JP5033121B2 - ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ - Google Patents

ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカーである１８７Ａ５遺伝子に関し、詳細には、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出手段、並びに該細胞の検出方法および検出キットに関する。
ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達における異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経変性疾患である(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 第２巻 第２３版，Isselbacher et al.編McGraw-HillInc., NY(1994)pp.2275-7)。
パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーパミン量の低下を補うためにＬ−ドーパ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を経口投与する方法が主に採られているが、効果の持続性が良くないことが知られている。
そこで、失われたドーパミン産生ニューロンを補う方法として、最近では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む６〜９週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法が試みられている（米国特許第５６９０９２７号；Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1541-8; Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1549-55; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63; Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.332:1118-24; Defer et al.(1996)Brain 119:41-50; Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80)。しかし、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33:106; Turner et al.(1993)Neurosurg.33:1031-7)で問題があるとともに、感染汚染の危険性、免疫学的な移植片拒絶(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80; Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13:287-324)、胎児組織が糖分解よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ(Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33:106)等の様々な面で問題が指摘されている。
倫理面や供給不足の問題を解決する方法としては、例えば、ブタ由来の皮質、線条、および中脳細胞を用いる方法等も提案されている（例えば、特表平１０−５０８４８７号公報；特表平１０−５０８４８８号公報；特表平１０−５０９０３４号公報）。しかし、この方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も提案されている（特表平11-509170号公報；特表平11-501818号公報；Selawly and Cameron(1993)Cell Transplant 2:123-9)。ＭＨＣがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨髄バンク、及び臍帯血バンク等から移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。
そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞(ES)細胞、骨髄間質細胞などの非神経系細胞からのイン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロンの分化系の移植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変線条への移植により、ＥＳ細胞由来のドーパミン産生ニューロンが機能的であることも確認されている(Kim et al.(2002)Nature 418:50-56)。将来的にはＥＳ細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。
一方で、神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成）ために、成熟した細胞ではなくイン・ビボにおいてニューロンへと分化し得る前駆細胞を移植する必要がある。しかし、ニューロン前駆細胞の移植においては、上述した供給面以外に、前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化する可能性があるという問題点がある。例えば、パーキンソン病の治療においては、カテコールアミン含有ニューロンの中でもドーパミン産生ニューロンを選択的に移植することが必要であり、これまでに、パーキンソン病の治療に用いる移植細胞として、線条体(Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46:615-31; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63)、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ＮＴ２Ｚ細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平９−５０５０５５４号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生するように外来遺伝子によりトランスフェクトされた細胞、骨髄ストロマ細胞（特表２００２−５０４５０３号公報；特表２００２−５１３５４５号公報）、遺伝子改変されたＥＳ細胞(Kim et al(2002)Nature 418:50-56)等が提案されている。しかしながらいずれも、ドーパミン産生ニューロンまたはドーパミン産生ニューロンへと分化する細胞のみを含むものではない。
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮・分離する方法としては、ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）等の遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現するレポーター遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮・分離、または同定する方法（特開２００２−５１７７５号公報）が提案されている。しかしこの方法は、外来遺伝子の導入という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを日的とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面からも問題である。
以上のことから、現時点でのパーキンソン病移植治療における大きな問題の一つは、中絶胎児の中脳腹側領域由来あるいは分化誘導されるドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましい。さらに、細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早期の増殖前駆細胞を分離し、移植することが治療効果の観点から望ましいと言える。
これまでに、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に発現する遺伝子としてＬｒｐ４（ＷＯ２００４／０６５５９９号公報）が報告されている。その他にも、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーがいくつか報告されている（ＷＯ２００４／０３８０１８号公報、ＷＯ２００５／０５２１９０号公報）。
 発明の概要
本発明者らは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子を単離するために、ラット１３．５日胚中脳腹側および後脳腹側より、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子であるＬｒｐ４タンパク質が陽性である細胞を分離し、サブトラクション（Ｎ−ＲＤＡ）法により中脳においてＬｒｐ４陽性細胞に特異的な遺伝子を探索したところ、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子（１８７Ａ５遺伝子（本明細書において、単に「１８７Ａ５」と言うことがある））を見出した（実施例２）。本発明はこの知見に基づくものである。
本発明は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出手段、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出方法、およびドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出キットを提供することを目的とする。
本発明はまた、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の製造方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ポリヌクレオチド（以下、「１８７Ａ５遺伝子」ということがある）が提供される：
（ｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明によればまた、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択される、タンパク質（以下、「１８７Ａ５タンパク質」ということがある）が提供される：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出または選択に用いられるプローブまたはプライマー（以下、それぞれ「本発明によるプローブ」および「本発明によるプライマー」ということがある）が提供される。
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出または選択に用いられる、１８７Ａ５タンパク質に結合性を有する抗体（以下「本発明による抗体」ということがある）が提供される。
本発明によれば、１８７Ａ５遺伝子の発現または１８７Ａ５タンパク質を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の検出または選択方法（以下「本発明による検出方法」ということがある）が提供される。
本発明によれば、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）を検出または選択するためのキット（以下「本発明による検出キット」ということがある）が提供される。
本発明によれば、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）を検出または選択するための試薬（以下「本発明による検出用試薬」ということがある）が提供される。
本発明によれば、１８７Ａ５遺伝子の発現または１８７Ａ５タンパク質を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）の製造方法が提供される。
本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、および抗体は、中脳においてドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に特異的なマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、移植材料の純度検定やイン・ビトロでのドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の分化誘導法の開発等において極めて有用であり、再生医療の実用化推進に大きく貢献するものである。また、本発明によるタンパク質は、単に発現しているものではなく、タンパク質の一部が細胞外に発現している。従って、本発明によるタンパク質の細胞外領域を指標とすることで生きたままの細胞を確実に検出できるとともに、当該細胞を分離および取得することができ、再生医療の実用化により大きく貢献すると言える。
ドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子の発現時期を示した図である。 ラット１４．５日胚の中脳および後脳におけるＬｒｐ４、ＴＨのタンパク質発現を免疫染色法により解析した結果を示した図である。 中脳および後脳Lrp4陽性細胞における、１８７Ａ５、Ｌｍｘ１ａおよびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。 マウス１２．５日胚の中脳および後脳における、１８７Ａ５およびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果を示した図である。 ＥＳ細胞からＳＤＩＡ法により分化誘導したドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞における、１８７Ａ５、Ｌｍｘ１ａおよびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。 ＥＳ細胞から５−ｓｔａｇｅ法により分化誘導したドーパミン産生ニューロン前駆細胞における、１８７Ａ５、Ｌｍｘ１ａおよびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。 マウス１８７Ａ５および１８７Ａ５−ＳＥＡＰを示した図である。 １８７Ａ５のシグナル配列活性について解析した結果を示した図である。 １８７Ａ５1タンパク質の細胞表面発現を、細胞表面タンパク質のビオチン化修飾法で解析した結果を示した図である。 １８７Ａ５タンパク質の細胞表面発現を、FACS解析で調べた結果を示した図である。図中枠で囲った部分が１８７Ａ５発現細胞を示す。 マウス１１．５日胚の中脳および後脳腹側における１８７Ａ５タンパク質の発現を免疫染色法により解析した結果を示した図である。 マウス１２．５日胚の中脳および後脳腹側における１８７Ａ５およびＬｒｐ４タンパク質の発現をＦＡＣＳ解析で調べた結果を示した図である。 ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞から分化誘導したドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞における１８７Ａ５およびＬｒｐ４タンパク質の発現をＦＡＣＳ解析で調べた結果を示した図である。 ＳＤＩＡ法によりＥＳ細胞から分化誘導した１８７Ａ５／Ｌｒｐ４共陽性細胞を分離し、培養した結果を示した図である。 ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を選択するために利用可能なＤＮＡ構築物の構造を模式的に表した図である。
発明の具体的な説明
以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示であり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
［ドーパミン産生ニューロン前駆細胞]
本発明において、検出または選択の対象である「ドーパミン産生ニューロン前駆細胞」は、成熟前のドーパミン産生ニューロン細胞を意味する。
本発明においてまた、検出または選択の対象である「ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞」は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を意味する。
ドーパミン産生ニューロンは、神経上皮細胞から、増殖前駆細胞、分裂停止後の前駆細胞の分化段階を経て、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化する。ドーパミン産生ニューロン前駆細胞は、ドーパミン産生ニューロンの前駆細胞であり、その中でもドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、ドーパミン産生ニューロンの最も初期の前駆細胞であるから、移植先の脳内での高い生存率や、高いネットワーク形成能が期待できる。従って、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、特にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの変性脱落によるドーパミン減少に起因する疾患の移植治療に有用である。
本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を指標として選択された細胞は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞であることから、従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入したドーパミン産生ニューロン前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面でパーキンソン病等の神経変性疾患の移植治療に好ましいものである。特に、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体で検出または選択される細胞が、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、すなわち増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞である場合は、脳内の最適な場所で分化成熟していく可能性があり、また、イン・ビボにおいてさらにドーパミン産生ニューロン前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的な治療効果も期待できる。従って、本発明は、パーキンソン病等の神経変性疾患の効果的な移植治療の実用化に途を拓くものであるといえる。
［１８７Ａ５遺伝子およびタンパク質］
本発明において「１８７Ａ５遺伝子」は、１８７Ａ５タンパク質をコードするものを意味し、ｃＤＮＡのみならず、ゲノムＤＮＡも含むものである。またこれに対応するＲＮＡも含まれる。
本発明において、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の存在の指標となる「１８７Ａ５遺伝子」は、マウスにおいて機能未知の配列としてデータベースに登録されているが、ヒト、ラット、ウシ、イヌ、チンパンジー等においては配列が予測されているのみである。それぞれの配列が開示されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は下記の通りである。
ヒト：ＸＭ＿０４４０６２（配列番号：３（塩基配列）、配列番号：４（アミノ酸配列）、以下同様の順に示す）、ＡＫ１２６７１５（配列番号：５、配列番号：６）、ＨＳＭ８０３２５６（配列番号：７、配列番号：８）、ＨＳＭ８０３４６７（配列番号：９、配列番号：１０）
マウス：ＡＫ０２８２８９（配列番号：１１、配列番号：１２）、ＡＫ１５７８２３（配列番号：１３（塩基配列））、ＡＫ０２８５４１（配列番号：１４、配列番号：１５）、ＡＫ０３５０５３（配列番号：１６、配列番号：１７）、ＸＭ＿４８５６８４（配列番号：１８、配列番号：１９）、ＡＫ１６３３５６（配列番号：２０（塩基配列））
ラット：ＸＭ＿３４４１０７（配列番号：２１、配列番号：２２）
ウシ：ＸＭ＿５９０１４７（配列番号：２３、配列番号：２４）
イヌ：ＸＭ＿５４３３６０（配列番号：２５、配列番号：２６）
チンパンジー：ＸＭ＿５２２５５７（配列番号：２７、配列番号：２８）
本発明において、中脳部位のドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）に選択的に発現している遺伝子として、ヒト１８７Ａ５遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号：１）、また、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞（好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）に選択的に発現しているタンパク質（ポリペプチド）として、ヒト１８７Ａ５タンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列（配列番号：２）が決定された。
当業者であれば、配列番号１の１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列や配列番号２の１８７Ａ５タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、様々な動物に内在する１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列や１８７Ａ５タンパク質のアミノ酸配列を特定することができる。例えば、ヒトあるいはマウスの１８７Ａ５遺伝子や１８７Ａ５タンパク質に基づいて相同性検索を行い、その動物の１８７Ａ５遺伝子や１８７Ａ５タンパク質を検索し、特定することができる。相同性検索に当たっては後述のＢＬＡＳＴ等を利用することができる。従って、本発明において「１８７Ａ５遺伝子」および「１８７Ａ５タンパク質」とは、ヒト由来の１８７Ａ５遺伝子やヒト由来の１８７Ａ５タンパク質に加えて、様々な動物（好ましくは、哺乳動物）に内在する１８７Ａ５遺伝子や１８７Ａ５タンパク質を含む意味で用いられる。
１８７Ａ５遺伝子の例としては、
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなるヒト１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含んでなるマウス１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含んでなるラット１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を含んでなるウシ１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含んでなるイヌ１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含んでなるチンパンジー１８７Ａ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が挙げられる。
１８７Ａ５遺伝子の例としては、また、
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９で表されるヒト１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、または配列番号：２０で表されるマウス１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
配列番号：２１で表されるラット１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
配列番号：２３で表されるウシ１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； 配列番号：２５のイヌ１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；および
配列番号：２７で表されるチンパンジー１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド
が挙げられる。
１８７Ａ５遺伝子としては、以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択される、ポリヌクレオチドが挙げられる：
（ｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１８７Ａ５遺伝子としてはまた、以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択される、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる：
（ｖ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、好ましくは、以下の（ｉ’’）、（ｉｉ’’）、（ｉｉｉ’’）、および（ｉｖ’’）から選択される、ポリヌクレオチドが提供される：
（ｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明によればまた、好ましくは、以下の（ｖ’’）、（ｖｉ’’）、（ｖｉｉ’’）、および（ｖｉｉｉ’’）から選択される、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される：
（ｖ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、より好ましくは、以下の（ｉ’’’）、（ｉｉ’’’）、（ｉｉｉ’’’）、および（ｉｖ’’’）から選択される、ヒト由来のポリヌクレオチドが提供される：
（ｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明によればまた、より好ましくは、以下の（ｖ’’’）、（ｖｉ’’’）、（ｖｉｉ’’’）、および（ｖｉｉｉ’’’）から選択される、ヒト由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される：
（ｖ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、さらに好ましくは、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなる、ヒト由来のポリヌクレオチドが提供される。
本発明によればまた、さらに好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるヒト由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
１８７Ａ５タンパク質（ポリペプチド）の例としては、
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含んでなるヒト１８７Ａ５タンパク質；
配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含んでなるマウス１８７Ａ５タンパク質；
配列番号：２２のアミノ酸配列を含んでなるラット１８７Ａ５タンパク質；
配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるウシ１８７Ａ５タンパク質；
配列番号：２６のアミノ酸配列を含んでなるイヌ１８７Ａ５タンパク質；および
配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなるチンパンジー１８７Ａ５タンパク質
が挙げられる。
１８７Ａ５タンパク質（ポリペプチド）の例としては、また、
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９で表されるヒト１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；
配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、または配列番号：２０で表されるマウス１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；
配列番号：２１のラット１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；
配列番号：２３のウシ１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；
配列番号：２５のイヌ１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；および
配列番号：２７のチンパンジー１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質
が挙げられる。
１８７Ａ５タンパク質（ポリペプチド）としては、以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択される、タンパク質が挙げられる：
（ｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列でコードされるタンパク質；
（ｉｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ’）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、または配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
１８７Ａ５タンパク質（ポリペプチド）としてはまた、以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択される、タンパク質が挙げられる：
（ｖ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、好ましくは、以下の（ｉ’’）、（ｉｉ’’）、（ｉｉｉ’’）、および（ｉｖ’’）から選択される、タンパク質（ポリペプチド）が提供される：
（ｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列でコードされたタンパク質；
（ｉｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によればまた、好ましくは、以下の（ｖ’’）、（ｖｉ’’）、（ｖｉｉ’’）、および（ｖｉｉｉ’’）から選択される、タンパク質（ポリペプチド）が提供される：（ｖ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、より好ましくは、以下の（ｉ’’’）、（ｉｉ’’’）、（ｉｉｉ’’’）、および（ｉｖ’’’）から選択される、ヒト由来のタンパク質（ポリペプチド）が提供される：
（ｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列でコードされたタンパク質；
（ｉｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ’’’）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によればまた、より好ましくは、以下の（ｖ’’’）、（ｖｉ’’’）、（ｖｉｉ’’’）、および（ｖｉｉｉ’’’）から選択される、ヒト由来のタンパク質（ポリペプチド）が提供される：
（ｖ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’’’）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
本発明によれば、さらに好ましくは、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列でコードされたヒト由来のタンパク質が提供される。
本発明によればまた、さらに好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるヒト由来のタンパク質が提供される。
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた」および「アミノ酸配列において、のアミノ酸の挿入、置換または欠失、および／またはその一方または両末端への付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のヌクレオチドあるいはアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。ポリヌクレオチドの場合、一塩基多型（ＳＮＰｓ）も含む意味である。ヌクレオチドおよびアミノ酸の改変の個数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１または数個（例えば、９個以下）、特に好ましくは１〜４個、最も好ましくは１〜２個のヌクレオチドおよびアミノ酸の挿入、置換、または欠失、および／またはその一方または両末端への付加がなされたものであることができる。
改変ヌクレオチド配列は、好ましくは、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能に影響を与えない変異を有する配列番号：１で表されるヌクレオチド配列であることができる。
改変アミノ酸配列は、好ましくは、１または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有する配列番号：２で表されるアミノ酸配列であることができる。
（ｉｉ）、（ｉｉ’）、（ｉｉ’’）、または（ｉｉ’’’）において、ヌクレオチド配列に導入される挿入、置換、欠失、または付加の個数は、好ましくは、１または数個（例えば、９個以下）、より好ましくは、１〜６個、特に好ましくは１〜４個、最も好ましくは１〜２個とすることができる。
（ｖｉ）、（ｖｉ’）、（ｖｉ’’）、または（ｖｉ’’’）において、アミノ酸配列に導入される挿入、置換、欠失、または付加の個数は、好ましくは、１または数個（例えば、９個以下）、より好ましくは、１〜６個、特に好ましくは１〜４個、最も好ましくは１〜２個とすることができる。
本願明細書において、「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
改変ヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の５１２番目のグアニンのアデニンへの置換、８４４番目のグアニンのアデニンへの置換、１３６０番目のグアニンのアデニンへの置換、２４５８番目のアデニンのグアニンへの置換、２９９１番目のアデニンのグアニンへの置換を有するヌクレオチド配列が挙げられる。改変ヌクレオチド配列は、これらすべての置換またはその一部を組み合わせて有していてもよい。
改変アミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１６１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換、２７２番目のバリンのイソロイシンへの置換、４４４番目のバリンのイソロイシンへの置換、または８１０番目のアルギニンのグリシンへの置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。改変アミノ酸配列は、これらすべての置換またはその一部を組み合わせて有していてもよい。
本願明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを意味する。具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、標的ヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダイズしたものを洗浄するときの条件は、０．２または２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、温度２０℃−６８℃で行うことができる。ストリンジェント（high stringency）な条件にするかマイルド（low stringency）な条件にするかは、洗浄時の塩濃度又は温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー（high stringency wash buffer）として０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、マイルド洗浄バッファー（low stringency wash buffer）として２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は６８℃、中等度（moderate stringency）の場合は４２℃、マイルドの場合は室温（２０℃−２５℃）でいずれの場合も０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行えばよい。
通常、プレハイブリダイズを実施する場合にはハイブリダイズと同じ条件で実施するが、ハイブリダイズとプレ（予備）洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
本願明細書において、アミノ酸配列について「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)）。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ(Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 (1990))等を用いることができる。
「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
配列番号：１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることができる。
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
本発明において、配列番号：２で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に決まり、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：１で表されるｃＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをｃＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。更に、イントロンや非翻訳領域も含むゲノムＤＮＡ配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
本願明細書において「配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有する」かどうかについては、１８７Ａ５遺伝子の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより、例えば、中脳においてドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞において選択的に発現しているか否かを評価することにより決定することができる。
本発明によれば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の２４８番目〜３９７番目または７９２番目〜８７７番目のアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基）または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質が提供される。このタンパク質は、１８７Ａタンパク質のアミノ酸配列のうち識別性が高い部分に相当することから、１８７Ａ５タンパク質をより高精度で識別できる抗体の抗原として用いることができる。
１８７Ａ５タンパク質は、Ｉ型の１回膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外とする向きで細胞表面に発現している。従って、該タンパク質に結合性を有する抗体を用いたフローサイトメトリーにより、該タンパク質を発現する生細胞を分離することができる。
本発明によれば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の２８番目〜９２７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１６番目〜１２６７番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜５５０番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜５４２番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４１８番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の７６番目〜９６４番目、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の４０番目〜９２８番目、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列の１番目〜５４０番目、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の４０番目〜１１０６番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の２４番目〜１５２４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の４３番目〜１０１８番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の４３番目〜９０８番目、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜８６６番目のアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基）または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質が提供される。このタンパク質は、１８７Ａタンパク質のアミノ酸配列の細胞外領域に相当することから、検出対象の細胞を生きたまま検出できる抗体を作製するための抗原として用いることができる。
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するための指標としての、本発明によるタンパク質の使用が提供される。
［プローブ、プライマー、およびプライマーセット］
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる本発明によるプローブおよびプライマーは、１８７Ａ５遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる。実施例２によれば、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるマウス１２．５日胚において、１８７Ａ５のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の存在する中脳最腹側脳室領域（ventricular zone；ＶＺ）と中脳最背側ｒｏｏｆ ｐｌａｔｅ領域に選択的に発現するが、Ｌｒｐ４陽性である後脳ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ細胞には発現しないことから、１８７Ａ５のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現することが明らかになった。よって、１８７Ａ５遺伝子の発現はドーパミン産生ニューロン前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明によるプローブ、プライマー、およびプライマーセットは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、好ましくは、１０〜５０個または１０〜３０個、より好ましくは、１５〜５０個または１５〜３０個、さらに好ましくは、２０〜５０個または２０〜３０個、さらにより好ましくは、２５〜５０個または２５〜３０個、最も好ましくは、２６〜３９個または２６〜３５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、少なくとも１０塩基長であることができ、好ましくは、少なくとも１５塩基長、より好ましくは、少なくとも２０塩基長、さらに好ましくは、少なくとも２５塩基長である。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、好ましくは、１０〜５０塩基長または１０〜３０塩基長、より好ましくは、１５〜５０塩基長または１５〜３０塩基長、さらに好ましくは、２０〜５０塩基長または２０〜３０塩基長、さらにより好ましくは、２５〜５０塩基長または２５〜３０塩基長、最も好ましくは、２６〜３９塩基長または２６〜３５塩基長である。
本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によれば、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個（より好ましくは、少なくとも１５個）のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなり、１８７Ａ５遺伝子にハイブリダイズすることができる、中脳におけるドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる１５〜５０塩基長または１５〜３０塩基長、より好ましくは２５〜５０塩基長または２５〜３０塩基長、最も好ましくは２６〜３９塩基長または２６〜３５塩基長のポリヌクレオチドが提供される。
本発明によるプローブの好ましい態様によればまた、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列のうち、識別性の高い部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の７７４番目〜１２２１番目または２４０３番目〜２６６６番目のヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明によるプライマーの好ましい態様によればまた、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列のうち、識別性の高い部分を核酸増幅法により増幅することができるものや、識別性の高い部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の７７４番目〜１２２１番目または２４０３番目〜２６６６番目のヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列を核酸増幅法により増幅することができるポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
本発明によるプローブは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プローブの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
本発明によるプライマーセットは１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーセットの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方が１８７Ａ５遺伝子の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択することができる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
［抗体］
本発明による抗体は、１８７Ａ５タンパク質を特異的に認識することができる。実施例５によれば、１８７Ａ５タンパク質は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に存在することが確認された。よって、１８７Ａ５タンパク質の存在はドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むドーパミン産生ニューロン前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明による抗体は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
１８７Ａ５タンパク質は、Ｎ末端側を細胞外とする向きで細胞表面に発現していることから（実施例４）、本発明による抗体は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を生細胞として検出または選択することができる点で有利である（実施例６）。また、本発明による抗体は、ＥＳ細胞由来の細胞についても検出または選択することができる点で有利である（実施例７）。
本発明による抗体を得るための１８７Ａ５タンパク質は、１８７Ａ５の抗原性を有していればよく、上述のタンパク質が挙げられる。また、１８７Ａ５タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al.(1984)Science 224:1431-3;Dalbadie-McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409-13)。あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,(1987-1997),Section8.1-8.5;Hashimoto-Goto et a1.(1995)Gene 152:271-5;Kinkel(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82:488-92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:350-67;Kunke1(1988)Method.Enzymo1.85:2763-6)。
本発明による抗体には、１８７Ａ５タンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれる。即ち、本発明の抗体を得るための１８７Ａ５タンパク質には、１８７Ａ５タンパク質の全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、１８７Ａ５タンパク質の少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片である。本明細書における１８７Ａ５タンパク質のポリペプチド断片は、１８７Ａ５タンパク質またはその抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。
好ましい断片としては、１８７Ａ５タンパク質のアミノ末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定し、さらにコンピュータープログラム(Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
１８７Ａ５タンパク質に結合性を有する抗体の例としては、
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体；
配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：１９で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体；
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体；
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体；
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体；および
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質に結合性を有する抗体
が挙げられる。
本発明による抗体の好ましい態様によれば、１８７Ａ５タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このような抗体としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の２４８番目〜３９７番目または７９２番目〜８７７番目のアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基）または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質に結合性を有する抗体が挙げられる。
本発明による抗体の好ましい態様によればまた、１８７Ａ５タンパク質の細胞外に発現しているポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞を生きたまま検出することが可能となる。このような抗体としては、細胞外に発現している１８７Ａ５タンパク質のポリペプチド部分に結合性を有する抗体が挙げられ、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の２８番目〜９２７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１６番目〜１２６７番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜５５０番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜５４２番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４１８番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の７６番目〜９６４番目、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の４０番目〜９２８番目、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列の１番目〜５４０番目、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の４０番目〜１１０６番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の２４番目〜１５２４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の４３番目〜１０１８番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の４３番目〜９０８番目、または配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜８６６番目のアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基）または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質に結合性を有する抗体が挙げられる。
本発明による抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる（例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
本発明による抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、多特異性抗体、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片（フラグメント）が含まれる。
ポリクローナル抗体であれば、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離し、ポリクローナル抗体を含む血清とすることができる。
必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。
モノクローナル抗体であれば、上記抗原を感作した哺乳動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を取り出し、骨髄腫細胞などと細胞融合させ、得られたハイブリドーマ（融合細胞）をクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
免疫抗原としては、１８７Ａ５タンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。
免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
ハイブリドーマ（細胞融合）の操作は既知の方法、例えば、Nature, 256,495, 1975に従って実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、１８７Ａ５タンパク質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ法、１８７Ａ５タンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などが挙げられる。
このようなウェルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらに１８７Ａ５タンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
血清からのポリクローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
［検出方法］
１８７Ａ５遺伝子の発現は、前記のように、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明によれば、１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。
ここで、「１８７Ａ５遺伝子の発現を検出する」方法としては、被験細胞試料における１８７Ａ５遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ）被験細胞試料と本発明によるプローブ、プライマー、またはプライマーセットとを接触させる工程；および（ｂ）反応性の有無を検出する工程。
ここで「反応性の有無を検出する」方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法が挙げられる。
ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料であればよく、好ましくは、中脳腹側領域の細胞を用いることができる。中脳腹側領域の細胞は公知の方法により取得することができ（Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295）、例えば、胎児（好ましくは、ヒト中絶胎児）または患者自身の中脳腹側領域の細胞を被験細胞試料として用いることができる。また、イン・ビトロで分化誘導されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含む培養細胞を用いることができる。イン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロン前駆細胞あるいはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40, Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579）、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40）、５−ｓｔａｇｅ法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)等による分化させる処理を行うことにより実施することができる。好ましくは、ＳＤＩＡ法による分化させる処理が行われたＥＳ細胞を被験細胞試料として用いることができる。
ここで「ＳＤＩＡ法」は、無血清培地中で、ＥＳ細胞をストローマ細胞株ＰＡ６と共培養することにより行うことができる（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40）。また、「５−ｓｔａｇｅ法」は、ＥＳ細胞を血清存在下で非付着性培養皿上で培養することによりｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ（ＥＢ）を形成させ、続いてＥＢを付着性培養皿上に付着させることで、神経前駆細胞を選択する。最後に、Ｓｈｈ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８等の成長因子を添加し、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を誘導することにより行うことができる(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
本発明による検出方法の第一の態様によれば、本発明によるプローブを用いて、該検出用ポリヌクレオチドを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより細胞試料における１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection 9.47-9.58)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997)、特にSection 6.3-6.4)、『DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)、条件については特にSection 2.10)を参照することができる。
ハイブリダイゼーション法を利用した１８７Ａ５遺伝子の発現を検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および
（ｂ−１）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
工程（ａ−１）において、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。
ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。
ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、１８７Ａ５遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
本発明による検出方法の第二の態様によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、細胞試料における１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することができる。
核酸増幅法を利用した１８７Ａ５遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ−２）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
（ｂ−２）形成された増幅産物を検出する工程。
工程（ａ−２）において、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。
増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。
増幅産物が検出される細胞は、１８７Ａ５遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
１８７Ａ５タンパク質は、前記のように、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明によれば、１８７Ａ５タンパク質を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。
ここで、「１８７Ａ５タンパク質を検出する」方法としては、被験細胞試料における１８７Ａ５タンパク質を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、抗原抗体反応法が挙げられる。
本発明による検出方法の第三の態様によれば、本発明による抗体と細胞試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより細胞試料における１８７Ａ５タンパク質を検出することができる。
抗原抗体反応を利用した１８７Ａ５タンパク質の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｃ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｄ）反応性に有無を検出する工程。
ここで、「反応性の有無を検出する」方法としては、例えば、抗原抗体反応法が挙げられる。
ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料であればよく、好ましくは、中脳腹側領域の細胞、あるいはイン・ビトロで分化誘導されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含む培養細胞である。被験細胞試料は、例えば、胎児中脳由来のものを用いることができる。被験細胞試料の取得方法等は前記の通りである。
抗原抗体反応法を利用した１８７Ａ５タンパク質の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｃ−１）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｄ−１）抗体抗原複合体を検出する工程。
抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料中の１８７Ａ５タンパク質を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に結合性を有する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
被験細胞試料由来のタンパク質は、細胞外領域（すなわちＮ末端領域）を含んでなるポリペプチドであることが好ましい。
抗体抗原複合体が検出される細胞は、１８７Ａ５タンパク質を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
パーキンソン病の治療に用いるためには、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は純度が高いことが望ましい。
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返し行うことにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
従って、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
また、他のマーカー遺伝子、好ましくは１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子、を併用することにより、さらにドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
従って、本発明による検出方法によればまた、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、あるいは成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質のみならず、前記した他のマーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
各分化段階において選択的に発現するドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子を図１に示す。
１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５遺伝子のみならず、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）において、被験細胞試料として、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）は、１８７Ａ５遺伝子を発現し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（ｅ−１）１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−１）において、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、１８７Ａ５遺伝子を発現し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）は、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（ｅ−２）分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−２）において、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５遺伝子のみならず、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）において、被験細胞試料として、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）は、１８７Ａ５遺伝子を発現し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（ｅ−３）１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−３）において、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、１８７Ａ５遺伝子を発現し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）において、被験細胞試料として、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）は、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）において、反応性が検出された細胞（例えば、ハイブリダイゼーション複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（ｅ−４）成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−４）において、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は、１８７Ａ５遺伝子は発現するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５タンパク質のみならず、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ｃ）において、被験細胞試料として、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）は、１８７Ａ５タンパク質が存在し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）について、（ｅ−１）１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−１）において、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、１８７Ａ５タンパク質が存在し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５タンパク質は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ｃ）において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）は、１８７Ａ５タンパク質は存在するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）について、（ｅ−２）分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−２）において、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は、１８７Ａ５タンパク質は存在するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはさらに、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５タンパク質のみならず、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ｃ）において、被験細胞試料として、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）は、１８７Ａ５タンパク質が存在し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）について、（ｅ−３）１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−３）において、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、１８７Ａ５タンパク質が存在し、かつ、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現しているか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
１８７Ａ５タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはさらに、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、１８７Ａ５タンパク質は発現するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ｃ）において、被験細胞試料として、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）は、１８７Ａ５タンパク質は存在するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｄ）において、反応性が検出された細胞（例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞）について、（ｅ−４）成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｅ−４）において、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は、１８７Ａ５タンパク質は存在するが、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質」とは「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」または「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質」である。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
Ｌｒｐ４遺伝子については、ＷＯ２００４／０６５５９９号公報に記載されている。Ｎａｔｏ３遺伝子については、ＷＯ２００７／０２１００３号公報に記載されている。Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子については、ＷＯ２００７／０２１００４号公報に記載されている。Ｍａｓｈ１遺伝子については、Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F, Arenas E, Ang SL.Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons. Development. 2006 Feb;133(3):495-505に記載されている。
１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法が挙げられる。
「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質が挙げられ、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のみで検出されるタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子のタンパク質が挙げられる。
１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質の検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質」としては、中脳最腹側外套層（ＭＬ領域）に発現している遺伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば、Ｎｕｒｒ１遺伝子、Ｅｎ１遺伝子、Ｅｎ２遺伝子、Ｐｔｘ３遺伝子、ＴＨ遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している遺伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば、６５Ｂ１３遺伝子が挙げられる。
Ｎｕｒｒ１遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。Ｅｎ１遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｅｎ２遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｐｔｘ３遺伝子については、Proc.Natl.Acad.Sci.1997 94: 13305-10に記載されている。ＴＨ遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。６５Ｂ１３遺伝子については、ＷＯ２００４／０３８０１８号公報に記載されている。
分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の検出は、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質」とは「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子」または「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質」である。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側に発現している１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｍｘ１ａ遺伝子が挙げられる。
Ｌｍｘ１ａ遺伝子については、ＷＯ２００５／０５２１９０号公報に記載されている。
１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法が挙げられる。
「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質」としては、中脳最腹側に発現している１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、Ｌｍｘ１ａ遺伝子のタンパク質が挙げられる。
１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質の検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
「成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子」としては、例えば、ＤＡＴ遺伝子が挙げられる。
ＤＡＴ遺伝子については、Development 2003 131: 1145-55に記載されている。
成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の検出は、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
また、１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを併用することにより、さらにドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
従って、本発明による検出方法によればまた、１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を併用し、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質のみならず、マーカー遺伝子の発現をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを利用したドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出は、例えば、特開２００２−５１７７５号公報に従って実施することができる。
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞で発現する１８７Ａ５遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で検出可能なマーカー遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、マーカー遺伝子の発現を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出することができる。
具体的には、本発明による遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより被験細胞試料を形質転換し、該被験細胞試料における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程を実施することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、該工程において、マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
ここで、「本発明による遺伝子のプロモーター」のヌクレオチド配列としては、後述する１８７Ａ５遺伝子の発現領域解析により得られたプロモーター部分のヌクレオチド配列が挙げられるが、プロモーター活性を有する同等程度有するその改変配列も含まれる。
ここで、「マーカー遺伝子」としては、１８７Ａ５遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で検出可能なマーカー遺伝子であればよく、例えば、ＧＦＰ等が挙げられる。
ここで、「遺伝子構築物」としては、１８７Ａ５遺伝子の発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等を含む）の制御下に、１８７Ａ５遺伝子がマーカー遺伝子の上流もしくは下流に連結された構造を有していてもよい。その他、１８７Ａ５遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。該遺伝子構築物の好ましい態様としては、例えば、図１５において２〜４に模式的に記載された構造の構築物を例示することができる。
［検出キット］
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
本発明による検出キットの第一の態様としては、本発明による検出方法の第一の態様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には１８７Ａ５遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法により１８７Ａ５遺伝子の発現を検出する。従って第一の態様の検出キットは、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
本発明による検出用キットの第二の態様としては、本発明による検出方法の第二の態様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、１８７Ａ５遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法により１８７Ａ５遺伝子の発現を検出する。従って第二の態様の検出キットは、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、増幅反応が正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
本発明による検出キットの第三の態様としては、本発明による検出方法の第三の態様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、１８７Ａ５タンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することにより１８７Ａ５タンパク質の発現を検出する。従って第三の態様の検出キットは、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
さらに、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、本発明による第一ないし第三の態様の検出キットが挙げられる。
［検出用試薬］
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出用試薬が提供される。
本発明による検出用試薬の第一の態様としては、本発明による検出方法の第一の態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には１８７Ａ５遺伝子の発現を検出するための試薬であって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなる検出用試薬が挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用試薬はハイブリッド形成法により１８７Ａ５遺伝子の発現を検出する。従って第一の態様の検出用試薬は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
本発明による検出用試薬の第二の態様としては、本発明による検出方法の第二の態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には、１８７Ａ５遺伝子の発現を検出するための試薬であって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなる検出用試薬が挙げられる。この検出用試薬は核酸増幅法により１８７Ａ５遺伝子の発現を検出する。従って第二の態様の検出用試薬は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、増幅反応が正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
本発明による検出用試薬の第三の態様としては、本発明による検出方法の第三の態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には、１８７Ａ５タンパク質を検出するための試薬であって、本発明による抗体を少なくとも含んでなる検出用試薬が挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用試薬は抗原抗体反応を検出することにより１８７Ａ５タンパク質の発現を検出する。従って第三の態様の検出用試薬は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
さらに、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、本発明による第一ないし第三の態様の検出用試薬が挙げられる。
［スクリーニング方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、候補物質の添加により、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化誘導されたか否かを、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質を指標として判定することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることができる。
従って、本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉ）ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程。
工程（ｉ）において、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞に分化し得る細胞は、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞であり、好ましくは、胎児中脳、またはＥＳ細胞より分化誘導した神経前駆細胞を含む培養細胞から採取することができる。
工程（ｉ）において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
工程（ｉｉ）においては、本発明による検出方法に従って、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出することができる。
具体的には、ハイブリダイゼーション法を利用した検出については工程（ａ−１）および（ｂ−１）を、核酸増幅法を利用した検出については工程（ａ−２）および（ｂ−２）を、抗原抗体反応法を利用した検出については工程（ｃ−１）および（ｄ−１）それぞれ実施することにより、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出することができる。
工程（ｉｉ）において、被験物質を接触させて、被験細胞試料において１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。
本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質として用いることができる。
本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉｉｉ−１）被験物質を接触させた後の前記細胞における、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程。
工程（ｉｉ）において、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ−１）において、１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
工程（ｉｉｉ−１）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉｉｉ−２）被験物質を接触させた後の前記細胞における、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出する工程。
工程（ｉｉ）において、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されたが、工程（ｉｉｉ−２）において、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質が検出されなかった場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
工程（ｉｉｉ−２）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質」とは「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」または「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質」である。
「１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
１８７Ａ５遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法が挙げられる。
「１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質が挙げられ、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のみで検出されるタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子のタンパク質が挙げられる。
１８７Ａ５タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質の検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質」としては、中脳最腹側外套層（ＭＬ領域）に発現している遺伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば、Ｎｕｒｒ１遺伝子、Ｅｎ１遺伝子、Ｅｎ２遺伝子、Ｐｔｘ３遺伝子、ＴＨ遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している遺伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば６５Ｂ１３遺伝子が挙げられる。
分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の検出は、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉｉｉ−３）１８７Ａ５遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより、被験物質を接触させた後の前記細胞を形質転換し、該細胞における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程。
工程（ｉｉ）において、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ−３）において、マーカー遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
工程（ｉｉｉ−３）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。さらに、工程（ｉｉｉ−１）または工程（ｉｉｉ−２）の後に行われてもよい。
［製造方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択することができる。ドーパミン産生ニューロン前駆細胞はパーキンソン病の治療に用いることができる。従って、１８７Ａ５遺伝子の発現またはそのタンパク質を指標として、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞から、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン前駆細胞を製造することができる。
ここで、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞であることが好ましい。
本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の製造方法が提供される：
（ｉ）ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
（ｉｉ）本発明による検出方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含んでなる、パーキンソン病治療剤が提供される。
本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられる薬剤を製造のための、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の使用が提供される。
本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を、ヒトを含む哺乳類の脳に移植する工程を含んでなる、パーキンソン病の治療方法が提供される。
なお、本願明細書において、「検出」には「識別」も含まれる。また、「検出」とは、対象となる細胞が特定の種類の細胞であると識別する場合のみならず、対象となる細胞が特定の種類の細胞ではないと識別する場合も含まれる。
[実施例１] ドーパミン産生ニューロン前駆細胞選択的遺伝子の単離および配列解析
ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を分離するための細胞表面マーカーとしてＬｒｐ４遺伝子が同定されており（ＷＯ２００４／０６５５９９）、抗Ｌｒｐ４抗体を用いてＥＳ細胞由来ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を分離することが可能になっている。そこで、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的な遺伝子の単離およびその配列解析について以下に説明する。
（１）Ｌｒｐ４陽性細胞の単離
まず、ラット１３．５日胚中脳腹側および後脳腹側をａｃｃｕｍａｘ（エムエステクノシステムズ）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗Ｌｒｐ４モノクローナル抗体（入手先：ハイブリドーマ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３１５および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３１６）、１／１０希釈、１％ウシ胎児血清（JRH）、５％ラット胎児血清（JRH）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Invitrogen）／ＰＢＳ（Sigma））を用いて４℃で３０分間染色した。その後、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清（JRH）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて４℃で３分間の洗浄を３回行い、ＰＥ標識抗ハムスターＩｇＧ抗体（Becton Dickinson、８μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、５％ラット胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて４℃で２０分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーター（ＦＡＣＳ ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、 Becton Dickinson）によりＬｒｐ４陽性細胞を分離した（図２）。分離直後の細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ(TAKARA)で消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅した。
増幅条件は、７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を２０サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
ａｄ２Ｓ：CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT（配列番号：２９）
ａｄ２Ａ：ACGGAATGATGT（配列番号：３０）
ＰＣＲは以下の反応液組成で行った。
１０×ＥｘＴａｑ ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ
ＥｘＴａｑ ０．２５μｌ
１００μＭ プライマー ０．５μｌ
ｃＤＮＡ ２μｌ
蒸留水 ３８．２５μｌ
次に、増幅したｃＤＮＡ ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて、以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ ０．０５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．１μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ６．９５μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、２６サイクルで行った。
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
Ｌｒｐ４ ：TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG（配列番号：３１）
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG（配列番号：３２）
Ｌｍｘ１ａ：TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG（配列番号：３３）
GAGTTGTAGACGCTCTGTTCAATGGC（配列番号：３４）
その結果、Ｌｒｐ４遺伝子は、中脳Ｌｒｐ４陽性細胞と後脳Ｌｒｐ４陽性細胞のいずれにおいても同程度に発現するが、ドーパミン産生ニューロンおよびドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカー遺伝子であるＬｍｘ１ａ遺伝子は（ＷＯ２００５／０５２１９０）、中脳Ｌｒｐ４陽性細胞のみに強く発現することが確認された（図３）。したがって、中脳Ｌｒｐ４陽性細胞にはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞が含まれ、後脳Ｌｒｐ４陽性細胞には含まれないと考えられる。
そこで、次にこのサンプルを用いて、中脳においてＬｒｐ４陽性細胞に特異的な遺伝子をサブトラクション（Ｎ−ＲＤＡ）法（ＷＯ２００４／０６５５９９に記載）により探索したところ、単離したｃＤＮＡ断片の一つ（１８７Ａ５）は機能未知な遺伝子をコードする断片であった。次に、この遺伝子の発現を、下記のプライマーを使用して、上記のＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
１８７Ａ５：ACCAGGAAGGACAATGCCATTCGTCC（配列番号：３５）
CCTTCTTCACCTTGGCTCTTAGGATG（配列番号：３６）
その結果、１８７Ａ５遺伝子は、Ｌｍｘ１ａ遺伝子と同様に、中脳においてＬｒｐ４陽性細胞に特異的に発現していることが確認された（図３）。
（２）配列解析
データベースサーチの結果、この遺伝子の全長と思われるラットおよびマウスｃＤＮＡ配列を得た（例えば、配列番号：Mouse 187A5 AK028289、Mouse 187A5 AK157823 (frame shift)、Mouse 187A5 AK028541、Mouse 187A5 XM_485684 (alternative)、Mouse 187A5 AK163356 (frame shift)、Rat 187A5 XM_344107 (predicted)）。ヒト相同遺伝子と思われる部分配列（配列番号：１）も得られたが、全長配列は得ることができなかった。そこで、ヒトゲノム配列に対してホモロジーサーチを行い、ヒトｃＤＮＡ配列を予想した。しかし、５’末端付近については相同性の高い領域は見出すことができなかった。そこで、５’ＲＡＣＥ法を用いて配列の決定を行った。
ヒト胎児脳ｍＲＮＡ（クローンテック）１μｇから、５’ ＲＡＣＥ ｃｏｒｅ ｋｉｔ (TAKARA)を用いてｃＤＮＡを増幅し、セルフライゲーション（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。以下のプライマーを用いてｃＤＮＡ ５’末端の増幅を行い、得られた断片をｐＣＲＩＩ(Invitrogen)にクローニングし、配列を決定した。
ＲＴ反応 ：CATCCCAGTCTC（配列番号：３７）
１次ＰＣＲ：TGGAGAAGGTTGTGCCTCTGGACTTG（配列番号：３８）
CTGGTTGGCTTCCTTGAGGAAGAAGG（配列番号：３９）
２次ＰＣＲ: TCCTGCGGGACAAAGTCTACCTGAGC（配列番号：４０）
CTGAGGATGTGGTAGCTCACAGGTAG（配列番号：４１）
ＰＣＲ反応は以下の組成で行った。
１０×ＥｘＴａｑ ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ
ＥｘＴａｑ ０．２５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．５μｌ
鋳型 １μｌ
ＤＭＳＯ １．５μｌ
蒸留水 ３７．２５μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、１次ＰＣＲは３５サイクルで行い、２次ＰＣＲは、１次ＰＣＲ産物を１０倍希釈したものを鋳型に用いて２０サイクルで増幅した。
次に、予想した配列が正しいものであるか確認するために、３つの領域に分けてそれぞれＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ（Invitrogen)にクローニングして、配列を決定した。
ヒト胎児脳ｍＲＮＡ（クローンテック）０．５μｇから、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ （ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡを増幅し、これを鋳型に用いてＰＣＲを行った。
５’末端付近は以下のプライマーを用いて増幅した。
ヒト１８７Ａ５ Ｆ４: GAGGTCGACGCCACCATGCGCTCCGAGGGTGCGGCCCCC（配列番号：４２）
ヒト１８７ａ５ Ｒ１: GGGTCCATAGCTGGCATTGAGCACTG（配列番号：４３）
ＰＣＲ反応は以下の組成で行った。
１０×ＬＡ Ｔａｑ ５μｌ
ＭｇＣｌ２ ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
ＬＡＴａｑ ０．５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．５μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
ＤＭＳＯ １．５μｌ
蒸留水 ２８μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で３．５分の増幅反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
残りの領域は、以下のプライマーＦ１２とＲ５、Ｆ１３とＲ４の組み合わせで行った。
ヒト１８７Ａ５ Ｆ１２： CTACCTGTGAGCTACCACATCCTCAG（配列番号：４４）
ヒト１８７Ａ５ Ｒ５ ： TTCTCTGCCAGGATGGAGTCAGACAG（配列番号：４５）
ヒト１８７Ａ５ Ｆ１３： ACTGGCAGTTCGACATCACTCACCTG（配列番号：４６）
ヒト１８７Ａ５ Ｒ４ ： GAGGAATTCCAGTACAAGGAAGGCATCTGGGCAGG（配列番号：４７）
配列を決定した結果、このヒト遺伝子をコードするタンパク質は、マウス１８７Ａ５タンパク質と全域に渡り高い相同性を示し、７７％同一、８７％相同アミノ酸であったことから、ヒトの１８７Ａ５相同遺伝子であると考えられる（配列番号：１）。
[実施例２] １８７Ａ５遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる発現解析 １８７Ａ５遺伝子のドーパミン産生ニューロン系列の細胞における詳細な発現パターンを調べるため、以下のプロトコールによるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、１８７Ａ５およびＬｒｐ４のｍＲＮＡの発現解析を行った。
まず、以下の方法でＤＩＧ化プローブを作製した。
マウス（ＳＬＣより入手）１２．５日胚より中脳後脳領域を切り出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ （TAKARA）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系で１８７Ａ５およびＬｒｐ４のｃＤＮＡを増幅した。
１０×ＥｘＴａｑ ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ 4μｌ
ＥｘＴａｑ ０．２５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．５μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
ＤＭＳＯ １．５μｌ
蒸留水 ３７.２５μｌ
増幅条件は、９４℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
１８７Ａ５：AGCTGAGCCACCTTCTCAGTCCAGAC（配列番号：４８）
CCACGTCCAGGTCTTGACAAACCCAC（配列番号：４９）
Ｌｒｐ４ ：GACAGTGAACCTTTGGTCACTGATGG（配列番号：５０）
GCCTTCCTGTCCTGGGATCAGCTTGG（配列番号：５１）
増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ（Invitrogen）にクローニングし、これを鋳型に用いてＤＩＧ化プローブを以下の反応系で合成した（試薬は全てRocheより購入）。
ＲＮＡ ポリメラーゼバッファー ２μｌ
ＮＴＰ ラベリング ミックス ２μｌ
ＲＮａｓｅ インヒビター １μｌ
ＲＮＡ ポリメラーゼ （Ｔ７またはＳＰ６） ２μｌ
鋳型ＤＮＡ １μｇ
蒸留水 総量２０μｌ
３７℃２時間の後、ＤＮａｓｅＩ（Roche）処理を３７℃で１５分行い、ＤＩＧ化ＲＮＡプローブをエタノール沈殿により回収した。
次に、マウス１２．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ（WAKO）／ＰＢＳを用いて４℃で２時間固定した後、２０％ショ糖（WAKO）／ＰＢＳを用いて４℃で一晩置換し、ＯＣＴ（サクラセイキ）で包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に４％ＰＦＡを用いて室温で３０分間再固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼーション（１μｇ／ｍｌ ＤＩＧ化ＲＮＡプローブ、５０％ホルムアミド（ナカライテクス）、５ｘＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ 酵母ＲＮＡ（Sigma）、５０μｇ／ｍｌ ヘパリン）を６８℃で４０時間行った。その後、洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ）を６８℃で行い、さらに洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ）を６８℃で行った。１ｘＴＢＳＴで、室温で洗浄ののち、ブロッキング（ブロッキング剤：Roche）を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（DAKO）を４℃で一晩反応させ、洗浄（１ｘＴＢＳＴ、２ｍＭ レバミソール）の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ (DAKO)を基質として発色させた。
その結果、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるマウス１２．５日胚において、１８７Ａ５のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の存在する中脳最腹側脳室領域（ventricular zone；ＶＺ）と中脳最背側ｒｏｏｆ ｐｌａｔｅ領域に選択的に発現することが明らかになった（図４）。一方、後脳腹側には発現が認められず、Ｌｒｐ４陽性である後脳ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ細胞には発現しないことが確認された。
以上のことから、１８７Ａ５のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現することが明らかになった。Ｌｒｐ４と１８７Ａ５の両遺伝子を同時に発現する細胞は中脳最腹側脳室領域に存在するドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に限定されることから、これらのマーカーを組み合わせて用いれば、より正確にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を識別することができると考えられる。
[実施例３]ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロンにおける１８７Ａ５遺伝子の発現
ＥＳ細胞をイン・ビトロでドーパミン産生ニューロンに分化誘導させた場合に、１８７Ａ５遺伝子が発現するか否かを検討した。
まず、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 Oct;28(1):31-40.）に従い、ＥＳ細胞（理研CDB西川氏から提供されたマウス由来ＣＣＥ株、Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40.）よりドーパミン産生ニューロンへの分化誘導を行った。誘導6日目の細胞からＬｒｐ４陽性および陰性細胞を分離し（ＷＯ２００４／０６５５９９号公報の実施例５）、分離直後の細胞から全ＲＮＡを調製した。これを鋳型にｃＤＮＡを合成し、増幅した。
また、5-stage法（Lee et. al. (2000) Nat.Biotech. 18: 675-679、mouse dopaminergic neuron differentiation kit (R&D Systems)）に従い、ES細胞（CCE）よりドーパミン産生ニューロンへの分化誘導を行った。ステージ4、7日目の細胞よりＬｒｐ４陽性および陰性細胞を分離し（ＷＯ２００４／０６５５９９号公報の実施例８）、分離直後の細胞から全ＲＮＡを調製した。これを鋳型にｃＤＮＡを合成し、増幅した。
次に、増幅したｃＤＮＡ ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いて、以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ ０．０５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．１μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
ＤＭＳＯ ０．３μｌ
蒸留水 ６．６５μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、２６サイクルで行った。
下記のプライマーをＰＣＲに使用した。
Ｌｍｘ１ａ：TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG（配列番号：３３）
TCTGAGGTTGCCAGGAAGCAGTCTCC（配列番号：５２）
なお、Ｌｒｐ４および１８７Ａ５は実施例１のプライマーを使用した。
その結果、１８７Ａ５遺伝子は、いずれの方法で分化誘導した際にも発現し、特にＬｒｐ４陽性細胞に強く発現することが確認された（図５、図６）。したがって、１８７Ａ５のｍＲＮＡは、マウスおよびラット胎児中脳由来の細胞だけでなく、ＳＤＩＡ法および５−ｓｔａｇｅ法のいずれの方法による分化誘導細胞においても、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において発現していることが明らかになった。すなわち、１８７Ａ５遺伝子は、胎児中脳由来のドーパミン産生ニューロン前駆細胞だけでなく、イン・ビトロでＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロン前駆細胞を識別するのにも有用なマーカーであることが明らかになった。
［実施例４］１８７Ａ５タンパク質の細胞表面での発現
１８７Ａ５タンパク質には膜貫通領域と思われる配列が1箇所存在する。１８７Ａ５タンパク質が細胞表面に発現していれば、これに結合性を有する抗体を用いてフローサイトメトリーにより、１８７Ａ５陽性である生細胞を分離することが可能となり、パーキンソン病などの移植材料の調製に有用であると期待される。そこで、１８７Ａ５タンパク質の細胞内局在について検討した。
（１）シグナル配列の解析
通常Ｉ型の膜貫通タンパク質の場合、Ｎ末端付近にシグナル配列が存在し、その直下で切断されることにより膜上に発現することができる。コンピューターサーチ（PSORT II, http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html）の結果、マウス１８７Ａ５遺伝子にはシグナル配列と予想される配列は見出されなかった。一方、ヒト１８７Ａ５遺伝子のＮ末端近傍にはシグナル配列様の配列が存在していた。そこで、１８７Ａ５遺伝子に機能的なシグナル配列が存在するかどうかを検討した。
マウスｃＤＮＡのうち、Ｎ末端から４５番目のアミノ酸までをコードする領域と、シグナル配列を欠く分泌型アルカリフォスファターゼｃＤＮＡとを連結したコンストラクトを作製し、２９３Ｅ細胞にトランスフェクションした。培養４日目の培養上清を回収し、Ａｕｒｏｒａ ｋｉｔ （ＩＣＮ）を用いてアルカリフォスファターゼ活性を測定した（図７）。
その結果、シグナル配列を欠く分泌型アルカリフォスファターゼ（コントロール）を発現させた際には、このタンパク質は分泌されないため、上清中にアルカリフォスファターゼ活性が認められないのに対し、Ｎ末端配列を連結させた融合タンパク質の場合、上清中に強い活性が認められたことから、１８７Ａ５のＮ末端配列により融合タンパク質が効率よく分泌されることが明らかになった（図８）。したがって、１８７Ａ５のＮ末端付近には機能的なシグナル配列が存在することが明らかになった。このことは、１８７Ａ５タンパク質がＩ型の１回膜貫通分子であることを示している。
（２）１８７Ａ５の細胞表面での発現（ビオチン化修飾法）
１８７Ａ５タンパク質が細胞表面に発現するか否かを確認するために、細胞表面のタンパク質のみをビオチン化修飾する際に、１８７Ａ５タンパク質がビオチン化されるかどうかを検討した。
１８７Ａ５のＣ末端にＨＡタグを付加したコンストラクトをＮＳ２０Ｙ細胞にトランスフェクションした。２日後、冷却したＰＢＳで細胞を２回洗浄した後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（PIERCE）（ＰＢＳ＋１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解）を５ｍｌ添加し、室温で３０分間反応させた。冷却したＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞を回収し、溶解バッファー（１％ＳＤＳ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ）６００ μｌに懸濁し、超音波処理を行った。１４０００回転で３分間の遠心の後、上清を回収した。ストレプトアビジンビーズ（PIERCE）２０μｌを加え、室温で１時間ローテーションした後、溶解バッファーで２回洗浄した。ビーズにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー７５μｌを加えて、１００℃３分間の後、遠心して結合タンパク質を回収し、抗ＨＡ抗体（Roche）を用いたウェスタンブロティングにより。１８７Ａ５タンパク質を検出した。
その結果、１８７Ａ５タンパク質が高効率にビオチン化されていることが明らかになった（図９）。したがって、１８７Ａ５タンパク質は細胞表面に発現すると考えられる。
（３）１８７Ａ５の細胞表面での発現（ＦＡＣＳ解析）
１８７Ａ５タンパク質をＦＡＣＳ法で検出できるかどうか検討した。１８７Ａ５の予想切断部位（３９番目のアミノ酸）よりＣ末端側をコードするｃＤＮＡをＰｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎのシグナル配列とＦＬＡＧタグをコードする配列の直下に連結したコンストラクトを作製した。このコンストラクトを発現させると、シグナル配列切断後に、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加した１８７Ａ５を発現させることができる。このコンストラクトを、Ｂ３００．１９細胞にレトロウイルスベクターによりステーブルに導入した。親細胞および形質転換体をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した後、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA）と氷上で３０分間反応させ、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。続いて、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson）（１／２００希釈）と氷上で３０分間反応させ、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。染色後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ、 Becton Dickinson）で解析した。
その結果、親株と異なり、ステーブル形質転換体ではＦＬＡＧ抗体に強く反応する集団が検出された（図１０）。したがって、１８７Ａ５はＮ末端側を細胞外とする向きで細胞表面に発現し、抗体を用いてＦＡＣＳで検出可能であることが明らかになった。すなわち、１８７Ａ５は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の生細胞を分離する際のマーカーとして有用であると考えられる。
[実施例５]１８７Ａ５タンパク質の発現解析
１８７Ａ５遺伝子のうち、細胞外領域をコードする遺伝子配列を用いて、以下のプロトコールにより抗１８７Ａ５抗体を作製し、免疫組織染色による発現解析を行った。
まず、マウス１８７Ａ５遺伝子のうち、細胞外領域（配列番号：１５の１番目〜９１９番目のアミノ酸）をコードする遺伝子配列を２９３Ｅ細胞に遺伝子導入して、１８７Ａ５タンパク質の細胞外領域を発現させて回収した。回収したタンパク質をラットに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞と融合させた。融合させた細胞集団より、１８７Ａ５に反応性を持つクローンを選択した。このクローンの培養上清より、抗１８７Ａ５モノクローナル抗体を精製した。次にマウス１１．５日胚を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で４℃、２時間固定したのち、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）で４℃、一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２ｕｍの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で３０分乾燥させ、ＰＢＳ（−）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（２５％ブロックエース（大日本製薬株式会社））を室温、３０分間行い、作製した抗１８７Ａ５モノクローナル抗体（培養上清 ２倍希釈、２．５％ブロックエース／ＰＢＳ）を室温、２．５時間反応させた後、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ（−）で、室温、１０分間の洗浄を４回行った。Ｃｙ３標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson、１０μｇ／ｍｌ、２．５％ブロックエース／ＰＢＳ）を室温、１時間反応させ、同様に洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）によって室温、５分間洗浄し、封入した。
作製した抗１８７Ａ５モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による発現解析の結果、実施例２の結果と同様に、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるＥ１１．５で、中脳腹側に１８７Ａ５タンパク質の存在が認められ、ドーパミン産生ニューロンの発生しない後脳腹側ではその存在が認められなかった（図１１）。
これらの結果から、１８７Ａ５タンパク質はドーパミン産生ニューロン前駆細胞に存在することが確認された。
[実施例６] １８７Ａ５タンパク質が存在する細胞の検出
実施例５で作製した抗１８７Ａ５モノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーにより１８７Ａ５タンパク質が存在する細胞の検出を行った。
まず、マウスＥ１２．５胎児中脳および後脳腹側領域を細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗１８７Ａ５モノクローナル抗体（精製抗体 １／１０希釈、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）および抗Ｌｒｐ４抗体（培養上清 １／２ 希釈、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で４℃、２０分間染色した。その後、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ−で４℃、３分間の洗浄を３回行い、ビオチン標識抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Jackson、１０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で４℃、２０分間染色し、同様に洗浄したのち、ＡＰＣ標識ストレプトアビジン（Pharmingen、８ｕｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）およびＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson、２０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で４℃、２０分間染色し、同様に洗浄した。染色後、フローサイトメーターによる検出を行った。
作製した抗１８７Ａ５モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーの結果、１８７Ａ５タンパク質が存在する細胞集団が検出された（図１２）。ここで、固定・透過処理することなく、１８７Ａ５タンパク質が存在する細胞を検出できることから、セルソーターを付属したフローサイトメーターを用いることにより、１８７Ａ５タンパク質が存在する細胞を生細胞の状態で分離することが可能であるが示唆された。また、中脳Ｌｒｐ４陽性細胞、すなわちドーパミン産生ニューロン前駆細胞においては全て１８７Ａ５タンパク質が存在することが確認され、一方、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含まない後脳Ｌｒｐ４陽性細胞においては１８７Ａ５タンパク質が存在しないことが確認された（図１２）。
これらの結果から、１８７Ａ５抗体はドーパミン産生ニューロン前駆細胞の分離に有用であることが示された。
[実施例７]ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロンにおける１８７Ａ５タンパク質の発現
ＳＤＩＡ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＥＳ細胞より分化誘導させたドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む細胞群を、細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、実施例５で作製した抗１８７Ａ５モノクローナル抗体（精製抗体 １／１０希釈、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）および抗Ｌｒｐ４抗体（培養上清 １／２ 希釈、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）で４℃、２０分間染色した。その後、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地で４℃、３分間の洗浄を３回行い、ビオチン標識抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Jackson、１０μｇ／ｍｌ、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）で４℃、２０分間染色し、同様に洗浄したのち、ＡＰＣ標識ストレプトアビジン（Pharmingen、８ｕｇ／ｍｌ、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）およびＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson、２０μｇ／ｍｌ、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）で４℃、２０分間染色し、同様に洗浄した。染色後、フローサイトメーターにて１８７Ａ５およびＬｒｐ４発現細胞を検出した。
フローサイトメトリーの結果、マウス胎児中脳と同様に、１８７Ａ５およびＬｒｐ４タンパク質が存在する細胞集団が検出された（図１３）。
これらの結果から、１８７Ａ５抗体はＥＳ細胞由来ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の分離にも有用であることが示された。
［実施例８］抗体によるＬｒｐ４発現細胞の分離
分離した１８７Ａ５およびＬｒｐ４共陽性細胞がドーパミン産生ニューロンに分化することを確認するため、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカーであるＮｕｒｒ１を用いて以下の実験を行った。
ＳＤＩＡ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＥＳ細胞より分化誘導させてから、分離した細胞をポリ−Ｌ−オルニチン（sigma、０．００２％ ｉｎ ＰＢＳ）、ラミニン（invitrogen、２．５μｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）、フィブロネクチン（sigma、５μｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）コートしたスライドガラス上に播き、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１ｘ）、Ｂ２７（Invitrogen、１ｘ）、アスコルビン酸（sigma、２００ｕＭ）ＢＤＮＦ（Invitrogen、２０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Invitrogen）／ＳＤＩＡ分化培地中で、３７℃、６日間培養した。培養した細胞を２％ＰＦＡ／ＰＢＳで４℃、２０分間固定し、ＰＢＳで４℃、１０分間の洗浄を２回行った。その後、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで室温、３０分間の透過処理を行い、１０％ ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／ブロックエースで室温、２０分間のブロッキングを行った。続いて、抗Ｎｕｒｒ１抗体（ｉｎ ｈｏｕｓｅ 培養上清 １／１０００希釈、１０％ ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ、２．５％ブロックエース、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ）、抗ＨｕＣ／Ｄ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、１／５０、４μｇ／ｍｌ、１０％ ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ、２．５％ブロックエース、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ）で、室温、１時間反応させ、引き続き、４℃、一晩反応させた。翌日、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで、室温、１０分間の洗浄を４回行った後、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体、Ｃｙ３標識した抗ラットＩｇＧ抗体（いずれもJackson、３μｇ／ｍｌ、１０％ ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ、２．５％ブロックエース、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ）で室温、１時間反応させた。その後、同様に洗浄し、ＰＢＳで室温、５分間洗浄し、封入して観察した。
フローサイトメトリーにより分離した細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６日間培養した結果、対照である分離していない細胞に比べて明らかに多くのＮｕｒｒ１陽性ドーパミン産生ニューロンが誘導された（図１４）。
これらの結果から、１８７Ａ５／Ｌｒｐ４共陽性細胞は、確かにドーパミンニューロン系列の前駆細胞であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟可能であることが明らかになった。

Claims (37)

  1. 以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド：
    （ｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｖ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
    以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
    （ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
    （ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
    （ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
    （ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質
    のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、少なくとも１５塩基長である、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出または選択に用いられるプローブまたはプライマー。
  2. ポリヌクレオチドが、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌまたはチンパンジーに由来する、請求項１に記載にプローブまたはプライマー。
  3. ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、および配列番号：２７からなる群から選択される、請求項１または２に記載にプローブまたはプライマー。
  4. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブまたはプライマー。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の二種以上のプライマーからなる、プライマーセット。
  6. 以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質またはその一部に結合性を有する、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出または選択に用いるための抗体：
    （ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
    （ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
    （ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
    （ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
  7. タンパク質またはその一部が、細胞外に発現しているポリペプチド部分である、請求項６に記載の抗体。
  8. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項６または７に記載の抗体。
  9. 請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現を検出する工程または請求項６に記載のタンパク質を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法。
  10. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項９または１０に記載の方法：
    （ａ）被験細胞試料と請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ、プライマー、またはプライマーセットとを接触させる工程；および
    （ｂ）反応性の有無を検出する工程。
  12. ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項９または１０に記載の方法：
    （ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブとを接触させる工程；および
    （ｂ−１）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
  13. ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項９または１０に記載の方法：
    （ａ−２）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーまたは請求項５に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
    （ｂ−２）形成された増幅産物を検出する工程。
  14. タンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項９または１０に記載の方法：
    （ｃ）被験細胞試料と請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗体とを接触させる工程；および
    （ｄ）反応性の有無を検出する工程。
  15. タンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項９または１０に記載の方法：
    （ｃ−１）被験細胞試料由来のタンパク質と請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗体とを接触させる工程； および
    （ｄ−１）抗体抗原複合体を検出する工程。
  16. 被験細胞試料が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞へ分化させる処理が行われたＥＳ細胞または胎児中脳腹側領域から得られた細胞である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 工程（ａ）または工程（ｃ）において、被験細胞試料として、前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質が検出された細胞；分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質が検出されなかった細胞；前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質が検出された細胞；または成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質が検出されなかった細胞；を使用することを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 工程（ｂ）または工程（ｄ）の後に、
    （ｅ−１）前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質を検出する工程；
    （ｅ−２）分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出する工程；
    （ｅ−３）前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質を検出する工程；または
    （ｅ−４）成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出する工程
    を更に含んでなる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより被験細胞試料を形質転換し、該被験細胞試料における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程
    を更に含んでなる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、請求項５に記載のプライマーセット、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキット。
  21. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項２０に記載のキット。
  22. 前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；
    分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；
    前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；または
    成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体
    を更に含んでなる請求項２０または２１に記載のキット。
  23. 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、請求項５に記載のプライマーセット、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬。
  25. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項２４に記載の試薬。
  26. 前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；
    分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；
    前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体；または
    成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体
    を更に含んでなる請求項２４または２５に記載の試薬。
  27. 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の試薬。
  28. 下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
    （ｉ）ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
    （ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現または請求項６に記載のタンパク質を検出する工程。
  29. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である請求項２８に記載のスクリーニング方法。
  30. （ｉｉｉ−１）被験物質を接触させた後の前記細胞における前記ポリヌクレオチド以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現または前記タンパク質以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカータンパク質を検出する工程
    を更に含んでなる請求項２９に記載の方法。
  31. （ｉｉｉ−２）被験物質を接触させた後の前記細胞における、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程
    を更に含んでなる請求項２９に記載の方法。
  32. （ｉｉｉ−３）前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより、被験物質を接触させた後の前記細胞を形質転換し、該細胞における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程
    を更に含んでなる請求項２９に記載の方法。
  33. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の製造方法であって、
    （ｉ）ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
    （ｉｉ）請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
    を含んでなる、方法。
  34. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞がパーキンソン病治療用のドーパミン産生ニューロン前駆細胞である、請求項３３の製造方法。
  35. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項３３または３４に記載の製造方法。
  36. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための指標としての、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質の使用：（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
    （ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
    （ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
    （ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
  37. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞である、請求項３６に記載の使用。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2836483C (en) * 2011-05-20 2020-08-18 The Mclean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses
JP6090937B2 (ja) * 2011-07-27 2017-03-08 国立大学法人京都大学 新規ドーパミン産生神経前駆細胞マーカー
WO2015034012A1 (ja) 2013-09-05 2015-03-12 国立大学法人京都大学 新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法
US11261461B2 (en) 2014-08-19 2022-03-01 Tongji University Methods and compositions for selective generation of dopaminergic precursors
US11111279B2 (en) 2015-11-20 2021-09-07 Grand Valley State University Nato3 mutant polypeptides and uses thereof
AU2017254268B2 (en) 2016-04-22 2023-03-16 Kyoto University Method for producing dopamine-producing neural precursor cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065599A1 (ja) * 2003-01-24 2004-08-05 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー
EP1447413A2 (en) * 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2004094651A2 (en) * 2003-04-18 2004-11-04 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
WO2004094598A2 (en) * 2003-04-18 2004-11-04 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of use for novel human polypeptides encoded by polynucleotides

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5753491A (en) 1993-04-13 1998-05-19 Us Health Use of neuro-derived fetal cell lines for transplantation therapy
ES2170096T3 (es) 1993-04-13 2002-08-01 Us Gov Health & Human Serv Uso de lineas celulares fetales neuroderivadas para terapia de trasplantes.
JPH09505054A (ja) 1993-11-09 1997-05-20 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 均質なニューロン細胞移植片としての組成物とこれらの移植片の製造及び使用方法
US6204053B1 (en) 1994-11-08 2001-03-20 Diacrin, Inc. Porcine cortical cells and their use in treatment of neurological deficits due to neurodegenerative diseases
US6277372B1 (en) 1994-11-08 2001-08-21 Diacrin, Inc. Porcine neural cells and their use in treatment of neurological deficits due to neurodegenerative diseases
US6294383B1 (en) 1994-11-08 2001-09-25 The Mclean Hospital Corporation Porcine neural cells and their use in treatment of neurological deficits due to neurodegenerative diseases
KR100297899B1 (ko) 1995-03-13 2001-10-25 케네스 지. 프레스톤 세르톨리세포를이식함으로써정상소재의영양인자를생산하는방법및이러한세르톨리세포
US5830460A (en) 1995-03-13 1998-11-03 University Of South Florida Sertoli cells as transplantation facilitator for cell transplantation
US6653134B2 (en) 1995-03-28 2003-11-25 Cp Hahnemann University Isolated stromal cells for use in the treatment of diseases of the central nervous system
US5753505A (en) 1995-07-06 1998-05-19 Emory University Neuronal progenitor cells and uses thereof
WO1999056759A1 (en) 1998-05-07 1999-11-11 University Of South Florida Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair
US6913925B1 (en) 1998-08-12 2005-07-05 Signal Pharmaceuticals Llc Human mesencephalon cell lines and methods of use therefor
ES2320814T3 (es) 1998-11-09 2009-05-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procedimiento de sintesis de acido nucleico.
JP2002051775A (ja) 2000-06-01 2002-02-19 Japan Science & Technology Corp ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法
AU2003245488A1 (en) 2002-06-13 2003-12-31 Regulome Corporation Functional sites
DE60335490D1 (de) 2002-10-22 2011-02-03 Eisai R&D Man Co Ltd Spezifisch in postmitotischen dopamin-produzierenden neuronalen vorläuferzellen exprimiertes gen
US7790867B2 (en) * 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
AU2003298786A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
ATE472292T1 (de) 2002-12-10 2010-07-15 Koninkl Philips Electronics Nv Tragbare vorrichtung für die bioelektrische interaktion mit bewegungsartefakt- korrekturmitteln
EP1712638B1 (en) 2003-11-26 2009-06-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Specific marker Lmx1a on dopaminergic neurons
US20080199437A1 (en) 2004-07-22 2008-08-21 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corin Dopaminergic Neuron Progenitor Cell Markers
EP1930429A4 (en) 2005-08-18 2009-03-11 Eisai R&D Man Co Ltd Msx1 / 2, MARKERS OF NEURONE DOPAMINE PROGENITOR CELL IN FULL GROWTH
WO2007021003A1 (ja) 2005-08-18 2007-02-22 Eisai R & D Management Co., Ltd. ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＮａｔｏ３
CA2676090A1 (en) * 2007-02-06 2008-10-02 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with adhd

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065599A1 (ja) * 2003-01-24 2004-08-05 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー
EP1447413A2 (en) * 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2004094651A2 (en) * 2003-04-18 2004-11-04 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
WO2004094598A2 (en) * 2003-04-18 2004-11-04 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of use for novel human polypeptides encoded by polynucleotides

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