JPH09505054A

JPH09505054A - 均質なニューロン細胞移植片としての組成物とこれらの移植片の製造及び使用方法

Info

Publication number: JPH09505054A
Application number: JP7513971A
Authority: JP
Inventors: リー，ヴァージニア
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 1997-05-20
Also published as: CA2176216A1; WO1995012982A1

Abstract

(57)【要約】安定で、均質な有糸分裂後ヒトニューロンを個体の脳に移植することを含む、中枢神経系の疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法を開示する。安定で、均質な有糸分裂後ヒトニューロンを神経損傷の部位に又は当該部位の近くに移植することを含む、神経損傷を特徴とする損傷、疾患、症状又は障害に罹患したと疑われる個体の治療方法。安定で、均質な有糸分裂後ヒトニューロンと、薬剤学的に受容される培地とを含む薬剤組成物を開示する。安定で、均質な有糸分裂後ヒトニューロンを非ヒト動物の脳に移植することを含む、ヒトＣＮＳ疾患、症状又は障害の非ヒト動物モデルの作製方法を開示する。それらの脳に移植された、安定で、均質な有糸分裂後ヒトニューロンを含む非ヒト動物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】均質なニューロン細胞移植片としての組成物とこれらの移植片の製造及び使用方法発明の分野本発明は、ヒトの疾患、症状及び障害を研究するために有用な、非ヒト動物モデルを作製するために、安定で均質なニューロン細胞集団を非ヒト動物に移植するために有用な組成物及び移植方法に関する。本発明は、個体の身体における疾患、症状及び障害、特に、脳の損失、損傷及び機能障害及び／又は他の部位における個体ニューロンの損失、損傷及び機能障害を治療又は予防するために個体中に安定で均質なニューロン細胞集団を移植するために有用な組成物及び移植方法に関する。この出願は米国特許出願第０８／１５０，３６８号（１９９３年９月９日出願）、米国特許出願第０８／１７０，６６８号（１９９３年１２月１７日出願）、米国特許出願第０７／９１１，９８０号（１９９２年７月１０日出願）、及び米国特許出願第０７／７８０，７１５号（１９９１年１０月２１日出願、現在、米国特許第５，１７５，１０３号、１９９２年１２月２９日発行）に関係し、これらの出願は本発明に援用される。本発明はＮＩＨ助成金第ＮＩＨ１８６１６号によって支援される研究の過程でなされた。合衆国政府は本発明にある一定の権利を有する。発明の背景中枢神経系（ＣＮＳ）細胞の主要な部類（すなわち、ニューロン、星状膠細胞）又はＣＮＳ組織フラグメントの移植は、これらの細胞の発達生物学及び免疫学的性質を研究し、例えばアルツハイマー病のようなＣＮＳ疾患の動物モデルを作製し、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症及び遺伝性脊髄性運動失調のような、厳しい進行性の神経変性障害を治療するための代替え方法を開発し、並びにこのような疾患、状態及び障害に罹患していると疑われる個体を治療するために個体中にニューロン細胞を移植することを含めて、ニューロンの損失、損傷又は機能障害を特徴とする他の疾患、状態及び障害を研究する機会を提供する。薬物誘導性及び突発性パーキンソン病の錐体外路発現を改善するためにヒト胎児中脳組織移植片を用いる最近の先駆的試みは、移植されたヒトＣＮＳ組織がヒト神経変性疾患を治療する可能性を強調している［Ｆｒｅｅｄ，Ｃ．Ａ．等，１９９２，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９〜１５５５；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｄ．等，１９９２，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４１〜１５４８；及びＷｉｄｎｅｒ，Ｈ．等，１９９２，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６〜１５６３］。しかし、これらの試みの結果は完全に満足できるものではなかった。温度に敏感なプロモーターを含む構造体(construct)を用いたＣＮＳ前駆細胞の不変化(immortalization)は、ニューロン及びグリアの遺伝子工学先駆体(gene tically engineered procursor)の移植を可能にしているが、これらの先駆体の脳移植片はグリア及びニューロンの子孫(progeny)の混合集団を生じている（Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｅ．とＲ．ＭｃＫａｙ，１９９１，ＴＩＮＳ，１４：３３８〜３４０；Ｒｅｎｆｒａｎz，Ｒ．Ｊ．等，１９９１，Ｃｅｌｌ，６６：７１３〜７２９；Ｓｙｎｄｅｒ，Ｅ．Ｙ．等，１９９２，Ｃｅｌｌ，６８：３３〜５１）。代替え方法は、ＣＮＳの腫瘍から得られたニューロン様形質転換細胞ラインを用いることであったが、腫瘍性ニューロン様細胞はこの細胞サイクルを永久的に出るように誘導されることができない、又はこれらの細胞は齧歯類脳に移植されたときに腫瘍に発達する（Ｆｕｎｇ，Ｋ．Ｆ．等，１９９２，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１３１９〜１３２８；Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．等，１９９２，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１７：１２１〜１３５；及びＷｉｅｓｔｌｅｒ，Ｏ．Ｄ．等，１９９２，ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．２：４７〜５９）。片側巨大脳症を有する小児から得られた、徐々に分裂するヒトニューロン細胞ラインが培養中にニューロン様表現型を示すことが判明したが、齧歯類ＣＮＳにおける、これらの細胞の移植片はニューロン及び間葉の混合表現型性質を示した（Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ｍ．等，１９９２，ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔＩ：３〜１５）。このような動物の脳にニューロンを移植して、ＣＮＳ疾患、症状若しくは障害に類似するか又はこれらを模倣する状態を生じることによる、ＣＮＳ疾患及び障害の動物モデルの作製方法が必要とされている。このような動物の脳にニューロンを移植して、ＣＮＳ疾患、症状若しくは障害に類似するか又はこれらを模倣する状態を生じることによる、ＣＮＳ疾患及び障害の動物モデルが必要とされている。その存在が治療すべき疾患に関係した病理学を逆転若しくは予防するような細胞を補充若しくは導入するためにニューロンを移植することによる、ＣＮＳ疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法が必要とされている。発作又は損傷によって損なわれた細胞を補充するためにニューロンを移植することによる、例えば、頭外傷、神経傷害又は脊髄損傷のような発作又は損傷によって生ずるニューロン障害に罹患していると疑われる個体の治療方法が必要とされている。発明の概要本発明は、ニューロンの損傷又は損失を特徴とする疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、少なくとも９５％純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物（culture）からのサンプルを損傷又は損失の部位において若しくはこのような部位の近くにおいて個体に移植することを含む方法に関する。本発明は、中枢神経系の損傷、疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、少なくとも９５％純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを個体の脳に移植することを含む方法に関する。本発明は、脊髄の損傷、疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、少なくとも９５％の純度で、安定、均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを個体の脊柱に移植することを含む方法に関する。本発明は、神経細胞の損傷、疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを個体の身体中に神経機能障害又は損傷の部位において移植することを含む方法に関する。本発明は、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルと、薬剤学的に受容される媒質とを含む薬剤組成物に関する。本発明は、中枢神経系のヒト疾患又は障害の非ヒト動物モデルの作製方法であって、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを非ヒト動物に移植することを含む方法に関する。本発明は、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを、その脳、神経系又は脊柱に移植された非ヒト動物に関する。図面の説明図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ及び図１Ｈは、種々なモノクローナル抗体によって検査した、移植後４週間目の海馬状隆起（歯状回と多形細胞層(polymorph layer)）中のＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を含む。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄは、クレシルバイオレット(Cresyl Viole t)で染色した（図２Ａ、図２Ｃ及び図２Ｄ）又はマクロファージに対してＭＡｂ（ＥＤ１）によって染色した（図２Ｂ）、移植後２〜４週間目の皮下白質と背側間葉（図２Ｃ）とにおける３種類のＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を含む。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈは、ＭＡｂによって検出し、ヘマトキシリンによって対比染色した移植後４週間目の皮下白質中のＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を含む。発明の詳細な説明本発明は、損傷、疾患、障害若しくは症状に罹患していると疑われる個体中に、若しくは非ヒト動物中にニューロンを移植して、ヒト疾患、障害若しくは症状の非ヒト動物モデルを作製することに関する、組成物及び方法に関する。本発明の方法に用いられるニューロンは少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンである。任意に、ニューロンは外因的な遺伝物質(gen et ic material)を含むことができる。本発明の方法に用いられるニューロンは遺伝子型的に及び表現型的に均質である。本明細書で用いるかぎり、“サンプル”なる用語は１個以上の細胞を表す意味である。好ましい実施態様では、サンプルは複数の細胞を含む。本発明によると、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを非ヒト動物又はヒトに移植する。したがって、本発明の方法は、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを非ヒト動物又はヒトに移植することに関する。本明細書で用いるかぎり、“前記神経損傷の部位において又はこのような部位の近くにおいて”なる用語は、破壊、損傷若しくは機能障害した神経細胞を置換するために及び／又は破壊、損傷若しくは機能障害した神経細胞に起因する機能を修復するために、神経細胞を移植する位置を意味する。この位置は、このような移植された細胞が破壊、損傷若しくは機能障害した神経細胞に代わる置換細胞として発達し、破壊、損傷若しくは機能障害した神経細胞によって失われた機能を修復するために必要な結合を形成することができる部位として定義される。本明細書で用いるかぎり、“外因的な遺伝物質”なる用語は、細胞又は原型(a ncestor)細胞中に導入される、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡとＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡとＲＮＡを意味する。外因的な遺伝物質は不均質でよい、又は個体若しくは動物に通常見い出される遺伝物質の１種以上の付加的なコピーであることができる。ヒトの損傷、疾患、症状又は障害の治療方法に薬剤組成物の成分として細胞を用いる場合には、細胞を形質転換しするために用いられる外因的遺伝物質が個体を治療するために及び／又は細胞をより移植されやすくするために用いられる治療法として選択されるタンパク質をコードすることができる。細胞をヒトＣＮＳ疾患又は障害の非ヒト動物モデルの作製方法に用いる場合には、細胞に導入される外因的遺伝物質が、モデル化すべきＣＮＳ疾患、症状又は障害に罹患したヒトの症状に類似した又はこのような症状を模倣した状態を非ヒト動物に生じるために選択されたタンパク質をコードすることができる。外因的遺伝物質は、発現ベクターを細胞にトランスフェクトする場合に、外因的遺伝物質がその細胞内に発現されることができるように、本質的な調節配列(r egulatory sequences)に機能的に結合した、細胞による産生が望ましいタンパク質のコーディング領域を含む発現ベクターで供給することが好ましい。本発明の幾つかの実施態様によると、純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルをＣＮＳ損傷、疾患、症状又は障害に関して治療される個体に移植する。これらの細胞は、損傷した、死亡した、非機能的又は機能障害的な内因的細胞の代わりに本質的に置換する及び／又は機能する。このように、例えば神経損傷又は脊髄損傷に関連した疾患のような、ニューロンの損失、損傷又は機能障害を特徴とする損傷、疾患、症状又は障害に罹患した個体の場合には、移植された細胞が損失、損傷若しくは機能障害した細胞の代わりに機能することができ、及び／又は個体において内因的に産生される産物の欠乏により低下若しくは損失された正常な機能を改良若しくは修復するために必要な、このような産物を産生することができる、個体の部位に細胞を移植する。脳におけるニューロンの損失、損傷又は機能障害を特徴とする損傷、疾患、症状又は障害に罹患した個体の場合には、個体の脳に細胞を移植する。移植された細胞は損失、損傷若しくは機能障害した細胞の代わりに機能し、及び／又は個体において内因的に産生される産物の欠乏により低下若しくは損失された正常な脳機能を改良若しくは修復するために必要な、このような産物を産生することができる。本発明の幾つかの実施態様によると、所望の産物を産生する生存ニューロンを供給するために、純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを疾患、症状又は障害に関して治療される個体に移植する。移植された細胞は、治療される個体の移植部位に又はこの移植部位の近くに存在する場合に、治療される疾患、症状又は障害に関連した病理学を逆転又は予防する特定の産物を産生することができる。本発明の幾つかの実施態様によると、ヒトのＣＮＳ疾患、症状又は障害のモデルを作製するために、純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後のヒトニューロンの培養物からのサンプルを非ヒト動物に移植する。移植された細胞は、ＣＮＳ疾患又は症状の病理学に類似する又はこのような病理学を模倣する症状の発現を生じる産物を産生することができる。この方法を用いて、内因的細胞の損失、損傷又は機能障害を特徴とする損傷、疾患、症状又は障害に罹患した個体を治療することができる。この方法を用いて、ニューロン損傷又は死亡に関連した、発作、脊髄損傷又は他の損傷、症状又は障害に罹患した個体を治療することができる。本発明の方法の実施によって治療することができるＣＮＳ疾患及び障害には、内因的細胞の損失、損傷又は機能障害を特徴とする任意の疾患であって、このような細胞に置換することができ、かつ適当な機能のために必要な又は正常でなく存在する若しくは異常なレベルで存在する化合物の存在を中和する(counteract)するために必要な産物を産生することができるニューロンを供給することによって、その症状が逆転されるか又は重症度を軽減される疾患がある。本発明は例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症及び遺伝性脊髄性運動失調のような、進行性の神経変性障害並びに、例えば発作及び神経損傷のような、神経症状(neurological condition)の治療に有用である。本発明は、適当な脳機能のために必要な有効タンパク質及び他の有効化合物を産生し、伝搬するための供給系 (delivery system)として役立つことによって疾患の治療に有用である。内因的細胞の損失、損傷又は機能障害を特徴とする、損傷、疾患、症状又は障害に罹患した個体を治療するために有用な、本発明による薬剤組成物は純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルと、薬剤学的に受容される媒質とを含む。本発明に用いられるニューロンは少なくとも９５％の純度である、有糸分裂後ヒトニューロンの安定で均質な培養物でなければならない。本発明に用いられるニューロンは外因的遺伝物質によってトランスフェクトされることができる。細胞の形質転換に用いられる外因的遺伝物質は、治療される個体の脳に供給するための治療法として選択されるタンパク質をコードすることができる。トランスフェクトされる遺伝物質によってコードされるタンパク質産物には、限定する訳ではなく、神経伝達物質の産生を生じるもの（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）並びに、例えば神経発育因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞（ｂＦＧＦ）及びグリア誘導成長因子（ＧＤＧＦ）のような、神経栄養物質がある。さらに、例えばＰ５３及びトロンボスポンジンのような、腫瘍サプレッサー遺伝子を細胞に導入することができる。本発明の他の実施態様によると、ヒトのＣＮＳ疾患、症状又は障害の非ヒト動物モデルを作製するために、非ヒト動物の脳に、純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルを移植する。これらの細胞の存在は、動物の脳に変化をもたらし、動物はヒトのＣＮＳ疾患、症状又は障害に類似する又はこれらを模倣する特徴を発生するようになる。移植された細胞は、動物の脳に存在する場合に、モデル化された疾患に関連した病理学に類似する又はこのような病理学を模倣する症状をもたらす、特定の産物を産生する。ＣＮＳ疾患の治療に有用な、本発明による非ヒト動物モデルの作製に用いられる細胞は、純粋で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルと、薬剤学的に受容される媒質とを含む。本発明に用いられるニューロンは少なくとも９５％の純度である、有糸分裂後ヒトニューロンの安定で均質な培養物でなければならない。本発明の方法の実施によってモデル化することができるＣＮＳ疾患及び障害には、内因的細胞の死亡、非機能化又は機能障害を特徴とするＣＮＳの任意の疾患、特に、細胞に正常に関連しないタンパク質を産生する又は異常なレベルで正常タンパク質を産生する細胞を特徴とする疾患がある。したがって、ヒトＣＮＳ疾患に関連したタンパク質を産生する細胞を動物の脳に移植すると、モデル化された疾患又は障害の病理学に関連した特徴に類似する又はこのような特徴を模倣する症状が生ずる。本発明は、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性脊髄性運動失調並びに運動ニューロン疾患及びレーヴィ小体疾患のような、進行性の神経変性障害の非ヒト動物モデルを作製するために有用である。これらの疾患には、例えば正常及び突然変異アミロイド先駆体遺伝子、遺伝子をコードするキナーゼ、ホスファターゼ、正常及び突然変異スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロフィラメントタンパク質並びにアポリポタンパク質４のような、多様な遺伝子が関与する。さらに、ある種類の癌の原因となる特定の癌遺伝子を導入して、ＮＴ２誘導細胞を用いて、このような癌の動物モデルを作製することができる。本発明の幾つかの実施態様では、用いるニューロンを米国特許第５，１７５，１０３号（１９９２年１２月２９日発行）に記載の方法によって製造することができ、この特許は、レチノイン酸（ＲＡ）によるＮＴ２細胞の処理後に、ヒト奇形癌細胞ライン（ＮＴｅｒａ２／クローンＰＩ又はＮＴ２細胞と名付ける）から＞９５％純粋な有糸分裂後ヒトニューロン（ＮＴ２Ｎ細胞と名付ける）を得る方法を開示する。インビトロにおけるニューロンの、広範囲な生化学的、分子生物学的及び形態学的研究のためにモデル系を形成する他に、ＣＮＳ疾患及び障害の動物モデルを作製するために純粋なヒトニューロンの安定で均質な集団をインビボ移植片として用いることができる、又は個体を悩ますＣＮＳ疾患若しくは障害に関連した病理学を逆転若しくは予防する産物を産生することができるニューロンを導入する治療法／予防法として、ＣＮＳ疾患若しくは障害に罹患した個体の脳に、純粋なヒトニューロンの安定で均質な集団をインビボ移植片として用いることができる。ＮＴ２細胞はその子孫がニューロン系統に限定される前駆細胞に相当すると思われるので、ＮＴ２細胞ラインは、ニューロン、グリア及び間葉細胞に分化することができる他の全ての奇形癌細胞ラインの中でも特有である（Ａｂｒａｍｈａｍ，Ｉ．等，１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２８：２９〜３９；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｗ．等，１９８１，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ１７：４９３〜５００；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｗ．等，１９８４，１９８４Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：１４７〜１６２；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｗ．等，１９８７，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：２８５〜２９３；Ｋｌｅｐｐｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．等，１９９２，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．１８：７８２；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．−Ｙ．とＰ．Ｗ．Ａｎｄｒｅｗ，１９８６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：５１４〜５２１；及びＹｏｕｋｉｎ，Ｄ．Ｐ．等，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２１７４〜２１７８）。ＮＴ２Ｎ細胞の他の特性化は、これらの細胞がＣＮＳニューロンに非常に密接に類似することを示している（Ｐｌｅａｓｕｒｅ，Ｓ．Ｊ．とＶ．Ｍ．−Ｙ．Ｌｅｅ．１９９３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．印刷中；Ｐｌｅａｓｕｒｅ，Ｓ．Ｊ．等，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：１８０２〜１８１５）。ＮＴ２Ｎ細胞はＣＮＳニューロンの他の重要な性質を有する、すなわち、これらの細胞は６９５アミノ酸長さのアミロイド先駆体タンパク質（ＡＰＰ）を殆ど排他的に発現し、アルツハイマー病アミロイドプラークに見い出されるβ−アミロイド又はＡ４（β／Ａ４）ペプチドを産生し、分泌し、それらの細胞表面にグルタメート受容体チャンネルを有する。本発明に用いられるニューロンは外因的遺伝物質によってトランスフェクトされることができる。米国特許第５，１７５，１０３号に記載される通りに形成される場合に、本発明に用いられるニューロンは分化の誘導前に遺伝物質によってトランスフェクトされることができる。トランスフェクション方法は周知であり、上記特許に開示される。細胞の形質転換に用いられる外因的遺伝物質は、脳の細胞内のその存在がヒトの疾患、障害又は症状に関連するタンパク質をコードすることができる。トランスフェクトされる遺伝物質によってコードされるタンパク質産物には、限定する訳ではなく、正常及び突然変異アミロイド先駆体、キナーゼ、ホスファターゼ、正常及び突然変異スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロフィラメントタンパク質及びアポリポタンパク質４並びに神経伝達物質（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）及び、例えば神経発育因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞（ｂＦＧＦ）及びグリア誘導成長因子（ＧＤＧＦ）のような、神経栄養物質がある。細胞をトランスフェクトするために用いられる外因的遺伝物質は好ましくは、トランスフェクトされる遺伝物質が細胞内に発現されることができるように、コーディング配列に機能的に結合した本質的な調節配列を含むベクターとして供給される。外因的遺伝物質をコードする発現ベクターは、遺伝子発現のために必要な調節要素に機能的に結合した、産生されるべきタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、ニューロン細胞中へのＤＮＡ又はＲＮＡ分子の組込みはタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現を生じ、したがって、タンパク質の産生を生じる。調節要素に機能的に結合した、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む外因的遺伝物質は機能性エピソーム分子として細胞中に存在して留まることができるか、又は細胞の染色体ＤＮＡに統合されることができる。外因的遺伝物質は細胞に組み込まれることができ、そこでプラスミドの形状の分離した遺伝物質として留まる。或いは、染色体に組み込まれることができる線状ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＤＮＡを細胞中に導入する場合に、染色体中へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するために有用であるＤＮＡ配列もＤＮＡ分子に含めることができる。或いは、ＲＮＡを細胞に導入することができる。発現ベクターの必要な要素はタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、細胞中にその配列を発現するために必要な調節要素とを含む。調節要素はタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に結合して、発現を可能にする。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくはこれらのハイブリッド又は例えばｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子であることができる。遺伝子発現のために必要な調節要素は、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルを含む。これらの要素がニューロン中で機能しうることが必要である。さらに、ヌクレオチド配列がニューロン細胞中で発現されることができ、したがって、タンパク質が産生されることができるように、これらの要素がタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に結合することが必要である。開始コドンと停止コドンは一般に、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素がニューロン中で機能的であることが必要である。同様に、用いるプロモーターとポリアデニル化シグナルとはニューロン細胞内で機能的でなければならない。本発明の実施に有用なプロモーターの例には、限定する訳ではなく、サイトメガロウイルスプロモーター、特に、イミージエトアーリープロモーター(immedia teearly promotor)、ＳＶ４０プロモーター及びレトロウイルスプロモーターがある。本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例には、限定する訳ではなく、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルがある。何らかの理由で、移植細胞の除去が望ましい場合には、細胞破壊の標的として役立つ付加的要素を加えることができる。ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）の発現可能な形を外因的遺伝物質に含めることができる。外因的遺伝物質をニューロン中に導入すると、ｔｋが産生される。移植細胞を殺すことが望ましい又は必要である場合には、薬物のガングシクロヴィール(gangcyclovir)を個体に投与して、この薬物にｔｋ産生細胞を選択的に殺害させる。このように、移植細胞の選択的破壊を可能にする系を形成することができる。発現ベクター中の外因的遺伝物質を発現させるために、タンパク質をコードするヌクレオチド物質に調節要素が機能的に結合しなければならない。したがって、プロモーターとポリアデニル化シグナルとがコーディング配列を含むフレーム (frame)内にあることが必要である。タンパク質産生を最大にするために、ニューロン細胞内での遺伝子発現に充分に適した調節配列を選択することができる。さらに、細胞に最も効果的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は外因的遺伝物質をニューロン中で機能的である発現ベクターとして製造することができる。ニューロンの損傷又は損失を特徴とする損傷、疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体中にこのようなニューロンの損傷又は損失の部位において、ニューロンの損傷又は損失の部位へのニューロンの直接移植によって、ニューロンを移植することができる。ＣＮＳの疾患、症状又は障害に罹患していると疑われる個体の脳に、このような個体の脳へのニューロンの直接移植によって、ニューロンを移植することができる。さらに、頭部外傷又は発作に罹患した個体の脳にニューロンを移植することができる。脳中のニューロンを損傷、破壊又は機能障害させる疾患、症状、障害又は損傷に罹患していると疑われる又は同定される個体を、内因的(endogenous)ニューロンの破壊又は機能障害によるニューロン機能の損失を補充又は補償するためのニューロンの移植によって治療することができる。幾つかの実施態様では、１ｘ１０³〜１ｘ１０⁶ニューロンを移植する。幾つかの実施態様では、（５〜１０）ｘ１０⁴ニューロンを移植する。ニューロンの移植には２方法が用いられており、第１方法はニューロン細胞の懸濁液を脳に移植する定位脳固定手術(stereotaxic surgery)を含み、第２方法ではミクロ手術(mi crosurgery)によって細胞を脳に移植する。ニューロン組織の移植方法は、Ｂａｃｋｌｕｎｄ，Ｅ．Ｏ．等，１９８５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６２：１６９〜１７３；Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．等，１９８７，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２２：４５７〜４６８；及びＭａｄｒａｚｏ，Ｉ．等，１９８７，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８３１〜８３４に開示されており、これらの文献の各々は本明細書に援用される。疾患又は傷害による神経損傷の部位に又はこのような部位の近くにおいて脊髄に、ニューロンを移植することができる。移植された細胞は運動ニューロンにさらに分化して、それによって損傷部位における神経を置換又は再結合させることができる。幾つかの実施態様では、脊髄の一部である運動ニューロンに損傷が生じる。また、幾つかの実施態様では、脊柱の外部の運動ニューロンに損傷が生じる。神経細胞損傷の部位に、すなわち、移植細胞の分化が個体の神経機能に代替えする又は神経を再結合させて、損傷を治療或いは改善することができるような箇所における１個以上の損傷細胞の付近に、本発明のニューロンを移植する。移植位置から発生する突起(process)が損傷神経の突起に置換して、損傷神経ネットワークを修復することができるような位置にニューロンを移植する。定位脳固定機器(stereotaxic instrument)と手で支える１０ｍｌハミルトン注射器(hamilton syringe)とを用いて、大脳半球(hemisphere)にニューロンを移植することによって、非ヒト動物の脳にニューロンを移植することができる。１ｘ１０³〜１ｘ１０⁶ニューロンのアリコートを成体ラット及び新生仔ラットに移植する。幾つかの実施態様では、（５〜１０）ｘ１０⁴ニューロンを移植する。成体ラットでは、各ラットの単一半球の１部位における大脳皮質、直下の白質又は海馬中に定位脳固定式(stereotaxically)に細胞を移植する。本発明を下記実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は限定を決して意図しないものである。実施例実施例１ヌードマウスの脳に移植したＮＴ２Ｎ細胞の研究は、これらのＮＴ２Ｎ細胞がニューロンとして免疫不全ヌードマウスの脳に組み込まれ、そこで拒絶又は腫瘍形成の兆候なしに＞１２月間生残することを示す。さらに、シクロスポリン処理した及び処理しない免疫適格Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＮＴ２Ｎニューロンの移植が実施され、細胞の生残が観察されている。免疫適格動物へのトランスフェクト済みニューロン細胞の移植を示す実験の考察を下記に述べる。材料と方法ＮＴ２細胞の培養と、ＮＴ２Ｎニューロンの作製とを本質的に米国特許第５，１７５，１０３号に記載の通りに実施した。簡単に説明すると、ＮＴ２細胞を標準方法を用いて培養し、５％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシンとを含むＯｐｔｉＭＥＭ中で１週間に２回、１：３で継代培養した。ＮＴ２細胞を１０μｍレチノイン酸（ＲＡ）の投与によってニューロンに分化するように誘導し、レチノイン酸は１週間に２回、５週間にわたって補充し、この時点で細胞を再培養して(replated)、Ｒｅｐｌａｔｅ１細胞を確立した。次に、２回連続再培養操作（Ｒｅｐｌａｔｅ２及びＲｅｐｌａｔｅ３と名付ける）後に高度に分化したＮＴ２Ｎ細胞が得られ、これらの時点においてＮＴ２Ｎ細胞は＞９９％純粋であった。Ｒｅｐｌａｔｅ３ＮＴ２Ｎニューロンの新たに回収されたアリコートを緩衝液中で３回洗浄してから、本明細書に述べる移植研究に用いた。さらに、２ラットで実施した実験では、ＮＴ２Ｎ細胞の予め凍結したアリコートをＣＮＳに移植する直前に解凍した。ラット脳へのＮＴ２Ｎ細胞の移植：成体（１７０〜２８０ｇ）雌Ｓｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙラットをケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）との腹腔内移植によって麻酔して、手術の準備をし、定位脳固定機器（Ｋｏｐｆ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）に入れた。新生仔（出生後５日目）雌Ｓｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙラットを、定位脳固定機器と手で支える１０ｍｌハミルトン注射器とを用いた、１半球へのＮＴ２Ｎ細胞の移植中に低体温法によって麻酔した。（５〜１０）ｘ１０⁴ＮＴ２Ｎ細胞のアリコートを成体及び新生仔のラットに移植した。成体ラットでは、各ラットの単一半球の１部位における大脳皮質、直下の白質又は海馬中に定位脳固定式にＮＴ２Ｎ細胞を移植した。この研究には、合計６８匹のラットを用いた（表１参照）。定位脳固定式移植部位はＰｅｌｌｅｇｒｉｎｏ等のシステムＢを用いて決定して（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ｌ．Ｔ．等，１９７９，「ラット脳の定位固定アトラス」，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ニューヨーク）、全ての移植はＮＴ２Ｎ細胞懸濁液２μｌを５分間にわたって移植することによって実施した。移植後に、針をさらに５分間その場に残し、その後に徐々に取り出した。移植前に、ＮＴ２Ｎ細胞の生存能力(viability)をトリパンブルー排除法を用いて顕微鏡検査によって監視した。移植操作が完了した後に、移植されない、残りのＮＴ２Ｎ細胞の生存能力を同様な操作を用いて監視した。ＮＴ２Ｎ細胞を移植した成体ラットのサブセット（Ｎ＝１３）を、それらの移植後生残期間にわたって、シクロスポリン（７〜１０ｍｇ／ｋｇ／日）の経口投与（Ｎ＝８；胃管を用いて）又は皮下投与（Ｎ＝５）によって毎日処置した。種々な移植後生残時間後に、ラットを深く麻酔し、リン酸塩緩衝化生理食塩水の灌流（赤血球と血清タンパク質との洗い落としのため）と、その後の７０％エタノール及び１５０ｍＭＮａＣｌの灌流とによって殺した。脳を取り出し、７０％エタノール及び１５０ｍＭＮａＣｌ中に一晩浸漬することによって固定した。移植後生残時間は、表１に要約するように、４日間〜２１週間の範囲であった。表１は移植に用いた成体ラット数と新生仔数（皮下及び経口のシクロスポリン処置をした及びしないの両方）並びに各ラット群の移植後生残時間に関するデータを要約する（左欄と中央欄）。生存能力のあるＮＴ２Ｎ移植片を有するラット数は最右欄に示す。皮下（ｓｃ）シクロスポリン処置したラット数は括弧内に示す。免疫組織化学的操作：組織処理方法と光学顕微鏡による免疫組織化学的分析方法とは周知である。ＮＴ２Ｎ移植片の免疫組織化学的特徴づけのために、抗体を用いた。ニューロン又はグリアの表現型の分子識別特性(molecular signature)として役立つことが判明しているニューロン及びグリアの細胞骨格タンパク質その他のポリペプチドに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を、ＮＴ２Ｎ移植片を同定し、特徴づけるために選択した。これらの抗体を詳細に特徴づけ、それらの性質を表２に要約する。詳しくは、表２はこの研究に用いた２７種類の抗体と、ラット脳に移植したＮＴ２Ｎ細胞とのそれらの反応性とを要約する。最左欄は第２欄に挙げた抗体によって認識されるポリペプチドを示す。第３欄は本明細書に適用するときの各抗体の希釈度又は免疫グロブリン濃度を示す。第４欄は抗体が移植ＮＴ２Ｎ細胞を染色するか否かを示す（十陽性；− 陰性；＋／− 弱い又は不明確な染色）。抗体は、それらが主として又は排他的に発現される細胞種類に応じて、類別する。表２の第１欄に用いる略号（アルファベット順）：ＧＦＡＰ＝グリア原繊維酸性タンパク質；ＭＡＰ２＝マクロチューブ関連タンパク質２；ＭＡＰ５＝マクロチューブ関連タンパク質５；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質；Ｎ−ＣＡＭ＝神経細胞接着分子；ＮＦ＝ニューロフィラメント；ＮＦ−Ｌ＝低分子量ＮＦタンパク質；ＮＦ−Ｍ＝中分子量ＮＦタンパク質；ＮＦ−Ｈ＝高分子量ＮＦタンパク質；ｐ７５ＮＧＦＲ＝低アフィニティ（７５ｋＤ）神経成長因子受容体；Ｐ^ind＝ＮＦ−Ｌ又はＮＦ−Ｈ中のリン酸塩独立性エピトープ；Ｐ^-＝ＮＦ−Ｈ又はＮＦ−Ｍ中の非ホスホリル化又は弱ホスホリル化エピトープ；Ｐ⁺＝ＮＦ−Ｈ中の中程度ホスホリル化エピトープ；Ｐ⁺⁺⁺＝ＮＦ−Ｈ中の高度ホスホリル化エピトープ；ＰＨＦ＝アルツハイマー病神経細繊維タングル中のペアードヘリカルフィラメントタウタンパク質に対する２抗体（すなわち、Ｔ３ＰとＰＨＦ１）が胎児タウと、ＰＨＦ（Ａ６８タンパク質としても知られる）中の異常ホスホリル化タウタンパク質（４４１アミノ酸長さタウタンパク質のナンバーリング系によってセリン番号３９６における）とを認識するが、正常な成体タウは認識しないことに注目のこと。また、抗ＣＦＡＰと抗マクロファージＭＡｂが、移植片に浸透した、偶発的な反応性星状膠細胞とマクロファージとをそれぞれ染色したが、ＮＴ２Ｎ細胞自体はこれらのＭＡｂによって染色されなかったことに注目のこと。結果モノクローナル抗体によるＮＴ２Ｎ移植片の特異的同定：図１Ａと図１Ｂとは、移植後４週間目の海馬（歯状回と多形細胞層）におけるＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を含む。図１ＡはＮＴ２Ｎ移植片のＣｒｅｓｙｌＶｉｏｌｅｔ染色切片の低倍率図を示す（矢印によって輪郭表示）。図１Ｂはヒト特異的抗Ｎ−ＣＡＭＭＡｂ（ＭＯＣｌ）によって染色した同じＮＴ２Ｎ移植片の低倍率図を示す。星印はＮＴ２Ｎニューロンの、細胞質と単純な樹状突起樹 (dendritic arbor)とを含む移植片部分の上方に存在し、矢印ヘッドは、移植片から発出して、ＣＡ３の錐体ニューロンの背側の苔状繊維経路に達する軸索を同定する。星印によって同定される領域を図１Ｃに高倍率で示し、中央矢印の下方にある移植片誘導軸索セグメントは図１Ｄに高倍率で示す。ＮＴ２Ｎニューロンとそれらの突起(processes)のみがこのＭＡｂによって染色されることに注目のこと。図１Ａと図１Ｂとは同じ倍率であり、図１Ａにおけるバーは１００μｍである。図１Ｃと図１Ｄとはヒト特異的抗Ｎ−ＣＡＭＭＡｂ（ＭＯＣｌ）によって染色したＮＴ２Ｎ移植片のより高い倍率図である。ＮＴ２Ｎニューロンとそれらの樹状突起の一部（図１Ｃ）並びにそれらの軸索（図１Ｄ）が染色されるが、内因的齧歯類Ｎ−ＣＡＭが染色されないことに注目のこと。図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｇ及び図１Ｈの顕微鏡写真は全て同じ倍率であり、図１Ｃにおけるバーは１００μｍであるが、図１Ｄと図１Ｅとはやや大きい倍率で撮影したものであり、図１Ｃにおけるバーは図１Ｄと図１Ｅとにおける２５μｍに相当する。図１Ｅと図１Ｆとは、それぞれ、図１Ｃ及び図１Ｄに図示した領域と同じ領域を示し、隣接切片において、弱ホスホリル化ＮＦ−Ｈ／Ｍに対するＭＡｂＲＨｄＯ２０によって染色され（図１Ｄ）、ＮＦ−Ｈの中程度ホスホリル化イソフォーム(isoform )に対するＭＡｂＨＯ１４によって染色されている（図１Ｆ）。図１Ｇは、内因的ラット軸索のみを染色し、ＲＭＯ２４がヒトＮＦ−Ｈも認識すると言う事実にも拘わらずＮＴ２Ｎ移植片（矢印）を染色しない、高ホスホリル化ＮＦ−Ｈに対するＭＡｂ（ＲＭＯ２４）によって得られた結果を示す。図１Ｈに示した切片は図１Ｆに示した切片に隣接し、これはＧＦＡＰに対するＭＡｂによって実証された。一部の反応性星状膠細胞は、ラット脳に移植された脊髄神経節移植片のコロニー化と同様に、移植片に浸透するが、大部分のＣＦＡＰ陽性反応性星状膠細胞は移植片を囲む。図１Ｂ〜図１Ｈの切片はヘマトキシリンによって軽度に対比染色した。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄは、移植後２〜４週間目のＣｒｅｓｙｌＶｉｏｌｅｔによって染色した（図２Ａ、図２Ｃ及び図２Ｄ）及びマクロファージに対してＭＡｂ（ＥＤｌ）によって染色した（図２Ｂ）、皮質下白質中（図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｄ）及び背側間脳中（図２Ｃ）の３種類のＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を示す。図２Ａと図２Ｂとは同じ移植片の隣接切片であり、矢印ヘッドは移植片（上方）と直下白質（下方）との界面を同定する。図２Ａと図２Ｂとは同じ倍率であり、図２Ａ中のバーは５０μｍである。図２Ｂの矢印は、限局性核崩壊を受けた幾つかのＮＴ２Ｎニューロンを含む移植片部分のＥＤｌ陽性マクロファージ(EDI positive macrophage)を同定する。移植片の縁（星印）における図２Ｃの血管の周囲（矢印）にはより広範囲な炎症が見られ、図２Ｄに示す他の皮質下白質ＮＴ２Ｎ移植片には、移植されたＮＴ２Ｎ細胞のより重度な核崩壊が見られ、図２Ｄでは矢印が核破片の蓄積を同定する。図２Ｃと図２Ｄは異なる倍率であり、図２Ａのバーは図２Ｃにおける１００μｍと、図２Ｄにおける３０ μｍとに相当する。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈは、ＭＡｂによって検出され、ヘマトキシリンによって対比染色された移植後４週間目の皮質下白質におけるＮＴ２Ｎ移植片の顕微鏡写真を含む。図３Ａに示す切片はヒト特異的抗ＮＦ−ＨＭＡｂ（ＨＯ１４）によって染色したものであり、図の右側にＮＴ２Ｎ移植片中の移植された細胞質とそれらの樹状突起とを示す。標識された軸索は移植片部位からこのパネルの左側までの中央に伸びる。これらの軸索が脳梁内の中線（星印）を横切ることに注目のこと。図３Ａに示す切片に隣接した切片である図３Ｂの切片は、ヒトＮ−ＣＡＭに対するＭＡｂ（ＭＯＣｌ）によって調べたものであり、このＭＡｂはこの図の右側に移植片中のＮＴ２Ｎ細胞の細胞体樹状突起(somatodendritic)ドメインと、脳梁内の左側に中線（星印）を横切る軸索とを染色する。図３Ａと図３Ｂとは同じ倍率であり、図３Ａ中のバーは１００μｍを表す。図３Ａと図３Ｂに見られる脳梁内の軸索は図３Ｃと図３Ｄとに、それぞれ、より大きい倍率で示す。これらの軸索（図３Ｃと図３Ｄにおける矢印）はＮＴ２Ｎ移植片の反対側の半球に、中線（図３Ｃと図３Ｄにおける星印）を横切る。図３Ｃと図３Ｄとは異なる倍率であり、図３Ｃにおけるバーは１００μｍであり、同じバーが図３Ｄでは５０μｍに相当する。図３Ｅでは、ＭＡＰ２に対するＭＡｂ（ＡＰ１４）が移植されたＮＴ２Ｎニューロンのソマト樹状ドメインを標識する。移植片の細胞体部(cell body mass)は星印によって同定され、上部(overlying)白質（ＷＭ）は染色されない。上部皮質内の内因的宿主ニューロンのソマト樹状ドメインもこの切片において標識され、この倍率では尖端樹状突起(apical dendrite)が最も顕著である。図３Ｅは図３Ａ及び図３Ｂと同じ倍率である。図３Ｆでは、高ホスホリル化ＮＦ−Ｈに対するＭＡｂ（ＲＨＯ２４）は移植片中のＮＴ２Ｎニューロン及びそれらの突起を染色しない（星印）。しかし、周囲白質（ＷＭ）中の内因的軸索はこのＭＡｂによって標識され、それによって、この移植片の細胞体部の範囲と樹状突起との輪郭を明確にする。図３Ｆのバーは１００μｍである。図３Ｇと図３Ｈとに示す２つの顕微鏡写真は抗ＮＦ−Ｌ抗血清によって（図３Ｇ）と、ＮＦ−Ｈの中程度ホスホリル化イソフォームに対するＭＡｂ（ＴＡ５１）によって（図３Ｈ）染色された、隣接切片におけるＮＴ２Ｎ移植片の高倍率図である。ＮＴ２Ｎニューロンの多くがそれらの細胞質と突起とにおいて免疫反応性ＮＦ−ＬとＮＦ−Ｈとを含む（それぞれ、図３Ｇと図３Ｈにおける矢印）ことに注目のこと。さらに、白質における内因的齧歯類軸索（図３Ｇと図３Ｈとの上部左）もこれらの抗体によって標識される。図３Ｇと図３Ｈとは同じ倍率であり、図３Ｆにおけるバーは図３Ｇと図３Ｈとにおける５０μｍに相当する。ＣｒｅｓｙｌＶｉｏｌｅｔによって染色された切片（図１Ａ）図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｄ）において移植片を認識することができるが、齧歯類ＣＮＳ中の移植ＮＴ２Ｎ細胞の同定は、ある一定のポリペプチド又はこれらのポリペプチドの一部に含まれるエピトープの、ヒト対ラット及び成熟対未成熟ＣＮＳニューロンへの限定を利用することによって非常に促進された。例えば、ＭＯＣｌ、ヒト神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はヒトＮＴ２Ｎニューロン中のＮ−ＣＡＭを認識するが、ラットＣＮＳ中のＮ−ＣＡＭを認識しないことが判明した（図１Ｂ〜図１Ｄ）。実際に、ＮＴ２Ｎ細胞の細胞学 (cytology)は、免疫組織化学を用いずに、ＮＴ２Ｎ細胞の認識を可能にするほど充分に特徴的ではない。さらに、ＮＴ２Ｎ移植片に由来する軸索は、それらを本明細書に述べるヒト特異的抗体によって標識する場合に初めて、移植片誘導されたと同定可能であった（図１Ｂ、図１Ｆ、図３Ａ〜図３Ｄ）。抗Ｎ−ＣＡＭＭＡｂの他に、移植ＮＴ２Ｎ細胞は、齧歯類ＣＮＳ中ではなく、ヒトＣＮＳ中及びＮＴ２Ｎ細胞中の中（ＮＦ−Ｍ）分子量（Ｍｒ）ニューロフィラメント（ＮＦ）サブユニットの中程度ホスホリル化イソフォームを認識する抗体、ＭＡｂＨＯ１４によっても特異的に同定することができた（図１Ｆ）。これとは対照的に、両方が、成熟ＣＮＳニューロンにのみ発現する高（ＮＦ−Ｈ）ＭｒＮＦサブユニットの最も重度にホスホリル化されたイソフォームに対するＭＡｂであるＲＭＯ２４（図１Ｇ）とＲＭＯ２１７とは、齧歯類ＣＮＳニューロン中のＮＦ−Ｈを免疫染色したが、これらのＭＡｂは本明細書で述べる移植片中のヒトＮＴ２Ｎ細胞を染色しなかった。ＲＭＯ２４とＲＭＯ２１７の両方は完全に成熟したヒトＣＮＳから抽出されたホスホリル化ＮＦ−Ｈを認識するので、これらのＭＡｂが移植されたＮＴ２Ｎ細胞を染色できないことは、移植ＮＴ２Ｎ細胞中のＮＦ−Ｈの不完全ホスホリル化（これらの移植ニューロンの不完全成熟を表す）を反映すると考えられる。ＮＴ２Ｎ細胞が免疫不全ヌードマウス脳中で長期間（すなわち、＞６か月）生存することができるならば、移植されたＮＴ２ＮニューロンはＮＦ −Ｈの最も重度にホスホリル化されたイソフォームを得て、これらの完全成熟移植ニューロンはＲＭＯ２４とＲＭＯ２１７によって標識される。しかし、移植ＮＴ２Ｎ細胞は＜４か月の移植後生存期間に関して本明細書で初めて研究され、ＲＭＯ２４とＲＭＯ２１７の両方はラットＣＮＳニューロンを強度に染色したが、移植ＮＴ２Ｎ細胞を染色せず、ＭＯＣｌとＨＯ１４とはＮＴ２Ｎ移植片を特異的にかつ強度に染色したが、ラットＣＮＳニューロン又は他のラットＣＮＳ細胞を染色しなかった。したがって、全体で４種のこれらのＭＡｂを用いて、生残するＮＴ２Ｎ移植片を特異的に同定するために、ＮＴ２Ｎ細胞の移植片を受容した全体で６８匹のラットからの切片を選別した。さらに、グリア原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するＭＡｂ（２．２Ｂ１０）は移植片を囲む反応性星状膠細胞を染色し（図１Ｈ）、このことはＮＴ２Ｎ移植片の範囲を明確にするためにも役立った。これらの反応性星状膠細胞の一部は、ラット脳に移植された反応性星状膠細胞による後根神経節移植片のコロニー化と同様に、ＮＴ２Ｎ移植片に浸透した（図１Ｈ）。ＭＡｂのこのパネルによって移植片部位を選別することは、ＮＴ２Ｎ細胞が軟膜中に又は、移植部位に背側の針トラック(needle track dorsal to the injection site)中に閉じ込められた小塊として存在する場合にも、移植されたＮＴ２Ｎ細胞を同定するための非常に効果的な方法を提供した。移植されたＮＴ２Ｎ細胞の生存：移植されたＮＴ２Ｎ細胞の殆ど全ては新皮質、直下白質及び海馬中に正確に注入されたが、間脳、側脳室中に又は、新皮質移植部位の上方の軟膜内にも若干のＮＴ２Ｎ細胞が検出された。移植ＮＴ２Ｎ細胞の数と性質(disposition)とはラットによって変化したが、ＮＴ２Ｎ移植片は、シクロスポリン処置なしに２週間まで生存した成体ラット（Ｎ＝５）及び新生仔ラット（Ｎ＝５）の１００％において免疫組織化学的に同定された（ＮＴ２Ｎ移植片生存に関するこれらのデータ及び下記データの要約に関しては表１を参照のこと）。生存可能なＮＴ２Ｎ移植片を有するラットのこの群は、予め凍結したＮＴ２Ｎ細胞のアリコートを移植された、シクロスポリン処置済み２ラットを含有した。次の移植後の生存期間をおいては、すなわち４週間目には、シクロスポリン処置しなかった、成体ラット１０／２４と新生仔ラット２／２とがＮＴ２Ｎ脳移植片を含有し（表１）、移植片のＮｉｓｓｌ染色標本において、移植された細胞の多くは形態学的かつ組織化学的に小星状(stellate)ニューロンに類似した。しかし、次の移植後の生存時間には、シクロスポリン処置しなかった、１９匹の成体ラット又は新生仔ラットの中の１匹のみが同定可能な、生存ＮＴ２Ｎニューロンを含有した。これらの所見は、移植されたＮＴ２Ｎ細胞によるＮ−ＣＡＭとＮＦタンパク質との停止(cessati on)よりもむしろＮＴ２Ｎ移植片の拒絶を表す。この結論は下記４理由に基づく：（１）移植後２週間程度では、生存可能な移植片の一部において細胞破片と共に炎症性細胞が検出され（図２Ｃ）、これらの炎症性細胞の多くはマクロファージ特異性ＥＤ１ＭＡｂによってマクロファージと同定された（図２Ｂ）；（２）シクロスポリンはこの薬物を皮下経路によって受容したラットにおける全てのＮＴ２Ｎ移植片の生存を延長した；（３）移植後２〜４週間目に移植片部位に最大数のマクロファージと炎症性細胞が浸透することが認められた；（４）免疫不全ヌードマウスでは、移植されたＮＴ２Ｎ細胞は＞１２か月生存し、Ｎ−ＣＡＭとＮＦタンパク質とを発現し続け、移植後１２か月までにこれらが完全な成熟ニューロン表現型を得るように徐々に成熟する。皮下シクロスポリンを受容した５ラット中で、５匹全てが移植後２〜１２週間の範囲である移植後時間に生存可能なＮＴ２Ｎ移植片を含有した。これに反して、同じ投与量（すなわち、７〜１０ｍｇ／ｋｇ）での胃管によるシクロスポリン投与は、このようにして処置された８ラット中の２匹のみが同定可能なＮＴ２Ｎ移植片を含有したにすぎなかったので（表１）、移植片拒絶の防止に効果的ではないように思われた。特に、これらのラットへのシクロスポリン投与は生存するＮＴ２Ｎ細胞がある範囲のニューロンポリペプチドを発現する能力に検出可能な影響を及ぼすようには思われなかった。移植されたＮＴ２Ｎ細胞の成熟と、ニューロン極性の確立：移植後２〜４週間生存したＮＴ２Ｎ移植片は、それらがインビボで徐々に成熟した結果として、連続切片(serial section)免疫組織化学的分析に対して最大にかつ最も敏感に反応したが、移植後４日から１週間まで生存したラットからは同定可能なＮＴ２Ｎ細胞を含有した、限られた数の切片が得られたに過ぎなかった。この理由から、移植後２〜４週間生存したラットの成熟状態とＮＴ２Ｎ細胞の極性とに研究を集中した。これらの時点において、海馬又は皮質下白質におけるＮＴ２Ｎ細微（恐らく皮質移植部位から上部の蜘蛛膜下空間へのＮＴ２Ｎ細胞の漏出のために、新皮質よりも大きいＮＴ２Ｎ細胞集団を矛盾なく含有した）は、決定的にＮＴ２Ｎ細胞をニューロンと同定する、幾つかの充分に特徴づけられたポリペプチド（例えば、ＮＦサブユニットと、他のニューロン細胞骨格タンパク質、シナプスポリペプチド）を発現した（図３Ａ〜３Ｅ、図３Ｇ）図３Ｈ及び表２を参照のこと）。しかし、これらのニューロンは、ＮＦ−Ｈの重度にホスホリル化されたイソフォームを得ることができなかった点で、成体ＣＮＳの完全成熟ニューロンではなく、後期胎児ヒト脊髄（すなわち、＞２５週間在胎齢）又は若い分娩後ヒト小脳（すなわち、＜１歳）ニューロンに類似した。これに反して、グリア細胞によって発現されたポリペプチドはこれらの移植片では稀であり、これらの移植片における稀なＧＦＡＰ陽性星状膠細胞の存在（図１Ｈ）は、移植片中への反応性ラット星状膠細胞の移行を明確に表す。生後４週間のＮＴ２Ｎニューロンは軸索を数ｍｍにわたって延ばし（図１Ｂ〜１Ｆ）、これらの軸索の一部は移植片部位とは反対側の半球に突出した（図３Ａ〜３Ｄ）。樹状突起は、ソマト樹状ドメイン（例えば、ＭＡＰ２）に限定された微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）に対する抗体によって標識されることができるので、容易に同定されたが、これらの樹状突起は短く、単純な分枝パターンを有した（図３Ｅ）。それにも拘わらず、インビボにおける明確なラット又はヒトのニューロンにおける対応物と同様に区画分けされたポリペプチドを含む、同定可能な軸索と樹状突起との存在（図１Ｂ〜１Ｆ、図３Ａ〜３Ｅ、図３Ｇ及び図３Ｈ）は、移植後４週間までに移植ＮＴ２Ｎニューロンが、インビボにおけるほぼ成熟したヒトＣＮＳニューロンに見られる分子表現型と構造極性とを得ていることを実証する。さらに、移植ＮＴ２Ｎ細胞のいずれも、ニューロン前駆細胞又は非常に未熟な（すなわち、“新生(nascent)”）ヒトＣＮＳニューロン中に見られるタンパク質（例えば、ナスチン、ビメンチン、ｐ７５ＮＧＦＲ）を発現しなかった。重要なことには、移植片拒絶によるニューロン変性の証拠（図２Ａ〜２Ｄ）にも拘わらず、移植片のいずれも通常の神経変性疾患に見られると同様なニューロン細胞骨格タンパク質異常の証拠を示さなかった。最後に、生存するＮＴ２Ｎ細胞が腫瘍性表現型に帰属する(reverted)ことを実証する証拠（例えば、有糸分裂、転移）は存在しなかった。この研究は、徐々に正常に成熟して、腫瘍形成の証拠なしに、宿主哺乳動物の脳に組み込まれることができる、クローナルヒトニューロン様の純粋な細胞集団のＣＮＳ移植片の性質を実証する。唯一の他のＣＮＳ細胞ライン（ヒトＨＣＮ− １ライン）が、このニューロン系統(neuronal Iineage)への排他的なインビトロ傾向(commitment)を示すように思われるが、この細胞ラインは実験動物の脳に移植されたときに安定なニューロン表現型を維持しなかった（Ｒｏｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｖ．等，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：６０３〜６０５）。移植に適したニューロン細胞ラインが不足していることは、移植されたニューロンのみに対するＣＮＳの免疫応答の研究を制限している。この報告は、ＮＴ２Ｎニューロンが、移植後約４週間までに拒絶を誘導する抗原を発現することができることを実証する。ＮＴ２Ｎ細胞におけるこれらの抗原の正確な性質はこの時点では不明であるが、ＮＴ２親細胞ラインに類似したヒト奇形癌細胞ラインは例えばＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ抗原と、β₂ミクログロブリンのような、主要な組織適合性抗原を発現することが判明している。さらに重要なことには、この研究は、移植されたＮＴ２Ｎニューロンがラット脳において部分的に(partial)ニューロン成熟することができることを実証する。ラット脳に移植されたＮＴ２Ｎ細胞は、Ｒｅｐｌａｔｅ３後２８日間まで培養中に維持された、それらのインビトロ対応物とほぼ同じ程度までに徐々に成熟した。しかし、これらは免疫不全ヌードマウス脳中で＞９〜１２か月間生存した移植ＮＴ２Ｎ細胞と同じ成熟度レベルに達しなかった。特に、ラット脳中のＮＴ２Ｎ移植片は移植後４週間までに、後期胎児脊髄又は未熟な、若い出生後小脳中の確実なヒトニューロンの成熟状態に相当する成熟レベルにまで進行した。これらは嗅覚ニューロン及びＣＮＳ髄芽細胞腫のニューロン様腫瘍細胞とは有意に異なる。しかし、移植され、培養されたＮＴ２Ｎ細胞は、一部の奇形癌及び多くの奇形腫中でその場で観察された、分化し、かなり成熟したニューロンに類似する。ここに述べる研究結果に基づくと、ＮＴ２Ｎ細胞の実験動物への移植は、ニューロンの発達的生物学と一部の神経障害において生ずる退行的神経変性現象との数種類の特有の研究に利用することができる。第一に、齧歯類の脳の種々な領域にＮＴ２Ｎ細胞を移植することによって、ニューロン成熟とニューロン極性発達とのプロセスを“再開始”できることは、これらの２種類の重要な、発達的に調節されるプロセスのモデルとして利用することができる。対照付き(controlled) 実験設定でこれらのプロセスを研究するために有効なヒトモデル系の入手可能性が、これらのプロセスを支配する調節機構を理解する試みを非常に容易にする筈である。このモデル系はまた、宿主の脳のミクロ環境が種々な神経解剖学的な部位に移植されたＮＴ２Ｎ細胞を誘導して、領域特異的な形態学的及び神経伝達物質の表現型を取らせる可能性を追及する機会を与えると考えられる。さらに、野生型の又は遺伝的に修飾されたＮＴ２Ｎ細胞を利用して、ヒト疾患、症状及び障害、特に神経系疾患の動物モデルを開発することができる。例えば、ＮＴ２Ｎ細胞は６９５アミノ酸長さアミロイド先駆体タンパク質（ＡＰＰ₆₉₅）を選択的に発現し、培地中にβ／Ａ４ペプチドを分泌する。それ故、移植後に細胞外スペースにＡＰＰ₆₉₅又はβ／Ａ４を放出する動物モデルを形成するために、野生型ＮＴ２Ｎ細胞、ＡＰＰ₆₉₅を過度に発現する(overexpress)ようにトランスフェクトしたＮＴ２Ｎ細胞、又はβ／Ａ４を過度に発現するようにトランスフェクトしたＮＴ２Ｎ細胞を移植することができる。アルツハイマー病の脳において生ずるβ／Ａ４ペプチド沈着をこのようにしてモデル化することができる。バイオアクティブ分子を産生するように遺伝的に操作されたＮＴ２Ｎ細胞の移植を利用して、ヒト神経変性疾患の治療のために血液−脳バリヤーを迂回する(c ircumvent)新規な方法を開発することができる。例えば、パーキンソン病の治療のための胎児中脳移植片を用いる最近の研究によって実証される治療的見込みに関して、パーキンソン病の治療に用いるためのドーパミン作動性表現型を得るようにＮＴ２Ｎ細胞を誘導してから移植することは、パーキンソン病に罹患していると疑われる個体の治療法であることができる。実施例２ β−ガラクトシダーゼのトランスフェクションと染色：ヒト奇形癌細胞ラインからの高度に精製したニューロン集団を米国特許第５，１７５，１０３号に記載の通りに得た。未分化であるときに、ＮＴ２細胞をＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮトランスフェクティング(transfecting)試薬（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いるリポフェクション (lipofection)によって、ＳＰＵＤ１１００μｇとｐＳＶ２ｎｅｏ１０μｇとでトランスフェクトした。ＳＰＵＤ１は、ＳＶ４０プロモーターを用いるβ− ガラクトシダーゼ発現ベクターであり、上流と下流にＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスＬＴＲ(long terminal repeat)を有する。完全培地中で２日間後に、トランスフェクタント(transfectant)をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）２００μｇ／ｍｌによって７日間選択した。リン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中の２％パラホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド中で固定した後に、細胞をＰＢＳ中のＸ−ｇａｌ１ｍｇ／ｍｌと、５ｍＭフェロシアン化カリウムと、５ｍＭフェリシアン化カリウムと、２ｍＭＭｇＣｌ₂とによってβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。β−ｇａｌ陽性培養物を２回サブクローン化し(s ubcloned)、これらのサブクローン(subclone)をさらに研究するために用いた。青色反応生成物とプロセス(process)との同時可視化を可能にするためにＨｏｆｆｍａｎモジュレーションコントラスト(modulation contrast)を用いて、細胞を撮影した。未分化細胞と有糸分裂後細胞との両方にβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）発現プラスミドが存在することが判明した。したがって、発現プラスミドの未分化細胞中へのトランスフェクションは外因的遺伝物質の細胞中への導入を可能にする。次に、細胞を安定な、有糸分裂後ヒトニューロンになるように誘導することができ、細胞は外因的遺伝物質を発現することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/27 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/36 Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/24 15/09 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．中枢神経系の疾患又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルを前記個体の脳に移植する工程を含む方法。２．前記ニューロンが分化したＮＴ２Ｎ細胞である、請求項１記載の方法。３．前記ニューロンが外因的遺伝物質によってトランスフェクトされたトランスフェクト済み分化ＮＴ２Ｎ細胞であり、トランスフェクト済み分化細胞が前記外因的遺伝物質のコーディング配列を発現して、タンパク質産物を産生する、請求項１記載の方法。４．前記外因的遺伝物質が神経伝達物質と、例えば神経成長因子、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びグリア誘導成長因子のような、神経栄養物質とから成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項３記載の方法。５．前記中枢神経系疾患又は障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチングトン病、発作及び神経損傷から成る群から選択される、請求項１記載の方法。６．少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルと、薬剤学的に受容される培地とを含む薬剤組成物。７．前記ニューロンが分化したＮＴ２Ｎ細胞である、請求項６記載の薬剤組成物。８．前記ニューロンが外因的遺伝物質によってトランスフェクトされたトランスフェクト済み分化ＮＴ２Ｎ細胞であり、トランスフェクト済み分化細胞が前記外因的遺伝物質のコーディング配列を発現して、タンパク質産物を産生する、請求項６記載の薬剤組成物。９．前記外因的遺伝物質が神経伝達物質（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）と、例えば神経成長因子、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びグリア誘導成長因子のような、神経栄養物質とから成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項６記載の薬剤組成物。１０．中枢神経系疾患又は障害の非ヒト動物モデルの作製方法であって、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルを前記非ヒト動物の脳に移植する工程を含む方法。１１．前記ニューロンがＮＴ２Ｎ細胞である、請求項１０記載の方法。１２．前記ニューロンが外因的遺伝物質によってトランスフェクトされたトランスフェクト済み分化ＮＴ２Ｎ細胞であり、トランスフェクト済み細胞が前記外因的遺伝物質のコーディング配列を発現して、タンパク質産物を産生する、請求項１０記載の方法。１３．前記外因的遺伝物質が正常及び突然変異アミロイド先駆体、キナーゼ、ホスファターゼ、正常及び突然変異スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロフィラメントタンパク質並びにアポリポタンパク質４から成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む請求項１０記載の方法。１４．前記疾患又は障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチングトン病、発作及び神経損傷から成る群から選択される、請求項１０記載の方法。１５．前記動物が齧歯類である請求項１０記載の方法。１６．前記動物が免疫適格齧歯類であり、前記細胞の移植前、中及び／後に前記齧歯類にシクロスポリンを投与する工程をさらに含む請求項１０記載の方法。１７．非ヒト動物の脳に移植された、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルを含む非ヒト動物。１８．前記ニューロンがＮＴ２Ｎ細胞である、請求項１７記載の非ヒト動物。１９．前記ニューロンが外因的遺伝物質によってトランスフェクトされたＮＴ２Ｎ細胞であり、トランスフェクト済み細胞が前記外因的遺伝物質のコーディング配列を発現して、タンパク質産物を産生する、請求項１７記載の非ヒト動物。２０．前記外因的遺伝物質が正常及び突然変異アミロイド先駆体、キナーゼ、ホスファターゼ、正常及び突然変異スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロフィラメントタンパク質並びにアポリポタンパク質４から成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む請求項１９記載の非ヒト動物。２１．神経損傷を特徴とする損傷、疾患又は障害に罹患していると疑われる個体の治療方法であって、少なくとも９５％の純度で、安定かつ均質な有糸分裂後ヒトニューロンの培養物からのサンプルを前記神経損傷の部位に又はこのような部位の近くに移植する工程を含む方法。２２．前記ニューロンが分化したＮＴ２Ｎ細胞である、請求項２１記載の非ヒト動物。２３．前記損傷が脊髄損傷であり、前記サンプルを前記個体の脊柱に移植する、請求項２１記載の方法。２４．前記損傷が運動ニューロンの損傷である、請求項１記載の方法。