JP2003521935A - 骨髄細胞のニューロン細胞への分化およびそのための使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は骨髄間質細胞をニューロン分化−誘導化合物と接触させることによる哺乳動物骨髄間質細胞のニューロン細胞への分化を誘導する方法に関する。本発明のニューロン分化−誘導化合物は抗剤、例えば限定されないがベータ−メルカプトエタノール、ジメチルスルホキシド、ブチル化されたヒドロキシアニソール、ブチル化されたヒドロキシトルエン、アスコルビン酸、フマル酸ジメチルおよびｎ−アセチルシステインを包含する。ニューロン細胞への分化が誘導されると、細胞を中枢神経系の疾病、障害、または症状の処置用細胞療法、遺伝子療法、または両者のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 自己−再生を受けながら正常な交替および修復に関係する成体の哺乳動物で複
数の組織内で多能性幹細胞が検出されていた（Hay, 1966, Regeneration, Holt, Rinehart and Winston, New York; McKay, 1999, Nature Med. 5:261-262; Lem iscka, 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 872:274-288; Owens and Friedenstein, 1 988, Ciba Foundation Syp. 136, Chichester, U.K. pp.42-60; Prockop, 1997, Science 276:71-74; Ferrari et al., 1998, Science 279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad . Sci. USA 92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97 :561-570; Majumdar et al., 1998, J. Cell Physiol. 176:57-66; Pittenger e t al., 1999, Science 284:143-147）。骨髄幹細胞のサブクラスは、インビトロ
で骨形成性、軟骨形成性、脂肪生成性および他の間葉系統への分化が可能な１種
の基本型である（Owens and Friedenstein, 1988, Ciba Foundation Symp. 136, Chichester, U.K. pp.42-60; Prockop, 1997, Science 276; 71-74; Ferrari e t al., 1998, Science 279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641- 650; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861; Kuzn etsov et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561-570; Majumdar et al., 19 98, J. Cell. Physiol. 176:57-66; Pittenger et al, 1999, Science 284:143- 147）。これらの多能性細胞は骨髄間質細胞（ＭＳＣ類）と称され、そして最近
では骨形成不全症を処置するために臨床的に使用されてきている（Horwitz et a l., 1999, Nature Med. 5:309-313）。

【０００２】 脳は再生不可能であると長いこと考えられていたため、中枢神経系（ＣＮＳ）
中の幹細胞集団の最近の発見は強い関心を引き起こした（Reynolds and Weiss, 1992, Science 255:1707-1710; Richards et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 89:8591-8595; Morshead et al., 1994, Neuron 13:1071-1082）。神経
幹細胞（ＮＳＣ類）はインビトロで膨張並びにニューロン、星状細胞および乏突
起膠細胞への分化を受けうる（Reynolds an Weiss, 1992, Science 255:1707-17 10; Johansson et al., 1999, Cell 96:25-34; Gage et al., 1995, Annu. Rev. Neurosci. 18:159-192; Vescovi et al., 1993, Neuron 11:951-966）。成体齧
歯動物の脳内に移植されて戻されたＮＳＣ類は生存しそしてニューロンおよびグ
リアに分化して、治療能力の可能性を高める（Lundberg et al., 1997, Exp. Ne urol. 145:342-360; Lundberg et al., 1996, Brain Res. 737:295-300; Renfra nz et al., 1991, Cell 66:713-729; Flax et al, 1998, Nature Biotech. 16:1 033-1039; Gage et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11879-11883; Svendsen et al., 1997, Exp. Neurol. 148:135-146）。しかしながら、脳内の
深部にあるＮＳＣ類の到達しがたいことが臨床的な利用を大きく制限している。
ＮＳＣ類がインビボで造血細胞を形成しうることを示す最近の報告は、幹細胞集
団がこれまで考えられたものより制限が少ないかもしれないことを示唆している
（Bjornson, 1999, Science 283:534-537）。

【０００３】 新生期マウスの側脳室内に注入されるＭＳＣ類が星状細胞および神経繊維−含
有細胞に分化しうるという証明がこの論点を支持する（Kopen et al., 1999, Pr oc. Natl. Acad. Sci. 96:10711-10716）。

【０００４】 しかしながら、ＭＳＣ類の星状細胞およびグリア細胞への分化は示されている
が（ＷＯ９９／４３２８６）、現在まで、ＭＳＣ類がニューロン細胞へ分化する
のを誘導させる方法はなかった。それ故、ＣＮＳ疾病、障害、および症状の処置
用のニューロン細胞を得るための極めて大きな要望にもかかわらず、ヒトＮＳＣ
類または胎児組織を得る際に関与する技術的および倫理的障壁に遭遇せずに多数
のニューロン細胞を得るための方法は得られていなかった。本発明はこの要望を
成就する。

【０００５】 発明の簡単な要旨 本発明は単離された骨髄間質細胞のニューロン細胞への分化を誘導する方法を
包含する。この方法は、単離された骨髄間質細胞を少なくとも１種のニューロン
分化−誘導化合物と接触させることを含んでなる。これは、単離された骨髄間質
細胞のニューロン細胞への分化を包含する。

【０００６】 一面では、単離された骨髄間質細胞はラット細胞である。好ましくは、単離さ
れた骨髄間質細胞はヒト細胞である。

【０００７】 一面では、ニューロン分化−誘導化合物は抗酸化剤である。他の面では、抗酸
化剤はベータ−メルカプトエタノール、ジメチルスルホキシド、ブチル化された
ヒドロキシトルエン、ブチル化されたヒドロキシアニソール、アスコルビン酸、
フマル酸ジメチル、およびｎ−アセチルシステインよりなる群から選択される。

【０００８】 さらに他の面では、抗酸化剤はベータ−メルカプトエタノールである。

【０００９】 他の面では、抗酸化剤はジメチルスルホキシドである。さらに他の面では、抗
酸化剤はジメチルスルホキシドおよびブチル化されたヒドロキシアニソールであ
る。

【００１０】 ニューロン分化−誘導化合物は他の面では成長因子でもある。好ましい面では
、成長因子は血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子２および神経成長因子よ
りなる群から選択される。

【００１１】 本発明はさらに、単離されたニューロン細胞の製造方法も包含する。この方法
は、骨髄間質細胞を単離し、骨髄間質細胞をニューロン分化−誘導化合物と接触
させ、ここでこの化合物が単離された骨髄間質細胞が単離されたニューロン細胞
へ分化するのを誘導し、それにより単離されたニューロン細胞を製造することを
含んでなる。

【００１２】 さらに、本発明は中枢神経系の疾病、障害または症状のあるヒト患者の処置方
法も包含する。この方法は、ヒトドナーから骨髄サンプルを得、骨髄サンプルか
ら間質細胞を単離し、間質細胞が単離されたニューロン細胞へ分化するのを誘導
し、そして単離されたニューロン細胞をヒト患者の中枢神経系に投与することを
含んでなる。ヒト患者の中枢神経系内の単離されたニューロン細胞の存在が疾病
、障害または症状の処置を行う。

【００１３】 一面では、中枢神経系の疾病、障害または症状はアルツハイマー病、パーキン
ソン病、ハンチントン病、筋萎縮性外側硬化症、腫瘍、外傷、老人性痴呆症、テ
イ−サックス病、サンドホッフ病、フルラー症候群、クラッベ病、分娩で誘導さ
れる外傷性中枢神経系損傷、癲癇、多発性硬化症、外傷、腫瘍、発作、および脊
髄損傷よりなる群から選択される。

【００１４】 他の面では、単離されたニューロン細胞を投与する前に、単離されたニューロ
ン細胞を治療用蛋白質をコードする単離された核酸でトランスフェクトし、ここ
で蛋白質が細胞中で発現する時に蛋白質が該疾病、障害または症状の処置に有効
であるように機能する。

【００１５】 別の面では、単離されたニューロン細胞をサイトカイン、ケモカイン、ニュー
ロトロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、またはグリオーム毒性蛋白質
をコードする単離された核酸でトランスフェクトする。

【００１６】 本発明はさらに、ニューロン細胞を必要とするヒト患者の処置方法も包含する
。この方法は骨髄間質細胞をヒト患者から得、骨髄間質細胞を培養でそれらのニ
ューロン細胞への分化を誘導する条件下で増殖させ、ニューロン細胞をニューロ
ン細胞を必要とするヒト患者に移植し、それによりニューロン細胞を必要とする
該ヒト患者を処置することを含んでなる。

【００１７】 本発明はまた、単離された骨髄間質細胞のニューロン細胞への分化を誘導する
方法により製造される単離されたニューロン細胞も包含する。この方法は単離さ
れた骨髄間質細胞を少なくとも１種のニューロン分化−誘導化合物と接触させる
ことを含んでなる。単離された骨髄間質細胞とニューロン分化−誘導化合物との
間の接触が本発明の単離された骨髄間質細胞のニューロン細胞への分化を誘導す
る。

【００１８】 一面では、この方法により製造されるニューロン細胞は齧歯動物細胞である。
他の面では、ニューロン細胞はラット細胞である。好ましい面では、この方法に
より製造される細胞はヒトニューロン細胞である。

【００１９】 本発明の好ましい態様は、治療用蛋白質でトランスフェクトされた単離された
ニューロン細胞を包含する。ニューロン細胞は、上記の単離された骨髄細胞のニ
ューロン細胞への分化を誘導する方法により単離される。ニューロン細胞を次に
、発現時に中枢神経系の疾病、障害、または症状の処置を行うであろう治療用蛋
白質をコードする単離された核酸でトランスフェクトする。本発明の一面では、
単離された核酸によりコードされる治療用蛋白質はサイトカイン、ケモカイン、
ニューロトロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、およびグリオーム毒性
蛋白質である。

【００２０】 本発明は、アルツハイマー病。パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性外
側硬化症、腫瘍、外傷、老人性痴呆症、テイ−サックス病、サンドホッフ病、フ
ルラー症候群、クラッベ病、分娩で誘導される外傷性中枢神経系損傷、癲癇、多
発性硬化症、外傷、腫瘍、発作、および脊髄損傷を包含するがそれらに限定され
ない中枢神経系の疾病、障害または症状を包括する。

【００２１】 一面では、単離された骨髄間質細胞の分化を誘導する方法により製造されるト
ランスフェクトされたニューロン細胞はラット細胞または齧歯動物細胞である。
好ましくは、トランスフェクトされたニューロン細胞はヒト細胞である。

【００２２】 本発明はまた、骨髄間質細胞を単離しそしてそれをニューロン分化−誘導化合
物と接触させることを含んでなる方法により製造される単離されたニューロン細
胞も包含する。これが単離された骨髄間質細胞が単離されたニューロン細胞へ分
化するのを誘導する。

【００２３】 骨髄間質細胞を単離しそしてそれをニューロン分化−誘導化合物と接触させる
ことにより製造されるトランスフェクトされた単離されたニューロン細胞も本発
明に包含される。この方法により製造される単離されたニューロン細胞を次に、
ニューロン細胞中での発現時に中枢神経系の疾病、障害または症状の処置を行う
であろう治療用蛋白質をコードする単離された核酸でトランスフェクトする。

【００２４】 好ましい面では、単離された核酸によりコードされる治療用蛋白質はサイトカ
イン、ケモカイン、ニューロトロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、お
よびグリオーム毒性蛋白質である。

【００２５】 本発明の一面では、ニューロン分化−誘導化合物を骨髄間質細胞と接触させる
ことにより製造されるトランスフェクトされるニューロン細胞はラット細胞であ
る。他の面では、トランスフェクトされるニューロン細胞は齧歯動物細胞である
。好ましい面では、トランスフェクトされるニューロン細胞はヒト細胞である。

【００２６】 発明の詳細な記述 本発明は、骨髄間質細胞と神経−分化誘導剤との接触が種々のニューロン−特
異的マーカー（例えば、ＮｅｕＮ、神経繊維−Ｍ、ニューロン−特異的エノラー
ゼ［ＮＳＥ］、タウ、ネスチン、ｔｒｋＡなど）を発現するニューロン−類似細
胞への細胞の分化に介在するという発見に基づく。細胞は例えば典型的なニュー
ロン細胞質外観を示す球形で且つ不応性である細胞本体、ニューロンに典型的な
成長錐状体および糸状足の中で終結する長い突起に伸びる細胞本体、並びに典型
的にはニューロン伝達物質放出およびシナプス小胞再循環に標識付けする蛍光染
料ＦＭ１−４３による成長錐状体の標識の如きものであるがそれらに限定されな
い他のニューロン類似表現型特徴を示す。それ故、ここに開示されている方法は
ニューロン細胞への骨髄間質細胞の分化を包含する。そのような方法は中枢神経
系（ＣＮＳ）障害、疾病または症状の処置のための細胞に基づく療法の開発にお
いて重要である。実際に、本発明以前は、ヒト患者のＣＮＳに導入できるニュー
ロン細胞源の欠如がＣＮＳ療法の開発をひどく妨げていた。記述 本発明は、単離された骨髄間質細胞が単離されたニューロン細胞へ分化するの
を誘導する方法を包含する。本発明の方法の態様はここでは実施例部分に記載さ
れている。一般的には、細胞がドナーから単離され、普通は細胞選別方法を用い
てそこから間質細胞が得られ、そして間質細胞を引き続きインビトロで培養する
。ドナーは例えばラットであってよく、またはドナーはヒトであってもよい。本
発明は哺乳動物ドナーを包括することを意図しそしてここに開示されている特定
のドナーに限定されるべきではない。

【００２７】 ニューロン表現型を誘導するために、ある期間にわたり細胞培地中に導入され
る有効量のニューロン分化−誘導化合物で細胞を予備処理する。時間の長さは意
図する正確な方法に応じて変動させることができそして本発明を何らかの方法で
限定しようとすべきではない。ニューロン分化誘導化合物に対する予備処理的な
露呈後に、細胞をある量の同じニューロン分化−誘導化合物を含有する血清を含
まない培地に移す。例えば図２を参照すればわかるように、ニューロン形態は約
１時間以内に明らかになり、そしてその形態は時間が経つとよりはっきりと安定
する。ニューロンマーカー発現も処理から約３０分後に明白となる。このように
分化したニューロン細胞は実際に数種の蛋白質マーカーも発現し、それらは全て
ニューロンおよびニューロン突起に必然的に関連する蛋白質であるチロシンヒド
ロキシラーゼ、チューブリン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、シナプトフ
ィシン、およびＴＯＡＤを包含するがそれらに限定されない。

【００２８】 これらの新たに分化したニューロン細胞はコリン作用性およびカテコールアミ
ン作用性系統の疾病に罹っている患者、そしてより一般的には中枢神経系の疾病
に罹っている患者を処置する際に有用で割る。

【００２９】 本発明の１つの態様では、抗酸化剤がニューロン分化−誘導化合物として機能
し、それらはベータ−メルカプトエタノール、ジメチルスルホキシド、ブチル化
されたヒドロキシトルエン、ブチル化されたヒドロキシアニソール、アスコルビ
ン酸、フマル酸ジメチル、およびｎ−アセチルシステインを包含するがそれらに
限定されない。ここで開示されている実施例部分に示されているような特に好ま
しい態様はベータ−メルカプトエタノール、ジメチルスルホキシドおよびジメチ
ルスルホキシドとブチル化されたヒドロキシアニソールとの組み合わせを好まし
い抗酸化剤として包含する。しかしながら、本発明はここに開示されている抗酸
化剤に限定されずそして全ての抗酸化剤並びに骨髄間質細胞のニューロン分化を
誘導する他の化合物を包含すると考えるべきである。

【００３０】 本発明はまた、ＭＳＣ類のニューロン細胞への分化を誘導する方法におけるニ
ューロン分化−誘導化合物としての成長因子の使用も意図する。そのような成長
因子は線維芽細胞成長因子２、血小板由来成長因子、および神経成長因子、並び
に関連試薬を包含するがそれらに限定されない。

【００３１】 ニューロン同一性はニューロン−特異的マーカーの検出のために分化したニュ
ーロン細胞を染色することにより確認することができる。そのようなマーカーの
例は、神経繊維−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）、タウ蛋白質、Ｎｅｕ−Ｎ、ニューロン−特異
的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ネスチン、およびｔｒｋＡである。骨髄間質細胞のニ
ューロン細胞への段階的な分化はこれらのマーカーの各々における増加に対応し
ており、ニューロン細胞が製造されたことを示す。別の同定は既知の免疫細胞化
学的および抗体技術を用いて行うことができる。例えば、これらのニューロン細
胞の免疫細胞化学的分析は、これらの細胞が自然に分化したニューロンと関連す
る蛋白質も発現することを示す。そのような蛋白質はチューブリン、ＴＯＡＤ、
およびシナプトフィシンを包含するが、それらに限定されない。コリンアセチル
トランスフェラーゼおよびチロシンヒドロキシラーゼの抗体検出を評価すること
もできる。

【００３２】 単離された骨髄間質細胞をインビトロでニューロン細胞に分化可能であること
がここに開示されているデータから明らかである。このようにして分化したニュ
ーロン細胞は広範囲の中枢神経系疾病、障害、または症状のいずれかに罹ってい
る患者を処置する際に有用である。

【００３３】 本発明はまた、単離された骨髄間質細胞から単離されたニューロン細胞を製造
する方法も包含する。この方法は、骨髄間質細胞を以上で挙げられているのと同
じ一般的なやり方で単離された分化し、それにより単離されたニューロン細胞を
製造することを含んでなる。

【００３４】 上記の方法の両方で記述された単離されたニューロン細胞は治療用蛋白質をコ
ードする単離された核酸でトランスフェクトすることができる。治療用蛋白質は
、発現時に、中枢神経系の疾病、障害または症状のある患者を処置するであろう
。

【００３５】 多種の有益な蛋白質が当該技術で既知でありそして、例えば、ＷＯ９６／３０
０３１およびＷＯ９９／４３２８６に示されている。そのような例は、サイトカ
イン類、ケモカイン類、ニューロトロフィン類、他の栄養蛋白質、成長因子、抗
体、およびグリオーム毒性蛋白質を包含するが、それらに限定されない。そのよ
うな蛋白質をコードするトランスフェクトされたニューロン細胞を患者に投与す
る場合には、ニューロン細胞は中枢神経系にすでに存在する細胞に対して有利に
影響するであろう。例えば、中枢神経系に導入されるトランスフェクトされたニ
ューロン細胞を使用して中枢神経系の損傷を回復させ、および／または中枢神経
系の腫瘍を潰滅させることができる。

【００３６】 国際特許出願ＷＯ９６／３００３１およびＷＯ９９／４３２８６は広範囲のＣ
ＮＳ疾病、障害、または症状のための療法におけるＭＳＣ類の使用も記載してお
り、それらはＣＮＳの遺伝疾病（例えば、テイ−サックス病、サンドホッフ病、
フルラー症候群、クラッベ病）、分娩で誘導される外傷性ＣＮＳ損傷、成人ＣＮ
Ｓ疾病、障害または症状（パーキンソン、アルツハイマー、およびハンチントン
病、老人性痴呆症、癲癇、筋萎縮性側面硬化症、多発性硬化症、外傷、腫瘍、発
作など）並びに骨髄の退化性疾病および外傷性損傷を包含するが、それらに限定
されない。

【００３７】 新生児および子供では、トランスフェクトされたニューロン細胞をテイ−サッ
クス病および関連するサンドホッフ病、フルラー症候群および関連するムコポリ
サッカリドーゼ類並びにクラッベ病を包含するがそれらに限定されない中神経系
の多くの遺伝疾病の処置用に使用することができる。程度の差はあっても、これ
らの疾病は脊髄および末梢神経中で病変も生じそしてそれらは非−神経学的作用
も有する。これらの疾病の非−神経学的作用は骨髄移植により処置することがで
きるが、中枢神経系の作用は骨髄移植にもかかわわらず改良しない。本発明の方
法はこれらのタイプの疾病の中枢神経系の作用を処理するために有用である。さ
らに、新生児および子供では、これらのニューロン細胞を子供の中枢神経系中に
直接導入することにより分娩中または分娩後の頭部外傷を処置可能である。子供
における中枢神経系腫瘍形成も本発明の方法を用いて処置可能である。

【００３８】 単離されたニューロン細胞を成人に投与することにより中枢神経系の成人疾病
も処置可能である。そのような成人疾病はパーキンソン病、アルツハイマー病、
脊髄損傷、発作、外傷、腫瘍、脊髄の変性疾病、例えば筋萎縮性側面硬化症、ハ
ンチントン病および癲癇を包含するが、それらに限定されない。多発性硬化症の
処置も意図される。

【００３９】 本発明の方法を用いて脊髄損傷の処置も可能である。脊髄損傷の先行技術処置
方法は動物において線維芽細胞を用いてニュートロフィンを脊髄病変部位に送る
ことを包含する。このやり方で送られたニュートロフィン類は病変を減ずるかま
たは他の方法で損傷を処置する。しかしながら、線維芽細胞は多量のコラーゲン
を製造し、病変部位で線維症を引き起こし、その結果として処置の有利な作用を
無効にする。ニューロン細胞は多量のコラーゲンを製造せず、従って線維症を引
き起さないはずであるため、トランスフェクトされたニューロン細胞を用いるニ
ュートロフィン類の骨髄病変への送達は先行技術方法より有利である。

【００４０】 本発明はさらに、本発明の分化したニューロン細胞を患者の中枢神経系に投与
することによる中枢神経系の疾病、障害、または症状のあるヒト患者の処置方法
も包含する。ＭＳＣ類を用いるヒト患者の処置方法はＷＯ９６／３００３１およ
びＷＯ９９／４３２８６に記載されており、それらは引用することにより本発明
の内容となる。分化したニューロン細胞の患者への投与方法はＷＯ９６／３００
３１およびＷＯ９９／４３２８６に記載されているＭＳＣ類に関して使用された
ものと同一である。これらの方法は有益な蛋白質をコードする単離された核酸の
分化したニューロン細胞中への導入を包括し且つ患者がそのような細胞の投与を
必要とする場合の細胞を基にした療法における分化したニューロン細胞自体も包
括する。分化したニューロン細胞は好ましくはヒトに投与され、そしてさらに、
ニューロン細胞は好ましくはヒトの中枢神経系に投与される。ある場合には、分
化したニューロン細胞はヒトの脳の線条体に投与される。ニューロン細胞投与の
正確な部位は、処置しようとする病変の部位、処置しようとする疾病のタイプ、
ヒトの年令および疾病の重さなどを包含するがそれらに限定されない多くの因子
に依存するであろう。投与部位の決定は哺乳動物に対する細胞の投与に精通して
いる当業者には十分知られている。

【００４１】 ヒトの中枢神経系に対する分化したニューロン細胞の投与方式は、処置しよう
とする疾病のタイプ、ヒトの年令、ニューロン細胞がその中に導入された単離さ
れたＤＮＡを有するかどうかなどを包含するがそれらに限定されない数種の因子
に依存して変動できる。脳組織内へのニューロン細胞の直接的投与の一例がここ
では実験詳細部分に挙げられている。一般的には、最初に頭蓋に穴を開け、その
中を通して細胞を脳組織内に送ることにより、細胞を哺乳動物の脳内に導入する
。細胞を直接的注入により、シャントを用いることにより、または中枢神経系中
への化合物の導入に関する技術で使用される他の手段により導入することができ
る。定義 冠詞「ａ」および「ａｎ」はここでは１つまたは１つより多い（すなわち少な
くとも１つの）冠詞の数学的対象をさすために使用される。例として、「部品」
は１つの部品または１つより多い部品を意味する。

【００４２】 ここで使用される「中枢神経系」とは、哺乳動物の脳および／または脊髄を包
含すると考えるべきである。この用語はある場合には眼および視神経も包含する
。

【００４３】 ここで使用される「間質細胞」、「単離された骨髄間質細胞」、および「ＭＳ
Ｃ類」は互換的に使用され、そして骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の幹細胞
類似前駆体として機能でき且つ骨髄からそれらがプラスチック皿に付着する能力
により単離される骨髄中の細胞の小部分をさすことを意味する。骨髄細胞は動物
から由来できる。ある態様では、間質細胞は霊長類、好ましくはヒト、から由来
する。

【００４４】 ここで使用される用語「抗酸化剤」は、酸化または酸素もしくは過酸化物によ
り促進される反応を抑制する物質をさすことを意味する。抗酸化剤の例は、ベー
タ−メルカプトエタノール、ジメチルスルホキシド、ブチル化されたヒドロキシ
トルエン、ブチル化されたヒドロキシアニソール、アスコルビン酸、フマル酸ジ
メチル、およびｎ−アセチルスステインを包含するが、それらに限定されない。

【００４５】 ここで使用される用語「有益な蛋白質」および「治療用蛋白質」は互換的に使
用されそして遺伝子欠陥により特徴づけられる疾病もしくは疾病の兆候、障害ま
たは症状に因果関係がある欠陥遺伝子および／または不十分な遺伝子発現により
コードされる蛋白質を補充できる蛋白質をさすことを意味する。この蛋白質の存
在が疾病、障害または症状を特徴づける原因および／または兆候を緩和するか、
減少するか、防止するか、または緩和、減少もしくは防止させようとする。

【００４６】 ここで使用される、有益なすなわち治療用の蛋白質で処置されうる疾病、障害
または症状とは、疾病、障害または症状を特徴づける原因および／または兆候を
緩和するか、減少するか、防止するか、または緩和、減少もしくは防止させよう
とする蛋白質の存在により処置または防止されうる疾病、障害または症状をさす
ことを意味する。有益な蛋白質で処置されうる疾病、障害または症状は、遺伝子
欠陥により特徴づけられる疾病、障害または症状並びに遺伝子欠陥により特徴づ
けられないがそれにもかかわらず疾病、障害または症状を特徴づける原因および
／または兆候を緩和するか、減少するか、防止するか、または緩和、減少もしく
は防止させようとする蛋白質の存在により処置または防止されうるものを包含す
る。

【００４７】 用語「単離された核酸」とは、それを天然産出状態でフランクさせる配列から
精製された核酸配列、または区域、または断片、例えば通常は断片に隣接してい
る配列から除去されたＤＮＡ断片、例えばそれが天然に産出するゲノム中で断片
に隣接する配列、をさすと考えるべきである。この用語は、核酸に当然伴う他の
成分から実質的に精製された核酸、例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそれに
細胞中で当然伴う蛋白質、から実質的に精製された核酸にも適用される。

【００４８】 ここで使用される「トランスフェクトされた細胞」とは、核酸分子を細胞中に
導入するために使用される技術を用いて遺伝子構成体が提供されるような細胞を
さすことを意味し、古典的なトランスフェクション（燐酸カルシウムまたはＤＥ
ＡＥデキストラン介在トランスフェクション）、電気穿孔、微量注入、リポソー
ム−介在転移、化学−介在転移、配位子介在転移または組み換えウイルスベクタ
ー転移を包含するが、それらに限定されない。

【００４９】 ここで使用される用語「分化」とは、分化した細胞の実質的に均一な集団の存
在下で、分化した細胞の生成物の存在下でまたは細胞分化の誘導剤の存在下で未
分化細胞を同時培養することにより未分化細胞中の分化した表現型の誘導を意味
すると考えるべきである。

【００５０】 ここで使用される用語「ニューロン細胞」とは、それが下記のニューロンマー
カー：ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ＮｅｕＮ、神経繊維Ｍ、また
はタウ蛋白質、の少なくとも１種を発現するような分化したＭＳＣを意味すると
考えるべきである。

【００５１】 ここで使用される用語「ニューロン」とは、中枢神経系からの電気刺激を受け
そして伝えることが可能な神経細胞を意味すると考えるべきである。神経細胞ま
たは「ニューロン」は典型的には、細胞本体、軸索、軸索末端、および樹状突起
を含んでなる。

【００５２】 用語「ニューロン分化−誘導化合物」とは、間質細胞のニューロン細胞への分
化を誘導可能な化合物をさすことを意味する。これらの化合物は抗酸化剤、栄養
因子、および成長因子を包含するが、それらに限定されない。

【００５３】 本発明を下記の実験実施例を参照することにより詳細にさらに記載する。これ
らの実施例は説明目的だけのために提供され、そして断らない限り限定しようと
するものではない。それ故、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものと考え
るべきでなく、むしろ、ここに示された教示の結果として明らかになるであろう
全ての変更を包括すると考えるべきである。

【００５４】 実施例 この実施例で示される実験は下記の通りにまとめることができる。

【００５５】 骨髄間質細胞は幹細胞集団の複数の特性を示す。それらはインビトロで大きく
膨張し、そして複数の間葉細胞タイプへ分化するのを誘導しうる（例えば、ＷＯ
９６／３００３１、ＷＯ９９／４３２８６参照）。しかしながら、非−間葉死へ
の分化は示されていなかった。ここでは、成体ラット間質細胞は未分化細胞状で
培養で１４継代より多く膨張し、それらの増殖能力を示した。さらに、新規な処
理プロトコルは間質細胞がニューロン表現型を示すのを誘導して、種々のニュー
ロン−特異的マーカー、すなわち、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、
ＮｅｕＮ、神経繊維−Ｍ、タウ、ネスチン、およびｔｒｋＡを発現した。

【００５６】 さらに、処理した細胞の不応性（refractile）細胞本体はニューロン細胞に典
型的な成長錐状体および糸状足の中で終る長い突起に伸びた。処理した細胞によ
る伝達物質放出およびシナプス小胞再循環と矛盾しない蛍光染料、ＦＭ１−４３
、が成長錐状体を標識付けした。単細胞から確定されたクローン性細胞系統が増
殖して、未分化のそしてニューロン表現型を示す細胞の両方を生じた。

【００５７】 ここに開示されている新規なプロトコルを用いて処理されたヒト骨髄間質細胞
はｒＭＳＣ類と同様にニューロンに分化し、このプロトコルが齧歯動物間質細胞
に限定されないことを示した。その結果、ここに開示されているデータは、最初
に、哺乳動物骨髄間質細胞がそれらの間葉の行動を負かすのを誘導でき、そして
種々の神経学的疾病、障害または症状の処置のための多くの且つ入手しやすい細
胞レザバーを構成しうることを示す。

【００５８】 この実施例で示されている実験で使用される材料および方法を次に記載する。 細胞培養 ラットＭＳＣ類を２０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ミリリットル
当たり１００単位のペニシリン、１ミリリットル当たり１００ミリグラムのスト
レプトマイシンおよび１ミリリットル当たり２５ナノグラムのアムホテリシンＢ
が補充されたアルファ−改質イーグル培地（アルファ−ＭＥＭ）の中で一次培養
した。各継代に関して細胞を１平方センチメートル当たり約８,０００個の細胞
で板培養しそして集密となるまで成長させた。継代６で、細胞を追加補充なしに
ＤＭＥＭ（ｐＨ８.０）／２０％ＦＢＳに移し、そして継代１４を越えるまで保
った。規格ＩＡＣＵＣにより認可されたプロトコルおよび工程を用いてラットＭ
ＳＣ類が得られた。情報告知された志願者からそして規格審査委員会により認可
されたプロトコルに従いヒトサンプルが得られた。ウェスタンブロット 無処理（Ｕ）およびＢＭＥで誘導した（Ｉ）ｒＭＳＣ培養物からの３０ミリグ
ラムの蛋白質抽出物を４％−２０％勾配のアクリルアミドゲル上で分離しそして
ナイロン膜に電気泳動的に移した。ウェスタンブロットをチューブリン発現に関
して抗−チューブリンモノクローン性抗体（シグマ・ケミカル・カンパニー、セ
ントルイス、ミズーリ州）を用いて、引き続きホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）と共役した二次抗体を用いて、検査した。強化した化学蛍光試薬
（アメルシャム、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて発色を行った
。ブロットを次に剥離しそして抗−ＮＳＥポリクローン性抗体（ＩＣＮ）を用い
てＮＳＥ発現に関して検査した。再び、二次抗体をＨＲＰ−共役し、そしてＥＣ
Ｌ試薬を用いて発色させた。免疫細胞化学 培養したｒＭＳＣ類を４％パラホルムアルデヒドで固定し、一次抗体と共に一
晩にわたり４℃においてインキュベートし、二次抗体と共に１時間にわたりイン
キュベートし、引き続きアビジン−ビオチン複合体に１時間にわたり２５℃にお
いて露呈した。ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）がＨＲＰ用の色素基質として機能
した。ＦＭ１−４３標識 培養物を血清を含まない培地（ＳＦＭ）の中で約４時間にわたりＤＭＳＯ／Ｂ
ＨＡで処理した。細胞をさらに３０分間にわたり人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）／Ｂ
ＨＡの中で保った。細胞を１ミリモルのＦＭ１−４３および７５ｍＭのＫＣｌを
含有するａＣＳＦの中で６０秒間にわたり標識付けした。標識混合物を除去し、
培養物をａＣＳＦで２回洗浄し、そして細胞をａＣＳＦの中で６０分間にわたり
インキュベートして背景染色を減じた。培養物を４％パラホルムアルデヒドで固
定し、そして２４時間にわたり燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に分析前に浸漬し
た。

【００５９】 この実施例で示された実験の結果を次に記載する。間質細胞同定 ラット間葉間質細胞（ｒＭＳＣ類）を成体ラットの大腿骨から単離しそしてイ
ンビトロで増殖させた（Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913）。図１Ａに開示されているデータは、抗体で染色された細胞のＣＤ
１１ｂ（空白部）への分配はイソタイプ対照（書き込まれている）とは異ならず
、ｒＭＳＣ培養物は有意数の汚染性ＣＤ１１ｂ−発現細胞を含有しないことを示
した。さらに、図１Ｂに開示されているデータも染色強度がＣＤ４５抗体（空白
部）および対照（書き込まれている）プロフィルの間で異ならないことも示して
おり、培養されたｒＭＳＣ類はＣＤ４５−発現細胞により汚染されないことを示
す。継代１における蛍光細胞選別も、細胞がリンパ造血細胞と関連する細胞表面
マーカーであるＣＤ１１ｂ（図１Ａ）およびＣＤ４５（図１Ｂ）に関して陰性で
あることを示した。従って、培養物中では造血前駆体の証拠はなかった。

【００６０】 対照的に、ここに開示されているデータはｒＭＳＣ類がＣＤ９０を発現したこ
とを示し（図１Ｃ）、それらの未分化状態と矛盾しない。低い板培養密度では、
ｒＭＳＣ類は大きな平らな細胞の単分子層として成長した。細胞が集密に近付く
につれて、それらはより紡錘体形状の線維芽細胞形態をとった。ここで他の場所
に開示されているニューロン分化試験の最初に、細胞表面マーカーであるＣＤ４
４およびＣＤ７１を染色することにより無処理ｒＭＳＣ類をさらに同定した。細
胞はＣＤ４４およびＣＤ７１発現に関して陽性であり、これまでの報告（Pitten ger et al., 1999, Science 284:143-147; Bruder et al., 1998, Clin. Orthop . Relat. Res. 355S:S247-S256）に矛盾しない。ニューロン分化 ニューロン表現型を誘導するために、ｒＭＳＣ類を最初に集密に近い培養物中
で１ｍＭのベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）が補充された培地の中で２
４時間にわたり保った。これらの条件下で形態における変化は明白でなかった。
ニューロン分化を行うために、細胞を１−１０ミリモルのＢＭＥを含有する血清
を含まない培地（ＳＦＭ／ＢＭＥ）に移した。ニューロン形態をとる細胞の百分
率はより高いＢＭＥ濃度において増加し、そしてＢＭＥ予備処理により増加した
。ＳＦＭ／ＢＭＥに対する６０分間以内の露呈で、ｒＭＳＣ類の一部の形態にお
ける変化がはっきりした（図２Ｃ）。感応する細胞は段階的に最初の３時間にわ
たりニューロン形態特徴をとった。最初に、平らなｒＭＳＣ中の細胞質が核に向
かって収縮して、収縮した多極性細胞本体を形成し、膜状の突起類似延長部分が
周囲に残った（０−９０分間）。

【００６１】 処理した細胞は３０分間の処理中にニューロンマーカーＮＳＥの発現増加を示
した。その後の２時間にわたり、細胞本体は段々球形に且つ不応性になり、典型
的なニューロン細胞質外観を示した。突起を形成し続けて、成長錐状体類似末端
膨張および糸状足延長部分を生長させた（例えば、図２Ｇおよび２Ｈ参照）。細
胞突起は一次および二次分岐を示し、そして動的成長を受けた。収縮並びに延長
は、１２０分において矢印（図２Ｅ）によりマークされる細胞が最初に近くの突
起（「＞」によりマークされる）と接触し、それが１８０分間で接触量の減少な
しに収縮した（図２Ｇ）。

【００６２】 有効なニューロン分化をさらに同定するために、ＢＭＥ−処理した培養物を染
色してニューロンマーカーであるニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の発
現を検出した。感応しない平らなｒＭＳＣ類は非常に低いが検出可能な水準のＮ
ＳＥ蛋白質を発現し、骨髄源の細胞中の少量の蛋白質および／または遺伝情報の
これまでの検出結果と矛盾しなかった（Pechumer et al., 1993, Lab. Invest. 89:743-749; Reid et al., 1991, Clin. Pathol. 44:483-486; vanObberghen et al., 1988, J. Neurosci. Res. 19:450-456）。

【００６３】 ｒＭＳＣ類のニューロン表現型への段階的な遷移はＮＳＥの増加した発現と一
致した（図３Ａ）。収縮した細胞本体を示した機能はＮＳＥ発現（矢印）に関し
て染色された濃褐色を有するが、平らな感応しないｒＭＳＣ類（＞）は最少のＮ

【００６４】

【外１】

【００６５】 褐色の染色を示し、形態学的および分子状の分化の同調性を示す。ｒＭＳＣ由来
ニューロンは、簡単な二極性（▼）から大きい非常に分岐した多極性細胞（矢印
）の範囲にわたり、顕著なニューロン形態（図３Ｂ）を示した。稀なＮＳＥ−陽
性ニューロンはピラミッド細胞形態を示したが（図３Ｃ）、明白な静脈瘤（矢印
）を有する長い突起を形成するニューロンがより一般的であった（図３Ｄ）。分
化した細胞のクラスターは強いＮＳＥ陽性を示し、且つ生成した莫大な網目構造
を有する（図３Ｅ）。これらのクラスター内でも、典型的な平らなｒＭＳＣ類（
＞）は淡くのみ染色され、それらの未分化状態と矛盾しない。

【００６６】 ウェスタンブロット分析（図３Ｆ）は誘導されなかったｒＭＳＣ類中の低水準
のＮＳＥ蛋白質の発現を確認した。ニューロン表現型の誘導がＮＳＥ発現におけ
る劇的な増加をもたらし、免疫細胞化学的データと矛盾しない。

【００６７】 ニューロン特性をさらに試験するために、未分化培養物を有糸分裂後細胞中で
発現したニューロン−特異的マーカーであるＮｅｕＮに関して染色した（Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88-94）。丸い細胞本体および突起（矢印）を示
す細胞の亜群はＮｅｕＮ発現に関して染色したが、未分化細胞（＜）はＮｅｕＮ
−陰性のままであった（図４Ａ）。ニューロン細胞のＮｅｕＮ染色を記載してい
るこれまでの報告（Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88-94）と矛盾せず、
ＮｅｕＮ染色は陽性細胞の核および周囲細胞質に制限され、そして突起中に伸び

【００６８】

【外２】

【００６９】 かったが、近くの細胞は強く陽性であった（矢印）（図４Ｂ）。このパターンは
、ニューロン形態を示す各細胞が増加したＮＳＥ発現を示したＮＳＥ染色に関し
て確定されたものと対照的である。何らかの特定の理論により拘束しようとは望
まないが、これらのデータはＮＳＥ−陽性細胞の亜群が有糸分裂後ニューロンで
あることを示唆している。これも何らかの特定の理論により拘束しようとは望ま
ないが、インビトロでニューロン生存を高めるＢＭＥの抗酸化性質（Ishii et a l., 1993, Neurosci. Lett. 163:159-162）は、部分的には、ＭＳＣ類中のニュ
ーロン分化の誘導に介在しうるが、この驚異的な結果はこれまでの研究に基づく
と予期されなかった。

【００７０】 中間的なフィラメント蛋白質であるネスチンは感覚上皮ニューロン前駆体幹細
胞中で発現し、ニューロンが成熟するにつれて発現が減少する。実験データは、
ＭＳＣ−分化したニューロン細胞を染色してネスチンを検出する場合にはネスチ
ンの発現は時間が経つと減少することを示す（図９Ａ−９Ｃ）。さらに、ニュー
ロン中に存在する高親和性神経成長因子受容体であるｔｒｋＡに関する染色は、
ＭＳＣ−分化したニューロン細胞の成熟突起全体にわたりｔｒｋＡ水準が未変化
のままであることを示す（図９Ｄ−９Ｆ）。

【００７１】 ＢＭＥの抗酸化性質がＭＳＣ中のニューロン分化の誘導に介在するという仮説
の試験を始めるために、ＭＳＣ類を他の抗酸化剤、例えば、ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）、ブチル化されたヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、またはブチ
ル化されたヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸、フマル酸ジメチル
、ｎ−アセチルシステインなどで、単独でそして互いに組み合わせて、処理した
。さらに、ＢＨＴと組み合わせた抗酸化剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を用いる処理もＭＳＣ類によるニューロン分化を誘導し、ＤＴＴが単独でニュー
ロン分化を誘導できることを示唆している。

【００７２】 それぞれの抗酸化剤処理（例えば、単独でまたは組み合わせての、ＤＭＳＯ、
ＢＨＡ、ＢＨＴ、アスコルビン酸、フマル酸ジメチル、ｎ−アセチルシステイン
など）がＢＭＥの効果と同様な時間経過でニューロン形態を誘導した。さらに、
予備データは、広範囲の濃度がニューロン分化を誘導したが約２％（容量／容量
）のＤＭＳＯおよび約２００ミリモルのＢＨＡ（ＤＭＳＯ／ＢＨＡ）を用いる処
理が好ましいことを示唆していた。

【００７３】 ニューロン同一性をさらに同定するために、ＤＭＳＯ／ＢＨＡで処理したＭＳ
Ｃ類を神経突起延長部分の開始を助けるニューロン−特異的中間フィラメントで
ある神経繊維−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）に関して染色した（Carden et al., 1987, Neuro sci. 7:3489-3504）。ここでこれまでに他の場所で開示されているデータは、Ｍ
ＳＣ類のＢＭＥ処理がニューロン形態を示す細胞中でＮＦ−Ｍの発現増加を引き
起こしたことを示した。丸い細胞本体をＤＭＳＯ／ＢＭＥ露呈後の突起（矢印）
と共に示すほとんどの細胞は高水準のＮＦ−Ｍを発現したが、平らな未分化細胞
（＞）は示さなかった（図５Ａ）。精製したＮＦ−Ｍ蛋白質によるＮＦ−Ｍ抗体
の予備吸着が染色を０にし（図５Ｂ）、特異性を確定した。

【００７４】 ＤＭＳＯ／ＢＨＡ処理した培養物を次に、分化中のニューロンにより発現され
るニューロン−特異的微小管に関連する蛋白質であるタウの存在に関して試験し
た（Kosik and Finch, 1987, J. Neurosci. 7:3142-3154）。ニューロン形態（
矢印）を示す細胞は細胞本体中並びに突起（＊）中でタウ蛋白質を発現したが、
未分化の平らな細胞はタウ−陰性（＜）であった（図５Ｃおよび５Ｄ）。ここに
開示されているデータは、ここに記載されている方法が骨髄間質細胞のニューロ
ン分化を誘導することを示す。活性−依存性シナプス小胞再循環 ニューロン性質をさらに同定するために、培養物集団をスチリル染料ＦＭ１−
４３で処理し、それはシナプス小胞の外側尖頭部を活性−依存性伝達物質放出時
に標識付けする（Betz and Bewick, 1992, Science 255:200-203; Betz et al., 1992, J. Neurosci. 12:363-375; Diefenbach et al., 1999, J. Neurosci. 19

【００７５】

【外３】

【００７６】 じ、細胞が活性−依存性伝達物質放出の結果として生ずる再循環するシナプス小
胞であったことを示唆する。クローン分析 個別のｒＭＳＣ類が自己再生および多能性の幹細胞特性を示すかどうかを測定
するために、個別クローンを分析した。クローンを確定するために、ｒＭＳＣ類
を１平方センチメートル当たり約１０個の細胞で板培養し、１コロニー当たり５
０−１５０個の細胞となるまで成長させ、クローニングシリンダーを用いて単離
し、別個のウェルに移しそして事実上個別フラスコに移した。単細胞が典型的な
ｒＭＳＣ類として複製しそしてＢＭＥ処理後にＮＳＥ−陽性ニューロンに分化し
た。

【００７７】 ４種の顕著なクローン系統の分析が図７Ａ−７Ｄに示されている。それぞれの
個別細胞はＢＭＥ処理後に不応性の突起を有するＮＳＥ−陽性細胞を生成した。

【００７８】

【外４】

【００７９】 。従って、単細胞由来クローンはｒＭＳＣ類およびニューロンの両者を生ずるこ
とができ、幹細胞特性を示す。ヒト間質細胞が間質に分化する ＭＳＣ類のニューロン能力はヒトから得られるＭＳＣ類（ｈＭＳＣ類）を用い
る下記の実験により示されるように齧歯動物に独特のものでなかった。ｈＭＳＣ
類を健康な成人ドナーから単離しそしてインビトロで成長させた（Bjornson et al., 1999, Science 283:534-537）。ｈＭＳＣ類はそれらの齧歯動物同等物と類
似しており、未分化状態で大きな平らな細胞状に成長した。

【００８０】 継代２からの細胞をニューロン分化プロトコルにかけそしてＮＳＥまたはＮＦ
−Ｍ発現に関して染色した。ＢＭＥ処理後に、ｈＭＳＣ類がニューロン特性を得
、そしてｒＭＳＣ類に関して観察されたものと同様な時間枠でＮＳＥ発現を高め
た。収縮した細胞本体が突起を形成しそして３時間以内にＮＳＥ発現に関して強

【００８１】

【外５】

【００８２】 来ニューロンにより形成された多くの突起は末端バルブ（８Ｂ中の矢印）を示し

【００８３】

【外６】

【００８４】 形態は図８Ｃの影像に描写された対になったニューロンにより形成された突起上
ではっきりと明白であった。これらの細胞もＮＦ−Ｍを発現し、それらのニュー
ロン分化と矛盾しない（図８Ｄ）。

【００８５】 ここに開示されているデータは、ラットおよびヒトＭＳＣ類が非−間葉誘導体
、特にニューロン、に分化する能力を保有することを示し、行動、線状制限およ
び細胞死滅の固有ゲノム機構が不定であることを示唆する。環境信号は古典胚芽
層で発生する細胞の許容された死滅制限をはるかに越えて伸びる多能性の発現を
誘導しうる。これらの成熟細胞は自己再生性で且つ多能性であり（Owens and Fr iedenstein, 1988, Ciba Foundation Symp. 136, Chichester, U.K. pp.42-60; Prockop, 1997, Science 276; 71-74; Ferrari et al., 1998, Science 279:152 8-1530; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira et al., 1995, P roc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561-570; Majumdar at al., 1998, J. Cell. Physiol. 176:57 -66; Pittenger et al., 1999, Science 284:143-147）、それにより幹細胞集団
の基準の多くを満たす。

【００８６】 出願人が知っている限り、末梢間葉細胞がインビトロでニューロンに分化しう
ることが最初の報告である。さらに、本発明はインビトロでＭＳＣ類のニューロ
ン細胞への分化に関する方法を、最初に、提供する。ＭＳＣ類は広範囲の神経学
的疾病、障害および症状の処置において有用であり、そしてこれらの細胞は他の
いわゆる「幹」細胞より有意な利点を与える。すなわち、骨髄細胞は容易に入手
可能であり、脳から神経幹細胞を得るという危険性が回避され、そしてインビト
ロで膨張しうる再生可能な集団を与え、それによりＣＮＳ部位に対する細胞の投
与を必要とするＣＮＳ疾病、障害または症状用のエクスビボ遺伝子療法および／
または細胞療法のために行われる複雑な遺伝子操作を可能にする。さらに、自己
移植は死滅組織の使用に関連する倫理的および免疫学的問題を克服する。さらに
、ＭＳＣ類は培養で急速に成長し、不死の必要性を排除し、そしてここに開示さ
れているプロトコルだけを用いてニューロンに分化する。ＭＳＣ−分化したニューロン細胞中のニューロン蛋白質の発現 ここに開示されているデータは、ここに記載されているようにＭＳＣ類から分
化したニューロン細胞が種々のニューロン−関連蛋白質を発現することを示す。
例えば、これらの分化したニューロンの免疫細胞化学的分析はベータ−３−チュ
ーブリンの発現を示した。さらに、未知の機能のニューロン蛋白質であるＴＯＡ
Ｄ−６４並びにシナプスおよびシナプス小胞と関連するシナプトフィシンも免疫
細胞化学的技術を用いて検出可能である。ポリクローン性およびモノクローン性
抗体をベースとした工程を用いると、これらの細胞は神経伝達物質であるアセチ
ルコリンの合成に責を負う酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼを発現
することが示された。最後に、カテコールアミン生合成における速度制限酵素で
あるチロシンヒドロキシラーゼもこれらの分化したニューロンの集団中で免疫細
胞化学的に検出された。

【００８７】 これらのニューロン遺伝子生成物の存在のために、分化したニューロンはコリ
ン作用性およびカテコールアミン作用性系統に影響を与える疾病、例えば、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、または分裂病、の処置に治療上有益でありうる
ことは明らかである。実験動物に対する分化したニューロンの移植 上記の通りにして生成した分化したニューロンをそれらのインビボ生存率を測
定するためにさらに試験した。ニューロンを殺菌技術並びに既知の認可された神
経外科工程（1997, Grill et al.; 1995, Gage et al.; 1994, Dunnett et al.
）を用いて、個々のラットの脳の海馬もしくは線状体または脊髄の後角に移植し
た。

【００８８】 各ラットは移植片を上記領域の１つに受容した。ラットはそれらのケージに戻
されそして随時食事および水をとれるような状態で標準的な術後管理を受けた。

【００８９】 ニューロン生存率がインビボで保有されたかどうかを測定するために、移植片
を受容したラットの術後試験を行った。ニューロン移植片を受容したラットを移
植手術を行った後に４２日間にわたり試験した。ビスベンズイミド−陽性移植細
胞を検出するための蛍光顕微鏡を用いて、脳の海馬および線状体領域の組織試験
は移植したニューロンが海馬中で生存していたことを示した。この結果は、移植
した分化したニューロンの長期生存が可能であることを示す。脊髄の後角に移植
したニューロンを受容したラットの試験は少なくとも３日間の生存期間を示した
。さらに、この領域中の移植したニューロンの突起は細胞本体直径より少なくと
も２〜３倍の長さに生長した。

【００９０】 これらの結果から明らかであるように、移植した分化したニューロンは多くの
ニューロン蛋白質を発現し、インビボで生存性を保ち、そして生存している動物
に対して検出可能な悪影響を見たところ与えない。その結果、これらのニューロ
ンはアルツハイマー病、パーキンソン病、分裂病、および外傷または退化から生
ずる脊髄損傷を包含するがそれらに限定されない種々の脳および脊髄疾病のため
の有効な治療処置を生ずる。

【００９１】 ここに引用されたそれぞれのそして全ての特許、特許出願、および刊行物の開
示はそれら全部が引用することにより本発明の内容となる。

【００９２】 本発明を具体的な態様を参照して開示してきたが、本発明の他の態様および変
更を本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに当業者により工夫できることは
明らかである。添付された請求項はそのような態様および同等な変更を全て包含
すると解釈すべきであると考える。

【図面の簡単な説明】

数枚の図面の簡単な記述 以上の要旨、並びに以下の本発明の詳細な記述は、添付図面と共に読む時にさ
らに良く理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、現在好ましい態
様が図面に示されている。しかしながら、本発明は示されている正確な配置およ
び手段に限定されないことを理解すべきである。図面において、

【図１Ａ】 図１Ａは、細胞表面マーカーＣＤ１１ｂ（ＣＤ１１／インテグリンアルファ_M
／Ｍａｃ−１アルファ鎖；ファーミンゲン(Pharmingen)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州）と特異的に結合するマウスのモノクローン抗体を用いる継代１ｒＭ
ＳＣ類の蛍光細胞選別を描写するグラフである（空白ピーク）。使用した二次抗
体はイソシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）と共役した抗マウス抗体であった
。背景蛍光を同定するための各実験にはアイソタイプ対照が包含される（書き込
みのあるピーク）。分析された細胞数（事象）をＹ軸にプロットし、染色強度を
Ｘ軸にプロットする。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、細胞表面マーカーＣＤ４５／白血球共通抗原（ファーミンゲン）と
特異的に結合するマウスのモノクローン抗体を用いる継代１ｒＭＳＣ類の蛍光細
胞選別を描写するグラフである（空白ピーク）。二次抗体はイソシアン酸フルオ
レセイン（ＦＩＴＣ）と共役した抗マウス抗体であった。背景蛍光を同定するた
めの各実験にはアイソタイプ対照が包含される（書き込みのあるピーク）。分析
された細胞数（事象）をＹ軸にプロットし、染色強度をＸ軸にプロットする。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、細胞表面マーカーＣＤ９０／Ｔｈｙ−１／ＣＤ９０.１／Ｔｈｙ１. １（ファーミンゲン）と特異的に結合するマウスのモノクローン抗体を用いる継
代１ｒＭＳＣ類の蛍光細胞選別を描写するグラフである（空白ピーク）。二次抗
体はイソシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）と共役した抗マウス抗体である。
背景蛍光を同定するための各実験にはアイソタイプ対照が包含される（書き込み
のあるピーク）。分析された細胞数（事象）をＹ軸にプロットし、染色強度をＸ
軸にプロットする。ここに開示されているデータは、対照抗体（書き込みのある
もの）と比べてｒＭＳＣ類がＣＤ９０抗体と共にインキュベートされた時（空白
）には蛍光強度はより大きい（右に移動した）ことを示し、ｒＭＳＣ培養中に非
常に多くの細胞がＣＤ９０を発現することを示し、それらの未分化状態と矛盾が
ない。

【図２Ａ−２Ｈ】 図２Ａ−２Ｈを含んでなる図２は、処置後の種々の時点におけるｒＭＳＣ類の
ニューロン分化を描写する影像である。手短に述べると、ここに開示されている
ニューロン分化プロトコルは０分で始まりそして２１０分間にわたり続く。図２
Ａは０分を示し、図２Ｂは３０分を示し、図２Ｃは６０分を示し、図３Ｄは９０
分を示し、図２Ｅは１２０分を示し、図２Ｆは１５０分を示し、図２Ｇは１８０
分を示し、そして図２Ｈは２１０分を示す。図２Ａ中の平坦なｒＭＳＣは分化前
に同定される（▼）。細胞本体の収縮および突起形成は時間の増加に伴い明白と
なる。図２Ｅ中の矢印は二次分化中の細胞を示す。収縮中の神経突起は（＞）に
より示される。（倍率＝２００Ｘ）。

【図３Ａ】 図３Ａは抗−ＮＳＥポリクローン性抗体（ポリサイエンセス(Polysciences)、
ワリントン、ペンシルバニア州）を用いる分化中のニューロンにおけるニューロ
ン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）発現を描写する影像である。手短に述べると、
未分化ｒＭＳＣ類（「＞」により示される）は平らな形態のままでありそしてＮ
ＳＥ発現に関してわずかだけ染色した。ｒＭＳＣ由来ニューロン（矢印）はＮＳ
Ｅ発現に関して濃褐色に染色しそして凝縮した細胞本体および高度に分岐した突

【外７】 た細胞本体および淡褐色のＮＳＥ染色を有していた。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ｒＭＳＣ由来ニューロンの形態が簡単な二極細胞（▼）および高度
に分岐した突起（矢印）を有する複雑な多極細胞を包含することを描写する影像
である。両方のニューロン細胞タイプにおいて強いＮＳＥ染色が明白である。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、ピラミッド形態を示すＮＳＥ−陽性ニューロンがここで他の場所に
開示されているプロトコルを用いて時々発生することを描写する影像である。移
行細胞（淡褐色）との接触は１回の未分岐突起により保たれる。

【図３Ｄ】 図３Ｄ、明らかな静脈瘤（矢印）を有する長い突起を形成するＮＳＥ−陽性ニ
ューロンを描写する影像である。ここに開示されているデータは、ニューロン細
胞本体が移行細胞と密に接触していることを示す。

【図３Ｅ】 図３Ｅは、変動する形態のｒＭＳＣ由来ニューロンのクラスターが複雑な網目
構造を形成することを描写する影像である。ここに開示されているデータは、未
分化ｒＭＳＣ（＞）が突起のこの網目構造内に包含されることを示す。（倍率＝
３２０Ｘ）。

【図３Ｆ】 図３Ｆは、誘導されていないｒＭＳＣ類（Ｕ）中の低水準のＮＳＥの発現を示
すウェスタンブロット分析の影像である。ここに開示されているデータは、ＮＳ
Ｅ発現における有意な増加がＢＭＥ処理（Ｉ）から５時間後に明白であることを
示す。匹敵する水準のチューブリンが各列で検出され、サンプルの等しい充填を
示す。

【図４Ａ】 図４Ａは、モノクローン性の抗−ＮｅｕＮ抗体（ケミコン(Chemicon)、テメユ
ーラ、カリフォルニア州）を用いるｒＭＳＣ由来ニューロン中のＮｅｕＮ発現を
描写する影像である。手短に述べると、ここに開示されているデータはＮｅｕＮ
類がｒＭＳＣ由来ニューロン（矢印）の核および周囲細胞質で検出できることを
示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、モノクローン性抗−ＮｅｕＮ抗体（ケミコン）を用いるｒＭＳＣ由
来ニューロンにおけるＮｅｕＮ発現を描写する影像である。手短に述べると、こ
こに開示されているデータはＮｅｕＮ類がｒＭＳＣ由来ニューロン（矢印）の核
および周囲細胞質で検出できることを示す。さらに、ここに開示されているデー
タは抗−ＮｅｕＮ抗体染色が陽性細胞の突起中に及ばないことも示す。この影像

【外８】 ことも描写している。

【図５Ａ】 図５Ａは、細胞を分化することによるＮＦ−Ｍおよびタウの発現を描写する影
像である。手短に述べると、ｒＭＳＣ由来ニューロンを免疫染色して抗−ＮＦ−
Ｍポリクローン性抗体（ケミコン）を用いてＮＦ−Ｍの発現を検出した。ここに
開示されているデータは、ニューロン形態を示す細胞が細胞本体（矢印）および
突起（＊）の両方でＮＦ−Ｍを発現することを示す。平らな未分化ｒＭＳＣ類（
＞）はＮＦ−Ｍ発現に関して染色しない。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、２０マイクログラムの精製したＮＦ−Ｍ蛋白質を用いる一晩にわた
る４℃における抗−ＮＦ−Ｍ抗体（ケミコン）の予備吸着がＮＦ−Ｍ染色の特異
性を示すｒＭＳＣ由来ニューロンの染色を排除したことを描写する影像である。

【図５Ｃ】 図５Ｃは、抗−タウポリクローン性抗体（シグマ・ケミカル・カンパニー(Sig ma Chemical Co.)、セントルイス、ミズーリ州）を用いるタウの発現に関して染
色されたｒＭＳＣ由来ニューロンを描写する影像である。ここに開示されている
データは、ニューロン形態（矢印）を示す細胞は細胞本体内でタウ発現に関して
濃褐色に染色しそして突起（＊）中に及ぶことを示す。平らな未分化ｒＭＳＣ類
（＞）はタウを発現せずそして染色されない。（倍率＝３２０Ｘ）。

【図５Ｄ】 図５Ｄは、抗−タウポリクローン性抗体（シグマ・ケミカル・カンパニー、セ
ントルイス、ミズーリ州）を用いるタウの発現に関して染色されたｒＭＳＣ由来
ニューロンを描写する影像である。ここに開示されているデータは、ニューロン
形態（矢印）を示す細胞は細胞本体内でタウ発現に関して濃褐色に染色しそして
突起（＊）中に及ぶことを示す。平らな未分化ｒＭＳＣ類（＞）はタウを発現せ
ずそして染色されない。（倍率＝３２０Ｘ）。

【図６Ａ】 図６Ａは、ｒＭＳＣ由来ニューロンのＦＭ１−４３標識を描写する影像である
。ここに開示されているデータは、ＫＣｌを用いて偏光解消されたｒＭＳＣ由来
ニューロンは末端推定成長錐状体（空白の三角形により示されている）の強い標
識を示す。

【図６Ｂ】 図６Ｂは、ｒＭＳＣ由来ニューロンのＦＭ１−４３標識を描写する影像である
。ここに開示されているデータは、ＫＣｌを用いて偏光解消されたｒＭＳＣ由来
ニューロンは末端推定成長錐状体（空白の三角形により示されている）の強い標
識を示す。

【図７Ａ】 図７Ａは、クローン性ｒＭＳＣ系統の分化を描写する影像である。ここに開示
されている分化プロトコルを受けた個別のｒＭＳＣクローン＃１のＮＳＥ−染色
。ＮＳＥ−陽性細胞（濃褐色）は各クローン系統から由来する。未分化ｒＭＳＣ

【外９】 ２０Ｘ）。

【図７Ｂ】 図７Ｂは、クローン性ｒＭＳＣ系統の分化を描写する影像である。ここに開示
されている分化プロトコルを受けた個別のｒＭＳＣクローン＃２のＮＳＥ−染色
。ＮＳＥ−陽性細胞（濃褐色）は各クローン系統から由来する。未分化ｒＭＳＣ

【外１０】 ２０Ｘ）。

【図７Ｃ】 図７Ｃは、クローン性ｒＭＳＣ系統の分化を描写する影像である。ここに開示
されている分化プロトコルを受けた個別のｒＭＳＣクローン＃３のＮＳＥ−染色
。ＮＳＥ−陽性細胞（濃褐色）は各クローン系統から由来する。未分化ｒＭＳＣ

【外１１】 ２０Ｘ）。

【図７Ｄ】 図７Ｄは、クローン性ｒＭＳＣ系統の分化を描写する影像である。ここに開示
されている分化プロトコルを受けた個別のｒＭＳＣクローン＃１のＮＳＥ−染色
。ＮＳＥ−陽性細胞（濃褐色）は各クローン系統から由来する。未分化ｒＭＳＣ

【外１２】 ２０Ｘ）。

【図８Ａ】 図８Ａは、ヒトＭＳＣ類の分化を描写する影像である。ここに開示されている
データは、ヒトＭＳＣ類がニューロンに分化しそして高水準のＮＳＥ（濃褐色）

【外１３】 左下に描写されている。

【図８Ｂ】 図８Ｂは、ＮＳＥ−陽性のｈＭＳＣ由来ニューロンがニューロン類似末端バル
ブ形態を示す突起を形成することを描写する影像である。

【図８Ｃ】 図８Ｃは、対になったＮＳＥ−陽性ニューロンの位相差影像を描写する影像で
ある。ここに開示されているデータは、糸状足延長部分（複合矢印）を有する成
長錐状体形態を示す。この影像は詳細を示すために５０％拡大されている。

【図８Ｄ】 図８Ｄは、ｈＭＳＣ由来ニューロンがＮＦ−Ｍに関して陽性に染色することを
描写する影像である。（倍率＝３２０Ｘ）。

【図９Ａ−９Ｆ】 図９Ａ−９Ｆを含んでなる図９は、ｒＭＳＣ由来ニューロンの分化におけるネ
スチンおよびｔｒｋＡを描写する影像である。図９Ａ−９Ｃは、それぞれ５時間
、１日間、および６日間におけるネスチン発現に関して染色された細胞を示す。
図９Ｄ−９Ｆは、それぞれ５時間、１日間、および６日間におけるｔｒｋＡ発現
に関して染色された細胞を示す。（倍率＝３２０Ｘ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 21/00 21/00 25/00 25/00 25/08 25/08 25/16 25/16 25/28 25/28 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 ブラツク，イラ・ビー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08558 スキルマン・モンゴメリーロード158 (72)発明者 ウツドベリー，デイル・エル アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08854 ピスカタウエイ・カンタベリーコート46 (72)発明者 プロコツプ，ダーウイン・エム アメリカ合衆国ルイジアナ州70130ニユー オーリンズ・セントチヤールズアベニユー 1750・アパートメント522 (72)発明者 シユワルツ，エミリー アメリカ合衆国ルイジアナ州70123リバー リツジ・シトラスブールバードジエイ258 5222 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4B065 AA93X AA99Y AB01 AC14 BA02 BB34 CA24 CA44 4C084 AA17 DB52 MA70 NA14 ZA011 ZA021 ZA061 ZA161 ZA891 ZA941 ZA961 ZB071 ZB261 4C206 AA01 AA02 JA19 JA61 MA04 MA90 NA14 ZA01 ZA02 ZA06 ZA16 ZA89 ZB26

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された骨髄間質細胞のニューロン細胞への分化を誘導す
   る方法であって、該方法が該単離された骨髄間質細胞を少なくとも１種のニュー
   ロン分化−誘導化合物と接触させ、それにより該単離された骨髄間質細胞のニュ
   ーロン細胞への分化を誘導することを含んでなる方法。
2. 【請求項２】 該単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項１の方
   法。
3. 【請求項３】 該ニューロン分化−誘導化合物が栄養因子である、請求項１
   の方法。
4. 【請求項４】 該ニューロン分化−誘導化合物が成長因子である、請求項１
   の方法。
5. 【請求項５】 該成長因子が血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子２、
   および神経成長因子よりなる群から選択される、請求項４の方法。
6. 【請求項６】 該ニューロン分化−誘導化合物が抗酸化剤である、請求項１
   の方法。
7. 【請求項７】 該抗酸化剤がベータ−メルカプトエタノール、ジメチルスル
   ホキシド、ブチル化されたヒドロキシトルエン、ブチル化されたヒドロキシアニ
   ソール、アスコルビン酸、フマル酸ジメチル、およびｎ−アセチルシステインよ
   りなる群から選択される、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 該抗酸化剤がベータ−メルカプトエタノールである、請求項
   ７の方法。
9. 【請求項９】 該抗酸化剤がジメチルスルホキシドである、請求項７の方法
   。
10. 【請求項１０】 該抗酸化剤がジメチルスルホキシドおよびブチル化された
    ヒドロキシアニソールである、請求項７の方法。
11. 【請求項１１】 単離されたニューロン細胞の製造方法であって、該方法が
    骨髄間質細胞を単離し、該骨髄間質細胞をニューロン分化−誘導化合物と接触さ
    せ、ここで該化合物が該単離された骨髄間質細胞が単離されたニューロン細胞へ
    分化するのを誘導し、それにより該単離されたニューロン細胞を製造することを
    含んでなる方法。
12. 【請求項１２】 中枢神経系の疾病、障害または症状のあるヒト患者の処置
    方法であって、該方法がヒトドナーから骨髄サンプルを得、該骨髄サンプルから
    間質細胞を単離し、該間質細胞が単離されたニューロン細胞へ分化するのを誘導
    し、そして該単離されたニューロン細胞を該ヒト患者の中枢神経系に投与し、こ
    こで該ヒト患者の中枢神経系内の該単離されたニューロン細胞の存在が該疾病、
    障害または症状の処置に有効である、ことを含んでなる方法。
13. 【請求項１３】 中枢神経系の該疾病、障害または症状がアルツハイマー病
    、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性外側硬化症、腫瘍、外傷、老人性
    痴呆症、テイ−サックス病、サンドホッフ病、フルラー症候群、クラッベ病、分
    娩で誘導される外傷性中枢神経系損傷、癲癇、多発性硬化症、外傷、腫瘍、発作
    、および脊髄損傷よりなる群から選択される、請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 該単離されたニューロン細胞を投与する前に、治療用蛋白
    質をコードする単離された核酸で該単離されたニューロン細胞をトランスフェク
    トし、ここで該蛋白質が該細胞中で発現する時に該蛋白質が該疾病、障害または
    症状の処置に有効であるように機能する、請求項１２の方法。
15. 【請求項１５】 該単離された核酸がサイトカイン、ケモカイン、ニューロ
    トロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、およびグリオーマ毒性蛋白質よ
    りなる群から選択される治療用蛋白質をコードする、請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 ニューロン細胞を必要とするヒト患者の処置方法であって
    、該方法が骨髄間質細胞をヒト患者から得、該骨髄間質細胞を培養中でそれらの
    ニューロン細胞への分化を誘導する条件下で増殖させ、該ニューロン細胞を該ニ
    ューロン細胞を必要とする該ヒト患者に移植し、それによりニューロン細胞を必
    要とする該ヒト患者を処置することを含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 単離された骨髄間質細胞の分化を誘導する方法により製造
    される単離されたニューロン細胞であって、該方法が該単離された骨髄間質細胞
    を少なくとも１種のニューロン分化−誘導化合物と接触させ、それにより該単離
    された骨髄間質細胞の該ニューロン細胞への分化を誘導することを含んでなるよ
    うな細胞。
18. 【請求項１８】 該細胞がヒト細胞である、請求項１７の細胞。
19. 【請求項１９】 単離された骨髄間質細胞の分化を誘導する方法により製造
    される単離されたニューロン細胞であって、該方法が該単離された骨髄間質細胞
    を少なくとも１種のニューロン分化−誘導化合物と接触させ、それにより該単離
    された骨髄間質細胞の該ニューロン細胞への分化を誘導し、ここで治療用蛋白質
    をコードする単離された核酸で該ニューロン細胞をさらにトランスフェクトし、
    そしてさらにここで該蛋白質が該細胞中で発現する時に該蛋白質が中枢神経系の
    疾病、障害または症状の処置に有効であるように機能するような細胞。
20. 【請求項２０】 該単離された核酸がサイトカイン、ケモカイン、ニューロ
    トロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、およびグリオーム毒性蛋白質よ
    りなる群から選択される治療用蛋白質をコードする、請求項１９の細胞。
21. 【請求項２１】 該細胞がヒト細胞である、請求項１９の細胞。
22. 【請求項２２】 単離されたニューロン細胞を製造する方法により製造され
    る単離されたニューロン細胞であって、該方法が骨髄間質細胞を単離し、該骨髄
    間質細胞をニューロン分化−誘導化合物と接触させ、ここで該化合物が該単離さ
    れた骨髄間質細胞が該単離されたニューロン細胞に分化するのを誘導し、それに
    より該単離されたニューロン細胞を製造することを含んでなるような細胞。
23. 【請求項２３】 該細胞がヒト細胞である、請求項２２の細胞。
24. 【請求項２４】 単離されたニューロン細胞を製造する方法により製造され
    る単離されたニューロン細胞であって、該方法が骨髄間質細胞を単離し、該骨髄
    間質細胞をニューロン分化−誘導化合物と接触させ、ここで該化合物が該単離さ
    れた骨髄間質細胞が該単離されたニューロン細胞へ分化するのを誘導し、それに
    より該単離されたニューロン細胞を製造し、ここで該ニューロン細胞を治療用蛋
    白質をコードする単離された核酸でさらにトランスフェクトし、そしてさらにこ
    こで該蛋白質が該細胞中で発現する時に該蛋白質が中枢神経系の疾病、障害また
    は症状の処置に有効であるように機能するような細胞。
25. 【請求項２５】 該単離された核酸がサイトカイン、ケモカイン、ニューロ
    トロフィン、他の栄養蛋白質、成長因子、抗体、およびグリオーム毒性蛋白質よ
    りなる群から選択される治療用蛋白質をコードする、請求項２４の細胞。
26. 【請求項２６】 該細胞がヒト細胞である、請求項２５の細胞。