KR100297899B1 - 세르톨리세포를이식함으로써정상소재의영양인자를생산하는방법및이러한세르톨리세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 영양 인자를 필요로 하는 포유동물의 조직 내로 정상소재의 영양 인자를 생산하는 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

신경변성 질환에 대한 신경회복 유도 세포로서의 세르톨리 세포 및 그를 포함하는 제약학적 조성물

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 일반적으로 세포이식 및 특히 중추신경계(CNS) 내로 이식한 후에 신경학적 및 신경변성 질환에 관련된 행동 및 기능 장애를 개선시키는 세포와 그를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

[발명의 배경]

예를들어 창상 치료와 같은 질병 치료에 있어서, 특히 조직 손상 영역을 국부적으로 영양 인자를 사용하여 치료하는 것이 전신 치료보다 유용할 때가 종종 있다.

또다른 예로서, 포유동물의 중추신경계(CNS) 내로 신경조직을 이식하는 것은 간질, 발작, 헌팅톤병, 두부 손상, 척추 손상, 동통, 파킨슨병, 마이엘린 결핍, 신경근육 질환, 신경통, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병, 및 뇌의 정동장애를 포함한 신경학적 및 신경변성 질환에 대한 대안 치료가 되고 있다. 잠복기 및 임상 데이타는, 신경변성 질환의 이러한 유형에 대한 세포 이식 프로토콜에 사용되는 이식 세포(이식편)과 숙주 조직과 함께 생존하고 통합되며 기능 회복을 제공함을 시사한다(Sanberg 등의 1994 참조).

이들 이식편의 1차 원천은 태아였다. 예를들어, 태아의 복측중뇌 조직은 파킨슨 병에 대한 생육가능한 이식편의 원천인 것으로 입증되었다(Lindvall 등의 1990 ; Bjoklund, 1992 참조). 마찬가지로, 태아의 선조체 조직은 헌팅톤병에 대한 이식편 물질로서 성공적으로 이용되었다(lsacson 등의 1986 ; Sanberg 등의 1994 참조).

신경학적 기능에 장애가 있는 동물은 비-태아 세포 및 비-신경 세포/조직으로 이식하였다. 예를들어, 성인 제공자로부터 수득한 크롬친화성 세포를 파킨슨병의 치료에 이용하였다. 이러한 형태의 이식 프로토콜의 주된 장점은, 이식원이 태아원이 아니므로 태아조직 수득에 관련된 윤리학적, 논리적 문제가 없다는 것이다. 크롬친화성 세포 프로토콜을 이용하면, 규격화된 행동이 관찰된다. 그러나, 이러한 행동 기능의 회복은 일시적이며 동물은 이식전 상태로 돌아간다(Bjorklund 및 Stenevi, 1985 ; Lindvall 등의 1987 참조). 파킨슨병 모델에 있어서 동물이 정상적인 행동의 활동도를 유지하도록 하는 데 이 프로토콜이 무력하므로, 이러한 프로토쿨의 임상 적용 뿐만 아니라 그외의 치료들은 시기 상조이다.

신경학적 및 신경변성 질환의 치료 방법으로서 성장 인자의 투여는 본 분야에서 주목되어 왔다. 그러나, 이러한 약물을 뇌로 수송하는 것은 아직도 성공적으로 그것을 극복하는 데 많은 어려움이 따른다. 일반적으로, 이들 약물은 전신투여될 수 없으며, 뇌로의 주입은 실행 불가능하고 불완전한 해결방법이다. 뇌 이식시에 특이한 하나의 영양인자를 수송하는 세포 조작이 제시되었으나, 뇌 이식시에 세포의 생존 및 안정한 트랜스펙션이 여전히 의심스럽다. 또한, 신경학적 및 신경변성 상태의 성공적인 치료에 일제히 작용하는 여러개의 영양 인자가 필요할 것이라는 인식이 증가하고 있다.

분리된 도 세포 및 세르톨리 세포를 이용한 새로운 치료 프로토콜을 사용하는 당뇨병 동물 모델에서 장기간 지속되는 기능 회복이 관찰되었다. 이러한 치료 효과는 세르톨리 세포의 존재, 부분적으로는 그들의 공지된 면역억압 분비 인자에서 기인한 것임이 명백하다(Selawry 및 Cameron, 1993; Cameron 등의 1990). 또한 세르톨리 세포는 다수의 중요한 영양 성장인자를 분비하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 손상된 조직을 원조하는 성장 인자 및 영양 인자가 유용할 경우에 질병에 대한 원으로서 세르톨리 세포만을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 예로는 신경변성 질환을 포함한 신경학적 질환 및 창상 치료가 포함된다. 영양 인자에 대한 정상소재의 생산공장으로서 작용하도록 하여 창상 치료를 촉진시키고 신경학적 및 신경변성 질환과 관련된 기능 및 행동장애를 개선시키는 데에 세르톨리 세포를 이용할 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 정상소재의 영양 인자를 분비하는 세르톨리 세포를 포유동물 내로 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 방법 및 상기 목적을 달성하기 위한 제약학적 조성물을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 다른 장점은 용이하게 평가될 수 있을 것이며, 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 관련하여 언급할 때 더 잘 이해될 것이다.

제1도는 이식전에 아포모르핀을 항원투여하였을 때 분 당 >7회전 또는 적어도 30분간 총 210회전(병변에 대하여 대측성)을 보이는 두 군의 동물의 아포모르핀-유도성 회전 동작 결과를 나타내는 그래프로서, 배지만을 투여한 동물은 이식후에도 계속 상당한 회전을 보이는 반면에 세르톨리 세포를 투여한 동물은 이식 후에 회전 동작에 있어서 현저한 감소(60% 이상)를 보였다;

제2도는 상승된 신체 스윙 실험에 의해 나타낸 바와 같이 >80% 편향된 스윙 활동도(병변에 대하여 대측성)를 보이는 두 군의 동물의 편향된 스윙 동작을 나타내는 그래프로서, 배지만을 투여한 동물은 이식후에도 계속 상당히 편향된 스윙 활동도를 보이는 반면에 세르톨리 세포를 투여한 동물은 이식후에 조금의 편향된 스윙 동작도 나타내지 않았다;

제3(a)-(c)도는 대조 배지(CM) 또는 세르톨리 세포 전-조정 배지(SCM)에서 7일 동안 배양하여 분리한 태아 랫의 복측 중뇌(VM)세포를 나타내는 광학 현미경사진으로 암시야에서 간섭 대조 광학으로 촬영한 것이다. 제3(a)도는 자극이나 분화의 흔적을 보이지 않는 CM에서 배양한 VM세포를 나타낸 것이며, 제3(b)도는 SCM에서 배양한 VM 세포로서 매우 자극된 상태를 보이며, 제3(c)도는 세르톨리 세포가 영양 인자를 분비함으로써 영양 성장을 보이는, SCM에서 배양한 VM 세포를 고배율로 나타낸 것이다;

제4(a)도는 세르톨리 세포의 이식 부위 및 침투관(화살표)이 나타나 있는 뇌 선조체를 보여주는 전자 현미경사진이며, 제4(b)도는 제4(a)도에 나타나 있는 상자 부위를 고배율, 고해상도로 나타낸 전자 현미경사진으로서 세르톨리 세포(화살표)는 이식전에 세포내로 가한 1μ라텍스주 세포함유물 때문에 용이하게 확인된다;

제5(a)-(b)도는 뇌 선조체 내로 이식하기 전에 형광 표식(DiI)으로 표지한 정상소재의 이식 세르톨리 세포를 나타내는 두 장의 광학 현미경사진으로, 제5(a)도는 사이클로스포린 A로 면역억압 치료를 하지 않은 랫 숙주에서 생존가능한 형광 세르톨리 세포를 나타낸 것이고, 제5(b)도는 사이클로스포린 A 면역억압 치료를 실시한 랫 숙주에서 생존가능한 형광 세르톨리 세포를 나타낸 것이다.

[발명의 상세한 설명]

일반적으로, 본 발명은 영양 인자로 간주되는 세르톨리 세포-유도성장 인자 및 조절 인자의 정상소재 생산을 포함한 메카니즘에 의해 기능장애 조직의 복구, 보호 및 원조를 촉진시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 정상소재의 영양 인자 산물의 생산방법을 제공한다. 이것은 정상소재의 영양 인자를 분비하는 세포인 분리된 세르톨리 세포를 포유동물 내로 이식함으로써 이루어지며, 따라서 본 발명은 세르톨리 세포 및 제약학적 용인가능한 담체로 구성되는 제약학적 조성물 또한 제공한다.

영양 인자 생산에 대한 정상소재의 생산공장으로서 세르톨리 세포를 사용하는 것의 중요한 잇점은, 세르톨리 세포가 효율적인 면역억압 효과를 갖는 것으로 나타났다는 것이다. 따라서, 면역억압을 일으키는 부수적인 치료를 필요로 하지 않는다. 즉, 세르톨리 세포는 국부적인 자기-유도 면역억압 효과를 제공하는 한편 영양 인자원으로도 사용될 수 있다.

세르톨리 세포에 의해 분비되는 영양 인자는 인슐린-유사 성장 인자 Ⅰ 및 Ⅱ, 상피 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α및 β, 및 인터루킨 1α와 같은 세르톨리 세포-유도 성장 인자와 조절 인자를 포함한다(Griswold, 1992 참조). 보다 광범위한 세르톨리 세포 분비 인자는 표 1에 나타나 있다. 이러한 인자는 신경변성 질환에 관련된 행동 및 기능 장애에 대한효과를 개선시키는 것으로 나타났다. 이들 인자는 정상 세포 및 조직 대사와 기능을 원조하는 영양 인자로 잘 알려져 있다(Griswold, 1992 참조). 본 발명은 세르톨리 세포가 세포 기능장애 또는 세포/조직 손상 부위에서 영양이 풍부한 성장-원조 유동성 미시환경을 생산할 수 있다는 현상을 이용하였다. 세포/조직 손상은 방사선 손상, 화상 및 창상을 포함하나이것으로 한정되지는 않는다. 당뇨병 모델에 사용된 세르톨리 세포/도 세포 이식 프로토콜과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 오직 한 형태의 세포, 즉 세르톨리 세포를 사용함으로써 하나의 숙주 부위에 서로 다른 두 세포 형태를 이식하려는 시도에 있어서 논리적인 절차상의 근본적인 문제를 상당히 해결할 수 있다.

하기 실시예에서는 랫의 세르톨리 세포를 사용하지만, 모든 적당한 원으로부터의 세르톨리 세포가 이용될 수 있다. 예를들어, 인체 세르톨리 세포는 인체 이식에 사용될 것이다. 또한, 본 발명의 바람직한 실시형태에서 돼지의 세르톨리 세포는 인체와 같은 포유 동물 내로 이식될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 수의학적 용도는 주목할만하며 이형적인 세르톨리 세포는 바람직한 포유동물 숙주내로의 이식에 대해 선택적일 것이다.

하기 실험 부분에서 설명되는 바와 같이, 본 발명은 헌팅톤병 및 파킨슨병과 같은 신경변성 질환과 관련된 행동 및 기능장애를 개선하기 위한 치료법으로 이용될 수 있다. 이것은 앞서 사용된 사이클로스포린 A의 만성적 사용과 같은 면역억압 보조 치료에 따른 부작용 없이 이루어질 수 있다. 세르톨리 세포는 영양 인자의 분비 및 면역억압 효과 둘 다를 제공한다.

하기 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 뇌 병변 유도나 형성에 앞선 세르톨리 세포의 이식은 신경보호 효과를 제공할 수 있다. 예를들어, 아래에 설명한 바와 같이 헌팅톤병의 유발 전에 세르톨리 세포를 이식하면 그 이후의 뇌 병변에 대한 신경보호 및 예방 효과 둘 다를 거두었다. 따라서, 신경변성 질환의 진단 후 초기에 세르톨리 세포를 이식하면 질병의 치료, 예방 또는 경감에 유용할 것이다. 또한, 세르톨리 세포는 CNS 손상의 영향을 치료, 예방 및/또는 예방 차원으로 경감시키기 위하여 두부 손상과 같은 다른 유형의 CNS 외상에 대해 이식될 수 있다.

하기 실시예는 신경변성 질환과 관련된 행동 장애를 개선시키는 본 발명의 능력을 설명하고 있다.

[실시예1]

[세르톨리 세포 이식]

[특정 프로토콜]

프로토콜은 일반적으로 두 기본 단계, (1) 세르톨리 세포의 분리 및 (2) 세포 이식을 포함하는데, 두 단계는 아래에 간단히 기술되어 있으며 세포 분리에 관한 보다 상세한 설명은 Selawry 및 Cameron의 (1993) 문헌을 참조하고 세포 이식에 대하여는 Pakzaben 등의 (1993) 문헌을 참조하라. 상기 두 문헌은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용하였다.

(1A) 세르톨리 세포의 분리

분리 과정은 Selawry 및 Cameron (1993)의 잘 규정된 방법을 따르며 전형적으로 이용된다. 모든 분리 단계 및 세포 배양에 이용된 세포 배양 배지는 레티놀, ITS 및 황산젠타미이신을 보충한 DMEM: 햄의 F12 였다(Cameron 및 Muffily, 1991 참조). 생후 16일된 숫컷의 스프래그-돌레이 랫의 고환을 외과수술로 취하였다. 세르톨리 세포로부터 다른 고환 세포 형태를 분리하기 위해 고환을 피막박리하여 효소적 절개를 준비하였다. 효소 과정에는 많은 세포 분리 프로토콜에 사용되는 전형적인 절차인 콜라게나제(0.1%), 히알루로니다제(0.1%) 및 트립신(0.25%)을 사용하였다. 연속적인 효소 절개 후, 세르톨리 세포 분리물을 배양 배지로 세척하여 멸균 배양기에 옮긴 다음 5% CO₂-95% 공기 가습 조직 배양 항온기에 두었다. 39℃ 항온기에서 미리 48시간 항온후에, 세르톨리 세포를 세척하여 모든 오염 물질을 제거하였다. 그 결과 생성된 세르톨리 세포-풍부 분획을 0.25ml의 DMEM/F12 배지에 재현탁하고, 37℃에서 최소한 24시간 동안 배양하였다.

세르톨리 세포를 트립신으로 용기 바닥에서 유리시키고 멸균된 코니칼 시험관에 옮긴 다음 원심분리에 의한 세척과 트립신 저해제로의 처리를 반복하여 트립신의 효소작용을 정지시켰다. 이식 기간 중에, 세르톨리 세포-풍부 분획을 재현탁하여 20 게이지의 주사바늘이 달린 해밀턴 주사기를 이용하여 빨아들였다.

(1B) 세르톨리 세포의 분리 및 전처리

택일적으로, 전기한 바와 같이(Cameron 등의 1987a; Cameron 등의 1987b) 0.25% 트립신(시그마에서 구입) 및 0.1% 콜라게나제(시그마에서 구입, 유형 V)를 이용하여 피막박리한 랫의 고환을 37℃에서 연속적으로 효소처리하였다(Cameron 등의1987a; Cameron 등의 1987b 참조). 그 결과 생성된 세르톨리 세포 집합체를 75㎠ 조직 배양 플라스크(코스타에서 구입)내20ml 부피의 배양 배지에 등분하여 분포시켰다. 오염된 생식 세포를 제거하기 위해 1분간 멸균된 0.5mM 트리스-HCl 완충액으로 세포를 저장 처리한 후(Galdieri 등의 1981 참조), 평판화된 세르톨리 집합체를 48시간 동안 5% CO2-95% 공기에서39℃로 항온하였다. 배양 배지로 2회 세척한 다음, 20ml의 배양 배지로 플라스크를 채우고 37℃의 5% CO₂-95% 공기 5% CO₂-주입 항온기로 되돌려 놓았다. 그 결과 생성된 전처리 세르톨리-풍부 개체배양액은 95% 이상의 세르톨리 세포를 포함하였다. 평판 밀도 ( 2.0×106 세르톨리/㎠)가 세포의 전면 단층 결과 수치는 아니었다.

(2) 세포 이식

이식 프로토콜은 앞서 Pakzaban 등의 1993 문헌에 기술된 과정을 따른다. 동물의 수술은 멸균 상태에서 실시하였다. 처음에 모든 동물은 0.60ml/kg의 펜토바비탈 나트륨으로 마취시켜 코프 입체정위 기구(a Koph stereotaxic instrument)에 두었다. 편측성 선조체 이식은 동등한 세트에서 실시하였다 : 전후방향= +1.2, 중외측= +/- 2.8, 배복방향=6.0, 5.9 및 5.8(Paxinos 및 Watson, 1984의 도해서에 근거함). 손상된 흑질과 동측성인 선조체를 세르톨리 세포로 이식하였다. 각 선조체에 총 3μl 부피의 세르톨리 세포 현탁액을 가하였다. 1μl의 세르톨리 세포 현탁액을 배복 부위에 1분 이상씩 주입하였다. 대조에는 배지만 가하였다. 바늘을 빼기 전에 최종 배복 부위에 이르도록 5분 더 두었다. 수술 후, 동물이 회복되도록 전기 담요위에 두었다. 수술 직후 및 이식일에 사이클로스포린 -A(20mg/kg/일, 복강내 투여)를 동물에게 이용하여 단기간의 면역억압이 되도록 하였다. 그러나 계속적인 연구로 이러한 단기간의 사이클로스포린 -A가 불필요함이 입증되었다(제5(a)-(b)도 참조).

세르톨리 세포는 예를들어 파킨슨병으로 설명한 바와 같이 특정 질병에 대하여 동등하게 규정된 입체정위에 의해 다양한 신경변성 질환의 동물 모델내로 이식되며, 그 동물 모델에 특이한 기술에 의해 기능회복에 대한 전신 검정이 이루어진다.

본 연구는 6-OHDA-유도성 반신불수(n=12)인 8주된 숫컷의 스프래그-돌레이 랫을 사용하였다. 병변 후 3주째에, 아포 모르핀-유도성 회전 동작 및 스윙 동작을 포함한 동물의 행동 실험을 실시하였다. 베이스라인 데이타는 이들 모든 동물에서 상당한 아포모르핀-유도성 회전 동작(CNS의 병변측에 대해 대측성)을 보였다(30분간 적어도 200회). 또한 상승된 신체 스윙 실험(elevated body swing test, EBST)을 이용하여, 상당한 우편향(right-biased) 스윙 활동도(70% 이상)가 기록되었다.

병변 후 3주째에, 일 군의 동물(n=6)에게 세르톨리 세포를 투여하였고 일 군에게는 대조로서 배지(혈청이 없는 DMEM)만을 투여한 것을 제외하고는 동일한 수술을 실시하였다. 모든 동물에게 이식 후 처음 이틀째에 사이클로스포린(20mg/kg)을 투여하였다. 이식 후 한 달, 한 달 반 및 두 달째에, 동물에 대해 동일한 동작 실험을 다시 실시하였다.

세르톨리 세포를 투여한 동물은 회전에 있어서 상당한 감소를 보인 반면에(30분간 평균 50회), 배지만을 투여한 동물은 이식전의 회전 수준이었다(제1도 참조). 회전 동작의 정규화는 두 달 동안의 실험 기간에 걸쳐 지속되었다. 세르톨리 세포 이식 동물이 앞서 나타낸 우편향 스윙 활동도 또한 이식후 실험 기간 중에 상당히 감소하였다(제2도 참조). 배지를 투여한 동물은 우편향 스윙 반응에 별다른 감소를 보이지 않았다.

해부시에, 동물의 뇌를 떼어 내고 40-80㎛씩 비브라톰 섹션(vibratom sectioning)에 대해 고정시켰다. 염색 후, 세르톨리 세포를 이식시키지 않은 병변 동물내의 침투 부위와 비교해 볼 때 세르톨리 세포 이식 랫의 침투 부위(즉, 병변 부위)에서 활성화된 신경교 세포가 현저히 감소하였다.

[실시예 2]

[신경 세포의 성장]

[배양 배지 및 세르톨리 세포 전-조정 배지]

세르톨리 세포 배양 및 공동 배양에 사용한 배양 배지는 1:1로 혼합된 둘베코 최소 필수 배지 : 햄의 F12 영양 배지(웨테이커 바이오프로덕츠에서 구입)이며, 3mg/ml의 L-글루타민(시그마에서 구입, Ⅲ 등급), 0.01cc/ml의 인슐린-트란스페린-셀렌(ITS, 콜라보라티브 리서치, 인코포레이티드에서 구입), 50ng/ml 레티놀(시그마에서 구입), 19μl/ml의 락트산(시그마에서 구입) 및 0.01cc/ml의 황산젠타마이신(깁코에서 구입)을 보충하였다.

분리된 세르톨리 세포의 초기 48시간 배양 후, 배지를 모아 1500rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 모아 즉각 멸균시험관에서 동결시켰다. 이 배지는 세르톨리 전-조정 배지(SCM)로 간주하였다.

[태아 뇌 세포의 분리 및 배양]

태아 랫(임신 15-17일)의 복측 중뇌로부터 태아 뇌 세포(FBC)를 모았다. 태아 뇌 조직을 배지에 현탁하고 연속적으로 크기가 감소하는 일련의 피하주사침(18-26게이지)에 의해 초기에 분산시켰다. 그 결과 생성된 현탁액을 0.1% 트립신으로 5분간 처리한 후 0.1% 트립신 저해제로 2분간 처리하였다. 현탁시킨 FBC를 3회 세척하고 배양 배지에 재현탁한 다음 폴리-L-리신-코팅한 배양기에 도말하였다.

태아 랫의 복측 중뇌(VM) 세포를 분리하여 제3(a)도에 나타나 있는 바와 같이 대조 배지(CM) 또는 세르톨리 세포 전-조정배지(SCM)에서 7일 동안 배양하였다. CM에서 배양한 VM 세포는 세포 자극이나 분화의 징후를 보이지 않았다. 제3(b)도를참조하여, SCM에서 배양한 VM 세포는 고도로 자극되었다. 제3(c)도는 SCM에서 배양한 VM 세포가 세르톨리 세포 분비 영양인자에 대한 반응으로 영양 생장함을 고배율로 나타낸 것이다.

[실시예 3]

[세르톨리 세포의 확인]

[라텍스주(latex bead)의 삽입]

세르톨리 세포를 기술한 바와 같이 분리하여 배양하였다. 이식전에(대략 12시간), 멸균한 1㎛의 라텍스주(10μl/ml 배지 ; 미국 캘리포니아 투스틴 소재 펠코에서 구입)를 배양 배지에 가하였다. 세르톨리 세포는 신속하게 주(bead)를 식작용하였다. 이식 직전에, 주상의 세르톨리 세포를 3회 세척하고 1ml의 배양 배지에 재현탁하였다.

제4(a)도에서는, 세르톨리 세포를 뇌의 선조체내로 이식하였는데 여기에서 침투관(화살표) 및 세르톨리 세포 이식 부위가 나타나 있다. 제4(b)도에 나타나 있는 바와 같이 고배율에서는, 이식 전에 세르톨리 세포내로 부하되는 1μ 라텍스주를 함유하므로 세르톨리 세포(화살표)를 쉽게 확인하였다.

[실시예4]

[이식한 세르톨리 세포의 생존에 대한 사이클로스포린 A(CAS)의 효과]

[형광 세포 표지]

이식 직전에(대략 2시간), 세포 궤적(cell tracking)을 위해 CM-DiI 형광 염료(100μl저장액/ml 배지; 미국 오리건 유진 소재 몰레큘라 프로브즈, 인코포레이티드에서 구입)로 37℃에서 7분간 처리한 다음 4℃에서 15분간 더 두었다. 형광 "표지된" 세르톨리 세포를 3회 세척하고 1ml의 배양 배지에 재현탁하였다.

정상소재의 이식된 세르톨리 세포의 생존에 대한 사이클로스포린 A의 효과를 실험하였다. 뇌의 선조체 내로 이식시키기 전에, 이식 세르톨리 세포를 형광 표식(DiI)으로 표지하였다. 이식한지 한달 후에 조직을 모았다. 제5(a)도에서는, 사이클로스포린 A로 면역억압 치료를 하지 않은 랫 숙주에서 생존가능한 형광 세르톨리 세포가 관찰되었다. 제5(b)도에서는, 사이클로스포린 A 면역억압 치료를 실시한 랫 숙주에서 생존가능한 형광 세르톨리 세포가 관찰된다. 이 실험은 사이클로스포린 A가 뇌로 이식되는 세르톨리 세포의 생존에 필요하지 않음을 입증한다.

[실시예 5]

[세르톨리 세포의 예방 효과]

세르톨리 세포의 이식은 뇌 병변 유도 전에 이식하였을 때 신경방어적이다. 이러한 세르톨리 세포의 예방 효과는 헌팅톤병(HD)에 대한 동물 모델에서 입증되었다. 이 모델은 미토콘드리아 저해제인 3-니트로프로프론산(3NP)의 전신 투여에 의해 생산한다. 3NP 주입이 선조체내에 헌팅톤병에서 나타나는 병리와 흡사한 특이 병변을 일으키는 것으로 Sanberg 및 그의 동료(Koutouzis 등의 1994; Borlongan 등의 1995) 및 그외의 사람들이 증명하였다.

본 실험에서는, 정상적인 랫의 한 쪽 선조체에 일측으로 랫의 세르톨리 세포를 8마리의 랫에게 이식하였다(전기한 바와같이). 따라서, 뇌의 한편에는 세르톨리 세포가 있고 다른 편에는 없었다.

한달 후,(Koutouzis 등의 1994 ; Borlongan 등의 1995) 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 동물에게 3NP를 주입하여 HD를유발시켰다. 3NP 주입시에 정상 랫은 뇌 선조체의 양측이 손상되고 몸체의 양편에 동일하게 행동 장애가 있다(Koutouzis등의 1994; borlongan 등의 1995 참조).

3NP 투여 한달 후, 동물은 일측성 행동 장애를 보였다. 이것은 대조에서가 아닌 세르톨리 이식 동물에서 병변 후 아포모르핀-유도 회전 실험에 의해 관찰하였다(회전 수 : 대조=0.25± 6 ; 세르톨리 이식=197± 31.9,P.0001). 이러한 비대칭 회전동작은 세르톨리 세포를 이식하지 않은 쪽의 뇌에 병변을 암시하는 것이었다. 따라서, 영양 메카니즘에 대하여 세르톨리세포 이식은 그 후에 일어나는 뇌 병변에 대한 신경방어 및 예방효과를 갖는다. 이것은, 심각하게 손상되기 전인 신경변성 질환 초기 치료에도 세르톨리 이식이 유용하다는 증거를 제공한다.

함께 도출한 이러한 결과는 세르톨리 세포가 파킨슨병 및 헌팅톤병 동물 모델의 행동 및 기능적 결함을 개선시킴을 보여준다. 관련 메카니즘은 실시예 2에서 신경원 조직의 성장에 의해 설명한 바와 같이, 관련된 신경 조직의 지속적인 원조와 회복을 촉진시키는 조절 인자 및 세르톨리 세포-유도 성장 인자의 분비일 것이다. 또한, 세르톨리 세포는 병변 부위에서 신경교 세포 활성화를 억제함으로써 뇌의 신경 조직 회복을 보호하고 촉진시킬 수 있다. 또한 이러한 결과는 정상소재의 이식된 세르톨리 세포의 생존성을 입증한다.

본 출원의 전체에 걸쳐 많은 간행물을 인용구 또는 번호로 언급하였다. 간행물에 대한 완전한 인용문은 아래에 열거한다. 본 출원에 속하는 기술 양상을 보다 충분히 설명하기 위해, 이들 간행물의 설명서 전체를 본원에서 참고문헌으로 인용한다.

본 발명은 설명 형식으로 기술하였으며, 사용한 용어는 제한적이기 보다는 기술의 성질을 나타내고자 한 것으로 인지된다.

명백하게, 상기 지침에 비추어 본 발명의 다양한 변형 및 수정이 가능하다. 따라서, 첨부한 특허청구 범위의 범주내에서 상세한 설명과는 달리 본 발명을 실시할 수 있을 것으로 인지된다.

[표 1]

Claims (16)

1. 인체를 제외한 포유동물의 중추신경계 내로 정상소재의 영양 인자를 생산하는 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자를 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 인체를 제외한 포유동물은 신경변성 질환을 포함한 신경학적 질환을 앓으며, 상기 방법은 질환으로 야기되는 행동 장애 및 기능 장애를 분비된 영양 인자의 작용에 의해 개선하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 생산방법.
3. 제1항에 있어서, 세르톨리 세포는 돼지의 세르톨리 세포임을 특징으로 하는 생산방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 이식 단계는 변성 질환으로부터 중추신경계를 보호하는 것으로 더 한정함을 특징으로 하는 생산방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 이식 단계는 손상된 중추신경계 조직을 회복시키는 것으로 더 한정함을 특징으로 하는 생산방법.
6. 제2항에 있어서, 신경학적 질환 또는 신경변성 질환은 간질, 발작, 헌팅톤병, 두부 손상, 척추 손상, 동통, 파킨슨병, 마이엘린 결핍, 신경근 질환, 신경통, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병 및 뇌의 정동장애를 포함함을 특징으로 하는 생산방법.
7. 간질 발작, 헌팅톤병, 두부 손상, 척추 손상, 동통, 파킨슨병, 마이엘린 결핍, 신경근, 질환, 신경통, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병 및 뇌의 정동장애를 포함한 신경학적 질환을 치료하기 위해, 인체를 제외한 피실험자의 중추신경계 내로 정상소재의 영양 인자를 분비하는 돼지의 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 방법.
8. 인체를 제외한 피실험자의 조직 손상 영역 내로 정상소재의 영양인자를 분비하는 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 방법.
9. 간질, 발작, 헌팅톤병, 두부 손상, 척추 손상, 동통, 파킨슨병, 마이엘린 결핍, 신경근 질환, 신경통, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병 및 뇌의 정동장애를 포함하는 신경학적 질환을 치료하기 위해, 정상소재의 영양 인자를 분비하는 돼지의 세르톨리 세포를 피실험자의 중추신경계 내로 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 데에 유용한 세르톨리 세포.
10. 제9항에 있어서, 피실험자의 인체임을 특징으로 하는 정상소재의 영양 인자 산물 생산에 유용한 세르톨리 세포.
11. 피실험자의 조직 손상 영역 내로 정상소재의 영양 인자를 분비하는 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자 산물을 생산하는 데에 유용한 세르톨리 세포.
12. 신경변성 질환을 포함한 신경학적 질환으로 야기되는 행동 장애 및 기능 장애를 선시키기 위하여 피실험자의 중추신경계 내로 세르톨리 세포를 이식함으로써 정상소재의 영양 인자를 생산하는, 세르톨리 세포 및 제약학적으로 용인가능한 담체로 이루어지는 제약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, 세르톨리 세포는 돼지의 세르톨리 세포임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
14. 제12항에 있어서, 상기 이식은 변성 질환으로부터 중추신경계를 보호하는 것으로 더 한정함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
15. 제12항에 있어서, 상기 이식은 손상된 중추신경계 조직을 회복시키는 것으로 더 한정함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
16. 제12항에 있어서, 신경학적 질환 또는 신경변성 질환은 간질, 발작, 헌팅톤병, 두부 손상, 척추 손상, 동통, 파킨슨병, 마이엘린 결핍, 신경근 질환, 신경통, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병 및 뇌의 정동장애를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.

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