和/或OPAC中的任意两种或全部三种。

在胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞和/或OPAC的以上组合中，胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞和/或OPAC中的任意一种、任意两种或全部三种，可以对受体是自体的(即，从受体获得)、或对受体是同源的(即，从所述受体以外的至少一个其它个体获得)。

本发明也提供了包含OPAC与胎盘灌注液细胞和/或胎盘灌注液的组合的组合物。因此，另一方面，本发明提供了包含分离的OPAC的组合物，其中所述胎盘干细胞是从胎盘灌注液分离的，而且其中所述OPAC包含组合物中的至少50％的细胞。在一个具体的实施方案中，所述OPAC包含组合物中的至少80％的细胞。在另一个具体的实施方案中，组合物包含分离的胎盘灌注液。在一个更加具体的实施方案中，所述胎盘灌注液与所述OPAC来自相同个体。在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘灌注液包含与所述OPAC来自不同个体的胎盘灌注液。在另一个具体的实施方案中，组合物包含胎盘灌注液细胞。在一个更加具体的实施方案中，所述胎盘灌注液细胞与所述OPAC来自相同个体。在另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘灌注液细胞与所述OPAC来自不同个体。在另一个具体的实施方案中，组合物额外包含分离的胎盘灌注液和分离的胎盘灌注液细胞，其中所述分离的灌注液和所述分离的胎盘灌注液细胞来自不同个体。在任何以上包含胎盘灌注液的实施方案的另一个更加具体的实施方案中，所述胎盘灌注液包含来自至少两个个体的胎盘灌注液。在任何以上包含胎盘灌注液细胞的实施方案的另一个更加具体的实施方案中，所述分离的胎盘灌注液细胞来自至少两个个体。

5.1.5 OPAC细胞库的生产

来自产后绒毛膜的OPAC可以用许多不同的方法培养，以生产一组批次，例如，一组可个体施用的剂量。从多种绒毛膜获得的多组OPAC批次可以排列在OPAC库中，供例如长期贮存。一般地，从绒毛膜材料的初代培养获得OPAC，以形成种子培养物，其在可控条件下扩增，由大约相等数目的倍增形成细胞群。批次优选地源自单一胎盘的绒毛膜组织，但可以源自大量胎盘的组织。

在一个实施方案中，OPAC批次如下获得。首先破坏绒毛膜组织，例如通过剁碎，用合适的酶消化，例如分散酶、或者分散酶和胶原酶(参见上面5.2.3部分)。绒毛膜组织优选地包含例如来自单一胎盘的完整绒毛膜，但可以包含绒毛膜的仅一部分。消化的组织培养例如约1-3星期，优选地约2星期。去除未贴壁细胞后，收集形成的高密度克隆，例如通过胰蛋白酶处理收集。收集这些细胞并在方便体积的培养基中重悬，并定义为0代细胞。

然后使用0代细胞来接种扩增培养。扩增培养可以是分开的细胞培养装置的任意排列，例如NUNC^TM的细胞工厂。0代培养中的细胞可以再分到任意程度，使得用例如1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、或10×10⁴个细胞来接种扩增培养。优选地，使用约2×10⁴到约3×10⁴个0代细胞来接种每个扩增培养。扩增培养的数目可以取决于0代细胞的数目，而且数目可以多一些或少一些，取决于由其获得OPAC的特定绒毛膜。

扩增培养生长，直到培养中的细胞密度达到某个值，例如，约1×10⁵个细胞/cm²。这时细胞可以被收集并冷冻贮存，或如上面描述的传代到新的扩增培养中。在使用前，细胞可以传代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在扩增培养期间，优选地保持群倍增累积次数的记录。来自0代培养的细胞可以扩增到2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增，或直到60次倍增。但是，优选地，在将细胞群分成个体剂量前，群倍增次数在约15到约30之间，优选地约20次倍增。在扩增过程中，细胞可以连续地培养，或可以在扩增期间的一个或多个点冷冻。

用于个体剂量的细胞可以被冷冻，例如冷冻贮存，供以后使用。个体剂量可以包含例如约一百万到约一亿个细胞每ml，而且可以包含总计约10⁶到约10⁹个之间的细胞。

在方法的一个具体实施方案中，0代细胞被培养到大约4次倍增，然后冷冻在第一细胞库中。来自第一细胞库的细胞被冷冻并用来接种第二细胞库，其中的细胞被扩增约另外八次倍增。这个阶段的细胞被收集并冷冻和用来接种新的扩增培养，让其进行约八次另外的倍增，从而使细胞倍增的累积次数达到约20次。在传代的中间点的细胞可以被冷冻，单位为约100,000到约一千万个细胞每ml，优选地约一百万个细胞每ml，供以后的扩增培养使用。约20次倍增的细胞可以被冷冻为约一百万到约一亿个细胞每ml的个体剂量供施用，或用来制造包含OPAC的组合物。

在一个优选的实施方案中，对由其获得胎盘的供体(例如母亲)测试至少一种病原体。如果母亲对测试病原体的测试为阳性，来自该胎盘的整个批次被丢弃。这样的测试可以在OPAC细胞批次生产期间的任何时间执行，包括在0代细胞建立之前或之后，或在扩增培养期间。要测试是否存在的病原体，可以包括且不限于甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、人免疫缺陷病毒(I型和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等。

5.1.6 OPAC的分化

OPAC可以被诱导分化，例如沿成骨途径。OPAC的成骨分化可以被诱导，例如，通过将OPAC放置在诱导分化为成骨细胞的细胞培养条件下。优选的骨细胞培养基包含MSCGM(Cambrex)或DMEM，其补充了15％脐带血血清；接着是成骨诱导培养基(Cambrex)，包含0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸-2-磷酸盐、10mM β甘油磷酸。在另一个实施方案中，OPAC在包含约10^-7到约10^-9M地塞米松、约10-50μM抗坏血酸磷酸盐(例如，抗坏血酸-2-磷酸盐)和约10nM到约10mM β-甘油磷酸的培养基(例如，DMEM-低葡萄糖)中培养。成骨培养基也可以包含血清、一种或多种抗生素/抗真菌剂、转化生长因子-β(例如，TGF-β1)和/或骨形态发生蛋白(例如，BMP-2、BMP-4、或其组合)。

可以使用钙特异性染色例如von Kossa染色，和例如碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨涎蛋白和/或骨桥蛋白基因表达的RT/PCR检测，来测试分化。

5.1.7 OPAC的贮存

OPAC可以被贮存，即放置在允许长期贮存的条件下，或抑制细胞死亡(例如凋亡或坏死)的条件下。

OPAC可以使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或载氧全氟化碳的组合物贮存，如在2005年12月25日提交的题为“Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs(收集胎盘干细胞和保存器官的改进的培养基)”的相关的美国临时申请号60/754,969中所述。在一个实施方案中，本发明提供了保存OPAC群的方法，包括将所述OPAC群与包含凋亡抑制剂和载氧全氟化碳的细胞收集组合物接触，其中所述凋亡抑制剂，与未与凋亡抑制剂接触的OPAC群相比，以足以降低或防止OPAC群中的凋亡的量和时间存在。在一个具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在一个更加具体的实施方案中，所述JNK抑制剂不调节所述OPAC的分化或增殖。在另一个实施方案中，所述细胞收集组合物包含分离相的所述凋亡抑制剂和所述载氧全氟化碳。在另一个实施方案中，所述细胞收集组合物以乳液形式包含所述凋亡抑制剂和所述载氧全氟化碳。在另一个实施方案中，细胞收集组合物额外包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一个实施方案中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触OPAC时温度在约0℃到约25℃之间。在另一个更加具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触OPAC时温度在约2℃到10℃之间，或在约2℃到约5℃之间。在另一个更加具体的实施方案中，所述接触在所述OPAC群的运输期间执行。在另一个更加具体的实施方案中，所述接触在所述OPAC群的冷冻和解冻期间执行。

在另一个实施方案中，本发明提供了保存OPAC群的方法，包括将所述OPAC群与凋亡抑制剂和器官保存化合物接触，其中所述凋亡抑制剂，和未与凋亡抑制剂接触的OPAC群相比，以足以降低或防止OPAC群中的凋亡的量和时间存在。在一个具体的实施方案中，器官保存化合物是UW溶液(在美国专利号4,798,824中描述；也称作ViaSpan；也可参见Southard等，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或在Stern等的美国专利号5,552,267中描述的溶液。在另一个实施方案中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖、或其组合。在另一个实施方案中，细胞收集组合物额外包含载氧全氟化碳，不管是处于两相还是作为乳液。

在方法的另一个实施方案中，在灌注期间，OPAC与包含凋亡抑制剂和载氧全氟化碳的细胞收集组合物、器官保存化合物、或其组合接触。在另一个实施方案中，所述OPAC在组织破坏(例如酶消化)过程期间接触。在另一个实施方案中，OPAC在通过灌注收集后，或通过组织破坏(例如酶消化)收集后，与所述细胞收集化合物接触。

典型地，在细胞的收集、富集和分离期间，最小化或消除由缺氧和机械应力引起的细胞应激是优选的。因此，在方法的另一个实施方案中，在所述贮存期间，OPAC在收集、富集或分离期间暴露于缺氧条件少于六小时，其中缺氧条件是低于正常的血氧浓度的氧气浓度。在一个更加具体的实施方案中，在所述贮存期间，所述OPAC暴露于所述缺氧条件少于两小时。在另一个更加具体的实施方案中，OPAC在收集、富集或分离期间暴露于所述缺氧条件少于一小时、或少于三十分钟，或没有暴露于缺氧条件。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC在收集、富集或分离期间没有暴露于剪切应力。

本发明提供的OPAC可以被冷冻贮存，例如，在冷冻贮存培养基中，在小的容器例如安瓿中。合适的冷冻贮存培养基包括但不限于培养基包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如可商业得到的细胞冷冻培养基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷冻贮存培养基优选地包含DMSO(二甲基亚砜)，浓度例如约10％(v/v)。冷冻贮存培养基可以包含额外试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。OPAC优选地在冷冻贮存期间以约1℃/min冷却。优选的冷冻贮存温度是约-80℃到约-180℃，优选地约-125℃到约-140℃。冷冻贮存的细胞在解冻使用前可以被转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，它们被转移到液氮贮存区域。冷冻贮存的细胞优选地在温度约25℃到约40℃解冻，优选地在温度约37℃。

5.1.8 包含OPAC的组合物

本发明提供了包含OPAC或由其得到的生物分子的组合物。本发明提供的OPAC可以与任何生理学可接受的或医学可接受的化合物、组合物或装置进行组合，供例如研究或治疗用途。

5.1.8.1 冷冻贮存的OPAC

本发明提供的OPAC群可以被贮存，例如冷冻贮存供以后使用。冷冻贮存细胞例如OPAC的方法是本领域熟知的。OPAC群可以被制备成可容易对个体施用的形式。例如，本发明提供了OPAC群，其被包含在适合医学用途的容器内。这样的容器可以是例如无菌的塑料袋、烧瓶、罐或其它容器，OPAC群可以从中容易地分配。例如，容器可以是血袋或其它塑料的医学可接受的袋子，适合向受体静脉内施用液体。容器优选地是允许组合的细胞群冷冻贮存的容器。

冷冻贮存的OPAC群可以包含源自单一供体或多个供体的OPAC。OPAC群可以与预期的受体完全HLA匹配，或者部分或完全HLA不匹配。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了容器中的包含OPAC群的组合物。在一个具体的实施方案中，所述群被冷冻贮存。在另一个具体的实施方案中，容器是袋、烧瓶、或罐。在更加具体的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在一个更加具体的实施方案中，所述袋适合、允许或促进OPAC群的静脉内施用。袋可以包含多个连通的腔或分隔，以在施用前或期间让OPAC与一种或多种其它溶液例如药物混合。在另一个具体的实施方案中，组合物包含一种或多种促进细胞群冷冻贮存的化合物。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC群被包含在生理学可接受的水溶液内。在一个更加具体的实施方案中，所述生理学可接受的水溶液是0.9％NaCl溶液。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC群包含与所述群的受体HLA匹配的胎盘细胞。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC群包含与所述群的受体至少部分HLA不匹配的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述OPAC源自多种供体。

5.1.8.2 药物组合物

OPAC群或包含OPAC的细胞群可以被配制成药物组合物供体内使用。这样的药物组合物包含OPAC群、或包含OPAC的细胞群，在药学可接受的载体中，例如，盐水溶液或其它公认的生理学可接受的供体内施用的溶液。本发明提供的药物组合物可以包含本发明别处描述的任意OPAC群。药物组合物可以包含胎儿的、母体的、或胎儿和母体双方的OPAC。本发明提供的药物组合物可以进一步包含从单一个体或绒毛膜、或从大量个体或绒毛膜获得的OPAC。

本发明提供的药物组合物可以包含任意治疗有用数目的OPAC。例如，单一单位剂量的OPAC可以包含，在各种实施方案中，约、至少、或不超过1×10⁵、5x10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的OPAC。

本发明提供的药物组合物可以包含细胞群，其包含50％或更多的存活细胞(即，群中的至少约50％的细胞是有功能的或活的)。优选地，群中的至少约60％的细胞是存活的。更加优选地，药物组合物中，群中的至少约70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是存活的。

本发明提供的药物组合物可以包含一种或多种例如促进植入的化合物(例如，抗-T-细胞受体抗体、免疫抑制剂等)，稳定剂例如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等。

5.1.8.3 OPAC条件培养基

本发明提供的OPAC可以用来生产条件培养基，即包含一种或多种由细胞分泌或排出的生物分子的培养基。在各种实施方案中，条件培养基包含OPAC在其中生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其他实施方案中，条件培养基包含OPAC在其中生长到至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％融合或直到100％融合的培养基。这样的条件培养基可以用来支持OPAC或另一种类型的干细胞的分离群的培养。在另一个实施方案中，条件培养基包含OPAC在其中已分化成终末分化细胞类型、或具有终末分化细胞的一个或多个特征的细胞的培养基。在另一个实施方案中，本发明提供的条件培养基包含在其中培养了OPAC和非OPAC的培养基。

5.1.8.4 包含OPAC的基质

本发明进一步提供了包含OPAC或OPAC群的基质、水凝胶、支架等。在某些实施方案中，基质可以是本领域技术人员已知对治疗骨缺损有用的任何底物。例如，基质可以是β-磷酸三钙底物、β-磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的胶原底物、和透明质酸底物。在一些实施方案中，基质中的胶原可以是胎盘胶原。分离和制备胎盘胶原的方法和组合物被广泛描述，例如在美国专利申请公开号2007/0020225中，其公开内容全文通过引用并入本发明。

OPAC可以在分化步骤之前或之后被接种到基质上供治疗骨。例如，OPAC可以在例如成骨培养基中培养例如约1-20天，然后接种到基质上。或者，OPAC可以被分离并接种到基质上，然后如本发明描述的在成骨培养基中培养例如约1-20天。在另一个实施方案中，OPAC在例如成骨培养基中培养例如约1-20天，然后接种到基质上，然后如本发明描述的在成骨培养基中培养例如约1-20天。

OPAC可以被接种到天然基质上，例如，胎盘生物材料例如羊膜材料。这样的羊膜材料可以是例如直接从哺乳动物胎盘分割的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本干燥的(即，＜20％H₂O)羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。OPAC可以在上面接种的优选的胎盘生物材料，在Hariri的美国申请公开号2004/0048796中描述。

本发明提供的OPAC可以悬浮在水凝胶溶液中，其适合例如注射。对这样的组合物，合适的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方案中，可以让包含细胞的水凝胶溶液硬化，例如在模子中硬化，以形成具有细胞分散在其中的供植入的基质。在这样的基质中的OPAC也可以被培养，以便细胞在植入前有丝分裂扩增。水凝胶是例如有机聚合物(天然或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联，从而产生三维开放栅格结构，该结构捕捉水分子形成凝胶。形成水凝胶的材料包括多糖例如藻酸盐及其盐、多肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，其离子交联；或嵌段聚合物例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH交联。在一些实施方案中，水凝胶或基质是可生物降解的。

在一些实施方案中，配方包含可原位聚合的凝胶(参见例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003)。

在一些实施方案中，聚合物在水性溶液例如水、缓冲盐溶液、或水醇溶液中至少部分可溶，其具有带电荷的侧基，或其单价离子盐。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的例子是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)、以及磺化的聚合物例如磺化的聚苯乙烯。具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应而形成的酸性侧基的共聚物也可以被使用。酸性基团的例子是羧酸基团、磺酸基团、卤代的(优选地氟化的)醇基团、酚的OH基团、和酸的OH基团。

OPAC或其群可以被接种到三维框架或支架上并植入体内。这样的框架可以与任意一种或多种生长因子、细胞、药物或其它刺激组织形成、或者增强或改善组织修复的成分联合植入。

可以被使用的支架的例子包括非纺织垫、多孔泡沫、或自组装肽。非纺织垫可以使用包含了合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(例如，PGA/PLA)的纤维来形成(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。泡沫由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成，通过过程例如冷冻干燥或冻干而形成(参见例如，美国专利号6,355,699)，也可以被用作支架。

本发明提供的OPAC也可以接种到生理学可接受的陶瓷材料上，或与其接触，陶瓷材料包括但不限于磷酸单-、二-、三-、α-三-、β-三-、和四-钙，羟磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物活性玻璃例如BIOGLASS

、及其混合物。当前可商业购买的可生物相容的多孔陶瓷材料，包括SURGIBONE

(CanMedica Corp.，Canada)、ENDOBON

(Merck Biomaterial France，France)、CEROS

(Mathys，AG，Bettlach，Switzerland)、和矿化胶原骨移植产品例如HEALOS^TM(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和VITOSS

、RHAKOSS^TM、以及CORTOSS(Orthovita，Malvern，Pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合物。

在另一个实施方案中，OPAC可以接种到毡上，或与其接触，毡可以例如由用可生物吸收的材料例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物，或透明质酸制造成的复丝组成。

在另一个实施方案中，本发明提供的OPAC可以接种到泡沫支架上，该支架可以是复合结构。这样的泡沫支架可以被模制成有用的形状，例如身体中待修复、替换或扩增的特定结构的一部分。在一些实施方案中，为了增强细胞附着，在接种OPAC前，框架用例如0.1M醋酸处理，接着在聚赖氨酸、PBS、和/或胶原中培养。基质的外表面可以被改性，以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，例如通过基质的等离子涂层，或添加一种或多种蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质、和/或其他材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖、和植物胶等来改性。

在一些实施方案中，支架包含令它不形成血栓的材料，或用该材料处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移、和细胞外基质的沉积。这些材料和处理的例子包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白例如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材料例如EPTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN^TM(The Polymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif)。支架也可以包含抗血栓形成剂，例如肝素；支架也可以在接种OPAC前被处理以改变表面电荷(例如，等离子涂层)。支架可以进一步包含刺激骨生长和/或抑制骨吸收的试剂。例如，支架可以包含骨形态发生蛋白，例如BMP-2和/或BMP-7，WNT抑制剂等。

5.1.9 永生化的OPAC细胞系

通过用任意包含促生长基因的合适载体转染，OPAC可以条件永生化，即编码蛋白的基因在适当条件下促进被转染的细胞的生长，从而使促生长蛋白的生产和/或活性可通过外部因素调控。在一个优选的实施方案中，促生长基因是原癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人乳头瘤病毒的E7蛋白。

促生长蛋白的外部调控可以通过将促生长基因放置在外部可调控的启动子控制下来达到，例如，启动子的活性可以通过例如修改转染的细胞的温度或与细胞接触的培养基的组份来控制。在一个实施方案中，可以使用四环素(tet)控制基因表达系统(参见Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551，1992；Hoshimaru等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1518-1523，1996)。tet缺乏时，这一载体内tet控制的转录激活因子(tTA)强烈激活融合到tet操纵子序列的来自人巨细胞病毒的最小启动子ph_CMV*-1的转录。tTA是大肠杆菌(Escherichia coli)的转座子-10-源tet抗性操纵子的阻遏物(tetR)和单纯疱疹病毒的VP16酸性域的融合蛋白。低的无毒浓度的tet(例如，0.01-1.0μg/mL)几乎完全取消了tTA的转录激活。

在一个实施方案中，载体进一步包含编码可筛选标记的基因，例如赋予药物抗性的蛋白。细菌新霉素抗性基因(neo^R)是一个这样的标记，可以如本发明描述般使用。携带neo^R的细胞可以通过本领域普通技术人员已知的手段筛选，例如向生长培养基添加例如100-200μg/mL G418。

转染可以通过各种本领域普通技术人员已知的手段中的任一种来实现，包括但不限于逆转录病毒感染。一般来说，通过用从载体的生产者细胞系收集的条件培养基和包含N2补充物的DMEM/F12的混合物培养，细胞培养可以被转染。例如，如上面描述般制备的胎盘细胞培养，通过在一体积条件培养基和两体积包含N2补充物的DMEM/F12中培养约20小时，可以在例如五天后体外感染。携带可筛选标记的转染的细胞然后可以如上面描述般筛选。

转染后，培养物被传代到允许增殖的表面上，例如，在24小时时期中让至少约30％的细胞倍增。优选地，底物是聚鸟氨酸/层粘连蛋白底物，由用聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)涂层的组织培养塑料制品组成，聚赖氨酸/层粘连蛋白底物或用纤连蛋白处理过的表面。然后培养每3-4天用生长培养基饲养，其可以补充或可以未补充一种或多种增殖增强因子。当培养低于50％融合时，增殖增强因子可以添加到生长培养基中。

当80-95％融合时，条件永生化的OPAC细胞系可以使用标准技术传代，例如通过胰蛋白酶处理。在一些实施方案中，直到大约第二十次传代，保持筛选(通过例如向包含新霉素抗性基因的细胞添加G418)仍是有益的。细胞也可以在液氮中冷冻供长期贮存。

克隆细胞系可以从如上面描述般制备的条件永生化的人OPAC细胞系中分离。一般来说，这样的克隆细胞系可以使用标准技术分离和扩增，例如通过有限稀释或使用克隆环分离。克隆细胞系一般可以如上面描述般饲养和传代。

条件永生化的人OPAC细胞系，其可以但不必是克隆的，一般可以通过在促进分化的培养条件下抑制促生长蛋白的生产和/或活性来诱导分化。例如，如果编码促生长蛋白的基因在外部可调控的启动子控制下，那么可以通过改变条件例如温度或培养基组份来抑制促生长基因的转录。对于上面讨论的四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素来抑制促生长基因的转录来实现分化。一般来说，4-5天的1μg/mL四环素足以启动分化。为促进进一步分化，生长培养基中可以包含额外试剂。

5.1.10 测试

本发明提供的OPAC可以在测试中使用，以与未暴露于这样的条件的OPAC比较，确定培养条件、环境因素、分子(例如生物分子、小的无机分子等)等对OPAC增殖、扩增、和/或分化的影响。

在一个优选的实施方案中，本发明提供的OPAC测试了与一种分子接触后增殖、扩增或分化上的改变。例如，成骨分化可以通过监测碱性磷酸酶活性和/或钙矿化来测试。

在一个实施方案中，例如，本发明提供了识别调节多种OPAC增殖的化合物的方法，包括将所述多种OPAC在允许增殖的条件下与所述化合物接触，其中如果与未与所述化合物接触的多种OPAC相比，所述化合物在所述多种OPAC的增殖中引起可检测的变化，那么所述化合物被识别为调节OPAC增殖的化合物。在一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为增殖抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为增殖增强剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了识别调节多种OPAC扩增的化合物的方法，包括将所述多种OPAC在允许扩增的条件下与所述化合物接触，其中如果与未与所述化合物接触的多种OPAC相比，所述化合物在所述多种OPAC的扩增中引起可检测的变化，那么所述化合物被识别为调节OPAC扩增的化合物。在一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为扩增抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为扩增增强剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了识别调节OPAC分化的化合物的方法，包括将所述OPAC在允许分化的条件下与所述化合物接触，其中如果与未与所述化合物接触的OPAC相比，所述化合物在所述OPAC的分化中引起可检测的变化，那么所述化合物被识别为调节OPAC增殖的化合物。在一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为增殖抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述化合物被识别为增殖增强剂。

5.2 OPAC的用途

5.2.1 使用OPAC治疗骨相关癌症

本发明提供了治疗患有骨相关癌症的个体的方法，包括对个体施用治疗有效量的OPAC。骨相关癌症包括且不限于多发性骨髓瘤、骨癌、乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、Ewing′s肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、骨的纤维肉瘤、转移性癌、多发性骨髓瘤、以及特征是骨转移的任何形式的转移性癌。在某些实施方案中，OPAC的施用治疗性地有效降低、改善或反转了与骨相关癌症相关的一种或多种症状，例如，由癌症对个体中一根或多根骨头的影响引起或与其相关的症状。本领域技术人员将意识到，癌症导致的骨缺损的治疗可能不一定减轻癌症本身。本发明提供的癌症相关的骨缺损的治疗可以在另外的癌症治疗之前、之后或同时进行，这如下所讨论。因此，在一个实施方案中，骨缺损在用抗癌治疗来治疗癌症之前治疗。在另一个实施方案中，骨缺损在用抗癌治疗来治疗癌症的同一时间或接近同一时间治疗。在另一个实施方案中，骨缺损在用抗癌治疗来治疗癌症之后治疗。

在某些实施方案中，骨相关癌症例如多发性骨髓瘤的治疗包括对含有骨相关癌症细胞例如多发性骨髓瘤细胞的个体施用治疗有效量的OPAC，其中至少一些所述OPAC直接接触了至少一些多发性骨髓瘤细胞，例如，在至少一些所述OPAC和一些所述骨相关癌症细胞之间存在直接的细胞间接触。在某些其它的实施方案中，骨相关癌症例如多发性骨髓瘤的治疗包括对含有骨相关癌症细胞例如多发性骨髓瘤细胞的个体施用治疗有效量的OPAC，其中没有或基本没有任何所述OPAC直接接触了多发性骨髓瘤细胞，例如，在至少一些所述OPAC和骨相关癌症细胞之间没有或基本没有直接的细胞间接触。

在某些实施方案中，OPAC是损害内施用的，例如直接进入或邻近(例如，在其1-5cm内)一处或多处癌症导致的骨损害。在某些实施方案中，OPAC与基质联合施用，例如可注射的基质。

在某些其它的实施方案中，OPAC与固体基质，例如骨替代物、下文5.2.2部分中描述的基质或骨替代物联合向患有骨相关癌症的个体施用。

在某些其它的实施方案中，OPAC对个体静脉内施用。OPAC可以从任何容器和通过任何医学上适合递送流体例如包含细胞的流体的递送系统对个体施用。这样的容器可以是例如无菌的塑料袋、烧瓶、罐或其它容器，OPAC群可以从中容易地分配。例如，容器可以是血袋或其它塑料的医学可接受的袋子，适合向受体静脉内施用液体。

损害内或静脉内施用在单一剂量中可以包含例如约、至少、或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的OPAC。OPAC在治疗进程期间可以施用一次，或超过一次。优选地，施用的OPAC包含50％或更多的存活细胞(即，群中的至少约50％的细胞是有功能的或活的)。优选地，群中的至少约60％的细胞是存活的。更加优选地，药物组合物中，群中的至少约70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是存活的。

5.2.1.1 多发性骨髓瘤的治疗

本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括对所述个体施用多种OPAC，其中所述OPAC具有上文5.1部分中描述的特征的任意组合或全部特征。在一个具体的实施方案中，所述多种OPAC是CD105⁺且CD200^dim的或CD105⁺且CD200^-的。本发明提供的治疗方法包含使用任意上文5.1部分中描述的OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群。

多发性骨髓瘤是浆细胞癌症，浆细胞是产生抗体的免疫系统细胞。疾病典型地存在四个主要特征：钙升高、肾衰竭、贫血、和骨损害。这些症状和其它症状在下文讨论。

骨痛-骨髓瘤细胞分泌IL-6，也称作破骨细胞活化因子(OAF)，它是激活破骨细胞分解骨头的细胞因子，造成疼痛的骨损害。这些骨损害实际上是溶解性的而且在射线照片中可见，其可能显示“穿孔”再吸收损害。骨髓瘤骨痛通常涉及脊柱和肋骨，而且随活性恶化。持久的局部疼痛可能存在，而且可以指明病理骨折。椎骨损害可能导致脊髓压迫。骨分解还导致钙向血液中释放，引起高钙血症及其相关症状。

骨分解区域，如在骨骼调查中观察到的，典型地呈现为骨头上的一处或多处溶解性损害，即其中骨头呈现为不存在或“穿孔”的区域。

感染-因为免疫系统被破坏，多发性骨髓瘤的另一种常见症状是感染。感染风险增加的原因是扩散性低丙球蛋白血症导致的免疫缺陷，这是因为正常抗体的生产下降和破坏增加。最常见的感染是肺炎和肾盂肾炎。在多发性骨髓瘤患者中导致疾病的常见肺炎病原体包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，而导致肾盂肾炎的常见病原体包括大肠杆菌(Escherichia coli)。典型地，感染发生在化疗开始后的最初几个月。

肾衰竭-多发性骨髓瘤还倾向于导致肾衰竭，其可能急性和慢性发展。多发性骨髓瘤中的肾衰竭很大程度上归因于高钙血症，其因破骨细胞拆卸现存的骨头而发展。肾衰竭也由轻链分泌引起的小管损伤而导致，其也称本周蛋白，可以表明Fanconi综合症(II型肾小管性酸中毒)。其它起因包括淀粉样蛋白的小球沉积、高尿酸血症、复发性感染(例如肾盂肾炎)、和肿瘤细胞的局部浸润。肾衰竭可以与血清肌酐水平的升高有关。

贫血-骨髓瘤中发现的贫血通常是红血球和血色素都正常的，而且是由浸润的肿瘤细胞替代了正常骨髓和正常的血红细胞生产(造血作用)被细胞因子抑制而导致的。

神经学症状-多发性骨髓瘤的症状包括一系列神经学状况，包括虚弱、由高钙血症性头痛引起的意识错乱和疲劳、视力变化和视网膜病变，这可以是血液高粘滞的结果，取决于病变蛋白(参见下文)的性质。其它神经学症状包括根性疼痛、肠或膀胱控制丧失(例如，由于脊髓损害导致脊髓压迫)、以及腕管综合症和其它神经疾病(例如，由于淀粉样蛋白对外周神经的浸润)。在最近出现的情况中，多发性骨髓瘤可能导致截瘫。

病变蛋白的存在-多发性骨髓瘤的一个诊断症状是血和/或尿中存在病变蛋白，其是单克隆蛋白(M蛋白)，例如，由浆细胞的克隆增殖产生的免疫球蛋白轻链，或免疫球蛋白片段。

当以下症状或信号存在时，典型地诊断为症状性多发性骨髓瘤：克隆浆细胞在骨髓活检时组成了超过10％的细胞，或者在其它组织(例如浆细胞瘤)的活检中以任何量存在；血清或尿中的病变蛋白；终末器官损伤证据(相关器官或组织损伤)，例如高钙血症(例如，血液中校正的钙＞2.75mmol/L)、骨髓瘤引起的肾功能不全、限定为血红蛋白＜10g/dL血液的贫血、骨损害(例如，溶解损害或伴有压缩性骨折的骨质疏松症、频繁严重感染(一年＞2次)、其它器官的淀粉样变性(淀粉样蛋白沉积)、和高粘滞综合症(血液粘度增加)。

患有多发性骨髓瘤的个体分成下列各组。在一个实施方案中，患有多发性骨髓瘤的个体从未被治疗过该疾病。在另一个实施方案中，个体患有应答型骨髓瘤；即，对治疗应答的多发性骨髓瘤。在一个具体的实施方案中，作为治疗结果，这样的个体显示了M蛋白(病变蛋白)的至少50％的下降。在另一个具体的实施方案中，作为治疗结果，个体显示了M蛋白在25％到50％之间的下降。在另一个实施方案中，个体患有稳固型多发性骨髓瘤，其指骨髓瘤对治疗无应答(例如，M蛋白的下降未达到50％)，但没有进展或转坏。在另一个实施方案中，个体患有进行性多发性骨髓瘤，其指恶化中的活性骨髓瘤(例如，增加的M蛋白和恶化中的器官或组织损伤或终末器官损伤)。在另一个实施方案中，个体患有复发的多发性骨髓瘤，其指起初对治疗应答但然后开始再次进展的骨髓瘤疾病。在具体的实施方案中，个体在初始治疗后复发或在后来的治疗后复发。在另一个实施方案中，个体患有难治性多发性骨髓瘤。在一个具体的实施方案中，难治性多发性骨髓瘤是对初始治疗无应答的多发性骨髓瘤。在另一个具体的实施方案中，难治性多发性骨髓瘤是对后来的治疗无应答的复发的多发性骨髓瘤。在另一个具体的实施方案中，难治性多发性骨髓瘤是无应答的进展中的难治性疾病，其指难治性疾病在不断进展。在另一个具体的实施方案中，难治性多发性骨髓瘤是无应答的非进展中的难治性疾病，其指难治性疾病未恶化。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用引起多发性骨髓瘤的一种或多种症状的进展的可检测降低、恶化的可检测停止、和/或可检测的改善。在具体的实施方案中，所述一种或多种症状包括与正常值相比升高的血或尿钙、存在骨损害、贫血、或肾衰竭。在一个更加具体的实施方案中，所述一种或多种症状包括克隆浆细胞在骨髓活检时组成了超过10％的细胞，或者在其它组织(例如浆细胞瘤)的活检中以任何量存在；血清或尿中的病变蛋白；和/或终末器官损伤证据。在一个更加具体的实施方案中，所述一种或多种症状是血钙浓度超过2.75mmol/L、肾功能不全、每升血液血红蛋白低于100g、存在骨损害、或者骨髓外一个或多个器官的淀粉样变性。

在另一个具体的实施方案中，所述症状是神经学症状。在更加具体的实施方案中，所述神经学症状是虚弱、意识错乱、疲劳、头痛、视力变化、视网膜病变、根性疼痛、肠或膀胱控制丧失、腕管综合症、和/或截瘫。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包含对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用在个体的一个或多个器官中引起多发性骨髓瘤细胞数目的可检测降低，例如，克隆的多发性骨髓瘤细胞。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包含对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用引起个体血液中血红蛋白的可检测增加，例如，在正常限度内增加。正常的血红蛋白水平随个体的年龄和性别而变化，如下面表1中显示的：

表1

新生儿	17-22gm/dl
		年龄一(1)周	15-20gm/dl
年龄一个(1)月	11-15gm/dl
		儿童	11-13gm/dl
成年男性	14-18gm/dl
		成年女性	12-16gm/dl
中年以后的男性	12.4-14.9gm/dl
		中年以后的女性	11.7-13.8gm/dl

因此，在一个更加具体的实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用引起所述个体中血液血红蛋白水平增加到11g/dL血液和20g/dL血液之间。在一个更加具体的实施方案中，所述施用引起所述个体中血液血红蛋白水平增加到11g/dL血液和13g/dL血液之间。在另一个更加具体的实施方案中，所述施用引起所述个体中血液血红蛋白水平增加到12g/dL血液和16g/dL血液之间。在一个更加具体的实施方案中，所述施用引起所述个体中血液血红蛋白水平增加到14g/dL血液和18g/dL血液之间。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用引起所述个体的血或尿中病变蛋白水平的可检测减少。在一个具体的实施方案中，所述施用引起所述个体的血或尿中病变蛋白减少到不可检测的水平。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用引起多发性骨髓瘤在所述个体中导致的骨损害的严重程度和/或数量可检测地降低，这通过例如骨骼扫描或射线照相术确定。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包含对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群，其中所述施用在所述个体中引起骨量或骨矿物质含量丢失的可检测降低、骨量或骨矿物质含量丢失停止、或骨量或骨矿物质含量增加。

在治疗方法的另一个具体实施方案中，所述多发性骨髓瘤的一种或多种症状是骨痛、骨细胞损害(例如，通过X射线或磁共振成像(MRI)可见)、骨质疏松症、贫血、高钙血症或由高钙血症引起的症状、或肾衰竭。在其他具体的实施方案中，所述个体从未被治疗过多发性骨髓瘤；所述个体已被治疗多发性骨髓瘤而且对非OPAC治疗应答；所述个体已被治疗多发性骨髓瘤而且对非OPAC治疗无应答，但所述个体中多发性骨髓瘤的进程未进展；或所述个体患有进行性多发性骨髓瘤。

另一方面，本发明提供了抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的方法，包括将所述多发性骨髓瘤细胞与大量OPAC接触，从而使得所述多发性骨髓瘤细胞的增殖被可检测地抑制。在某些实施方案中，本发明提供了体内抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的方法，包括对含有多发性骨髓瘤细胞的个体施用治疗有效量的OPAC，其中所述施用可检测地降低了所述多发性骨髓瘤细胞的增殖。在一个具体的实施方案中，所述施用可检测地降低(例如改善)了多发性骨髓瘤的一种或多种症状或迹象，或减轻了多发性骨髓瘤的所述一种或多种症状或迹象的恶化。

在本发明提供的方法中有用的OPAC是来自绒毛膜(但不是绒毛膜裙(无绒毛的))的贴壁成骨细胞，其可以通过至少在上文5.1部分中讨论的形态学、标记、和培养特征，来识别和筛选。

5.2.1.2 联合治疗

骨相关癌症例如多发性骨髓瘤的治疗可以包括对患有癌症的个体联合施用OPAC和另一种治疗。

因此，在另一方面，本发明提供了治疗患有骨相关癌症例如多发性骨髓瘤的个体的方法，包括与一种或多种其他抗癌治疗联合，例如与一种或多种化疗或化疗化合物联合，对个体施用OPAC、OPAC群或包含OPAC的细胞群。这样的其他抗癌治疗可以在所述OPAC施用的同一时间、同一治疗进程期间、或与其分开对个体施用。在一个具体的实施方案中，所述其他抗癌治疗的施用是与所述OPAC施用相继施用的。在一个更加具体的实施方案中，所述其他抗癌治疗或抗癌治疗们是在所述OPAC施用前对所述个体施用的；例如，在OPAC对个体施用前，这样的其他抗癌治疗进程对个体施用并完成。在另一个更加具体的实施方案中，所述OPAC在所述其他抗癌治疗施用前对个体施用；例如，OPAC进程在所述其他抗癌治疗施用前对所述个体施用，而且在所述其他抗癌治疗或抗癌治疗们对个体施用前完成。

在一个具体的实施方案中，抗癌剂是美法仑(也称作L-苯丙氨酸氮芥或L-PAM；商品名马法兰)。因此，在一个实施方案中，治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法包括对所述个体施用美法仑，例如治疗有效剂量的一剂或多剂美法仑。施用典型地为口服或静脉内。在另一个具体的实施方案中，抗癌剂是沙利度胺。在另一个具体的实施方案中，抗癌剂是泊马度胺(以商品名ACTIMID

出售)；来那度胺(以商品名REVLIMID

出售)；或来那度胺与地塞米松的组合。在另一个具体的实施方案中，抗癌治疗是硼替佐米(VELCADE

)。在另一个具体的实施方案中，抗癌剂包括美法仑、泼尼松和沙利度胺的组合(分开或一起施用)。在另一个具体的实施方案中，抗癌剂是硼替佐米、美法仑和泼尼松(分开或一起施用)。

其他抗癌剂是本领域熟知的。因此，在其他具体的实施方案中，抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯咪胺；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托克星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌罗霉素；盐酸嘌罗霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰索帝；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；三甲曲沙葡糖醛酸盐；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；和盐酸佐柔比星。

其他抗癌药物包括但不限于：20-表-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿克拉霉素；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；全TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；2，4二氯苯氧乙酸；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；9-[2-甲氧基-4-(甲基磺酰基氨基)苯基氨基]-N，5-二甲基-4-吖啶甲酰胺；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴兰醇(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并绿素类；苯甲酰基星孢菌素；β内酰胺衍生物；β-alethine；贝塔克拉霉素(betaclamycin)B；白桦脂酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；二氮丙啶基精胺；双奈法德；二枸橼酸环己噻卓酯A；比折来新；布福雷(breflate)；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；calphostinC；喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；源自软骨的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；绿素类；磺胺氯喹喔啉；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；考利丝霉素(collismycin)A；考利丝霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；自念珠藻环肽8；自念珠藻环肽A衍生物；curacinA；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；赛可霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；细胞裂解因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢的环羧酚酸肽(dehydrodidemnin)B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；环羧酚酸肽(didemnin)B；3，4-二羟基苯并氧肟酸(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢泰素，9-；二草霉素；联苯基螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；阿霉素；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡霉素(duocarmycin)SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯乳；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；荧蒽固酮；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；得克萨菲啉钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；氨基磺酸1，7庚烷二基酯；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；碘昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如GLEEVEC

)；咪喹莫特；免疫刺激剂多肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑(isobengazole)；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷那霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线形聚胺类似物；亲油的二糖肽；亲油的铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；得克萨菲啉镥；1-((R)-5-羟基己基)可可碱；裂解多肽；美坦新；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；爱必妥，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；甘露莫司汀抗癌剂；印度洋海绵B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+镇痛新；napavin；萘萜二醇；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；尼沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；奥利默森(GENASENSE)；O⁶-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；双氯非那胺；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥克萨霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺；棕榈酰根瘤菌素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；六配位儿茶胺铁螯合剂副菌铁素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他丁；盘托唑(pentrozole)；潘氟隆；培磷酰胺；芥子醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活剂的抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；羟基茜草素；吡唑啉吖啶；血红蛋白吡醇羟乙酯聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根瘤菌素；核酶；RTI维A胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；萨科叶绿醇(sarcophytol)A；沙莫司亭；Sdi 1模仿物；司莫司汀；源自衰老的抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯拜可霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；脾脏五肽；CD-螺环缩酮前体δ-内酯1；鲨胺；stipiamide；基质溶解素抑制剂；sulfinosine；强效的血管活性肠肽拮抗剂；suradista；舒拉明；苦马豆碱；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；十氧化四氯；四氮胺(tetrazomine)；唐松草碱；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模仿物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；乙基锡初紫红素；替拉扎明；二氯钛烯；topsentin；托瑞米芬；转译抑制剂；维A酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂tyrphostins；UBC抑制剂；乌苯美司；源自泌尿生殖窦的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；长春磷汀；维他辛(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。

在其他实施方案中，联合治疗包含与破骨细胞抑制剂联合，对个体施用OPAC。在一个具体的实施方案中，破骨细胞抑制剂是RANKL抑制剂，例如狄诺塞麦。在另一个具体的实施方案中，破骨细胞抑制剂是整联蛋白或组织蛋白酶K抑制剂。

在另一个实施方案中，联合治疗包含与双膦酸盐联合施用OPAC。在具体的实施方案中，双膦酸盐是氯膦酸盐和/或帕米膦酸盐。

5.2.2 使用OPAC治疗骨缺损

OPAC群可以用来治疗骨缺损，例如，创伤或疾病引起的骨缺损，例如骨相关癌症以外的疾病。OPAC也可以用来治疗任何导致骨量丢失或与其相关的疾病、病症或状况。本发明使用的“治疗”包含疾病、病症或状况，或其任何参数或症状的治愈、修复、改善、严重程度减轻、或时间进程减少。

分离的OPAC群也可以用来治疗骨折，例如骨不连骨折。分离的OPAC群也可以用来将椎骨融合在一起，目的是例如在需要其的个体中完成脊柱融合。分离的OPAC群与干细胞或前体细胞群联合，也可以用来治疗前述各项。

OPAC可以与底物例如基质结合，形成可植入的组合物。例如，本发明提供了包含OPAC的组合物，例如可植入的组合物。在一个具体的实施方案中，可植入的组合物包含基质。在一个更加具体的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻连蛋白。在另一个具体的实施方案中，所述基质包含羟磷灰石。在一个更加具体的实施方案中，所述基质包含胶原和羟磷灰石二者，例如，基质是HEALOS

。在另一个更加具体的实施方案中，基质是羊膜或羊膜源生物材料。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含细胞外膜蛋白。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含合成的化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5,000道尔顿的有机分子。在某些实施方案中，基质是合成的可降解的聚合物，例如聚乳酸或聚乙醇酸。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙底物、β-磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、或陶瓷底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙-胶原底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是胶原底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是磷酸钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是矿化的人胎盘胶原底物。

OPAC和OPAC群也可以体内或间接体内诱导分化成特定细胞类型，为向需要这样的细胞或由这样的细胞分化的细胞的个体施用作准备。例如，OPAC可以被注射到损坏的器官中，例如损坏的骨头，供体内器官再生和损伤修复。这样的损伤可以由这样的状况和病症引起，包括但不限于骨缺损包括骨质疏松症导致的损害、癌症、骨折、和可用例如脊柱融合来治疗的脊柱状况。OPAC可以单独注射到损坏的骨头中，或者可以如本发明描述的与可植入的底物一起引入。

当OPAC作为可注射的悬浮液或液体施用时，细胞可以被静脉内施用，或者，优选地，在骨缺损位点例如断裂处施用。

在某些方面，本发明提供了在个体中治疗骨缺损的方法，包含对需要其的个体施用可植入或可注射的包含本发明提供的OPAC群的组合物，从而在该个体中治疗骨缺损。在某些实施方案中，骨缺损是与癌症、骨折或脊柱例如需要融合的脊柱相关的溶骨性损害。在某些实施方案中，溶骨性损害与多发性骨髓瘤、骨癌、或转移性癌相关。在某些实施方案中，骨折是骨不连骨折。在某些实施方案中，可植入的组合物是手术植入的，例如在骨缺损位点。在某些实施方案中，对骨缺损区域手术施用可注射的组合物。在某些实施方案中，可注射的组合物是全身施用的。

在一个具体的实施方案中，包含OPAC的可植入的组合物包含基质。在一个更加具体的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻连蛋白。在另一个更加具体的实施方案中，基质是羊膜或羊膜源生物材料。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含细胞外膜蛋白。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含合成的化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更加具体的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5,000道尔顿的有机分子。在某些实施方案中，基质是合成的可降解的聚合物，例如聚乳酸或聚乙醇酸。在某些实施方案中，可植入的支架底物选自β-磷酸三钙底物、β-磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、和陶瓷底物组成的集团。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是β-磷酸三钙-胶原底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是胶原底物、在某些实施方案中，可植入的支架底物是磷酸钙底物。在某些实施方案中，可植入的支架底物是矿化的人胎盘胶原底物。

另一方面，本发明提供了配制可注射的组合物的方法，包含让OPAC群与可注射的透明质酸或胶原组合。另一方面，本发明提供了可注射的的组合物，包含OPAC和透明质酸或胶原。

OPAC可以未在引起OPAC分化的条件下培养，直接施用。或者，OPAC可以在施用前在例如成骨培养基中培养例如约1-20天。或者，OPAC可以被分离并接种到基质上，然后在成骨培养基中培养例如约1-20天。在另一个实施方案中，OPAC可以在例如成骨培养基中培养例如约1-20天，然后接种到基质上，然后如本发明描述的在成骨培养基中培养例如约1-20天。

在其他实施方案中，分离的OPAC群可以用在自体或异源组织再生或替换治疗或程序中，包括但不限于治疗角膜上皮缺损、软骨修复、面部皮肤磨削术、黏膜、鼓膜、肠的内膜、神经学结构(例如视网膜、基底膜中的听神经元、嗅觉上皮中的嗅神经元)、皮肤的外伤性损伤的灼伤和伤口修复、或其它损坏或患病的器官或组织的重建。

在某些实施方案中，分离的OPAC群在遭受造血干细胞的部分或完全丧失的个体的造血重建中使用，例如，暴露于致死或亚致死剂量的辐射(不管是工业性、医疗性还是军事性的)的个体；作为例如癌症治疗的一部分，经历了脊髓抑制的个体；等等。分离的OPAC群可以用来代替或补充骨髓或源自骨髓的干细胞群。典型地，在骨髓移植中，注入大约1×10⁸到2×10⁸个骨髓单核细胞每千克患者体重供植入(即，对70kg供体约70ml骨髓)。为获得70ml，在捐赠过程中需要密集的捐赠和供体血液的显著损失。供造血重建的分离的OPAC群，在各种实施方案中，可以包含约、至少、或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的OPAC。

本发明提供的OPAC，单独或与其它干细胞或前体细胞群联合，可以在组织或器官的体内制造中使用。本发明提供的方法包含使用OPAC接种基质并在适当条件下培养，让细胞分化并填充基质。通过本发明提供的方法获得的组织和器官可以供各种目的使用，包括研究和治疗目的。

在一个优选的实施方案中，本发明提供的OPAC和OPAC群可以用作自体和同种异体移植，包括HLA型匹配和不匹配的造血移植。在OPAC用作同种异体造血移植的一个实施方案中，宿主被治疗，以降低供体细胞的免疫排斥，或产生免疫耐受性(参见例如，美国专利号5,800,539和5,806,529)。在另一个实施方案中，宿主未被治疗以降低免疫排斥或产生免疫耐受性。

6.实施例

以下实施例意图说明现有的实施方案，而且不应被解释为以任何方式限制。本发明引用的所有参考，不管是专利参考、文献参考还是其他方面的参考，为所有目的特此引入作为参考。

6.1 实施例1：OPAC的分离和表征

6.1.1 材料和方法

OPAC的分离：知情同意后，获得从健康供体母亲收集的足月胎盘。绒毛膜组织从羊膜人工分离，切除12g绒毛膜组织并剁碎成1mm³的块。然后剁碎的组织转移到240mL的分散酶II溶液中，其浓度为2.4U/mL；组织在37℃在80RPM搅拌下用分散酶II培养1小时(hr)。用分散酶培养后，消化的组织等分到50mL管中，让其离心；消化的组织样本在室温(RT)220g离心5分钟。小心地倒出上清液后，成团的组织被重悬并合并到温的胶原酶II溶液(270U/mL，体积240mL)中，在80RPM搅拌下在37℃培养1小时。消化物等分到50mL管中，让其离心；消化的组织样本在RT 220g离心5分钟。在消化的组织中存在的酶用5％FBS/PBS洗涤液中和。样本再次提交离心(220g，5分钟，RT)。然后球团(包含释放的细胞和组织)在包含1X青霉素-链霉素和1X 1-谷氨酰胺的20％FBS(Hyclone)/α-MEM(Invitrogen)、或同样包含1X青霉素-链霉素和1X 1-谷氨酰胺的10％FBS(Hyclone)/DMEM(Invitrogen)培养基中重悬。

OPAC的选择性附着分离

作为选择性附着策略的一部分，向预涂层了纤连蛋白(FN，Sigma)、胶原(COL，Stem Cell Technologies)、玻连蛋白(VN，Sigma)、和层粘连蛋白(LN，Sigma)的烧瓶添加细胞悬浮液(如上面描述般获得)。通过让烧瓶和每种蛋白的10μg/mL溶液一起培养，对纤连蛋白和胶原室温1hr，对玻连蛋白37℃1hr，而对层粘连蛋白37℃2小时；在这些培养后用PBS洗涤烧瓶2X，为烧瓶涂层。

细胞悬浮液向涂层的烧瓶接种三小时、24小时和6天后，从建立的培养中去除未贴壁的细胞/组织。然后让留在组织培养烧瓶中的细胞增殖。一旦培养达到约80-90％融合，细胞被冷冻贮存。

基于CD200的细胞表面表达，使用磁辅助细胞分选(MAC)技术，使用抗人CD200-PE抗体(BD Biosciences，cat 552475)、抗PE微珠(Miltentyi，cat#130-048-801)、和MAC柱(Miltenyi)，依照Miltenyi′s MACs柱程序，分离绒毛膜源的贴壁细胞(OPAC)。

OPAC的培养

来自选择性附着策略的显示出最高水平的碱性磷酸酶(AP)诱导的条件(LN或VN涂层，20％FBS/α-MEM，6天建立附着)被进一步扩充到鼓励成骨功能的条件。这些条件包括在纤连蛋白涂层的表面上传代培养，使用可商业获得的间充质干细胞培养基，或使用间充质干细胞限定的胎牛血清。来自原始选择性附着基质的两个细胞系依照以下基质，在LN、VN、或FN涂层的表面上，用表2中描述的三种培养基传代培养。

表2：

建立涂层

1.Hyclone FBS/αMEM

2.Lonza MSC培养基

3.MSC-qualifd FBS(Stem Cell Tech)/αMEM

使用表2中显示的选择性附着基质获得的细胞，然后通过流式细胞术分析，并分析碱性磷酸酶活性。细胞使用以下测试表征：流式细胞术、基因表达分析、和碱性磷酸酶(AP)活性、和蛋白分泌。

基因表达

细胞用胰蛋白酶处理，执行有核细胞计数来确定最小量1×10⁶到1×10⁷的细胞。然后细胞使用来自Qiagen RNEasy试剂盒的裂解程序裂解；裂解液然后穿过QIA粉碎机，以最大化细胞裂解。使用Qiagen RNEasy试剂盒执行RNA分离。

使用Nanodrop ND1000分光光度计测定RNA量；通过Nanodrop ND1000分析最小量为28ng/μl的RNA。RNA的质量用Agilent 2100生物分析仪测量；2.0的rRNA比28S/18S被用作好品质RNA的决定因素。使用大容量cDNA归档试剂盒程序，执行由RNA生成cDNA的反应。使用来自Applied Biosystems的TAQMAN

通用PCR主混合物，执行实时PCR反应。PCR反应使用5′活性的Amplitaq Gold DNA聚合酶在PCR期间裂解TAQMAN

探针。TAQMAN

探针在5″端包含报告染料，而在探针的3″端包含淬灭染料。通过监测报告染料荧光的增加，直接检测PCR产物的积累。

从OPAC、胎盘干细胞、间充质干细胞(ScienCell Research Labs.，Carlsbad，California)、和人真皮成纤维细胞(ScienCell Research Labs.，Carlsbad，California)分离RNA，供骨生成superarray基因芯片，并从OPAC和胎盘干细胞分离RNA(供TGF-BMP芯片)。细胞在基本培养基(每种各自的细胞类型的生长条件)中培养3天，并在成骨培养基(成骨条件)中培养一星期。使用Qiagen′s RNeasy Plus Mini试剂盒，一式四份分离样本。所有的RNA分离是好品质的，而且达到足够的产量来运行(通过Nanodrop测量浓度，Agilent chip测量纯度)。芯片依照制造商的程序运行，而且结果用ABI 7900定量。

碱性磷酸酶活性

为诱导骨生成，细胞以5×10³细胞/cm²在生长培养基中接种约3天，然后保持在生长培养基中，或用包含抗坏血酸(50μg/mL)、地塞米松(0.1μM)、和α-甘油磷酸(10mM)的OS培养基(10％FBS/DMEM)诱导多达2星期；细胞用新鲜的生长或成骨培养基两星期饲养一次。

细胞裂解液中的碱性磷酸酶(AP)活性使用比色测定(Cell Biolabs，San Diego，CA)确定，其测量p-硝基酚产物的形成；使用PicoGreen dsDNA荧光测试，AP活性被标准化到μg DNA(以说明细胞数目的任何差异)。细胞裂解液形成的p-硝基酚量由使用已知量的p-硝基酚(由试剂盒提供)生成的标准曲线通过线性回归分析确定。也使用来自Sigma的试剂盒(#85)，按照制造商的说明书，组织化学地评估碱性磷酸酶活性。

集落形成单位测试-碱性磷酸酶活性

包含CD200^-和CD200⁺细胞的混合物、CD200⁺群、和流过部分(其包含相对高浓度的CD200阴性/dim群)的预分选的OPAC以22.5个细胞/cm²接种到35mm网格皿中的成骨分化培养基(10％FBS/DMEM/50μg/ml抗坏血酸/0.1μM地塞米松)中。细胞用成骨培养基两星期饲养一次，10天后，使用来自Sigma的试剂盒(#85)，按照制造商的说明书，组织化学地评估细胞的碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶阳性克隆的数目使用立体显微镜可视地定量。

免疫荧光染色

细胞在Labtek载玻片上以5000个细胞/cm²培养，并培养2-3天。细胞用3.7％甲醛固定9分钟，然后用PBS洗涤3X。在室温用封闭液(10％山羊血清，2X酪蛋白，0.3％triton)封闭20分钟后，细胞使用兔抗人NG2(Chemicon，1∶150稀释)、小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(Dako，1∶30稀释)抗体，对NG2(硫酸软骨素)和α-平滑肌肌动蛋白染色；细胞和第一抗体在4℃培养过夜。接着样本然后用PBS洗涤，并和带荧光标签的第二抗体，AlexaFluor488抗兔(Invitrogen，1∶400稀释)或AlexaFluor488抗小鼠(Invitrogen，1∶400稀释)一起培养；细胞和第二抗体在室温培养30分钟。接着细胞用PBS洗涤3X，使用包含DAPI的封片剂封装，其目的是核的复染色。细胞使用荧光显微镜成像。

Luminex测试

使用来自Millipore的人骨panel 1B-11plex(cat # HBN1B-51K-11)，依照制造商的说明书，分析来自细胞的条件培养基样本中分泌的因子。

抗体芯片

OPAC、间充质干细胞、胎盘干细胞、和成纤维细胞在基本培养基(生长条件)中培养3天，然后转换到不含血清的培养基中24小时。培养基样本按照制造商的说明书，在RayBiotech RAYBIO

基于生物素标签的抗体芯片上运行。化学发光芯片成像，而且分别使用GelLogic 2200成像系统和Kodak MI成像程序，分析点的尺寸。

6.1.2 结果

选择性附着和基因表达

所有的6天的附着条件生产了足够数量的分析用细胞，但是在10％FBS/DMEM中3hr和24hr的附着条件不足以增殖产生足够的分析用细胞。选择供mRNA表达分析的基因包括：碱性磷酸酶(AP)、DLX5(转录因子)、骨涎蛋白、RUNX2(转录因子)、胶原酶III、osterix(转录因子)、和骨钙蛋白。这些基因中，源自20％FBS/αMEM培养基6天附着，LN、VN和COL涂层的细胞与骨髓源间充质干细胞相比显示了AP mRNA水平的表达增加(图1)。分析的所有其它基因证明，与间充质干细胞相比，在新近分离的胎盘细胞中基因表达水平较低。

免疫表型结果显示，与胎盘干细胞相比，CD200^dim/CD200^-群在6天附着条件下显著增加，尽管最高的增加在20％FBS/αMEM中在LN、VN、COL涂层条件检测到(图2)。流式细胞术也确认，OPAC是CD34^-且CD105⁺的(图2)。

通过流式细胞术，产生增加的CD200^dim/CD200^-群的培养排列，即在20％FBS/αMEM中LN、VN、COL涂层条件，也展示了AP⁺和Stro-1⁺群的显著增加(图3)；与MSC对照相比，这些条件也显示了高的AP基因表达水平。这些同一条件也展示了SSEA3和SSEA4阳性群的显著增加(图4)。

功能分析，通过AP活性确定，展示了在成骨分化条件下(10天诱导)，在FN、LN、VN、COL涂层的底物中，在20％FBS/αMEM条件下，可诱导的AP活性，尽管FN涂层条件展示了更温和的诱导(图5)。

培养的细胞的表征

在各种生长条件增殖得到的细胞的免疫表型证明了在CD200⁺群中40-60％的细胞是CD200⁺的，而对于如例如美国申请公开号2007/0275362中所述的胎盘干细胞(PDAC^TM)为～100％。同样地，相对于PDAC^TM，AP阳性细胞百分比有适度的增加，但是CD105阳性细胞百分比仍然与PDAC^TM是相同的(图6)。

为了更好地定义绒毛膜源的细胞(OPAC)，执行免疫荧光染色来对与显示成骨活性的细胞相关的标记进行染色。周细胞是与脉管系统相关的细胞，而且已知对NG2和α-平滑肌肌动蛋白阳性法产生骨活性染色。因此免疫荧光染色研究对这些标记执行。OPAC与PDAC^TM相比显示两个染色差异：(1)与α-平滑肌肌动蛋白阳性的PDAC^TM相比，缺乏α-平滑肌肌动蛋白的染色，和(2)与标准PDAC^TM的粘着斑定位的NG2染色相比，NG2的弥漫性细胞定位；NG2对亚细胞结构例如粘着斑的定位，涉及到NG2的活性(数据未显示)。

在成骨分化条件下诱导10天后，LN-LN培养基1和VN-VN培养基1条件，如图7所示，显示最高的诱导(成骨/基本)AP活性(黑箭头)，而LN-LN培养基3和VN-FN培养基1展示了最高的总体AP活性(空心箭头)。

为了确定功能活性例如成骨活性和T细胞抑制是源自这些选择性附着细胞制剂的CD200低/阴性的部分还是CD200⁺部分，使用抗人CD200抗体的MAC(磁辅助细胞分离)被用来分离这两种细胞群。对如上识别的具有最高的AP诱导或最高的总体AP活性的4种细胞系基于CD200的表达进行磁分离，并通过流式细胞术、AP活性、和AP阳性的集落形成单位的形成来分析。

免疫表型显示，4个样本中的2个CD200⁺群纯度＞85％，以及流过部分仍包含CD200⁺细胞(图8)。

由分离得到的细胞用成骨培养基诱导10天，并分析AP活性。结果显示，与CD200^dim/CD200^-部分相比，CD200⁺部分具有下降的AP可诱导性(图9)。

CFU(集落形成单位测试)测试在群中测量前体细胞；例如，CFU-F测试一般用来测量骨髓抽出物中的前体数目。CFU-AP测试评估群中潜在的成骨细胞前体的数目。CD200部分在成骨培养基中在35mm网格皿中接种10天，并对碱性磷酸盐染色。每皿克隆数目和AP阳性克隆数目被量化。CD200⁺部分显示无CFU-AP和最低的总体CFU活性，而包含了最高的CD200dim/阴性群的预分选物显示出最大数量的AP阳性CFU和CFU活性。相比之下，CD200⁺群具有低得多的CFU-AP水平和总体CFU活性(图10和11)。

对来自OPAC、CD200⁺胎盘干细胞(PDAC^TM)和间充质干细胞(MSC)的条件培养基样本执行骨相关分泌蛋白的11-plex Luminex测试。细胞在其各自的培养基中培养3天，然后用不含血清的DMEM培养24小时。为了确定细胞在成骨条件下的表现，细胞在生长条件下培养3天，转移到成骨分化培养基(补充了抗坏血酸和地塞米松的培养基)7天，然后用不含血清的DMEM培养过夜。结果显示，3种细胞类型中，OPAC组成性分泌最高水平的骨保护素水平。此外，当三种细胞类型在成骨分化条件下培养时，仅OPAC显示骨保护素分泌上调，而MSC和PDAC^TM显示骨保护素下调。这意味着在骨的微环境中，通过释放高水平的骨保护素，OPAC可更适合抑制破骨细胞活性。

使用SuperArray RT2 Profiler PCR芯片-人骨生成(SABiosciences，Frederick，Maryland)执行骨生成相关的84个基因在OPAC、PDAC^TM、MSC、和成纤维细胞中的表达的分析，这些细胞在生长培养基和成骨培养基中培养。实验中使用的生长培养基是αMEM/20％胎牛血清，包含1X青霉素-链霉素和1X L-谷氨酰胺，实验中使用的成骨培养基是成骨培养基αMEM/20％胎牛血清，包含1X青霉素-链霉素、1X L-谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸、和100nM地塞米松。在在生长和成骨分化条件下培养的OPAC、PDAC^TM、MSC、和成纤维细胞中，测量骨生成相关基因的表达。

在所有细胞类型中，对测量的绝大部分成骨基因发现了基因表达(通过Ct值测量，在该PCR循环中，荧光信号的统计上地显著增加被首先检测)。OPAC与PDAC^TM、MSC和成纤维细胞相比(分别为表3A-3C)显示独有的基因表达谱，而且当细胞从生长转到成骨培养基时与PDAC^TM、MSC和成纤维细胞相比(分别为表3D-3F)显示独有的基因表达诱导谱。Ct值(表3A-3C)是直接从PCR循环器获得的数字，并作为范围被报告；像这样，这些值如下面解释的转换成一个、两个、三个或四个加号。为了计算在生长培养基中与成骨培养基相比基因表达的倍数变化，基于管家基因的表达，对Ct值应用修正系数。这一修正系数标准化了PCR中使用的RNA量的轻微差异。

表3A-3C：在生长或成骨培养基中，OPAC vs.PDAC^TM(表3A)、OPAC vs.MSC(表3B)和OPAC vs.成纤维细胞(表3C)的成骨基因表达(Ct值)如上文所定义(n＝2)。基因的表达水平被分类成++++(非常高，Ct＜20)、+++(高，20＜Ct＜25)、++(中，25＜Ct＜30)、+(低，30＜Ct＜35)、-(低，35＜Ct＜40)或空白(未检测到信号)。

表3A：

G：在生长培养基中，相对表达vs.对照。

O：在成骨培养基中，相对表达v.对照。

表3B

G：在生长培养基中，相对表达vs.对照。

O：在成骨培养基中，相对表达v.对照。

表3C：

G：在生长培养基中，相对表达vs.对照。

O：在成骨培养基中，相对表达v.对照。

表3D-3F：在OPAC以及PDAC^TM、MSC和成纤维细胞中，选择的基因在生长培养基中与成骨培养基相比的表达倍数差异。举例来说，对特定基因倍数差异10表明该基因在成骨培养基中与生长培养基相比被诱导了十倍。仅显示了在成骨培养基中OPAC中的成倍诱导比PDAC^TM(表3D)、MSC(表3E)或成纤维细胞(表3F)中的成倍诱导至少高或低十倍的结果(空白结果被赋值为0供选择)。

表3D

倍数差异：在生长培养基和成骨培养基中的表达之间的差异。

空白：因为来自一种细胞类型的荧光太低，倍数差异不可计算。

表3E：

表3F：

当OPAC和PDAC^TM在生长条件下培养时，使用TGFβ/BMP超家族中的一组84个基因来比较它们，OPAC一般显示骨形成相关基因的较高表达(表4)。OPAC具有与骨形成的营养支持相关的基因的较高表达，包括BMP(特别是BMP-2)和TGF-β。OPAC也具有可与骨形成抑制或骨吸收的营养支持相关的基因的较高表达，包括抑制素和TGF-β(TGF-β在骨形成和吸收中都涉及)。TGFβ/BMP超家族代表了调节多个不同器官系统的复杂回馈系统。这一超家族的基因在OPAC中表达水平比在PDAC^TM中要高的事实，表明OPAC具有比PDAC^TM更强的调节骨代谢能力。

表4：

上调/下调：OPAC/PDAC^TM倍数差异

表4：在生长培养基中OPAC、PDAC^TM、MSC和成纤维细胞的TGFβ/BMP超家族成员基因表达(Ct值)(n＝3)。基因的表达水平被分类成++++(非常高，Ct＜20)、+++(高，20＜Ct＜25)、++(中，25＜Ct＜30)、+(低，30＜Ct＜35)、-(低，35＜Ct＜40)或空白(未检测到信号)。倍数差异代表OPAC与PDAC^TM相比表达水平的差异。仅显示了OPAC中的表达超过PDAC^TM中的表达、或PDAC^TM中的表达超过OPAC中的表达的基因。

除了基因表达以外，对在生长条件下生长的OPAC、PDAC^TM、MSC和成纤维细胞也执行蛋白分泌分析(RayBiotech′s RayBio

基于生物素标签的抗体芯片)(图13)。在4种细胞类型之间识别总计46种分泌的蛋白。由OPAC但不由PDAC^TM分泌的蛋白包括凝血因子II/组织因子、核心蛋白聚糖、表皮调节素、卵泡抑素样1、IGFBP6、IGF-IIR、IL-2Rα(白细胞介素2受体α)、IL-12Rβ2(白细胞介素12受体亚基β2)、IL-17RC(白细胞介素受体C)、IL-27(白细胞介素27)、潜在的TGF-β结合蛋白1、NCAM-1/CD56(神经细胞粘着分子1)、sFRP-4(分泌的卷曲相关蛋白4)、SMAD4、脊骨蛋白、TFPI(组织因子途径抑制剂)、TGF-β R1/ALK5(转化生长因子β受体1)、TIMP-2(金属蛋白酶2的组织抑制剂)、和TSG-6(肿瘤坏死因子(TNF)刺激的基因6)。由OPAC但不由MSC分泌的蛋白包括核心蛋白聚糖、表皮调节素、FGF-7/KGF、IGFBP-3、IL-2Rα(白细胞介素-2受体α)、IL-3Rα(白细胞介素3受体α)、IL-5Rα(白细胞介素5受体α)、IL-17RC、IL-27、NCAM-1/CD56、SMAD4、TFPI、TGF-βR1/ALK-5、TGF-βRIII(转化生长因子β受体3)、和TIMP2。与PDAC^TM和MSC相比，其表达为OPAC独有的蛋白是核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5和TIMP-2。这些中，核心蛋白聚糖、IGFBP-6、和IL-27在骨调节中涉及。这些中，卵泡抑素样-1、sFRP-4、和TSG-6在骨调节中涉及。

在单独的实验中，OPAC还显示不表达RANKL，这通过定量RT-PCR评估；但是，骨髓源MSC生产显著数量的RANKL的RNA。

6.2 实施例2：OPAC的体内骨形成能力

为了评估OPAC的体内骨形成能力，使用骨修复的颅骨缺损模型，执行体内研究。实验上，使用四十八(48)只雄性Hsd:RH-Foxn1rnu裸大鼠(Harlan Laboratories，Indianapolis，Indiana)，在研究开始时大约6星期大。所有大鼠在颅盖骨每侧创造一个3mm×5mm的缺损。每只的左侧缺损用阴性对照(HEALOS

骨移植替代物，单独)处理，而每只的右侧缺损用阳性对照(HEALOS

+BMP-2)、阴性对照(空白缺损；骨头被去除，没有用任何东西代替)、或装载到HEALOS载体基质上的细胞(PDAC^TM或OPAC)处理。八只动物被分配到细胞治疗组，而四只动物被分配到BMP-2和空白缺损组。缺损用包含以下剂量的Healos处理：5μg BMP-2，或3×10⁵-4×10⁵个细胞。

在植入后七(7)星期杀死大鼠。尸体剖检时，收集头骨并放置在10％甲醛中。颅盖骨用PIXI扫描，射线拍照，然后脱钙供石蜡包埋和切片。颅盖骨的头颅组织切片用甲苯胺蓝和H&E染色(苏木紫和伊红)来染色。缺损的骨向内生长的量通过0到4的评分系统来评估，4是最大量。

手术详情

从Harlan，Indianapolis，IN USA定购总计四十八(48)只+备用四(4)只雄性裸大鼠Hsd:RH-Foxn1rnu。动物是无特定病原体的，而且在到达MDS-PS-功效药理学时大约6星期大。依照标准操作程序(SOP)，使用氯胺酮/赛拉嗪，通过腹腔内注射递送，麻醉大鼠。全身麻醉在大约3-5分钟中实现，通过缺乏对脚趾夹痛的反应来注意到。手术期间根据需要，用异氟烷来保持镇静状态。

使用电动推剪剃净头骨区域，用酒精和洗必泰擦洗作准备。动物摆成在向前的稳定姿势中稳固地抓住头部的姿势，在两耳间的中央颅骨区域皮下施用局部麻醉注射(大约0.2ml利多卡因)。在利多卡因注射位置制造横向的皮肤切口，将组织扩张器放置到切口嘴边缘(皮瓣)的中央区域中。扩张器打开切口，暴露了颅骨。切除变成凝胶样的利多卡因，使用手术刀片在顶缝/顶间缝处的骨膜中作横向切口。作切口后，从顶骨移走骨膜。以中速使用Dremel钻孔机，轻柔地雕刻出两个缺损的边缘，大约每侧顶骨中为3mm×5mm区域，直到中央骨块完全不再附着。该区域在钻孔期间用无菌盐水滴冲洗，以防骨头变得过热。当这块骨头完全分离时，用Adson钳子移走它。检查缺损的边缘，如果必要的话，使用钳子轻柔地弄平滑。为了去除骨粉和骨屑，颅骨用大约3mL无菌盐水冲洗，用一块无菌纱布吸收盐水。一旦干净了，多余的流体也去除了，缺损用指定的测试物品治疗。然后拉回皮肤覆盖颅骨，皮肤切口使用3.0或4.0Vicryl缝线封闭。动物设施人员作手术后检查以记录动物的完全恢复。在手术后49天，剩余的动物通过CO₂窒息安乐死。

分析详情

收集颅盖骨并放置在10％甲醛中。固定后，使用Lunar双能X射线吸收法(PIXI)，确定两侧颅盖骨缺损的骨矿物质密度(BMD)。设定比缺损区域边缘小的ROI，而且对所有样本中的两侧缺损使用相同大小的ROI。PIXI测量了骨矿物质面积(BMA)和骨矿物质含量(BMC；g)。然后用BMC除以BMA(mm²)，确定区域骨矿物质密度(BMD；g/mm²)。完成PIXI密度测定后，颅盖骨射线拍照并处理供组织学。颅盖骨射线拍照，通过脱钙组织处理来处理，获得两块。获得后，颅盖骨用石蜡包埋。穿过缺损区域切三块头颅切片，厚度各大约4-6μm，并封装到载玻片上。一块切片用甲苯胺蓝染色，一块用H&E染色，供骨向内生长的组织病理学评估。通过围绕颅骨缺损标出感兴趣的区域，使用X射线扫描执行缺损闭合检测，使用阀值来定义可透射线的(暗的残留缺损)区域，与不透射线的区域区分开来，使用成像软件量化这些残留缺损区域。

结果展示，OPAC与PDAC^TM相比，在这一模型中，骨形成增加了20％，这通过BMC和BMD的增加以及通过H&E染色可见。基于体内数据的分析，OPAC比PDAC^TM显示至少大20％的骨形成，这通过组织学(图14)和密度(PIXI)分析(图15)。此外，在杀死时使用X射线扫描获得的残留缺损区域的分析，表明与PDAC组中38％的动物相比，OPAC组中63％的动物显示大于50％的缺损闭合(图16)。

6.3 实施例3：使用OPAC治疗多发性骨髓瘤

6.3.1 材料&方法

6.3.1.1 用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)稳定转导的OPAC的建立

使用包含增强的绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的pLEGFP逆转录病毒载体(Clontech，Palo Alto，California，USA)，使用SuperFect(QIAGEN Inc.，Valencia，California，USA)，瞬时转染包装细胞系Phoenix Eco(单嗜性)。EGFP是野生型水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白的红移变种，其被优化成更亮的荧光和哺乳动物细胞中的更高表达。转染后24-48小时，收集包含逆转录病毒颗粒的上清液。OPAC在8μg/ml聚凝胺存在下用逆转录病毒颗粒感染12小时，在这时用新鲜的培养基替换培养基。在一些实验中，在通过在200-400μg/ml G418存在下培养它们2-3星期来筛选之前，细胞再一次暴露于包含病毒颗粒的上清液。

6.3.1.2 OPAC在骨髓瘤SCID-Rab小鼠中的植入

作为在原代人骨髓瘤的SCID-hu模型中使用人骨组织的替代，改而使用其中兔骨被植入到SCID小鼠中(SCID-rab小鼠)接着直接引入骨髓瘤细胞到植入的骨中的系统。骨髓瘤SCID-rab小鼠如先前描述般构建。参见Yata，K.和Yaccoby，S.等，Leukemia 2004；18：1891-1897。CB.17/Icr-SCID小鼠(6-8星期大)从Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN，USA)获得，怀孕的新西兰兔从Myrtle Rabbitry(Thompson Station，TN，USA)获得。3-4星期大的兔用高剂量的戊巴比妥钠深度麻醉，通过颈部脱臼安乐死。兔股骨和胫骨切成两片，近端和远端保持闭合，而椎骨切成小片(1×2cm²)。

对骨的植入，用酒精清洗SCID小鼠的右侧或左侧，并用无菌纱布吸干。兔骨通过小的(5mm)切口皮下插入。然后用无菌的手术钉封闭切口，让骨的植入进行6-8星期。在一些实验小鼠中，在同一小鼠中同时对侧植入两根骨头。对每个实验，10-50×10⁶个未分离的人类患者源骨髓瘤骨髓细胞，其包含17+/-8％的浆细胞(PC)，或者3.3+/-1.6×10⁶个PC，在50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，直接注射到植入的兔骨中。对每个实验，至少使用两只小鼠。小鼠周期性地从尾静脉取血，测量循环的M-蛋白同种型的人免疫球蛋白(Ig)水平变化。

通过小鼠血清中人单克隆免疫球蛋白(hlg)水平的增加(通过ELISA可见)和溶解的骨损害的射线照相评估，证明骨髓瘤生长的建立。使用胰蛋白酶-EDTA收集5×10⁵个表达EGFP的OPAC，并在50μl PBS中重悬。OPAC直接注射到SCID-rab小鼠中植入的骨中。实验持续到注射后8-16星期。使用PIXImus DEXA密度计(GE Medical Systems LUNAR，Madison，WI)，测定植入的骨的骨矿物质密度(BMD)变化。

6.3.1.3 从SCID/Rab小鼠收获的组织的免疫组织化学

来自携带原代骨髓瘤的SCID-rab小鼠的脱钙骨切片，在二甲苯中去石蜡，用乙醇再水化，在PBS中清洗，并使用微波如先前描述般回收抗原(参见Yata，K.，前述)。培养的OPAC用胰蛋白酶处理，制备细胞离心涂片载玻片，并用10％磷酸盐缓冲的福尔马林固定20min。过氧化物酶用3％过氧化氢淬灭10min后，载玻片用针对EGFP、以及人CD166、骨钙蛋白和BMP-2的单克隆抗体(5-10μg/ml)培养30-60min，使用Dako的免疫过氧化物酶试剂盒显影，用苏木紫复染色。

6.3.1.4 Von Kossa和茜素红染色

为检测钙沉积(von Kossa染色)，OPAC在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定10min。加入新鲜制备的5％硝酸银，试样留在黑暗中10min，用蒸馏水清洗，然后在水的覆盖下暴露于紫外光15min。通过用蒸馏水彻底清洗来停止反应。

6.3.1.5 统计分析

除非另外指出，所有的值都被表达为平均值±平均值的标准差(SEM)。使用Student′s配对t-检验来检验不同培养条件对骨髓瘤细胞数目、生存能力、凋亡、和增殖的影响，和检验SCID-rab小鼠中OPAC对肿瘤生长和人骨矿物质密度(BMD)的影响。

6.3.1.6 OPAC的慢病毒介导的转导

所有重组的慢病毒依照标准程序通过293T细胞的瞬时转染生产。简单来说，293T细胞与转染沉淀一起培养过夜；然后，替换培养基，接着培养另外2天。收获转染的细胞的培养基，在4℃在3,000rpm离心15分钟，通过0.22μm孔径的过滤器过滤。滤液在20％蔗糖垫的顶部分层，在4℃在Beckman超速离心机中使用SW28转子在26,000rpm旋转100分钟。成团的病毒样颗粒在DMEM中悬浮，并在-80℃贮存。通过将病毒悬浮液的等分试样添加到单层293T细胞或其它适当细胞类型上，然后通过荧光激活细胞分选(FACScan，Becton Dickinson)评估GFP阳性细胞的百分比，来测定病毒储存液的滴度(滴度单位[TU]/ml)。常规获得大于10⁹TU/ml的滴度。

OPAC在8μg/ml聚凝胺存在下用逆转录病毒颗粒转染12小时，在这时用新鲜的培养基替换培养基。在一些实验中，在通过在200-400μg/ml G418存在下培养它们2-3星期来筛选之前，细胞再一次暴露于包含病毒颗粒的上清液。

6.3.2 结果

6.3.2.1 OPAC的基质矿化

OPAC在成骨培养基(αMEM，补充了10％FBS、地塞米松(100nM)、抗坏血酸(0.05mM)和βGP(10mM))存在或缺乏下培养大约2星期。为检测钙沉积，细胞在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定10分钟。固定的细胞用茜素红染料染色。通过用蒸馏水彻底清洗来停止反应。在成骨培养基中培养的OPAC显示基质矿化的信号，通过沉积在细胞外基质中由细胞生产的钙与茜素红的结合表明。基质矿化是成骨分化的一个标记(数据未显示)。

6.3.2.2 OPAC抑制破骨细胞成熟

共培养实验：使用转孔装置，将OPAC或MSC先在膜背侧用成骨性培养基培养。然后将破骨细胞前体在上部间隔中培养。为了让成骨细胞和破骨细胞同时分化，然后用补充了10％PBS、RANKL(50ng/ml)、M-CSF(25ng/ml)、地塞米松(100nM)、抗坏血酸(0.05mM)和βGP(10mM)的α-MEM培养膜大约2星期。这一程序导致表达耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)的多核破骨细胞和表达碱性磷酸盐的成骨细胞同时生长。在OPAC或间充质干细胞缺乏下培养的破骨细胞前体，产生平均120个破骨细胞(参见图17)。相比之下，当在胎盘干细胞存在下培养时，破骨细胞前体产生平均40个破骨细胞，而当在MSC存在下培养时，平均60个破骨细胞。因此，OPAC显得比间充质干细胞更有效地抑制破骨细胞形成。

当破骨细胞和OPAC在骨保护素抗体存在下培养时，OPAC对破骨细胞分化的影响显著降低，而且形成了显著更多个破骨细胞(抗OPG；p＜0.04)。此外，OPAC单独和破骨细胞前体一起培养时，与破骨细胞前体在抗OPG存在下培养时相比，形成了显著(p＜0.004)更多个破骨细胞。因此，不愿受限于任何特定的机制或理论，OPAC对破骨细胞分化的抑制看起来被OPAC分泌的骨保护素介导。

6.3.2.3 通过OPAC抑制多发性骨髓瘤细胞的生长

由在预定的临床来访期间从27位患有活性骨髓瘤的患者抽出的肝素化的骨髓(BM)，获得多发性骨髓瘤细胞。骨髓样本使用Ficoll-Paque通过密度离心分离(比重1.077g/ml)，多发性骨髓瘤浆细胞部分处于轻密度细胞部分中，通过CD38/CD45流式细胞术确定。浆细胞(PC)使用CD138免疫磁珠筛选和autoMAC自动化分离系统(Miltenyi-Biotec，Auburn，CA)分离。PC纯度通过CD38/CD45流式细胞术确定，常规≥94％。

OPAC和MSC在标准条件或成骨条件下处理，并与多发性骨髓瘤细胞共培养。对共培养实验，使用带1μm孔的半透膜(transwell insert)。在这一系统中，成骨细胞(即，在成骨条件下生长的MSC或OPAC)、MSC或OPAC在膜背侧生长，而多发性骨髓瘤(Con MM)细胞在膜的上部间隔中培养。对培养，将6孔膜倒置翻转并放置在无菌的深皿中。用胰蛋白酶-EDTA收集MSC或OPAC，在MSC培养基中重悬(大约0.5×10⁶/ml)。将大约600μl细胞放置在翻转的膜的中心上。然后用封口膜覆盖皿，放置在培养箱中1小时，让细胞附着到膜上。培养后，将膜翻转回来，放置到6孔板中。当MSC或OPAC大约80％融合时，用MSC培养基或成骨性培养基培养它们2-3星期。使用MTT测试在72小时后评估多发性骨髓瘤细胞的生存能力。MTT测试是测量酶的活性的比色测定，该酶将MTT还原成甲瓒产生紫色。这一还原仅在线粒体还原酶有活性时发生，因此该转换经常用作存活细胞的测量。

结果显示未分化的OPAC抑制Con MM细胞的生存能力约70％，而MSC仅抑制Con MM生存能力约40％(参见图18)。在成骨条件下OPAC比在非成骨条件下更多地抑制Con MM细胞的生存能力；MSC也在成骨条件下显示更多抑制，尽管与OPAC不在同一水平(参见图18)。

也测试OPAC抑制多发性骨髓瘤细胞系增殖的能力，在允许细胞间接触的共培养环境中，与胎儿骨髓源间充质干细胞(FB MSC)比较。OPAC(10,000个细胞/孔)与多发性骨髓瘤细胞系BN和JB(参见Li等，Br.J.Haematology 138(6)：802-811(2007))、ARP1(地塞米松敏感的IgA多发性骨髓瘤源细胞系)、U266(产生IgE的浆细胞系)、Dn和Hale(10,000个细胞/孔)，其全部表达荧光素酶，在包含10％胎牛血清和抗生素的RPMI培养基中一起培养7天。通过检测荧光素酶活性，评估多发性骨髓瘤细胞的生长。多发性骨髓瘤细胞系的OPAC抑制的生长大致如下：BN(0.4)；JB(0.5)；ARP1(0.15)；U266(0.28)；Dn(0.32)；和hale(0.75)，其中圆括号中的数字表明MM细胞系的生长是与FB-MSC共培养的MM细胞系的生长的多少倍。

在进一步的实验中，获得来自六个不同人类患者的多发性骨髓瘤细胞，以400,000个细胞/孔与胎儿骨髓源间充质干细胞或OPAC共培养6-10天。与胎儿MSC相比，OPAC存在时多发性骨髓瘤细胞的生存能力显著降低(p＜0.03)。

6.3.2.4 带标签的、损害内施用的OPAC在动物中的生物分布

这一实施例论证了转染的OPAC在小鼠中的生物分布。OPAC用荧光素酶报告基因转染。使用包含EGFP的pLEGFP逆转录病毒载体(Clontech，Palo Alto，California，USA)，使用SuperFect(QIAGEN Inc.，Valencia，California，USA)，瞬时转染包装细胞系Phoenix Eco。转染后24-48小时，收集包含逆转录病毒颗粒的上清液。OPAC在8μg/ml聚凝胺存在下用逆转录病毒颗粒转染12小时，在这时用新鲜的培养基替换培养基。在一些实验中，在通过在200-400μg/ml G418存在下培养它们2-3星期来筛选之前，细胞再一次暴露于包含病毒颗粒的上清液。

SCID-rab动物如先前描述般植入了兔骨。具有显示进行性损害的骨头的动物，直接向损害中注射了带标签的细胞(1×10⁶个细胞)。OPAC在小鼠中的生物分布，通过生物发光成像这种实时非侵入性工具在不同时间点监测。在注射后2星期和5星期，在SCID-rab动物中植入了外源骨头的区域，在小鼠中可以检测到表达EGFP的OPAC(数据未显示)。

6.3.2.5 OPAC在原代骨髓瘤SCID-rab小鼠中增加骨矿物质密度

原代骨髓瘤SCID-rab小鼠如上文所述构建。通过小鼠血清中人单克隆免疫球蛋白(hIg)水平的增加(使用ELISA)和溶解的骨损害的射线照相评估，评估骨髓瘤生长的建立，骨髓瘤生长建立时，使用胰蛋白酶-EDTA收集1×10⁶个表达EGFP的OPAC，并在100μl PBS中重悬。OPAC和PBS直接注射到包含骨髓瘤损害的植入的骨中。在注射后8-16星期，间隔5星期使用PIXImusDEXA(GE Medical Systems LUNAR，Madison，WI)，测定植入的骨的骨矿物质密度(BMD)变化。与仅注射培养基的对照相比，发现损害内施用的OPAC增加了植入的骨的骨矿物质密度(BMD)。(p＝0.0006.)(参见图19)

6.3.2.6 OPAC在多发性骨髓瘤影响的骨头中增加骨量

骨髓瘤SCID-rab小鼠如上面描述般构建，注射了来自人类患者的原代骨髓瘤细胞。通过小鼠血清中人单克隆免疫球蛋白(hlg)水平的增加(通过ELISA评估)和溶解的骨损害的射线照相评估，证明了溶骨性损害的发展后，5-10×10⁵个表达EGFP的OPAC如先前实施例中描述般施用。实验持续到注射后8-16星期。注射OPAC后，使用小鼠血清中的人单克隆免疫球蛋白(hIg)(通过ELISA测试)，来确定人骨髓瘤细胞的水平(参见图20)。使用PIXImus DEXa(BEMedical Systems LUNAR，Madison，WI)，测定植入的骨的骨矿物质密度(BMD)变化。在研究进程内，注射后35天后，与仅接受缓冲液的小鼠相比，接受损害内施用的OPAC的骨髓瘤小鼠中，植入的骨显示骨量的显著增加(0.10gm/cm²)(p＝0.006)。

6.3.2.7 OPAC在施用了侵袭性多发性骨髓瘤细胞系的SCID-Rab动物中抑制骨破坏

骨髓瘤SCID-rab小鼠如上文所述构建。使用侵袭性BN骨髓瘤细胞系(从人类患者中分离的非超二倍体细胞系)建立骨髓瘤时，缓冲液或OPAC对骨髓瘤细胞生长的影响通过小鼠血清中人单克隆免疫球蛋白(hIg)水平的增加(使用ELISA)和溶解的骨损害的射线照相评估来评估。使用胰蛋白酶-EDTA收集0.5×10⁶个表达EGFP的OPAC(0.5×10⁶个细胞)，并在50μl PBS中重悬。在SCID-rab小鼠中，OPAC和PBS直接注射到植入的骨中。实验持续到注射后8-16星期。使用PIXImus DEXA(GE Medical Systems LUNAR，Madison，WI)，测定植入的骨的骨矿物质密度(BMD)变化。数据显示，OPAC抑制了应归因于这一侵袭性多发性骨髓瘤细胞系的骨量丢失，通过骨矿物质密度(BMD)和骨矿物质含量(BMC)测量。参见图21。

由OPAC引起的骨量丢失的降低/消除，通过X射线射线照相术确认(数据未显示)。OPAC治疗的动物与对照动物相比具有较高的骨量，通过新的骨头的不透射线区域的显著增加证明。

6.4 实施例4：使用OPAC与美法仑联合治疗多发性骨髓瘤

这一实施例论证了OPAC与美法仑联合施用，治疗与多发性骨髓瘤相关的溶骨性损害的效力。

骨髓瘤SCID-rab小鼠如上面6.3.1.2部分中描述般植入骨。将小鼠分成接受OPAC组，剂量约1百万个，在磷酸盐缓冲盐水中；和不接受OPAC的对照组。小鼠在星期0注射了表达EGFP/荧光素酶的多发性骨髓瘤细胞系(BN)，直接注射到植入的骨中，并从星期3开始用10mg/kg美法仑皮下治疗四星期(骨髓瘤细胞注射后星期3-7)，每星期两次。在星期7，美法仑治疗停止，无标签的OPAC损害内注射到植入的骨中，大约1百万个细胞/小鼠。疾病继续进展另外十一星期。在星期3、7和18，执行活动物成像。与对照相比，接受OPAC的小鼠显示多发性骨髓瘤肿瘤细胞的负担降低，通过EGFP和荧光素酶的荧光证明。此外，接受OPAC的小鼠比对照小鼠更好地保持骨量，与对照小鼠的美法仑后大约4％丢失相比，美法仑后的骨量显示大约28％的增加。

6.5 实施例5：冷冻贮存的OPAC产品和细胞库的生产

这一实施例论证了冷冻的基于OPAC的产品的生产。

冷冻贮存：OPAC如实施例1中描述般获得。将要冷冻的细胞，用胰蛋白酶-EDTA从培养中收获，用含2％FBS的PBS淬冷，并用血细胞计数器计数。离心后，细胞用含10％DMSO的FBS重悬，对用于组成细胞库的细胞，浓度约1百万个细胞/ml，对个体冷冻细胞剂量，浓度一千万个细胞/ml。细胞溶液转移到冷冻容器中，该容器放置在-80℃冰箱中的异丙醇浴中。下一天，细胞转移到液氮中。

6.5.1 OPAC库的设计

“批次”定义为源自单一供体绒毛膜的所有细胞剂量。在扩增培养期间，细胞在8次传代和30次倍增内保持正常生长、核型、和细胞表面标记表型。考虑到这一限制。剂量包含5次传代和约20次倍增的细胞。为了产生等同的细胞供应，单一批次在培养中扩增，并贮存在双重细胞库和冷冻剂量中。详细地，从原代培养收获细胞，其定义为经历过0次倍增的0代细胞，用它开始扩增培养。第一次传代后，发生大约4次倍增，而且细胞在主细胞库(MCB)中冷冻。使用来自MCB的小瓶接种另外的扩增培养。从MCB解冻的细胞另外传代两次后，细胞在工作细胞库(WCB)中冷冻，累积大约12次倍增。使用来自WCB的小瓶接种扩增培养，另外传代2次，得到5代细胞，大约20次倍增，其被冷冻为个体剂量。

6.5.2 解冻细胞供培养

将冷冻的细胞容器放置到密封的塑料袋中并浸入37℃水浴。轻柔地旋转容器，直到除了一小块冰以外所有内容物融化。从密封的塑料袋中取出容器，缓慢向细胞添加10×体积的培养基，轻柔混合。样本用血细胞计数器计数，并接种到扩增培养中。

6.5.3 解冻细胞供注射

冷冻的细胞容器在干燥的氮运输器中转移到施用地点。在施用前，将容器放置到密封的塑料袋中并浸入37℃水浴。轻柔地旋转容器，直到除了一小块冰以外所有内容物融化。从密封的塑料袋中取出容器，添加等体积的2.5％HSA/5％葡聚糖。注射细胞，无需进一步洗涤。

6.5.4 测试和规格

所有供体胎盘都伴有母体血样。对样本筛查乙肝核心抗体和表面抗原、丙肝病毒抗体和核酸、以及HIV I和II抗体和核酸。胎盘加工和原代培养在收到测试结果前开始，但仅在与胎盘相关的母体血样对所有病毒测试为阴性时继续。如果供体对任何病原体测试为阳性，批次不被接受。另外，对MCB、WCB和源自WCB小瓶的细胞剂量材料的样本，执行表3中描述的测试。批次仅在满足全部规格时才能发布。

表3：细胞测试和规格

^*对设计为40ml冷冻细胞/剂量且最大值5EU/ml的产品，对体重超过40kg的受体，细胞产品是低于5EU/kg/剂量的上限的。

6.6 实施例6：通过施用OPAC来治疗多发性骨髓瘤

6.6.1 OPAC在溶液中损害内施用

个体显示患有多发性骨髓瘤，伴有骨痛和高钙血症(在这一例子中，血钙水平在3到4mmol/L之间)的症状。X射线成像确认在胫骨、腓骨、桡骨和尺骨中存在多重损害。每个损害约1×10⁷到约1×10⁸的OPAC，在1.0-2.0mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过直接注射到损害中对个体施用。注射后个体每两个星期通过X射线评估，以确定骨损害范围，而且每星期评估血钙水平，直到通过X射线，骨损害可见地降低，或血钙水平可检测地降低。OPAC任选地在初始施用的四星期内再次施用。

6.6.2 OPAC在胶原凝胶中损害内施用

个体显示患有多发性骨髓瘤，伴有骨痛和高钙血症(在这一例子中，血钙水平在3到4mmol/L之间)的症状。X射线成像确认在胫骨、腓骨、桡骨和尺骨中存在多重损害。每个损害约1×10⁷到约1×10⁸的OPAC，在包含足以形成可注射凝胶的胶原的1.0-2.0mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过直接注射到损害中对个体施用。注射后个体每两个星期通过X射线评估，以确定骨损害范围，而且每星期评估血钙水平，直到通过X射线，骨损害可见地降低，或血钙水平降低到3mmol/L或更少。OPAC任选地在初始施用的四星期内再次施用。

6.6.3 OPAC和骨移植替代物一起损害内施用

个体显示患有多发性骨髓瘤，伴有骨痛和高钙血症(在这一例子中，血钙水平在3到4mmol/L之间)的症状。X射线成像确认在胫骨、腓骨、桡骨和尺骨中存在多重损害。在床旁，可注射的骨移植替代物(例如HEALOS

)与约1×10⁷到约1×10⁸的OPAC在1.0-2.0mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中预混合，然后在损害位点注射到个体中。注射后个体每两个星期通过X射线评估，以确定骨损害范围，而且每星期评估血钙水平，直到通过X射线，骨损害可见地降低，或血钙水平降低到3mmol/L或更少。OPAC任选地在初始施用的四星期内再次施用。

6.6.4 OPAC的静脉内施用

个体显示患有多发性骨髓瘤，伴有骨痛和高钙血症(在这一例子中，血钙水平在3到4mmol/L之间)的症状。X射线成像确认在胫骨、腓骨、桡骨和尺骨中存在多重损害。约1×10⁹到约1×10¹⁰的OPAC，在约750mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过静脉内注入对个体施用。注射后个体每两个星期通过X射线评估，以确定骨损害范围，而且每星期评估血钙水平，直到通过X射线，骨损害可见地降低，或血钙水平降低到3mmol/L或更少。OPAC任选地在初始施用的四星期内再次施用。

等同物：

本发明提供的组合物和方法不被本发明描述的具体实施方案的范围限制。实际上，由前述的描述和附图，除了描述的那些以外，实施方案的各种修改对本领域技术人员将成为显然的。这样的修改将落在所附的权利要求范围内。

各种公开物、专利和专利申请在本发明中被引用，其公开内容全文通过引用并入本文。

Claims

1.治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括对所述个体施用分离的成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)，其中所述OPAC是从绒毛膜获得的，而且附着到组织培养塑料制品上，而且其中所述OPAC是CD200阴性的或是CD200^dim的，且CD105阳性的，而且其中所述施用可检测地降低、停止所述多发性骨髓瘤的一种或多种症状的进展或改善所述多发性骨髓瘤的一种或多种症状。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述OPAC是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述OPAC是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。

4.如权利要求1所述的方法，其中：

当所述OPAC和所述CD200⁺胎盘干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的CD200⁺贴壁胎盘干细胞相比，所述OPAC以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP3(骨形态发生蛋白3)、CDH11、COL10A1、COL14A1、COL15A1、DMP1(牙本质基质酸性磷蛋白1)、DSPP(牙本质涎磷蛋白)、ENAM(釉蛋白)、FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)、MMP10(基质金属蛋白酶10(基质分解素2))、TGFB3、和/或TGFBR1中的一个或多个，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的CD200⁺贴壁胎盘干细胞相比，所述OPAC以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN(成釉蛋白(釉基质蛋白))、BMP2(骨形态发生蛋白2)、CALCR(降钙素受体)、CDH11、COL11A1、COL14A1、COL15A1、COL2A1、CSF2、CSF3、DMP1、DSPP、ENAM、FGF3、GDF10(生长分化因子10)、IGF1(胰岛素样生长因子1)、ITGA1(整联蛋白，α1(CD49))、ITGA2(整联蛋白，α2(CD49B))、MMP10、MMP8(基质金属蛋白酶8(中性粒细胞胶原酶))、MMP9、PDGFA(血小板源生长因子A)、SMAD1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2(转化生长因子β，受体2)中的一个或多个，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺胎盘干细胞相比，所述OPAC在可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CDH11、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、MMP10、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG(α-2-HS-糖蛋白)、ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏)、EGF(表皮生长因子)、FLT1(fins相关的酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体))、IGF2、ITGA2、ITGAM(整联蛋白，αM(补体成分3受体3亚基))、SCARB1(清道夫受体B类，成员1)、SOX9(SRY(性别决定区Y)-盒9)、TNF、TWIST1(扭曲同系物1；以前称作睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂3，尖头并指趾畸形3)、VCAM1(血管细胞粘附分子1)和/或VDR(维生素D(1，25-二羟基维生素D3)受体)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BGN(双糖链蛋白多糖)、COL11A1、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、FGF1和/或VCAM1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达VCAM1，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、CALCR、CD36、CDH11、COL12A1、COL14A1、COL15A1、COL3A1、COL5A1、DMP1、DSPP、FLT1、MSX1、PDGFA、TGFB3、TGFBR1和/或TUFT1(釉丛蛋白1)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、CALCR、COL14A1、COL15A1、CSF3、DMP1、DSPP、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP9、MSX1、PDGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CALCR、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、MSX1、PDGFA、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和间充质干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP(骨γ-羧基谷氨酸(gla)蛋白)、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1和/或SOX1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、BGLAP、BGN、BMP3、BMP5、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL2A1、COL4A3、COMP、EGF、FGF1、FGFR2、IGF2、MMP8、PHEX(磷酸盐调节的肽链内切酶同系物，X连锁)、RUNX2(runt-相关转录因子2)、SCARB 1、SOX1、VCAM1和/或VEGFB中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；或

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述OPAC在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、SCARB1和/或SOX9中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述OPAC：

与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CD36、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、CSF2、CTSK、FGF2、FGFR1、FLT1、ITGA1、MINPP1、MMP9、MSX1、PDGFA、SERPINH1、TGFB3和TGFBR1中的一个或多个，其中所述OPAC和所述间充质干细胞经历了相等数目的传代；或

与相等数目的成纤维细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、FLT1、IGF1R、ITGA1、MINPP1、PDGFA、SERPINH1、SMAD3、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TNF、TUFT1、VCAM1和VEGFA中的一个或多个，而且其中所述成纤维细胞经历了相等数目的传代。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述OPAC分泌一种或多种蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5或TIMP-2。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述OPAC分泌蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5和TIMP-2。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种症状是骨痛、骨细胞损害、贫血、或肾衰竭。

9.如权利要求1所述的方法，包括对所述个体施用至少1×10⁸OPAC/kg。

10.分离的成骨胎盘贴壁细胞(OPAC)，其中所述细胞是从绒毛膜获得的，而且附着到组织培养塑料制品上，而且其中所述细胞是CD200阴性的或是CD200^dim的，且是CD105阳性的。

11.如权利要求9所述的分离的细胞，其是SSEA3⁺或SSEA4⁺的。

12.如权利要求9所述的分离的细胞，其是SSEA3⁺且SSEA4⁺的。

13.如权利要求9所述的分离的细胞，其中所述细胞生产骨保护素。

14.如权利要求9所述的分离的细胞，其中所述细胞额外地是α-平滑肌肌动蛋白表达阴性、RANKL表达阴性、NG2表达阳性、骨保护素表达阳性的，或显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

15.如权利要求13所述的分离的细胞，其中所述细胞额外地是α-平滑肌肌动蛋白表达阴性、RANKL表达阴性、NG2表达阳性、骨保护素表达阳性的，并显示可诱导的碱性磷酸酶活性。

16.如权利要求9所述的分离的细胞，其中所述细胞：

与CD200⁺贴壁胎盘干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP6、CDH11、COL10A1、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A3、COL5A1、CSF3、CTSK、IGF1R、MINPP1、MMP2、MMP9、MSX1、SMAD1、SMAD3、TGFB3、TGFBR1和VEGFB中的一个或多个，其中所述OPAC和所述CD200⁺贴壁胎盘干细胞经历了相等数目的传代；

与骨髓源间充质干细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CD36、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、CSF2、CTSK、FGF2、FGFR1、FLT1、ITGA1、MINPP1、MMP9、MSX1、PDGFA、SERPINH1、TGFB3和TGFBR1中的一个或多个，其中所述OPAC和所述间充质干细胞经历了相等数目的传代；和/或

与成纤维细胞相比以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、BMP6、CDH11、COL14A1、COL15A1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、FLT1、IGF1R、ITGA1、MINPP1、PDGFA、SERPINH1、SMAD3、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TNF、TUFT1、VCAM1和VEGFA中的一个或多个，其中所述成纤维细胞在培养中经历的传代数目与所述成纤维细胞经历的传代数目相等。

17.如权利要求9所述的分离的细胞，其中所述细胞分泌一种或多种蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5或TIMP-2。

18.如权利要求16所述的分离的细胞，其中所述细胞分泌蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5和TIMP-2。

19.分离的细胞群，包含如权利要求9所述的细胞。

20.如权利要求9所述的细胞的分离的群，其中：

当所述OPAC和所述CD200⁺胎盘干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的CD200⁺贴壁胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP3(骨形态发生蛋白3)、CDH11、COL10A1、COL14A1、COL15A1、DMP1(牙本质基质酸性磷蛋白1)、DSPP(牙本质涎磷蛋白)、ENAM(釉蛋白)、FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)、MMP10(基质金属蛋白酶10(基质分解素2))、TGFB3、和/或TGFBR1中的一个或多个，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的CD200⁺贴壁胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN(成釉蛋白(釉基质蛋白))、BMP2(骨形态发生蛋白2)、CALCR(降钙素受体)、CDH11、COL11A1、COL14A1、COL15A1、COL2A1、CSF2、CSF3、DMP1、DSPP、ENAM、FGF3、GDF10(生长分化因子10)、IGF1(胰岛素样生长因子1)、ITGA1(整联蛋白，α1(CD49))、ITGA2(整联蛋白，α2(CD49B))、MMP10、MMP8(基质金属蛋白酶8(中性粒细胞胶原酶))、MMP9、PDGFA(血小板源生长因子A)、SMAD1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2(转化生长因子β，受体2)中的一个或多个，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200⁺胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CDH11、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、ENAM、MMP10、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在生长培养基中培养时，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG(α-2-HS-糖蛋白)、ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏)、EGF(表皮生长因子)、FLT1(fms相关的酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体))、IGF2、ITGA2、ITGAM(整联蛋白，αM(补体成分3受体3亚基))、SCARB1(清道夫受体B类，成员1)、SOX9(SRY(性别决定区Y)-盒9)、TNF、TWIST1(扭曲同系物1；以前称作睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂3，尖头并指趾畸形3)、VCAM1(血管细胞粘附分子1)和/或VDR(维生素D(1，25-二羟基维生素D3)受体)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当所述OPAC和所述胎盘干细胞在成骨培养基中培养时，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BGN(双糖链蛋白多糖)、COL11A1、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、FGF1和/或VCAM1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与不是滋养层或细胞滋养层的相等数目的贴壁CD200+胎盘干细胞相比，所述细胞以可检测的较低水平表达VCAM1，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括BMP4、CALCR、CD36、CDH11、COL12A1、COL14A1、COL15A1、COL3A1、COL5A1、DMP1、DSPP、FLT1、MSX1、PDGFA、TGFB3、TGFBR1和/或TUFT1(釉丛蛋白1)中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞以可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AMBN、CALCR、COL14A1、COL15A1、CSF3、DMP1、DSPP、ITGA1、ITGA2、MMP10、MMP9、MSX1、PDGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBR1和/或TGFBR2中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞在可检测的较高水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括CALCR、COL14A1、COL15A1、DMP1、DSPP、MSX1、PDGFA、TGFB3和/或TGFBR1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述间充质干细胞在生长培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP(骨γ-羧基谷氨酸(gla)蛋白)、IGF2、ITGA2、ITGAM、SCARB1和/或SOX1中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；

当OPAC和所述干细胞在成骨培养基中培养时，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括AHSG、ALPL、BGLAP、BGN、BMP3、BMP5、CD36、COL10A1、COL11A1、COL12A1、COL2A1、COL4A3、COMP、EGF、FGF1、FGFR2、IGF2、MMP8、PHEX(磷酸盐调节的肽链内切酶同系物，X连锁)、RUNX2(runt-相关转录因子2)、SCARB1、SOX1、VCAM1和/或VEGFB中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估；或

不管所述OPAC和所述胎盘干细胞是在生长培养基中还是在成骨培养基中培养，与相等数目的骨髓源间充质干细胞相比，所述细胞在可检测的较低水平表达一个或多个基因，其中所述一个或多个基因包括ALPL、BGLAP、IGF2、SCARB1和/或SOX9中的一个或多个，或全部，这通过来自实时定量PCR的Ct值来评估。

21.如权利要求18所述的分离的细胞群，其中所述细胞群中的细胞表达一种或多种蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5或TIMP-2。

22.如权利要求18所述的分离的细胞群，其中所述细胞群中的细胞表达蛋白：核心蛋白聚糖、表皮调节素、IGFBP-3、IGFBP-6、IL-2Rα、IL-17RC、IL-27、潜在的TGF-β结合蛋白1(LTBP)、NCAM-1、Smad4、TFPI、TGF-βR1/ALK5和TIMP-2。

23.如权利要求18所述的分离的细胞群，其中所述群的至少50％的细胞是如权利要求9所述的细胞。

24.如权利要求18所述的分离的细胞群，其中所述群的至少80％的细胞是如权利要求9所述的细胞。

25.如权利要求18所述的分离的细胞群，其中所述群的至少95％的细胞是如权利要求9所述的细胞。

26.如权利要求18所述的分离的细胞群，基本由如权利要求9所述的细胞组成。