JP2010529987A - ｉｎｖｉｔｒｏで培養および増殖させた自己複製性コロニー形成細胞を用いる疾患および障害の治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、低次継代および長期継代培養した、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）を用いた、多種多様な疾患および障害を予防および治療し、組織および器官を修復および再生するための方法および細胞の使用に関する。例えば、成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）またはそのような細胞によって産生される組成物は、単独で、または他の成分と併用すると、例えば心血管、神経、外皮、皮膚、歯周および免疫媒介性の疾患、障害、病状および傷害を治療するのに有用である。

Description

発明の背景
本発明は、一般に、様々な疾患および障害の治療のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）、およびそのような細胞によって産生される組成物の生成および使用に関する。そのようなＣＦ−ＳＣの一例は、成人ヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、増殖させた、自己複製性コロニー形成細胞によって産生される様々な可溶性または分泌組成物の生成を調節（すなわち、上方制御または下方制御）するための、培養中のＣＦ−ＳＣ細胞集団の操作にも関する。
本発明の分野は、細胞ベースおよび組織工学的療法、詳細には、薬学的に許容される担体（薬学的に許容される溶液、または一時的、永久的もしくは生物分解性マトリックス）への組込みまたはそれとの混合を介した投与を含めた、ＣＦ−ＳＣ、またはそのような細胞によって産生される組成物を使用および／または投与する方法にも関する。
細胞ベースの療法
全体の目的が損傷組織の機能的および／または美容的な修復である、慢性および急性の組織損傷を管理および治療するための細胞ベースの療法の利用には、２つの主要な選択肢がある。これらの細胞ベースの療法の選択肢には、以下のものが含まれる。１）細胞置換−長期移植を確立することによる損傷組織を置換するための細胞の使用；２）栄養因子の供給−長期移植なしで細胞によって送達または産生される因子の放出を介した内因性修復機構を刺激するための、細胞および細胞によって産生される組成物（例えば、成長因子）の使用。
本発明は、長期の細胞移植に依存しない、細胞ベースの療法の使用に関する。詳細には、本発明は、様々な疾患および障害、特に限定的自己複製能を有する組織および器官（例えば神経および心臓の組織および器官）に関係するものの治療における、細胞および細胞によって産生される組成物の使用に関する。
組織損傷の管理および治療における細胞ベースの治療選択肢は、自己由来または同種異系の細胞の使用の可能性も提供する。これらは、それぞれ、一定の利点および欠点を有する。自己由来細胞の使用は、以下の因子またはパラメータを含む。
・患者が提供者である；
・患者別の細胞生成物の製造を必要とする；
・細胞生成物の同一性、純度および効力の変動性；ならびに
・治療するとの臨床判断と移植用細胞の入手可能性との間のラグタイム。
対照的に、同種異系細胞の使用は、以下の因子またはパラメータを含む。
・提供者は、第二者である（すなわち、提供者は患者でない）；
・提供者変動性に付随するリスク；
・細胞生成物の製造バッチにつき複数の患者を治療できる；
・細胞生成物の同一性、純度および効力の一貫性の向上；ならびに
・治療するとの臨床判断と細胞生成物の入手可能性との間のラグタイムの低減。
本発明は、主に、同種異系細胞の使用を含む治療に関する。しかし、自己由来細胞を用いてこれらの同じ治療を実施することも、同様に可能であろう。
器官および組織修復
哺乳動物の体のある組織の再生能は、何世紀もの間知られており、例えば、皮膚および骨のような組織は、傷害を受けた後に自らを修復することが知られている。しかし、中枢神経系（すなわち、脳および脊髄）、末梢神経系および心臓のいくつかの状態および疾患は、影響された組織における再生能の欠損のため、ヒトに有害な影響を及ぼす。これらの状態および疾患には、例えば、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、外傷性脳損傷、脳腫瘍、ファブリー病、心臓疾患（例えば、うっ血心不全および心筋梗塞）が含まれる。臨床上の管理戦略は、例えば、損傷を受けた組織（例えば、ニューロン、グリア細胞、心筋）の置換または修復よりも、さらなる損傷または傷害の予防に注目することが多く、それらには外来性のステロイドおよび合成の、非細胞性医薬による治療が含まれ、それらは、ステロイドまたは合成薬の連続投与に依存し得る様々な成功度を有する。
例えば、大多数の脊髄損傷は圧縮傷害であり、残りの症例は脊髄の完全な離断を含む。脊髄損傷のための現在の治療処置には、外科的および非外科的処置を通して脊柱を物理的に安定させること、およびステロイド療法により炎症応答を阻止することによる、さらなる脊髄損傷の予防が含まれる。
さらに、加齢は、哺乳動物に影響を及ぼすほとんどすべての一般的な疾患に対する主要なマイナス要素であり、皮膚、骨、目、脳、肝臓、腎臓、心臓、血管系、筋肉、その他のものを含む多くの組織の変性における加齢の基本的特徴の１つである。さらに、ある体組織のすでに限定されている再生能は、人生の過程でほとんどすべての組織衰退において、年齢、組織の維持および修復機構によって衰退することが知られている。
したがって、疾患および状態、特に、ヒトの神経および心臓の疾患ならびに加齢性変性状態のための、新しい、改善された有効な治療方法を開発する必要がある。
赤血球形成
健康なヒトまたは他の哺乳動物の造血細胞は、限定された長期自己複製能を通常有しない。しかし、血液の破滅的な損失（またはその他の形での血液の補助的供給の必要性）の可能性は、献血血液の限定的供給と合わさって、赤色血液供給をｉｎ ｖｉｔｒｏで増強、維持または生成する方法が非常に望ましいことを意味する。
血液は、血漿として知られる流体媒体中に懸濁するいくつかの型の細胞からなる、非常に専門化した循環組織である。細胞性の構成要素は以下の通りである：ヘモグロビン（肺で酸素と結合してそれを体組織へ輸送する鉄含有タンパク質）を含むので、呼吸ガスを運び、その赤色を与える赤色の血球（赤血球）、疾患と戦う白色の血球（白血球）、および血液の凝固で重要な役割をする細胞断片である血小板（栓球）。しばしば、血液に関係する医学用語は、「血液」を意味するギリシア語の単語「ｈａｉｍａ」に由来する、ｈｅｍｏ−またはｈｅｍａｔｏ−（イギリス英語：ｈａｅｍｏ−およびｈａｅｍａｔｏ−）で始まる。血球は、骨髄において、造血と呼ばれる過程で生成される。血球は、脾臓および肝臓によって分解される。健康な赤血球は１２０日の血漿半減期を有し、その後、それらは造血過程によって形成される新しい赤血球によって組織的に置換される。血液輸血は、血液の最も一般的な治療的使用である。それは、通常、ヒト献血者から得られる。異なる血液型があり、誤った血液の輸血は重度の合併症の原因となることがあるので、正しい型が輸血されるように交差適合試験が実施される。
輸血のための血液提供者の不足および赤血球の不十分な供給は、世界で共通する、患者の治療における問題点である。したがって、赤血球の利用可能性を増加させる新しく、改善された、有効な方法は、赤血球供給の世界的不足の少なくとも一部を緩和する手段を提供するであろうから、その必要性がある。
皮膚
本発明は、一部、皮膚創傷の治療に関する。表皮置換製品、真皮置換製品、人工皮膚製品および創傷被覆材などの、皮膚創傷のためのいくつかの異なる治療法が今日利用できる。これらのいくつかの例を、下で簡潔に記載する。
表皮の置換製品
製造業者によると、ＥＰＩＣＥＬ（商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）は、火傷の治療のための患者自身の皮膚の生検材料から増殖させた、自己由来の表皮細胞皮膚で構成される。細胞は、マウス支持細胞系と共培養され、自己由来の表皮のシートにされる。
製造業者によると、ＭＹＳＫＩＮ（商標）（ＣｅｌｌＴｒａｎ社、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、Ｓ１ ４ＤＰ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）は、火傷、潰瘍および他の非治癒創傷の治療のための、培養した自己由来の表皮代用品である。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、個々の患者の組織から増殖させた生細胞を含む。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、それらが治癒を開始することができる創傷への細胞の移動を促進する、高度重合体様コーティング上のケラチノサイト（表皮細胞）の層を含む。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、細胞送達、創傷被覆をサポートし、滲出物管理を可能にするために、医療グレードのシリコーン基質層を用いる。
製造業者によると、ＥＰＩＤＥＸ（商標）（Ｍｏｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、Ｌａｕｓａｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、非外科的方法で患者から直接採取された髪に由来する幹細胞および前駆細胞から直接増殖させた、自己由来の表皮皮膚同等物である。
製造業者によると、ＣＥＬＬＳＰＲＡＹ（商標）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２ １ＮＬ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）は、速やかな表皮カバーを提供し、治癒を促進し、傷跡の状態を最適化するために損傷皮膚の上に噴霧される、培養上皮自家移植懸濁液である。
真皮置換製品
製造業者によると、ＩＮＴＥＧＲＡ（商標）真皮再生鋳型（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）は、皮膚置換用の二層膜系である。真皮置換層は、制御された空隙率および規定の分解速度で製造される、架橋ウシ腱コラーゲンの線維およびグリコサミノグリカン（コンドロイチン−６−硫酸）の多孔性マトリックスで作製される。一時的な表皮代用層は、合成ポリシロキサン重合体（シリコーン）で作製され、創傷からの水分損失を制御する働きをする。コラーゲン真皮置換層は、創傷床に由来する線維芽細胞、マクロファージ、リンパ球および毛細管の浸入のためのマトリックスの役目を果たす。
製造業者によると、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｈｅａｌｉｎｇ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）は、全層糖尿病性潰瘍のために指示される、生物分解性メッシュ骨格上に増殖させた同種異系新生児線維芽細胞である。
製造業者によると、ＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ ０１８１０）Ｐｅｒｍａｃｏｌ（商標）外科用移植材料は、ヒト体内に移植した場合、非アレルギー性で持続性である、ブタ真皮由来のコラーゲンである。
製造業者によると、ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｈｅａｌｉｎｇ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７）ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）は、ヒト包皮由来線維芽細胞の一時的皮膚代用品（同種異系）である。本製品は、ポリマー膜および、無菌条件下においてナイロンメッシュ上でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した新生児のヒト線維芽細胞からなる。細胞増殖の前に、このナイロンメッシュをブタの真皮コラーゲンで被覆して、ポリマー膜（シリコーン）に結合させる。この製品を火傷に適用すると、この膜は透明な合成表皮を提供する。ヒト線維芽細胞に由来する一時的な皮膚代用品は、一時的な防御バリアを提供する。ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）は透明であり、目視による創傷床の直接モニタリングを可能にする。
製造業者によると、ＲＥＮＧＲＡＮＥＸ（商標）ゲル（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社（Ｃ）ＥＴＨＩＣＯＮ社）は、ゲル内の組換え体ＰＤＧＦで作製された、局所用創傷ケア製品である。
人工皮膚製品（表皮および真皮の複合製品）
製造業者によると、ＰＥＲＭＡＤＥＲＭ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）ＰＥＲＭＡＤＥＲＭ（商標）は、自己由来の皮膚の表皮および真皮の層から構築され、重度の火傷の治療に指示される。この製品は柔軟性があり、患者と一緒に成長することが報告されている。
製造業者によると、ＯＲＣＥＬ（商標）（Ｏｒｔｅｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）は、ウシコラーゲンで培養した同種異系表皮細胞および線維芽細胞から作製された二層構築物で、分層火傷に指示される。製造業者は、この製品で治療した２人のヒト患者において、それぞれ２週時または３週時に検出可能な製品由来のＤＮＡの証拠を報告していない。
製造業者によると、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（商標）（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ社、Ｌｏｎｄｏｎ、ＷＣ２Ｎ ６ＬＡ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）は、ウシコラーゲンで培養した同種異系表皮細胞および線維芽細胞であり、静脈性脚潰瘍に指示される。
創傷被覆材
製造業者によると、３Ｍ（商標）ＴＥＧＡＤＥＲＭ（商標）透明膜被覆材（３Ｍ社、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）は、外部の汚染物に対して細菌およびウイルスのバリアを提供する通気性フィルムである。
製造業者によると、ＴＩＳＳＥＥＬ（商標）ＶＨフィブリンシーラント（Ｂａｘｔｅｒ社、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）は、止血の補助としての使用を指示される。
発明の要旨
本発明は、安定細胞集団およびそれによって生成される組成物の生成および使用に関する。本明細書で用いるように、用語「安定細胞集団」とは、哺乳動物の生物体（例えばマウス、ラット、ヒト、イヌ、ウシなど）に導入されても、専門化した１つまたは複数の細胞型（例えば軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞など）に分化した細胞の検出可能な生成をもたらさない、単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞集団を意味し、そこでは、細胞集団内の細胞は、少なくとも１つの治療上有用な組成物（例えば、膜に結合しているか可溶性のＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃなどに示す組成物など）の検出可能なレベルを発現するか、または発現する能力もしくは発現するように誘導される能力を維持する。
本発明の安定細胞集団の別の特徴は、細胞が異所性分化を示さないということである。用語「異所性」は、「間違った場所」または「場違い」を意味する。用語「異所性」は、「置換」を意味するギリシア語「ｅｋｔｏｐｉｓ」（「ｅｋ」は外、＋「ｔｏｐｏｓ」は場所＝場違い）が語源である。例えば、異所性腎臓は、通常の場所にないものであり、または、子宮外妊娠は「異所性妊娠」である。本文脈では、異所性分化の例は、心臓組織に導入されると、骨組織様カルシウム沈着および／または骨化を起こす細胞であろう。この現象は、例えば、間葉性幹細胞が心臓組織に注入されるときに起こることが証明されている。Ｂｒｅｉｔｂａｃｈら、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｉｓｋｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｔｏ Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ Ｈｅａｒｔｓ」、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻、４号（２００７年８月）を参照。
本発明は、様々な疾患および障害の治療のための、増殖させた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した自己複製性コロニー形成体細胞（以下、「ＣＦ−ＳＣ」と称す）、ならびにそのような細胞によって産生される生成物の生成および使用に関する。さらに、本発明は、様々な疾患および障害の治療のための、長期間増殖させた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した自己複製性コロニー形成体細胞（以下、「ｅｘＣＦ−ＳＣ」と称す）、ならびにそのような細胞によって産生される生成物の生成および使用にも関する。ｅｘＣＦ−ＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養中、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の細胞集団倍加を経た自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）である。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた自己複製性コロニー形成体細胞は、以下、「ＣＦ−ＳＣ」と称す（したがって、特に明記しない限り、この用語は、集団の約３０回未満の倍加（例えば、集団の約５回未満、約１０回未満、約１５回未満、約２０回未満、約２５回未満の倍加）を経た細胞集団、そのうえ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで集団の約３０回を超える倍加、約４０回を超える倍加または約５０回を超える倍加を経た細胞集団の両方を包含する）。ＣＦ−ＳＣの一特定例は、成人のヒト骨髄由来体細胞（以下、「ＡＢＭ−ＳＣ」と称す）である。さらに、ｅｘＣＦ−ＳＣの一特定例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中に、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加を経た、成人ヒト骨髄由来体細胞である（以下、「ｅｘＡＢＭ−ＳＣ」と称す）。したがって、特に明記しない限り、用語「ＡＢＭ−ＳＣ」は、集団の約３０回未満の倍加（例えば、集団の約５回未満、約１０回未満、約１５回未満、約２０回未満、約２５回未満の倍加）を経たＡＢＭ−ＳＣ細胞集団、そのうえ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで集団の約３０回を超える倍加、約４０回を超える倍加または約５０回を超える倍加を経たＡＢＭ−ＳＣ細胞集団の両方を包含する。本明細書で用いるように、用語「長期間増殖させた」は、細胞集団の少なくとも約３０回以上の倍加を経た細胞集団を指し、そこでは、細胞は老齢化、不死化していなく、元の細胞種で見られる正常な核型を維持し続ける。
本明細書で用いるように、用語「自己複製の実質的な能力」は、複数世代の細胞後代の生成をもたらす多数の細胞分裂周期を通り抜ける能力を有することを意味する（したがって、各細胞分裂で、１つの細胞は２つの「娘細胞」を生成し、少なくとも１つの娘細胞はさらなる細胞分裂が可能である）。「自己複製の実質的な能力」の１つの尺度は、細胞の少なくとも約１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回またはそれ以上の倍加を経る細胞集団の能力によって示される。「自己複製の実質的な能力」の別の尺度は、（同じか類似した培養条件が維持される場合）細胞継代培養後の組織培養容器内で再増殖するか、または集密に近づく細胞集団の能力の維持によって示される。したがって、初期の細胞培養倍加の間（例えば、細胞集団が集団の約１０回を超える倍加を経る前）に、そのような再増殖のために必要とされる時間の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の期間で、細胞集団が組織培養容器で再増殖し続ける場合に、「自己複製の実質的な能力」の例が実証される。「自己複製の実質的な能力」の別の尺度は、集団倍加時間の一貫した速度、または集団倍加の一貫した、比較的速やかな速度の維持である。
本明細書で用いるように、用語「実質的に多分化能のない」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、複数の異なる細胞型に分化することができない細胞集団を意味する。実質的な多分化能を有する細胞の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、その他に分化することができる造血幹細胞である。実質的な多分化能を有する細胞の別の例は、例えば、骨細胞（骨）、脂肪細胞（脂肪）または軟骨細胞（軟骨）に分化することができる間葉性幹細胞である。対照的に、「実質的に多分化能のない」細胞集団の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または生物体もしくは標的組織に導入された場合はｉｎ ｖｉｖｏで、複数の細胞型に分化することができない。本発明の好ましい実施形態では、「実質的に多分化能のない」細胞集団は、細胞集団内の細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで検出が可能になるように、複数の細胞型に分化するように誘導することができない細胞集団である。「単分化能」細胞または「単分化能前駆細胞」は、実質的に多分化能を有しない細胞の例である。
本明細書で用いるように、「幹細胞」は以下の２つの特性を有する１つまたは複数の細胞を意味する：１）未分化状態を維持しつつ、多数の細胞分裂周期を通り抜ける能力である、自己複製能；および、２）１種類または複数種類の成熟細胞型に変化し、そのような変化の後には、細胞分裂周期を経ることはもはやない能力（例えば、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、などへ変化する能力）である分化能。本明細書で用いるように、分化能は、細胞が全能性、多能性、多分化能性または単分化能性の前駆細胞であることを意味する。「間葉性幹細胞」はこの同じ定義の幹細胞であるが、前記細胞は、間葉組織（例えば骨髄、脂肪質または軟骨）から誘導されたか、または得られた。Ｈｏｒｗｉｔｚら、「Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＭＳＣ： Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ」、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、７巻、５号、３９３〜３９５頁（２００５年）；および、その中の引用文献を参照。
本明細書で用いるように、「全能性」は、細胞起源の生物体の任意の成長段階で見られるような、任意の細胞型になることができる細胞を意味する。全能性細胞は、一般的に受精卵の最初の数分裂によって（すなわち、卵と精子細胞との融合の後）生成される。したがって、全能性細胞は、胚および胚体外の細胞型に分化することができる。
本明細書で用いるように、「多分化能」は、細胞起源の生物体で見出される３つの胚層（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞を意味する。
本明細書で用いるように、「多能」は、数種類（すなわち、複数の型）の分化細胞を生成することができる細胞を意味する。間葉性幹細胞は、多能性細胞の例である。
本明細書で用いるように、「単分化能」は、１細胞型だけを生成することができる細胞を意味する。単分化能細胞は自己複製の性質を有するが、ただ１種類の成熟細胞型に変化することができる。
本明細書で用いるように、「正常な核型」は、その細胞が由来する種で一般に見出され、それが正常とみなされる数および構造の染色体を含む遺伝的組成物を有することを意味する。
本明細書で用いるように、「結合組織」は、従来の分類で通常参照される４つの型の組織の１つである（他は、上皮、筋肉および神経組織）。結合組織は生物体および器官の構造および支持体に含まれ、中胚葉に通常由来する。本明細書で用いるように、「結合組織」は、「真性結合組織」、「専門化した結合組織」および「胚性結合組織」と呼ばれることもある組織を含む。
「真性結合組織」には、輪紋状の（または疎な）結合組織が含まれ、それは、器官および上皮を適所に保持し、コラーゲンおよびエラスチンを含む様々なタンパク性線維を有する。真性結合組織には、靭帯および腱を形成する緻密な結合組織（または線維性結合組織）も含まれる。
「専門化した結合組織」には、血液、骨、軟骨、脂肪および網様の結合組織が含まれる。網様の結合組織は、リンパ様器官（リンパ節、骨髄および脾臓）を支える軟骨格を形成する網様線維（微細なコラーゲン、ＩＩＩ型）のネットワークである。
「胚性結合組織」には、間葉性結合組織および膠様結合組織が含まれる。間葉（別名胚性結合組織）は、主に胚の中胚葉（三層胚盤の中間層）から発達する組織の塊である。粘稠度は粘性であり、間葉は、コラーゲン束および線維芽細胞を含む。間葉は、血管、血液関係の器官および結合組織に後に分化する。膠様結合組織（または粘液組織）は、胎児成長の間に見られる種類の結合組織である。それは、ウォートンゼリー（へその緒で細胞を保護、遮蔽する役目を果たす、へその緒の中のゲル状物質）の成分として、最も容易に見出される。
本明細書で用いるように、「不死化された」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無限回の細胞倍加を経ることができる細胞または細胞系を指す。不死化された細胞は、絶えず分裂する細胞の能力に対する自然の制限を除去または回避する遺伝的変更を通して、そのような能力を得る。対照的に、「非不死化」細胞は、生物体から直接採取されてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した場合（「一次細胞培養」を生成する）、老化（分裂能力を失うこと）し、死に至る前に限定回数の細胞倍加を経ることができる真核細胞である。例えば、ほとんどの型の哺乳動物の非不死化細胞の一次培養物は、分化、老化または致死の前に、比較的明確であるが再現可能的に限定された範囲の細胞倍加（一次細胞型によって決まる）を通常経ることができる。
本明細書で用いるように、「長期の移植」は、それに対して（または、その中に）提供者細胞が投与から約４週間を超えた後に送達された標的組織の中に（またはその一部として）存在する提供者細胞の検出可能な存在を意味する。「約４週間を超える」には、約５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２４週間を超える期間が含まれる。「約４週間を超える」には、約６カ月、８カ月、１０カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月、３６カ月、４２カ月および４８カ月を超える期間も含まれる。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、増殖させた自己複製性コロニー形成細胞によって産生される様々な可溶性の、または分泌された組成物の産生を調節（すなわち、上方制御または下方制御）するための、培養中のＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ細胞集団の操作にも関する。
本発明は、骨の細胞（骨細胞）に分化する能力の喪失を特徴とする長期間増殖させた細胞集団にも関する。例えば、本発明は、補助的骨モルフォゲンであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）の存在下での培養の有無を含む、骨誘導条件下で培養した場合のカルシウム沈着を生じさせる能力の喪失を特徴とする、長期間増殖させた細胞集団に関する（実施例１６を参照）。（マウスおよびヒトのノギン：例えば、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＰｕｂＭｅｄタンパク質データベースアクセッション番号ＮＰ＿０３２７３７およびＮＰ＿００５４４１（それぞれ）を参照；また、例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｏｇｇｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５巻（９号）、６０７７〜６０８４頁（１９９５年）を参照）。
本発明は、骨細胞に分化する能力の喪失および／または（上述の）カルシウム沈着を生成する能力の喪失を特徴とする長期間増殖させた細胞集団にも関するが、前記細胞集団は、少なくとも１つの治療上有用な組成物を分泌し続けるか、または分泌するかもしくは分泌するように誘導される能力を維持する。
本発明は、細胞ベースおよび組織工学的療法、詳細には、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、またはそのような細胞によって産生される組成物を使用および／または投与する方法、例えば、薬学的に許容される担体（例えば薬学的に許容される溶液または一時的、永久的もしくは生物分解性マトリックス）への組込みまたはそれとの混合を介した投与にも関する。
本発明は、ＳＴＲＯ−１細胞表面マーカーの発現が好ましくは陰性である、増殖させた（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養および継代培養した）、および長期間増殖させた細胞集団にも関する。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、「ＳＴＲＯ−１， ＨＯＰ−２６ （ＣＤ６３）， ＣＤ４９ａ ａｎｄ ＳＢ−１０ （ＣＤ １６６） ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｙ： ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２００３年９月；３１３巻（３号）：２８１〜９０頁；Ｄｅｎｎｉｓら、「Ｔｈｅ ＳＴＲＯ−１＋ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ．２００２年；１７０巻（２〜３号）：７３〜８２頁；Ｏｙａｊｏｂｉら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ ｕｓｉｎｇ ＳＴＲＯ−１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．１９９９年３月；１４巻（３号）：３５１〜６１頁を参照。
本発明は、追加の構造的および／または治療的な成分と一緒にＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を含む、薬学的に許容される組成物の製造および使用にも関する。一例として、ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）およびコラーゲンを薬学的に許容される溶液で組み合わせて、例えば、皮膚障害（例えば、火傷、擦過、裂傷、潰瘍、感染症などの皮膚創傷）の治療、修復および再生で使用するための、液体、半固体または固体様の形態（マトリックス）の組成物を生成することができる。
一般に本発明は、長期継代培養したコロニー形成体細胞（ｅｘＣＦ−ＳＣ）を含む、本明細書でコロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）と呼ぶ自己複製性の細胞の使用に関する。そのような細胞の例は、様々な疾患および障害、特に、虚血、外傷および／または炎症を含む疾患および障害（例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）による心不全および脳卒中）の治療で使用するための、長期継代培養した成人ヒト骨髄に由来する体細胞（ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を含む成人ヒト骨髄に由来する体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）である。
本発明で用いられる成人ヒト骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）などの自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）は、米国特許出願公開第２００３００５９４１４号（２００１年９月２１日に出願の米国特許出願第０９／９６０，２４４号）および米国特許出願公開第２００４００５８４１２号（２００２年９月２０日に出願の米国特許出願第１０／２５１，６８５号）に記載のように調製される。これらの特許出願のそれぞれは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
詳細には、ＣＦ−ＳＣが多集団倍加回数を通して基本的に一定の集団倍加速度を維持するように、細胞の源集団から（例えば、骨髄、脂肪、皮膚、胎盤、筋肉、臍帯血または結合組織から）単離されたＣＦ−ＳＣを、低濃度酸素条件（例えば、大気未満）の下で培養し、低い細胞密度で継代培養する。適当な細胞数へのＣＦ−ＳＣの増殖の後、ＣＦ−ＳＣを用いて本発明の組成物を生成することができる。例えば、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加のＣＦ−ＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の後、ｅｘＣＦ−ＳＣを用いて本発明の組成物を生成することができる。一実施形態では、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣは、本発明で用いるように、骨髄に由来し、（それぞれ、本明細書でＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣと称す）。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの一実施形態（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、本発明で用いるように、単離された細胞集団であり、そこでは、細胞集団の細胞はＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現し、細胞集団は、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、本発明で用いるように、単離された細胞集団であり、そこでは、細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、および、ＣＤ４４、ＨＬＡクラス−１抗原およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンからなる群から選択される１つまたは複数の細胞表面タンパク質を同時発現し、細胞集団は、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、本発明で用いるように、単離された細胞集団であり、そこでは、細胞集団の細胞はＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現するが、細胞表面プロテインＣＤ１０の発現に陰性であり、細胞集団は、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、本発明で用いるように、単離された細胞集団であり、そこでは、細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、および、ＣＤ４４、ＨＬＡクラス−１抗原およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンからなる群から選択される１つまたは複数の細胞表面タンパク質を同時発現するが、細胞表面プロテインＣＤ１０の発現に陰性であり、細胞集団は、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、本発明で用いるように、単離された細胞集団であり、そこでは、細胞集団の細胞は、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す可溶性タンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質を発現し、細胞集団は、細胞集団の少なくとも約３０回、少なくとも約４０回または少なくとも約５０回の倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
損傷組織および器官は、例えば、疾患（例えば、遺伝性（遺伝的）または感染性の疾患（例えば細菌性、ウイルス性および真菌性の感染症））、物理的外傷（例えば火傷、裂傷、擦過、圧迫または侵襲性の組織および器官の傷害）、虚血、加齢、有毒化学物質曝露、電離放射線、ならびに免疫系の調節不全（例えば、自己免疫疾患）の結果生じることがある。
本発明は、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの精製タンパク質分画、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの馴化培地の上清、ならびにＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの馴化培地に由来する細胞上清の分画の使用を包含する。本発明の一実施形態では、上述の成分は、追加の成分、例えばコラーゲンおよび／またはフィブリン（例えば、精製された天然のまたは組み換えられたヒト、ウシもしくはブタのコラーゲンまたはフィブリン）、および／またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および／または追加の構造的または治療的な化合物を含む生理的に適合する生物分解性マトリックスと組み合わせるか、それらに導入することができる。これらなどの組合せマトリックスは、損傷組織または器官の修復および／または再生を促進、増強および／または誘起するために、組織または器官の損傷部位に投与することができる。
本発明の実施形態は、液体、半固体または固体様状態で投与することができる薬学的に許容される組成物に組み込まれた、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の使用を含む。本発明の実施形態は、関連する分野の熟練技術者によって通常用いられる方法によって、例えば、注射によるスプレー用またはエアゾール化された組成物として局所投与によって、および移植によって投与することができる。
組織再生療法のための、本発明に記載のＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、これらの細胞によって産生される細胞および組成物の使用は、それ以前に記載された組織再生療法および生成物と比較していくつかの利点を提供することができる。例えば、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、それぞれＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ細胞およびそれらによって産生される組成物の使用は、低減した炎症およびＴ細胞活性化などの低減した有害免疫応答を示すことができる組織再生療法手段を提供する。例えば、実施例３Ａ、３Ｂ、５、１８および１９を参照。さらに、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは免疫学的にサイレントであるので、対象は、治療前にＨＬＡを一致させるか事前調整する必要はない。実施例１０、パートＩＩを参照；図１７も参照のこと。
本発明は、造血を誘導、増強および／または維持するための（より詳細には、赤血球形成と呼ばれる過程において造血前駆細胞から赤色血球（赤血球）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成および生産のための）、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、増殖させた、および長期増殖した成人ヒト骨髄に由来する体細胞（それぞれ、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ））、およびこれらの細胞によって産生される細胞生成物の使用にも関する。したがって、本発明の別の実施形態は、赤色血球（赤血球）の生成および生産を誘導、増強および／または維持するための、そのような細胞および／またはそのような細胞によって産生される組成物の使用を包含する。
本発明の分野の別の実施例は、そのような細胞、細胞集団およびそれらによって産生される組成物の使用を介した、免疫性、自己免疫性および炎症性の障害の予防および治療に関する。
別の実施例では、本発明は、皮膚（すなわち、表皮、真皮、角皮下層）の創傷の修復および再生のための組成物および方法を提供し、それには、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはそのような細胞によって産生される生成物、および追加の構造的または治療的化合物を組み込む、液体、半固体および固体様マトリックスの製造および使用が含まれる。
前臨床研究結果の例
ｉｎ ｖｉｖｏ前臨床薬理研究は、心筋梗塞および脳卒中の治療におけるＡＢＭ−ＳＣの有益な効果を証明した。例えば、（特に、ＡＭＩ（急性心筋梗塞）後の心機能の回復におけるｈＡＢＭ−ＳＣの効力を判定し、ｈＡＢＭ−ＳＣの分布および配置を評価するために）、心筋梗塞のラットモデルでｈＡＢＭ−ＳＣの心臓内注射の影響を調査する研究において、ｈＡＢＭ−ＳＣが、心機能のかなりの改善および線維症のかなりの減少をもたらすことが示された。さらに、ｈＡＢＭ−ＳＣは、心臓注射から４週間後の心臓にも、また、注射から８週間後の調査した末梢器官のいずれにも残存しないことが観察された。さらに、ブタのＡＭＩモデルにおける、（特に、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルによる、細胞の経皮的ＮＯＧＡ（商標）誘導心内膜心筋投与の実行可能性、安全性および有効性を評価するための）、ブタおよびヒトのＡＢＭ−ＳＣの安全性および有効性を調査する研究において、この特定の送達方法が十分に許容され、心臓パラメータのかなりの改善をもたらすことが証明された。同様に、（特に、虚血性脳卒中からの神経筋回復の促進における、ｈＡＢＭ−ＳＣの効力を判定するための）、ｈＡＢＭ−ＳＣ送達の方法および脳卒中回復の比較では、静脈内または大脳内治療が神経筋活性のかなりの改善をもたらすことが観察された。
ヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ、約２７回の集団倍加時）によって分泌されたタンパク質の二次元ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分離（ｐＨ３．５〜１０；１２％ポリアクリルアミド）を示す図である。ゲル上の各スポットは、サイズが約５〜２００キロダルトン（ｋＤａ）の範囲に及ぶ、個別の異なるタンパク質を示す。Ｘ軸は、等電点（ｐＨ３．５〜１０）によって分離されたタンパク質を示す。Ｙ軸は、（１２％ポリアクリアミドを通しての通過による）分子量によって分離されたタンパク質を示す。 神経増殖因子（ＮＧＦ）、およびヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（約４３回の集団倍加時）に由来する馴化培地を使用した、ＰＣ−１２の、神経細胞への分化を示す顕微鏡写真である。Ａ）ＲＰＭＩ−ＩＴＳ培地のみ。Ｂ）ＮＧＦを補ったＲＰＭＩ−ＩＴＳ。Ｃ）濃縮対照培地の１：５０希釈液およびＮＧＦを補ったＲＰＭＩ−ＩＴＳ。Ｄ）ヒトＡＢＭ−ＳＣ由来濃縮馴化培地の１：５０希釈液およびＮＧＦを補ったＲＰＭＩ−ＩＴＳ。矢印は、神経突起の伸長を示す。パネルＤ中の神経突起の伸長の程度は、パネルＢおよびＣの神経突起の伸長の程度よりも、顕著にロバストである。 ヒトＡＢＭ−ＳＣを使用した、マイトジェン誘導Ｔ細胞増殖の阻害を示すグラフである。ロット番号：ＲＥＣＢ８０１は、約１９回の集団倍加時まで継代培養されているＡＢＭ−ＳＣを指し、ロット番号：ＲＥＣＢ９０６は、約４３回の集団倍加時まで継代培養されているｅｘＡＢＭ−ＳＣを指す。Ｔ細胞の増殖を刺激するために、培養物に、２．５または１０マイクロｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンを接種した。次いで、細胞を７２時間後に採集し、ＣＤ３−ＰＣ７抗体を用いて染色した。ヒト間葉系幹細胞を、陽性対照として使用した。（ヒト間葉系幹細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手した；これは、現在、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄが所有する）。 外科的誘導切開創傷形成７日後のブタの皮膚を示す顕微鏡写真である（左の２つのパネル、共に実験群＃４からの創傷）。Ａ）同種異系のブタＡＢＭ−ＳＣ（約２８回の集団倍加時）を用いて治療した創傷Ｎｏ．３は、完全な創傷の閉鎖を示し、瘢痕を事実上全く伴わない。Ｂ）それと比較して、ビヒクルのみを用いて治療した創傷Ｎｏ．４は、目に見える瘢痕を示す。Ｃ）グラフ（右のパネル）は、両方の治療群からの組織切片の組織形態計測的スコア化を示し、ブタＡＢＭ−ＳＣ治療創傷における組織球数の統計学的に有意な低下（ｐ＝０．０３）を示す（統計学的有意性は、対応のない両側Ｔ検定を使用して決定した）；「組織球」のバーを、ＰＢＳＧ治療とｐＡＢＭ−ＳＣ治療とで比較されたい。 治療７日後の切開創にわたる再上皮化の程度を示すグラフ（上のパネル）である。ブタＡＢＭ−ＳＣ（約２８回の集団倍加時）を用いて治療した創傷は、ビヒクルのみを用いて治療した創傷よりも厚い表皮を示した。左下のパネル中の顕微鏡写真は、ブタＡＢＭ−ＳＣを用いて治療した創傷における表皮の（組織学的に）完全かつ解剖学的に正確な修復を示す。右下のパネル中の顕微鏡写真は、この第７日時点において、皮下組織中で、（組織学的に）少なくとも一過性に生着しているように見える、ブタＡＢＭ−ＳＣ（矢印）を示す。 細胞再構成２４時間後に播種した、水和コラーゲンゲルの格子のＡＢＭ−ＳＣ媒介収縮を示すグラフである。ヒトＡＢＭ−ＳＣ（約２７回の集団倍加時）を、生物分解性コラーゲンベースの液体培地中で（１．８×１０６細胞／ｍＬで）再構成し、次いで、約４〜８℃で２４時間保管した。翌日、液体の細胞懸濁液を、培養皿中に置いて、半固体のコラーゲンの格子を形成した。この半固体のコラーゲンの格子を、３日にわたり細胞培養インキュベーター中に維持して、収縮を促進した。細胞なしで調製したコラーゲンの格子は、収縮しなかった。このことから、収縮は、細胞の存在に依存することが実証されている。 約４３回の集団倍加時におけるｅｘＡＢＭ−ＳＣを活用した、異なる細胞濃度で播種した、水和コラーゲンゲルの格子のＡＢＭ−ＳＣ媒介収縮を示すグラフである。データから、収縮の速度および絶対的な大きさは、細胞数に関係があることが実証されている。熱不活性化細胞は、ゲルを収縮させない。このことから、この活性は、生物物理学的な事象であることが実証されている。 約４３回の集団倍加時におけるｅｘＡＢＭ−ＳＣを活用した、水和コラーゲンゲルの格子中で、３日間培養した場合の、いくつかのサイトカインおよびマトリックスプロテアーゼ（すなわち、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、アクチビン−Ａ、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２）のＡＢＭ−ＳＣ媒介分泌を示すグラフである。 生物分解性コラーゲンベースの培地中で、液体（左のパネル）または半固体（右のパネル）として再構成したヒトＡＢＭ−ＳＣを示す顕微鏡写真である（約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣを活用した）。この処方を使用して再構成した場合、細胞懸濁液は、液体として、４℃で２４時間超留まることができる。培養皿中に置き、３７℃でインキュベートした場合、細胞懸濁液は、１〜２時間以内に凝固して、物理的に操作することができる半固体の構造を生じる。 生物分解性コラーゲンベースの培地中で再構成した（約４３回の集団倍加時の）ヒトＡＢＭ−ＳＣを、３日間培養することによって形成した固体様の新生組織を示す顕微鏡写真である。左上のパネルは、引き伸ばした場合の組織の柔軟性を示す。右上のパネルは、固体様の新生組織の全体的な生地を示す。下のパネルは、ＡＢＭ−ＳＣによって合成された豊富な細胞外マトリックスを実証している、マッソントリクロームによって染色した組織の組織切片を示す。同一の方法によるが、細胞を欠いて構築した対照のゲルは、この方法によっては青色に染色されず、このことから、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンに富むマトリックスが細胞によって生成されることが実証されている。 ＴＮＦ−アルファの刺激がある場合とない場合との、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌された複数の再生促進性サイトカインの分量の例を示す図である。ＡＢＭ−ＳＣは、継代培養すると、潜在的に、血管新生、炎症および創傷治癒を増大することが知られている、治療濃度のいくつかの増殖因子およびサイトカインを分泌する。ＡＢＭ−ＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、いくつかのサイトカインおよび増殖因子を一貫して分泌することが示されており；これらには、血管新生促進因子（例えば、ＳＤＦ−１アルファ、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８およびアンジオゲニン）、免疫調節物質（例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−８）、ならびに瘢痕阻害物質／創傷治癒調節物質（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびアクチビン−Ａ）がある。さらに、これらの因子のうちのいくつかの放出は、急性の組織傷害の経過の間に放出される炎症性サイトカインとして知られている、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）によっても調節される。 傷害−応答カスケード（傷害から瘢痕に至る炎症、再生および線維症）のモデル、ならびに炎症、再生および線維症に関与し得る分子の例を示す図である。 ヒトＡＢＭ−ＳＣを用いて治療したラットにおける改善された心機能の結果の例を示す図である。治療４週間後、ＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、有意により高い＋ｄｐ／ｄｔ（圧力の正の最大変化率）値を示した（Ａ）。第４週の＋ｄｐ／ｄｔ値から第０週の値を差し引くことによって表した（「デルタ＋ｄｐ／ｄｔ」）、研究期間の間の心機能の変化からは、ビヒクル治療ラットは、研究期間の間に心機能を低下させた（負のデルタ）が、一方、いずれかの細胞調製物を用いて治療した動物は、心機能の有意な改善を示すことが実証された（Ｂ）。ビヒクル治療ラットと比較して、ＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、有意により低いタウ値を示し（Ｃ）、このことから、左心室コンプライアンスの増加が示唆されている。タウは、等容性の左心室圧力の減衰の時定数である。圧力の負の最大変化率（−ｄｐ／ｄｔ）については、第４週の−ｄｐ／ｄｔ値から第０週の値を差し引くことによって表した（「デルタ−ｄｐ／ｄｔ」）、研究期間の間の心機能の変化からは、ビヒクル治療ラットは、研究期間の間に心機能を低下させた（負のデルタ）が、一方、細胞調製物を用いて治療した動物は、心機能の有意な改善を示すことが実証された（Ｄ）。［分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１］ ｈＡＢＭ−ＳＣを用いて治療したラットモデル心筋梗塞における線維症の低減および血管新生の増強を示す図である。半定量的スコア化を使用して、心筋梗塞７日後にビヒクルまたはＡＢＭ−ＳＣを与えたラットの心臓の梗塞のサイズの変化を評価した。ＡＢＭ−ＳＣ投与約３０日後に実施した病理組織診断解析からは、ｈＡＢＭ−ＳＣを与えたラットにおいて、ビヒクルと比較して、梗塞のサイズの有意な減少が示された。あらかじめ設定したスケールによると、ｈＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、ビヒクル対照よりも約２点低い組織学的スコアを示した。この図は、典型的な梗塞サイズの減少の例を示す。 心筋梗塞７日後にビヒクルまたはＡＢＭ−ＳＣを与えたラットの心臓構造の変化の、ＡＢＭ−ＳＣ投与約３０日後に実施した、組織学的測定から得られた結果を示す図である。 同種異系のヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、一方向性ＭＬＲ（混合性リンパ球反応）アッセイにおいて、マイトジェン誘導Ｔ細胞の増殖を抑制することを示す図である。 同種異系のブタＡＢＭ−ＳＣは、二方向性ＭＬＲ誘発実験において、Ｔ細胞媒介免疫応答を惹起しないことを示す図である。収集した試料について、分裂指数を、ベースライン、および治療後第３日または第３０日において計算し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、培地、ビヒクル、ｐＡＢＭ−ＳＣまたはＣｏｎＡを用いて誘発した。ＣｏｎＡを用いて刺激したＣＤ３＋細胞については、第３日または第３０日における、すべての動物からの平均分裂指数は、治療前および剖検時の両方における、ビヒクルおよびｐＡＢＭ−ＳＣ治療動物からのＣＤ３＋細胞の分裂指数よりも有意により高かった（＊ｐ＜０．０５）。 ３人の患者における、ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いた治療９０日後に得た測定値と比較することによる、心臓の修復された灌流不足のサイズの変化を示す図である。 ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いた治療９０日後に得た測定値と比較することによる、３人の患者において測定した心臓の駆出分画の変化を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ｈＡＢＭ−ＳＣによって分泌された赤血球新生性のサイトカイン（すなわち、ＩＬ−６、アクチビン−Ａ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＳＤＦ−ＩおよびＳＣＦ）の分量の例を示す図である。ＡＢＭ−ＳＣのロットを、サイトカインの分泌について、ＲＡＹＢＩＯ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用して試験した。最初に、細胞を、無血清Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標））中で、３日間培養して、馴化培地（ＣＭ）を生成した。次いで、ＣＭを、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮してから解析した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ｅｘＡＢＭ−ＳＣが、ＴＮＦ−αのレベルを用量依存性の様式で減少させることを示す図である。ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（約４３回の集団倍加時）を、種々の播種密度（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２、２０，０００細胞／ｃｍ２および４０，０００細胞／ｃｍ２）で培養した場合に、ＴＮＦ−αのレベルを減少させる能力について試験した。細胞を、無血清Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標））中、単独でまたは１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを補ってのいずれかで、３日間培養した。また、熱不活性化細胞も、陰性対照として含めた。ＴＮＦの濃度を、Ｙ軸上に示す。（Ｙ軸は、物質の、１００×に濃縮されている培地中の濃度を示す）。 ＴＮＦ−αの減少が、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ（約４３回の集団倍加時）によるｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの分泌によって媒介されると思われることを示す図である。ｓＴＮＦ−ＲＩの基礎レベルの発現は、炎症促進性の誘導物質の非存在下で生じ（Ａ）、一方、ｓＴＮＦ−ＲＩＩは、最初にＴＮＦ−αを用いて予備刺激された場合に限って、かなりのレベルで検出される（Ｂ）。これらのデータから、播種した細胞数と、検出されたｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの両方のレベルとの間の反比例関係が明らかである。このことから、分泌された受容体自体が、ＴＮＦ−αに結合し、それをマスクした状態をとり得ることが示唆されている（Ｙ軸は、物質の、１００×に濃縮されている培地中の濃度を示す）。 （約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣによる）ＩＬ−ＩＲＡの分泌レベルが、用量依存性であることを示す図である。ＩＬ−ＩＲＡの基礎レベルの発現は、炎症促進性の誘導物質の非存在下で生じるが、ＴＮＦ−αを用いて予備刺激した場合、可溶性のレベルが約１０倍加加する（Ｙ軸は、物質の、１００×に濃縮されている培地中の濃度を示す）。 ｅｘＡＢＭ−ＳＣによる、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の発現を示す図である。ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−アルファ等の炎症性シグナルの非存在下であっても、基礎レベルのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；図３６Ａ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；図３６Ｂ）を発現させる。 混合性ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣが、ＴＮＦ−アルファ（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを減少させ、かつ同時に、ＩＬ−２の発現上昇を誘導する（図２５Ｃ）ことを示す図である（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、Ｓｅｌｆ＝マイトマイシンＣ処理した、レスポンダーと同一のドナーから単離したＰＢＭＣ、Ｓｔｉｍ＝マイトマイシンＣ処理した、異なるドナーから単離したＰＢＭＣ。） 混合性ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣが、ＴＮＦ−アルファ（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを減少させ、かつ同時に、ＩＬ−２の発現上昇を誘導する（図２５Ｃ）ことを示す図である（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、Ｓｅｌｆ＝マイトマイシンＣ処理した、レスポンダーと同一のドナーから単離したＰＢＭＣ、Ｓｔｉｍ＝マイトマイシンＣ処理した、異なるドナーから単離したＰＢＭＣ。） 混合性ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣが、ＴＮＦ−アルファ（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを減少させ、かつ同時に、ＩＬ−２の発現上昇を誘導する（図２５Ｃ）ことを示す図である（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、Ｓｅｌｆ＝マイトマイシンＣ処理した、レスポンダーと同一のドナーから単離したＰＢＭＣ、Ｓｔｉｍ＝マイトマイシンＣ処理した、異なるドナーから単離したＰＢＭＣ。） ヒトＡＢＭ−ＳＣを使用した、マイトジェン誘導ヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖の阻害を示すグラフである。ＲＥＣＢ８０１は、約１９回の集団倍加時まで継代培養されているＡＢＭ−ＳＣの特定のロットを指し、＃ＲＥＣＢ９０６は、約４３回の集団倍加時まで継代培養されているＡＢＭ−ＳＣの特定のロットを指す。ＰＢＭＣの増殖を刺激するために、培養物に、２．５マイクロｇ／ｍＬフィトヘマグルチニンを接種した。培養５６時間後、細胞を、チミジン−［メチル−３Ｈ］でパルスし、第７２時に、同位体の組込みを定量化した（ＣＰＭ）。ヒト間葉系幹細胞を、陽性対照として含めた。
発明の詳細な説明
一般的に、幹細胞または他の初期段階の前駆細胞は、特定の分化経路に専念するので、柔軟性を失う。生体分子レベルでは、この過程が起こり始めるにつれて、細胞は、さもなければ細胞が分裂するようにまたは別の細胞型になるように働きかける、あるシグナル伝達分子（例えば、マイトジェンおよびモルフォゲン）に応答する能力を失う。したがって、細胞が分化を始めるにつれて、細胞は細胞周期を離れ（すなわち、それ以上有糸分裂を経ることができない）、細胞がそれ以上分裂できないＧ０と呼ばれる不可逆的状態に入る。Ｇ０に入ることは、複製老化（その特質には、細胞内タンパク質ｐ２１およびｐ５３の発現の増加が含まれる）とも関連している。したがって、柔軟性（様々な細胞型に分化する能力）の喪失は、一般的に細胞分化または細胞老化の前兆と考えられる。さらに、柔軟性の喪失は、一般的に細胞の連続的自己複製能の喪失とも関連する。対照的に、この一般的で従来から認められているシナリオにとって予想外で驚くべき本発明の結果は、本発明のｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）が、柔軟性の喪失にもかかわらず自己複製（比較的一定の速度の自己複製を含む）を継続することである。したがって、本発明の一実施形態は、連続した自己複製能を有する治療上有用な「末期細胞」（例えば、連続した自己複製および栄養支持因子（または「栄養支持細胞」）の生成が可能である細胞）である。別の実施形態では、本発明のｅｘＣＦ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ｐ２１および／またはｐ５３のかなりの量を発現しないが、前記分子の「かなりの量」とは、細胞老化（老化はｐ２１、ｐ５３および／または他の細胞周期調節因子の十分な発現レベルを必要とすることがある）を示す量である。
さらに、本発明の分野のほとんどの専門家は、器官および組織の再生を生成または促進する限定された有用性または能力を有するための柔軟性を失った、非造血間質型細胞を予想するであろう。したがって、本発明の別の驚くべき予想外の結果は、柔軟性を失っても新しい組織をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、ｉｎ ｖｉｖｏで組織再生を促進する能力を保持する、長期継代培養したＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣ）を生成する能力である。
本発明は、とりわけ、本明細書でコロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）（その例は、成人ヒト骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）である）と呼ばれる自己複製性細胞を用いて、組織の修繕、再生および／または若返りを実施する方法を対象とする。本発明で用いられる成人ヒト骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）などの自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）は、米国特許出願公開第２００３００５９４１４号（２００１年９月２１日に出願の米国特許出願第０９／２６０，２４４号）および米国特許出願公開第２００４００５８４１２号（２００２年９月２０日に出願の米国特許出願第１０／２５１，６８５号）に記載のように調製される。これらの特許出願のそれぞれは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。米国特許仮出願第６０／９２９，１５１号および６０／９２９，１５２号（各々は、２００７年６月１５日に出願された）、米国特許仮出願第６０／９５５，２０４号（２００７年８月１０日に出願された）および米国特許仮出願第６０／９９６，０９３号（２００７年１１月１日に出願された）も、参照により本明細書に組み込まれる。
詳細には、細胞の源集団から（例えば、骨髄（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、脂肪、皮膚、胎盤、筋肉、臍帯血または結合組織から）単離されたＣＦ−ＳＣを、適当な培地（例えば、それに限定されないが、４ｍＭグルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた最小必須培地−α（例えば、ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）から入手可能））の存在下で細胞培養表面に付着させ、低酸素条件（例えば、それに限定されないが、約２〜５％のＯ２、約５％のＣＯ２、窒素で平衡化）の下で培養し、その後、低い細胞密度（例えば約３０〜１０００細胞／ｃｍ２）で継代培養して、ＣＦ−ＳＣが、多集団倍加回数（例えば、それらに限定されないが、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５および／または５０回の集団倍加を経ること）を通して、基本的に一定の集団倍加速度（例えば、それに限定されないが、約３０時間未満の倍加速度）を維持するようにする。
本発明の実施形態は、低酸素条件下で培養したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成することができ、前記Ｏ２濃度は約１〜２０％の範囲であり（例えば、Ｏ２濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％である）、それにＣＯ２を加え、窒素で平衡化する。例えば、ＡＢＭ−ＳＣは低酸素条件下で培養することができ、前記Ｏ２濃度は、約２０％、約２０％未満、約１５％、約１５％未満、約１０％、約１０％未満、約７％、約７％未満、約６％、約６％未満、約５％、約５％未満、約４％、約４％未満、約３％、約３％未満、約２％、約２％未満、約１％であるか；または、前記低い酸素条件は、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約２％〜約８％、約２％〜約７％、約２％〜約６％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約３％〜約８％、約３％〜約７％、約３％〜約６％、約３％〜約５％、約３％〜約４％、約４％〜約８％、約４％〜約７％、約４％〜約６％、約４％〜約５％、約５％〜約８％、約５％〜約７％、約５％〜約６％の範囲、または約５％である。
本発明の実施形態は、低酸素条件下で培養したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成することができ、そこで、ＣＯ２濃度は約１〜１５％の範囲であり（例えば、ＣＯ２濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％である）、それに低濃度Ｏ２を加え、窒素で平衡化する。本発明の実施形態は、細胞を低い細胞密度で播種することにより継代培養したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成することができ、前記細胞密度は、約１〜２５００細胞／ｃｍ２の範囲である（例えば、細胞密度は約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００または２５００細胞／ｃｍ２である）。例えば、ＡＢＭ−ＳＣは、約２５００細胞／ｃｍ２未満、約１０００細胞／ｃｍ２未満、約５００細胞／ｃｍ２未満、約１００細胞／ｃｍ２未満、約５０細胞／ｃｍ２未満、約３０細胞／ｃｍ２未満または約１０細胞／ｃｍ２未満の播種密度で継代培養することができる。本発明の実施形態は、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成することができ、そこにおいて、細胞集団倍加速度は約２４〜９６時間未満の範囲で維持される（例えば、細胞集団倍加速度は、約２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０または９６時間未満に維持される）。本発明の実施形態はＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成することができ、そこにおいて、細胞集団は、ある範囲の集団倍加、例えば約５〜５０回の集団倍加を通して、基本的に一定の倍加速度を維持する（例えば、集団倍加速度は、約５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５または５〜５０回の集団倍加の間維持される）。
本発明の実施形態は、液体、半固体または固体様状態であることができる薬学的に許容される組成物に組み込まれた、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の使用を含む。用語「液体、半固体または固体様状態」の使用は、細胞が含まれる薬学的に許容される組成物が、１）一般的な液体状態（例えば、通常の生理食塩水におけるような）から、２）ゼリー様、ゲル状または粘弾性状態を含む低粘性から高粘性に至る広い範囲（そこにおいて、医薬組成物は、例えば、油または蜂蜜のような徐々に「にじむ」状態から、ゼリー様、柔軟、半弾性および／または展性であることができるますますゲル状または粘弾性の状態まで組成物の粘度が変化するように、非常に高いレベルから非常に低いレベルまでの細胞外水分を含む）まで；３）固体様状態（非常に低いレベルの細胞外水分を有する）であって、マトリックス中の生細胞が、それらが耐久性、非ゲル状であるが、依然として柔軟、半弾性および展性であるマトリックス（それは、例えば、哺乳動物の皮膚の同じ柔軟で、半弾性の特性のいくつかを有する）に当初懸濁された環境を改造した固体様状態まで；の広い範囲の物理的状態にわたることができることを示すものとする；図１０Ａおよび１０Ｂを参照。
（注：非弾性としても知られる粘弾性は、塑性変形を受ける場合に、粘性および弾性の両特性を示す物質を記述するものである。蜂蜜と同様に、粘性物質は、ストレスが加えられると、時間と共に直線的に剪断流および歪みに抵抗する。弾性物質は引き伸ばされると直ちに伸び、ストレスが取り除かれるとそれらの元の状態にまた速やかに戻る。粘弾性物質はこれらの特性の両方の要素を有するので、時間依存性歪みを示す。）
液体、半固体および固体様溶媒中の細胞の臨床投与は、創傷の望ましくない滲出物を捕えることなく、創傷床の輪郭を形作る治療の適用を可能にする。
コラーゲンまたはフィブリンなどの可溶性のマトリックス成分をＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）と組み合わせることは、サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼなどの重要な分泌タンパク質の発現を上方制御するように、細胞集団を誘導する。さらに、手術誘導性の創傷へのＡＢＭ−ＳＣの適用は、創傷の閉鎖を促進し、瘢痕化を予防し、それによって最小限の瘢痕をもたらすようである（実施例７を参照）。
さらに、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の見かけの免疫調節特性（例えば、実施例４を参照）は、これらの細胞を組み込む組成物および療法を、皮膚に関係する免疫的障害および疾患、例えば、それらに限定されないが、慢性炎症性皮膚症、乾癬、扁平苔癬、エリテマトーデス（ＬＥ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および薬疹（すなわち、皮膚の薬物有害反応）の治療にとって魅力のあるものにする。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の馴化培地からの分泌タンパク質および細胞上清分画は、無血清状態から製造し、濃縮し、それらをｉｎ ｖｉｖｏ使用に適するようにする方法で調製することができる。このように調製された場合、ＡＢＭ−ＳＣからの無血清馴化培地は、治療上有効な濃度で多数の再生促進性のサイトカイン、成長因子およびマトリックスプロテアーゼを含むことが証明された（表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照）。ＡＢＭ−ＳＣによって産生される数百の可溶性因子の複合混合物は、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥによって識別することができる（図１を参照）。個々のタンパク質および他の巨大分子は、これらのゲルから切り取り、当技術分野で日常実施される技術、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間分光分析）を用いて同定することができる。
開示されている方法（ならびにクロマトグラフィーまたは中空繊維細胞培養系などの他の単離技術）を利用して、所望のタンパク質または細胞上清分画を単離、透析、凍結乾燥し、固体として保存するか、または、治療的投与のために適当な媒体で再構成することができる。一実施形態では、タンパク質または細胞上清分画は、半固体のコラーゲンまたはフィブリンベースの媒体で再構成され、創傷床に局所的に塗布されよう。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって産生される生成物に加えて、任意の数および種類の薬学的に許容される小分子から大きな高分子化合物（脂質、タンパク質および核酸などの生物学的製剤を含む）までを、薬学的に許容される担体、例えば、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、またはそのような細胞によって産生される生成物が含まれる生物分解性マトリックスと一緒の投与のために組み込むことができる。非常に小さな標本として、そのような追加の分子は、ほんの少しのカテゴリーの例を挙げれば、抗炎症剤、抗生物質、ビタミン類およびミネラル（例えばカルシウム）などの小分子医薬を含むことができる。同様に、生物学的製剤の非常に小さな標本は、細胞外マトリックスタンパク質、血漿凝固タンパク質、抗体、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、脂質（例えばカルジオリピンおよびスフィンゴミエリン）ならびに核酸（例えばリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ発現構築物）を含むことができ；これらには、そのような分子の治療上有用な変異体および誘導体、例えば、様々なアイソフォーム、断片およびサブユニット、ならびに置換、挿入および欠失変異体が含まれる。本明細書で提供される教示と合わせて、任意の数の追加の構造的または治療上有用な化合物を、薬学的に許容される担体、例えば、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、またはそのような細胞によって産生される生成物が含まれる生物分解性マトリックスと一緒の投与のために含めることができるであろうことが、当分野の技術者には理解できるので、これらは単に例として指摘するだけである。
本発明の一実施形態は、糖尿病患者、例えば、糖尿病患者の足もしくは静脈性脚潰瘍、または術後の創傷における、創傷閉鎖を刺激する方法を包含する。創傷閉鎖の刺激は、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはそのような細胞によって産生される生成物を、天然に存在する細胞外マトリックスおよび／または血漿タンパク質成分、例えば、精製された天然または組換えのヒト、ウシ、ブタ、または組換え型のコラーゲン、ラミニン、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビンと組み合わせた医薬組成物による治療で促進することができる。医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に、組織損傷の部位に投与することができる。別の実施形態では、局所投与される生物分解性マトリックスは、精製された天然または組換えのコラーゲン、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビンなどの成分を、同種異系ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）と組み合わせた混合物から作られる。
本発明の別の実施形態では、同種異系細胞およびマトリックスの医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期間（例えば、それに限定されないが、１日〜１カ月またはそれ以上）培養され、結合組織の新規形成をもたらす。本発明の別の実施形態では、生物分解性マトリックスは、ウシコラーゲンまたはポリグリコール酸である。別の実施形態では、医薬組成物は、低下させた酸素圧条件、例えば、それに限定されないが、約４〜５％Ｏ２に等しい酸素圧、５％ＣＯ２、窒素による平衡の条件下で、無血清細胞培地で培養される。
一実施形態では、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、
可溶性のコラーゲン、無血清細胞培地であってグルタミン、炭酸水素ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ（任意選択で、インスリン、トランスフェリンおよび／またはセレニウムの補充を含む）を加えたものを含む溶液を調製するステップと、
溶液にＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を再懸濁するステップと、
細胞懸濁液を組織の型またはその同等物に移し、例えば細胞培養インキュベーターに置いた場合、３７℃で固めるステップと
を含む方法を含む。
医薬組成物を調製する上記の方法は、約４〜５％Ｏ２と等しい低い酸素圧条件、５％ＣＯ２、窒素による平衡の下で長期間（例えば、それに限定されないが、１〜３日以上）、培養物をインキュベートするステップをさらに含むことができる。
別の実施形態では、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、
フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む溶液を調製するステップと、
溶液にＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を再懸濁するステップと、
再懸濁した溶液を開放創に投与するステップと
を含む方法を含む。
別の実施形態では、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、
可溶性のコラーゲン、無血清細胞培地であってグルタミン、炭酸水素ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ（任意選択で、インスリン、トランスフェリンおよび／またはセレニウムの補充を含む）を加えたものを含む溶液を調製するステップと、
ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来する細胞上清の１つまたは複数の分画を溶液に混合するステップと、
溶液を組織の型またはその同等物に移し、例えば細胞培養インキュベーターに置いた場合、３７℃で固めるステップと
を含む方法を含む。
医薬組成物を調製する上記の方法は、組織の型またはその同等物を、約１８〜２１％Ｏ２と等しい大気酸素圧条件および５％ＣＯ２の下でインキュベートするステップをさらに含むことができる。
別の実施形態では、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、
フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む溶液を調製するステップと、
ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来する細胞上清の１つまたは複数の分画を溶液に混合するステップと、
溶液を開放創に投与するステップと
を含む方法を含む。
別の実施形態では、本発明は、特に以下に起因する組織損傷の治療における組織再生を包含する：免疫関係の障害（例えば自己免疫疾患）；炎症（急性および慢性の炎症性障害を含む）；虚血（例えば心筋梗塞）；外傷（例えば火傷、裂傷および擦過）；感染症（例えば細菌、ウイルスおよび真菌による感染症）；ならびに、慢性皮膚創傷。本発明は、多様な損傷および障害、例えば、それらに限定されないが、中枢神経系（脳）および末梢神経系（例えば、脊髄）の神経性の損傷および障害（例えば、神経外傷および神経変性疾患によって起こり得るものなど）の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、骨、結合組織および軟骨の再生を必要とする疾患および障害、慢性および急性の炎症性肝疾患、血管不全、ならびに角膜および黄斑の変性の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、心血管および肺の損傷および障害を治療すること（例えば、心筋虚血と血管の修復および再生）を包含する。本発明の別の実施形態は、膵臓および肝臓の組織、ならびに他の内分泌腺および外分泌腺の損傷および障害を治療することを包含する。本発明の別の実施形態は、胸腺、ならびに他の免疫細胞生成、収容器官の損傷および障害を治療することを包含する。本発明の別の実施形態は、尿生殖器系（例えば、尿管および膀胱）の損傷および障害を治療することを包含する。本発明の別の実施形態は、ヘルニアおよび脱出組織を治療することを包含する。本発明の別の実施形態は、心臓弁の治療、修復、再生および再建を包含する。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来するタンパク質および細胞上清分画は、固体様コラーゲンに基づく装置で再構成することもできる。細胞をそのような方法で再構成する場合、固体様コラーゲンマトリックスを数日間にわたって改造して、それ自身の特有のマトリックスを作製する新組織を生成する。そのようなＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来する新組織は、柔軟で、縫合可能であり、生体活性である（例えば、図６、７および１０Ａ〜Ｃを参照）。これらの構造物は、滅菌、化学架橋、凍結乾燥またはさらに処理して、細胞を生育不能に、およびさらなる増殖ができないようにすることもできた。
そのような装置は、全層熱傷創傷を含む火傷の治療で、特に有益であろう。血管が新生した創傷床を再建するために、重度火傷の患者は、死滅組織の外科的切除の後、人工真皮代用物でしばしば治療される。創傷床が治癒した後、これらの患者は、宿主表皮の再成長を試みるために、上皮細胞の人工皮膚製品または塗布剤で続けて治療される。
例えば本明細書に記載されているような組成物は、従来の人工真皮製品（例えば、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標））の代わりに用いられる場合、望ましくないＴ細胞媒介免疫反応を阻害または低減することによって、その後移植される同種異系皮膚の寿命を延ばすことができる（実施例５を参照）。Ｔ細胞媒介免疫応答を調節することによって、本発明の組成物は、患者自身の皮膚の再成長を刺激するのに十分な時間、人工皮膚の以降の再適用を可能にすることができる。
上記のＡＢＭ−ＳＣは、以下の特性を示すことが明らかになっている：
ｉｎ ｖｉｔｒｏ
・血管形成および組織修復で重要なサイトカインの分泌。
・瘢痕およびマトリックスターンオーバーの予防および阻害のための因子の放出。
・血管形成促進活性を示す内皮細胞の移動の促進。
ｉｎ ｖｉｖｏ
・急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および脳卒中の複数の動物モデルにおける予後のかなりの改善。
・心臓内または大脳内への有効で十分に耐えられる細胞送達。
・注射から８週間後の組織に細胞が検出されない。
・細胞に対する測定可能な免疫応答がない。
本発明の一実施形態では、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって分泌されるいくつかの再生促進細胞因子を、損傷を受けた組織および器官（例えば急性心筋梗塞（ＡＭＩ）または脳卒中による心不全によって損傷を受けた心臓およびニューロンの器官および組織）の治療、修復、再生および／または若返りにおいて用いることができる。これらには、図１１に示すＡＢＭ−ＳＣなどのＣＦ−ＳＣが分泌することができる因子が含まれる。例えば、これらの因子には、それらに限定されないが、ＳＤＦ−１α、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、アンジオゲニン、ＢＤＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＡＬＣＡＭ、ＭＭＰ−２、アクチビン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１３、ＭＣＰ−１が含まれる。図１１を参照。追加の因子、例えば表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに記載のものなども、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）が分泌することができる。例えば表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照。
ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）による再生促進因子の分泌は、馴化細胞培地の生成を誘導するための、または患者への細胞の投与の前に細胞を初回刺激するための刺激因子（例えば腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α））による前処理によって、増強または誘導することができる。
急性虚血、外傷または炎症は、罹患器官および組織における一群の細胞事象および化学的事象をもたらす。例えば、図１２を参照。炎症相では、傷害部位への因子の放出および細胞の流入が起こる。再生相では、機能的組織の適切な修復のために、循環細胞の動員が起こる。そして、線維化相では、器官機能に障害を起こす可能性のある線維性瘢痕の沈着が起こる。さらに、様々なサイトカインおよび他の生体分子が、これらの過程の各々で多様な役割をする。例えば、図１２を参照。
本発明のＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の使用は、炎症を治療および予防する方法、線維化（すなわち、組織瘢痕）を低減しながら器官および組織の再生を刺激する方法、ならびに、刺激されたか刺激されていないＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって産生される組成物（例えば、サイトカイン、プロテアーゼ、細胞外マトリックスタンパク質など）を通して血管形成を刺激する方法を含む。
別の実施形態では、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣは、線維化の生物学的過程を阻害することができる。線維化は、多くのヒト組織における創傷治癒、瘢痕化および炎症の自然の副産物である。瘢痕組織が最適な器官機能に必要とされる細胞を置換するので、線維性瘢痕化とも呼ばれる線維化は、特に心臓および中枢神経系（ＣＮＳ）において、最適な機能を有する組織の再生にとってかなりの障害である。本明細書で開示される細胞による治療は、線維化を予防または低減するのを助け、それによって損傷組織の治癒を促進する。線維化は、膜結合細胞表面分子を含む、２つ以上の分泌タンパク質または細胞産生組成物の相加作用または相乗作用によって予防することができる。さらに、投与されたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって誘導または産生されるマトリックスプロテアーゼは、線維化の予防で重要な役割を果たすことができる。
本発明の別の使用例では、新血管形成とも呼ばれる血管形成が、所望の組織で増加する。新しく形成された組織には血液が供給されなければならないので、血管形成、すなわち新しい血管の形成は再生医療の重要な構成要素であり、本発明がそのための治療である変性過程、疾患進行または急性傷害の間に内皮細胞が失われる場合は、血管形成は重大である。したがって、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはそのような細胞によって産生される組成物の使用は、標的の組織および器官（特に、例えば損傷を受けた心臓組織）における血管形成の刺激に有益である。血管形成は組織修復の重要な要素であり、損傷組織の治癒を最適化するために、線維化の阻害と一緒に作用することができる。
本発明の別の使用例は、投与される細胞の移植なしの、再生または若返り過程の刺激を含む。ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ヒトＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣの長期細胞移植または組織特異分化が一般に見られないことを示し、これらの細胞が組織再生を刺激する機構が、細胞置換を介したものではなく、代わりに、細胞自体および／またはそれらが産生する因子への宿主応答を介したものであることを示唆する。しかし、骨髄でのＡＢＭ−ＳＣの役割が構造的および栄養的な支援を提供することであることを考慮すると、これは驚きではない。したがって、本発明は損傷を受けた組織および器官の治療を含み、そこでは、投与されたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、永久的であるか長期的な組織または器官の移植を示さない。代わりに、治療的なＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、かなりのレベルまたは現在検出可能なレベルで修復組織の一部になることなく、栄養支援因子を提供し、細胞死を抑制し、線維化を阻害し、炎症（例えば、免疫細胞炎症性応答）を阻害し、細胞外マトリックスのリモデリングを促進し、かつ／または血管形成を刺激する。
本発明のさらなる実施例は、投与された細胞が、しばらくしてから実験動物のどこにも検出されないことを教示し、投与された細胞が体から完全に取り除かれることを示唆する。これは、損傷組織の修復において、分泌された因子が必須の役割を演ずることを示唆する。
その有用性を例示する本発明のさらに別の実施例では、本明細書で開示されるｈＡＢＭ−ＳＣは、１つの提供源に由来する。このように、これらの細胞は患者では同種異系細胞移植片であり、これらの移植された細胞が有害な免疫応答を刺激する可能性があることが示唆されよう。しかし、驚くべきことに、本明細書で開示される移植された同種異系細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでマイトジェン誘導性のＴ細胞増殖を実際に抑制すること、およびｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞依存性免疫応答の誘導を回避することができることが認められる。Ｔ細胞媒介免疫応答は、治癒、再生および若返り過程に有害である免疫過程における、重要な因子である。
本明細書で用いるように、「有効量」は、組織、器官または生物系（例えば、免疫系）の性能、機能、統合性、構造または組成で検出可能な改善を生成するのに十分な量であり、前記改善は、損傷を受けた組織、器官または生物系の完全または部分的な改善、修復、補修、再生または治癒を示す。
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、無血清細胞培地で継代培養した場合にヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌される、サイトカイン、成長因子、可溶性受容体およびマトリックスプロテアーゼの広範なリストを示す。培地上清濃縮物＃１＝４ｍＭのＬ−グルタミンを補った高度ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標））。培地上清濃縮物＃２＝インスリン−トランスフェリン−セレニウム−Ａ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補った４ｍＭのＬ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ−１６４０。
結果は、これらの条件下で培養した場合、ＡＢＭ−ＳＣによって組織再生および免疫系の調節にとって重要な多数の栄養因子および可溶性受容体が、治療的に適切なレベルで産生されることを証明する。特に、より早期の実験は、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すものなどの分泌タンパク質レベルを達成するために、インスリン、トランスフェリンおよびセレニウムを基礎培地に補充することが必要とされることを証明した。
免疫障害
本発明の細胞および組成物は、とりわけ、免疫性、自己免疫性および炎症性の疾患および障害を予防、治療および／または改善するために用いることができる。そのような障害の一部の例を、下に示す。これらのリストは例示に過ぎず、すべての免疫性、自己免疫性および炎症性の疾患および障害に関して包括的であることを意図していないし、以下のものを、本発明の細胞および組成物で治療することができる病状に関して限定するものと解釈するべきでもない。
完全または部分的な自己免疫病因を有する一部の疾患例：急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、無形成性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、セリアック病、クローン病、１型糖尿病、妊娠性類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性の血小板減少性紫斑病、川崎病、エリテマトーデス、多発硬化症、重症筋無力症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オードの甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、多発関節炎、原発性胆汁性肝硬変症、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、高安の動脈炎、側頭動脈炎（別名「巨細胞性動脈炎」）、温式自己免疫溶血性貧血およびヴェーゲナー肉芽腫症。
自己免疫に関連すると疑われる一部の疾患例。全身性脱毛、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、ライム病、斑状強皮症、神経ミオトニー、ナルコレプシー、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、白斑および外陰部痛。
一部の免疫過敏性疾患および障害の例：アレルギー性喘息、アレルギー結膜炎、アレルギー性鼻炎（「花粉症」）、アナフィラキシー、重症筋無力症、血管性浮腫、アルサス反応、アトピー性皮膚炎（湿疹）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性悪性貧血、セリアック病、接触性皮膚炎（ツタウルシ毒発疹、好酸球増加、胎児赤芽球症、農夫肺（例えばアルサス型反応）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、新生児溶血性疾患、免疫複合体糸球体腎炎、免疫性血小板減少、重症筋無力症、天疱瘡、リウマチ熱、関節リウマチ、血清病、亜急性細菌性心内膜炎、らい症状、マラリアの症状、結核の症状、全身性エリテマトーデス、側頭動脈炎、輸血反応、移植拒絶およびじんま疹（皮疹）。
一部の炎症性障害の例：アレルギー、強直性脊椎炎、関節炎、喘息、自閉的全腸炎、自己免疫疾患、ベーチェット病、慢性炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶および血管炎。
一部の免疫不全障害の例：Ｂ細胞欠乏症（例えばＸ連鎖の無ガンマグロブリン血症および選択的免疫グロブリン欠乏症）、Ｔ細胞欠乏症（例えばディジョージ症候群（胸腺形成不全）、慢性皮膚粘膜カンジダ症、過剰ＩｇＭ症候群およびインターロイキン−１２受容体欠乏症）、複合型Ｔ細胞およびＢ細胞異常（例えば重度の複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコットアルドリッチ症候群および毛細血管拡張性運動失調）、補体欠乏症（例えば遺伝性の血管性浮腫または遺伝性血管神経性浮腫および発作性夜間ヘモグロビン尿症）、食細胞欠乏症（例えば白血球接着欠損症、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、チェジアック−東症候群、ジョブ症候群（過剰ＩｇＥ症候群）、循環好中球減少、ミエロペルオキシダーゼ欠乏症、ブドウ糖−６−リン酸脱水素酵素欠乏症およびインターフェロン−γ欠乏症）、ならびに分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、バイサイ症候群および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）。
本発明の実施形態
本発明の特定の実施形態には、以下のものが含まれる。
Ａ１． 対象に１つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を投与する方法であって、前記対象に自己複製性コロニー形成細胞の単離集団を投与することを含み、前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ２． 対象に１つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を投与する方法であって、
（ｉ）自己複製性コロニー形成細胞の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
（ｉｉ）前記対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することと
を含み、
前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ３． 対象の損傷組織を修復、治療しまたはその再生を促進する方法であって、前記対象に自己複製性コロニー形成細胞の単離集団の有効量を投与することを含み、前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ４． 対象の損傷組織を修復、治療しまたはその再生を促進する方法であって、
（ｉ）自己複製性コロニー形成細胞の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
（ｉｉ）前記対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することと
を含み、
前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ５． 対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、前記対象に自己複製性コロニー形成細胞の単離集団の有効量を投与することを含み、前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ６． 対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、
（ｉ）自己複製性コロニー形成細胞の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
（ｉｉ）前記対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することと
を含み、
前記細胞集団内の細胞は実質的に多能的分化能を有さず、前記細胞は正常な核型を有し、前記細胞は不死化されていない方法。
Ａ７． 投与の前に、前記細胞集団が、前記集団内の細胞に多能的分化能を失わせるのに十分な回数の集団倍加の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで継代培養されている、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の方法。
Ａ８． 前記細胞集団が単分化能を有する、実施形態Ａ１〜Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９． 前記細胞が実質的な自己複製能を有する、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の方法。
Ａ１０． 投与の前に、前記細胞集団が、実質的な自己複製能を保持しながら集団倍加回数の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで継代培養されている、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれかに記載の方法。
Ａ１１． 前記単離細胞集団内の細胞が胚性幹細胞でない、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２． 前記単離細胞集団内の細胞が、幹細胞、間葉性幹細胞、造血幹細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）または線維芽細胞でない、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３． 前記細胞が、
ａ）骨細胞、ｂ）脂肪細胞およびｃ）軟骨細胞
からなる群から選択される１つまたは複数の細胞型に分化しない、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４． 前記細胞が、骨誘導条件下での治療の後にカルシウムの検出可能なレベルを沈着させない、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５． 前記骨誘導条件が外部供給ノギンへの曝露を含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
Ａ１６． 前記単離細胞集団内の細胞が結合組織に由来する、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１７． 前記単離細胞集団内の細胞が間質細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８． 前記単離細胞集団内の細胞がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現させる、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９． 前記細胞集団が複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞倍加を通してほぼ一定の倍加速度を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の方法、
Ａ２０． 前記細胞が、
ａ）ＣＤ１０、ｂ）ＳＴＲＯ−１およびｃ）ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ−１
からなる群から選択される１つまたは複数の抗原の検出可能な発現に陰性である、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２１． 前記細胞が、
ａ）ＣＤ４４、ｂ）ＨＬＡクラス１抗原およびｃ）β（ベータ）２−ミクログロブリン
からなる群から選択される１つまたは複数の抗原の検出可能な発現に陽性である、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２２． 前記細胞が、
ａ）ＴＮＦ−ＲＩ、ｂ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩ、ｃ）ＴＮＦ−ＲＩＩ、ｄ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ、ｅ）ＩＬ−１Ｒアンタゴニストおよびｆ）ＩＬ−１８結合タンパク質
からなる群から選択される組成物の検出可能な量を発現または分泌する、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３． 前記細胞が、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す組成物からなる群から選択される組成物の検出可能な量を発現または分泌する、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４． 前記単離細胞集団内の細胞が、
ａ）骨髄、ｂ）脂肪組織／脂肪、ｃ）皮膚、ｄ）胎盤、ｅ）へその緒、ｆ）腱、ｇ）靭帯、ｈ）筋肉筋膜およびｉ）他の結合組織
からなる群から選択される組織源から最初に単離される、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５． 前記組織源がヒトである、実施形態Ａ２４に記載の方法。
Ａ２６． 前記細胞集団が、
ａ）１〜５回の細胞倍加、ｂ）５〜１０回の細胞倍加、ｃ）１０〜２０回の細胞倍加、ｄ）２０〜３０回の細胞倍加、ｅ）３０〜４０回の細胞倍加、ｆ）４０〜５０回の細胞倍加、ｇ）１〜５０回の細胞倍加、ｈ）５〜５０回の細胞倍加、ｉ）１０〜５０回の細胞倍加、ｊ）２０〜５０回の細胞倍加、ｋ）３０〜５０回の細胞倍加、ｌ）１〜１０回の細胞倍加、ｍ）１〜２０回の細胞倍加、ｎ）１〜３０回の細胞倍加、ｏ）１〜４０回の細胞倍加、ｐ）５〜２０回の細胞倍加、ｑ）５〜３０回の細胞倍加、ｒ）５〜４０回の細胞倍加、ｓ）１０〜３０回の細胞倍加、ｔ）１０〜４０回の細胞倍加、およびｕ）２０〜４０回の細胞倍加
からなる群から選択される数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞倍加を通してほぼ一定の倍加速度を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７． 前記細胞集団が、
ａ）少なくとも約１０回の集団倍加、ｂ）少なくとも約１５回の集団倍加、ｃ）少なくとも約２０回の集団倍加、ｄ）少なくとも約２５回の集団倍加、ｅ）少なくとも約３０回の集団倍加、ｆ）少なくとも約３５回の集団倍加、ｇ）少なくとも約４０回の集団倍加、ｈ）少なくとも約４５回の集団倍加、およびｉ）少なくとも約５０回の集団倍加
からなる群から選択される集団倍加回数を経ている、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、前記細胞集団の細胞表面において、またはそれに結合される、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、前記細胞集団の細胞外環境へ分泌される、実施形態Ａ１〜Ａ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、
ａ）タンパク質、ｂ）炭水化物、ｃ）脂質、ｄ）脂肪酸、ｅ）脂肪酸誘導体、ｄ）ガスおよびｅ）核酸
からなる群から選択される１つまたは複数の分子である、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１． 前記タンパク質が、
ａ）グリコシル化タンパク質、ｂ）サイトカイン、ｃ）ケモカイン、ｄ）リンフォカイン、ｅ）成長因子、ｆ）栄養因子、ｇ）形態発生タンパク質およびｈ）ホルモン
からなる群から選択される、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３２． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、
ａ）脂肪酸、ｂ）脂肪酸誘導体、ｃ）受容体分子、ｄ）サイトカイン、ｅ）ケモカイン、ｆ）リンフォカイン、ｇ）成長因子、ｈ）栄養因子、ｉ）形態発生タンパク質およびｊ）ホルモン
からなる群から選択される分子に結合して不活性化するか、またはその生物活性を低減する、実施形態Ａ３１に記載の方法。
Ａ３３． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、
ａ）脂肪酸、ｂ）脂肪酸誘導体、ｃ）受容体分子、ｄ）サイトカイン、ｅ）ケモカイン、ｆ）リンフォカイン、ｇ）成長因子、ｈ）栄養因子、ｉ）形態発生タンパク質およびｊ）ホルモン
からなる群から選択されるコグネイトリガンドに結合する可溶性の受容体である、実施形態Ａ３２に記載の方法。
Ａ３４． 前記細胞が１つまたは複数の生物学的組成物の発現を増加させるように誘導される、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３５． 前記細胞が１つまたは複数の生物学的組成物を発現するように誘導される、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３６． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃから選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３７． 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、
ａ）ＴＮＦ−ＲＩ、ｂ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩ、ｃ）ＴＮＦ−ＲＩＩ、ｄ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ、ｅ）ＩＬ−１Ｒアンタゴニストおよびｆ）ＩＬ−１８結合タンパク質
からなる群から選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３８． 前記細胞集団内の細胞が哺乳動物生物体に投与された場合に、組織または器官において、またはそれらと長期の移植を示さない、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３９． 前記細胞集団内の細胞が、１つまたは複数の治療上有用な組成物のほぼ一定の産生レベルをｉｎ ｖｉｖｏで維持する、実施形態Ａ１〜Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４０． 前記産生レベルが、
ａ）少なくとも約２４時間、ｂ）少なくとも約４８時間、ｃ）少なくとも約７２時間、ｄ）少なくとも約４日、ｅ）少なくとも約５日、ｆ）少なくとも約６日、ｇ）少なくとも約７日、ｈ）少なくとも約２週間、ｉ）少なくとも約３週間、ｊ）少なくとも約４週間、ｋ）少なくとも約１カ月、ｌ）少なくとも約２カ月、ｍ）少なくとも約３カ月、ｎ）少なくとも約６カ月、およびｏ）少なくとも約１年
からなる群から選択される時間尺度の間維持される、実施形態Ａ３９に記載の方法。
Ａ４１． 前記患者がヒトである、実施形態Ａ１〜Ａ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４２． 前記方法が、
ａ）神経系の疾患または障害、ｂ）心臓の疾患または障害、ｃ）皮膚の疾患または障害、ｄ）骨格筋の疾患または障害、ｅ）呼吸器の疾患または障害、ｆ）肝臓の疾患または障害、ｇ）腎臓の疾患または障害、ｈ）尿生殖器系の疾患または障害、ｉ）膀胱の疾患または障害、ｊ）内分泌系の疾患または障害、ｋ）造血系の疾患または障害、ｌ）膵臓の疾患または障害、ｍ）糖尿病、ｎ）眼の疾患または障害、ｏ）網膜の疾患または障害、ｐ）胃腸の疾患または障害、ｑ）脾臓の疾患または障害、ｒ）免疫系の疾患または障害、ｓ）自己免疫性の疾患または障害、ｔ）炎症性の疾患または障害、ｕ）過剰増殖性の疾患または障害、およびｖ）癌
からなる群から選択される疾患または障害を治療するために用いられる、実施形態Ａ１〜Ａ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４３． 前記細胞が遺伝子操作されている、実施形態Ａ１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４４． 前記細胞が組換え核酸分子の導入によって遺伝子操作されている、実施形態Ａ４３に記載の方法。
Ａ４５． 実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つに記載の単離細胞集団を作製する方法であって、
ｉ）生物体から細胞源集団を得ることと、
ｉｉ）前記細胞源集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することと
を含む方法。
Ｂ１． 自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）またはそのような細胞に由来する馴化細胞培地、および精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質の薬学的に許容される混合物を含む組成物。
Ｂ２． 前記ＣＦ−ＳＣが骨髄に由来する、実施形態Ｂ１に記載の組成物。
Ｂ３． 前記ＣＦ−ＳＣがヒトに由来する、実施形態Ｂ１またはＢ２に記載の組成物。
Ｂ４． 前記ＣＦ−ＳＣが、ヒトを含む成体哺乳動物に由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ５． 前記ＣＦ−ＳＣが、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す１つまたは複数の分泌タンパク質を発現する、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ６． 前記細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質が、
ａ）コラーゲン、ｂ）エラスチン、ｃ）フィブロネクチン、ｄ）ラミニン、ｅ）エンタクチン（ニドゲン）、ｆ）ヒアルロン酸、ｇ）ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ｈ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、ｉ）フィブリン、ｊ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、ｋ）トロンビン、ｌ）アンチトロンビン、ｍ）組織因子ＶＩＩａの補因子（第ＩＩＩ因子）、ｎ）プロテインＣ、ｏ）プロテインＳ、ｐ）プロテインＺ、ｑ）プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害因子、ｒ）ヘパリン補因子ＩＩ、ｓ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、ｔ）第ＶＩＩ因子、ｕ） 第ＶＩＩＩ因子、ｖ）第ＩＸ因子、ｗ）第Ｘ因子、ｘ）第ＸＩ因子、ｙ）第ＸＩＩ因子、ｚ）第ＸＩＩＩ因子、ａａ）フォンウィルブラント因子、ａｂ）プレカリクレイン、ａｃ）高分子キニノーゲン、ａｄ）プラスミノーゲン、ａｅ）プラスミン、ａｆ）組織プラスミノーゲン活性化因子、ａｇ）ウロキナーゼ、ａｈ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、および、ａｉ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−２
からなる群から選択される分子の１つまたは複数の完全長、または選択的プロセシングされたアイソフォーム、タンパク分解断片もしくはサブユニットを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ７． 精製された天然に存在するかまたは単離された組換えサイトカインまたはケモカインをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ８． 前記細胞外マトリックス、血漿タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインがヒトに由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ９． 前記薬学的に許容される混合物が半固体または固体のマトリックスを形成する、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ１０． 実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物が液体である方法。
Ｂ１１． 液体が注射によって適用される、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１２． 実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物は液体として適用されるが、その後、半固体または固体のマトリックスを形成する方法。
Ｂ１３． 前記組織が、
ａ）疾患、ｂ）物理的外傷、ｃ）虚血、ｄ）加齢、ｅ）火傷、ｆ）細菌感染症、ｇ）ウイルス感染症、ｈ）真菌感染症、および、ｉ）免疫系の調節不全
からなる群から選択される状態の結果として損傷を受ける、実施形態Ｂ１０〜Ｂ１２に記載の方法。
Ｂ１４． 前記損傷組織が皮膚である、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
Ｂ１５． 顔の皮膚の若返りのために、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の組成物を用いる方法。
Ｂ１６． 前記組成物が急性炎症を阻害する、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の組成物を用いる方法。
Ｃ１． 損傷を受けた器官または組織の治療、修復、再生または治癒のための方法であって、損傷を受けた器官または組織の前記治療、修復、再生または治癒を達成するために、前記損傷を受けた器官または組織を、自己複製性コロニー形成体細胞またはそのような細胞から産生される組成物の有効量と接触させることを含む方法。
Ｃ２． 前記損傷を受けた器官または組織を、
ａ）損傷を受けた器官または組織への注射、ｂ）損傷を受けた器官または組織への塗布、ｃ）損傷を受けた器官または組織の近位への注射、ｄ）損傷を受けた器官または組織の近位への塗布、およびｅ）静脈内投与
からなる群から選択される手段によって、自己複製性コロニー形成体細胞またはそのような細胞から産生される組成物の有効量と接触させる、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３． 前記細胞が骨髄に由来する、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
Ｃ４． 前記細胞がヒトである、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、有害な免疫応答（例えば細胞性自己免疫）、線維化（瘢痕化）および／または有害な組織リモデリング（例えば、心室のリモデリング）を阻害または低減する、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、炎症を制御し、かつ／または急性炎症を阻害する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、血管形成を刺激または増強する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ８． 前記細胞が、前記損傷を受けた器官または組織へのかなりのもしくは検出可能なレベルの永久的または長期の移植を示さない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ９． 前記損傷器官が、心臓、脳および脊髄からなる群から選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１０． 前記損傷組織が、心臓組織、ニューロン組織（中枢および末梢の神経系組織を含む）ならびに血管組織（主要および非主要な動脈、静脈および毛細管を含む）からなる群から選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１． 自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）またはそのような細胞に由来する馴化細胞培地、および精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質の薬学的に許容される混合物を含む組成物。
Ｄ２． 前記ＣＦ−ＳＣが骨髄に由来する、実施形態Ｄ１に記載の組成物。
Ｄ３． 前記ＣＦ−ＳＣがヒトに由来する、実施形態Ｄ１またはＤ２に記載の組成物。
Ｄ４． 前記ＣＦ−ＳＣが、ヒトを含む成体哺乳動物に由来する、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ５． 前記ＣＦ−ＳＣが、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す１つまたは複数の分泌タンパク質を発現する、実施形態Ｄ１〜Ｄ４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ６． 前記細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質が、
ａ）コラーゲン、ｂ）エラスチン、ｃ）フィブロネクチン、ｄ）ラミニン、ｅ）エンタクチン（ニドゲン）、ｆ）ヒアルロン酸、ｇ）ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ｈ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、ｉ）フィブリン、ｊ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、ｋ）トロンビン、ｌ）アンチトロンビン、ｍ）組織因子ＶＩＩａの補因子（第ＩＩＩ因子）、ｎ）プロテインＣ、ｏ）プロテインＳ、ｐ）プロテインＺ、ｑ）プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害因子、ｒ）ヘパリン補因子ＩＩ、ｓ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、ｔ）第ＶＩＩ因子、ｕ）第ＶＩＩＩ因子、ｖ）第ＩＸ因子、ｗ）第Ｘ因子、ｘ）第ＸＩ因子、ｙ）第ＸＩＩ因子、ｚ）第ＸＩＩＩ因子、ａａ）フォンウィルブラント因子、ａｂ）プレカリクレイン、ａｃ）高分子キニノーゲン、ａｄ）プラスミノーゲン、ａｅ）プラスミン、ａｆ）組織プラスミノーゲン活性化因子、ａｇ）ウロキナーゼ、ａｈ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、および、ａｉ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−２
からなる群から選択される分子の１つまたは複数の完全長、または選択的プロセシングされたアイソフォーム、タンパク分解断片もしくはサブユニットを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ７． 精製された天然に存在するかまたは単離された組換えサイトカインまたはケモカインをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ８． 前記細胞外マトリックス、血漿タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインがヒトに由来する、実施形態Ｄ１〜Ｄ７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ９． 前記薬学的に許容される混合物が半固体または固体のマトリックスを形成する、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ１０． 実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物が液体である方法。
Ｄ１１． 前記液体が注射によって適用される、実施形態Ｄ１０に記載の方法。
Ｄ１２． 実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物は液体として適用されるが、その後、半固体または固体のマトリックスを形成する方法。
Ｄ１３． 前記組織が、
ａ）疾患、ｂ）物理的外傷、ｃ）虚血、ｄ）加齢、ｅ）火傷、ｆ）細菌感染症、ｇ）ウイルス感染症、ｈ）真菌感染症、および、ｉ）免疫系の調節不全からなる群から選択される状態の結果として損傷を受ける、実施形態Ｄ１０〜Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１４． 前記損傷組織が皮膚である、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
Ｄ１５． 顔の皮膚の若返りのために、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の組成物を用いる方法。
Ｄ１６． 前記組成物が急性炎症を阻害する、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の組成物を用いる方法。
Ｄ１７． 損傷を受けた器官または組織の治療、修復、再生または治癒のための方法であって、損傷を受けた器官または組織の前記治療、修復、再生または治癒を達成するために、前記損傷を受けた器官または組織を、自己複製性コロニー形成体細胞またはそのような細胞から産生される組成物の有効量と接触させることを含む方法。
Ｄ１８． 前記損傷を受けた器官または組織を、
ａ）損傷を受けた器官または組織への注射、ｂ）損傷を受けた器官または組織への塗布、ｃ）損傷を受けた器官または組織の近位への注射、ｄ）損傷を受けた器官または組織の近位への塗布、およびｅ）静脈内投与
からなる群から選択される手段によって、自己複製性コロニー形成体細胞またはそのような細胞から産生される組成物の有効量と接触させる、実施形態Ｄ１７に記載の方法。
Ｄ１９． 前記細胞が骨髄に由来する、実施形態Ｄ１７またはＤ１８に記載の方法。
Ｄ２０． 前記細胞がヒトである、実施形態Ｄ１７〜Ｄ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２１． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、有害な免疫応答（例えば細胞性自己免疫）、線維化（瘢痕化）および／または有害な組織リモデリング（例えば心室のリモデリング）を阻害または低減する、実施形態Ｄ１７〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２２． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、炎症を制御し、かつ／または急性炎症を阻害する、実施形態Ｄ１２〜Ｄ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２３． 前記細胞または前記細胞によって産生される組成物が、血管形成を刺激または増強する、実施形態Ｄ１７〜Ｄ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２４． 前記細胞が、前記損傷を受けた器官または組織へのかなりのもしくは検出可能なレベルの永久的または長期の移植を示さない、実施形態Ｄ１７〜Ｄ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２５． 前記損傷器官が、心臓、脳および脊髄からなる群から選択される、実施形態Ｄ１７〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２６． 前記損傷組織が、心臓組織、ニューロン組織（中枢および末梢の神経系組織を含む）ならびに血管組織（主要および非主要な動脈、静脈および毛細管を含む）からなる群から選択される、実施形態Ｄ１７〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２７． 新しい赤血球の生成をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導、増強および／または維持する方法。
Ｄ２８． 前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と自己複製性コロニー形成細胞との共培養によって達成される、実施形態Ｄ２７に記載の方法。
Ｄ２９． 前記自己複製性コロニー形成細胞がヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ２８に記載の方法。
Ｄ３０． 前記ｈＡＢＭ−ＳＣが成体に由来する、実施形態Ｄ２９に記載の方法。
Ｄ３１． 前記共培養が、自己複製性コロニー形成細胞からの造血前駆細胞の分離を維持するために、半透過性バリアを利用し、一方、前記自己複製性コロニー形成細胞によって産生される組成物の前記バリアを越える交換を可能にする、実施形態Ｄ２７〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３２． 前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と、自己複製性コロニー形成細胞によって産生される単離組成物との共培養によって達成される、実施形態Ｄ２７に記載の方法。
Ｄ３３． 前記自己複製性コロニー形成細胞がヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ３２に記載の方法。
Ｄ３４． 前記ｈＡＢＭ−ＳＣが成体に由来する、実施形態Ｄ３３に記載の方法。
Ｄ３５． 前記単離組成物が凍結乾燥される、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３６． 前記単離組成物が低温保存される、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３７． 前記単離組成物が１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合される、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３８． 細胞由来の組成物および／または栄養因子を生成、単離、精製および／またはパッケージ化する方法。
Ｄ３９． 馴化培地を生成する方法であって、前記培地が血清を含むか、無血清培地である方法。
Ｄ４０． 馴化培地から分画および／または細胞由来の組成物を単離および精製する方法であって、前記培地が血清を含むか、無血清培地である方法。
Ｄ４１． ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢＣ）を単離、低温保存および／または増殖させる方法。
Ｄ４２． 前記ＣＢＣを懸濁培養中で増殖させる、実施形態Ｄ４１に記載の方法。
Ｄ４３． 前記ＣＢＣを自己複製性コロニー形成細胞のフィーダー層と共培養することによって増殖させる、実施形態Ｄ４１に記載の方法。
Ｄ４４． 前記自己複製性コロニー形成細胞がヒト骨髄に由来する体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ４３に記載の方法。
Ｄ４５． デキストロースで平衡させた塩溶液（ＢＳＳＤ）を含む洗浄溶液。
Ｄ４６． 前記デキストロースが約４．５％デキストロースの濃度である、実施形態Ｄ４５に記載の洗浄溶液。
Ｄ４７． ヒト血清アルブミンをさらに含む、実施形態Ｄ４５またはＤ４６に記載の洗浄溶液。
Ｄ４８． 前記ヒト血清アルブミンが約５％ヒト血清アルブミンの濃度である、実施形態Ｄ４７に記載の洗浄溶液。
Ｄ４９． 平衡塩溶液中にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびヒト血清アルブミンを含む、低温保存培地。
Ｄ５０． 前記ＤＭＳＯ濃度が約５％であり、前記ＨＳＡ濃度が約５％である、実施形態Ｄ４９に記載の低温保存培地。
Ｅ１． 骨髄に由来する単離細胞集団であって、細胞集団の細胞の約９１％を超えるものがＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する、約３０時間未満の倍加速度を有する細胞集団。
Ｅ２． ヒト骨髄に由来する、実施形態Ｅ１に記載の単離細胞集団。
Ｅ３． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞がＣＤ３４および／またはＣＤ４５を発現しない、実施形態Ｅ１またはＥ２に記載の単離細胞集団。
Ｅ４． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、ＧＡＴＡ−４、Ｉｒｘ４およびＮｋｘ２．５からなる群から選択される少なくとも１つの心臓関連の転写因子をさらに発現する、実施形態Ｅ１、Ｅ２またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ５． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、
ａ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、
ｂ）シスタチン−Ｃ、
ｃ）インターロイキン６（ＩＬ−６）、
ｄ）インターロイキン７（ＩＬ−７）、
ｅ）インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、
ｆ）神経成長因子（ＮＧＦ）、
ｇ）ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、
ｈ）マクロファージ化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）、
ｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、
ｊ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、および
ｋ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）
からなる群から選択される少なくとも１つの栄養因子をさらに発現する、実施形態Ｅ１、Ｅ２またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ６． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、ｐ２１またはｐ５３をさらに発現し、ｐ５３の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写産物につきｐ５３の最高約３０００個の転写産物の相対的発現であり、ｐ２１の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写産物につきｐ２１の最高約２０，０００個の転写産物の相対的発現である、実施形態Ｅ１、Ｅ２またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ７． ａ）少なくとも約１５回の集団倍加、
ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加、
ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加、
ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加、
ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加、および
ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加からなる群
から選択される集団倍加回数を通してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されている、実施形態Ｅ１、Ｅ２またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ８． 骨髄に由来する単離細胞集団を作製する方法であって、細胞集団の細胞の約９１％を超えるものがＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現し、前記細胞集団が約３０時間未満の倍加速度を有し、
ａ）低酸素条件または低い酸化的ストレス条件下で前記細胞集団の源を培養して接着性細胞集団を生成するステップと、
ｂ）約２５００細胞／ｃｍ２未満の播種密度で接着性細胞集団を培養するステップと
を含む方法。
Ｅ９． 前記細胞集団がヒト骨髄に由来する、実施形態Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０． 実施形態８パートａ）の細胞集団源が、
ａ）約７５０００細胞／ｃｍ２未満、および
ｂ）約５００００細胞／ｃｍ２未満
からなる群から選択される初期播種密度で培養される、実施形態Ｅ８またはＥ９に記載の方法。
Ｅ１１． 実施形態８パートｂ）の接着性細胞集団が、
ａ）約２５００細胞／ｃｍ２未満、
ｂ）約１０００細胞／ｃｍ２未満、
ｃ）約１００細胞／ｃｍ２未満、
ｄ）約５０細胞／ｃｍ２未満、および
ｅ）約３０細胞／ｃｍ２未満
からなる群から選択される播種密度で培養される、実施形態Ｅ８〜Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２． 前記低酸素条件が、
ａ）約１〜１０％酸素、
ｂ）約２〜７％酸素、
ｄ）約２０％未満酸素、
ｃ）約１５％未満酸素、
ｄ）約１０％未満酸素、
ｅ）約５％未満酸素、および
ｆ）約５％酸素
からなる群から選択される、実施形態Ｅ８〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１３． 前記細胞集団の源を培養する前に前記細胞集団の源の中の赤血球を溶解することをさらに含む、実施形態Ｅ８〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４． 前記細胞集団の源を培養する前に、密度勾配を介した継代培養によって前記細胞集団の分画された源を選択することをさらに含む、実施形態Ｅ８〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞がＣＤ３４および／またはＣＤ４５を発現しない、実施形態Ｅ８〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、ＧＡＴＡ−４、Ｉｒｘ４およびＮｋｘ２．５からなる群から選択される少なくとも１つの心臓関連の転写因子をさらに発現する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、
ａ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、
ｂ）シスタチン−Ｃ、
ｃ）インターロイキン６（ＩＬ−６）、
ｄ）インターロイキン７（ＩＬ−７）、
ｅ）インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、
ｆ）神経成長因子（ＮＧＦ）、
ｇ）ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、
ｈ）マクロファージ化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）、
ｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、
ｊ）幹細胞因子（ＳＣＦ）および
ｋ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）
からなる群から選択される少なくとも１つの栄養因子をさらに発現する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８． ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する前記細胞集団の細胞が、ｐ２１またはｐ５３をさらに発現し、ｐ５３の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写産物につきｐ５３の最高約３０００個の転写産物の相対的発現であり、ｐ２１の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写産物につきｐ２１の最高約２０，０００個の転写産物の相対的発現である、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９． 前記単離細胞集団が、
ａ）少なくとも約１５回の集団倍加、
ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加、
ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加、
ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加、
ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加、および
ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加
からなる群から選択される集団倍加回数を通してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されている、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０． 実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の単離細胞集団の使用であって、
ａ）変性性の状態、
ｂ）急性傷害状態、
ｃ）神経の状態、および
ｄ）心臓の状態からなる群から選択される状態を起こしているヒトを治療するための医薬の製造における使用。
Ｅ２１． 実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の単離細胞集団の使用であって、変性性または急性傷害状態を起こしているヒトを治療するための医薬の製造における使用。
Ｅ２２． 骨髄に由来する単離細胞集団であって、細胞集団の細胞の約９１％を超えるものがＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現する、低酸素条件下で約３０時間未満の倍加速度を有する細胞集団。
Ｅ２３． ヒト骨髄に由来する、実施形態Ｅ２２に記載の単離細胞集団。
Ｅ２４． 前記低酸素条件が約１〜１０％酸素である、実施形態Ｅ２２またはＥ２３に記載の単離細胞集団。
Ｅ２５． 前記低酸素条件が約５％酸素である、実施形態Ｅ２４に記載の単離細胞集団。
Ｅ２６． 約２５００細胞／ｃｍ２未満の播種密度で接着性細胞集団として培養される、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ２７． 前記播種密度が約１０００細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ２８． 前記播種密度が約１００細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ２９． 前記播種密度が約５０細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ３０． 前記播種密度が約３０細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
Ｅ３１． 単離細胞集団を作製する方法であって、細胞集団の細胞の約９１％を超えるものがＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現し、前記細胞集団が約３０時間未満の倍加速度を有し、
ａ）ヒトから骨髄細胞を吸引するステップと、
ｂ）骨髄穿刺液の赤血球成分を溶解するステップと、
ｃ）非溶解骨髄細胞を組織培養装置に播種するステップと、
ｄ）非溶解骨髄細胞を表面に付着させるステップと、
ｅ）５％酸素条件下で接着性細胞を培養するステップと、
ｆ）３０細胞／ｃｍ２の播種密度で接着性細胞を継代培養するステップと
を含む方法。
Ｅ３２． 実施形態Ｅ３１に記載の方法によって入手可能な単離細胞集団。
Ｅ３３． 実施形態Ｅ３１に記載の方法によって得られた単離細胞集団。
Ｅ３４． 単離細胞集団を作製する方法であって、細胞集団の細胞の約９１％を超えるものがＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を同時発現し、前記細胞集団が３０回の細胞倍加の後に約３０時間未満の倍加速度を有し、
ａ）ヒトから骨髄細胞を吸引するステップと、
ｂ）密度勾配を介した継代培養によって細胞集団の分画された源を選択するステップと、
ｃ）分画化細胞を組織培養装置に播種するステップと、
ｄ）分画化細胞を表面に付着させるステップと、
ｅ）５％酸素条件下で接着性細胞を培養するステップと、
ｆ）３０細胞／ｃｍ２の播種密度で接着性細胞を継代培養するステップと
を含む方法。
Ｅ３５． 実施形態Ｅ３４に記載の方法によって入手可能な単離細胞集団。
Ｅ３６． 実施形態Ｅ３４に記載の方法によって得られた単離細胞集団。
（実施例１）
成人骨髄由来体細胞の生理活性：
無血清馴化培地の生成
分泌タンパク質の固相抗体捕捉（これについても以下に記載する）等のアッセイ中で使用するために、無血清馴化培地の生成を、以下の記載に従って実施した。
ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＲＥＣＢ−８１９；約４３回の集団倍加時）を解凍し、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（カタログ番号：ＳＨ３００３４．０１．ロット番号：１３４−７９４４、（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ））を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号：１２４９１−０１５、ロット番号：１２１６０３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））、または４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有し、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（ＩＴＳ）（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号：５１３００−０４４、ロット番号：１３４９２６４）を補ったＨｙＱ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）カタログ番号：ＳＨ３０２５５．０１、ロット番号：ＡＲＣ２５８６８）のいずれかの中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）培養フラスコ（培養表面が、特許されているマイクロ波プラズマ処理を用いて処理されている；米国特許第６，６１７，１５２号を参照されたい）（ｎ＝３）中、３６ｍＬの培地中に、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（各条件につき、ｎ＝３）。培養物を、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に、約２４時間置いた。次いで、同じ日に、培養物に新鮮培地を再供給して、非付着性デブリを除去し、インキュベーターに戻した。第３日に、細胞培養培地を、２０ｍＬのＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って濃縮した。手短にいうと、濃縮器を、１１４０×Ｇで４５分間遠心分離した。濃縮した上清を、清浄な２ｍＬクライオバイアルに移し、−８０℃で保管した。また、新鮮培地も、陰性対照として使用するために、記載に従って濃縮した。次いで、フラスコから、０．２５％ブタトリプシンＥＤＴＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）；カタログ番号：３０−００４−Ｃ１（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、ＵＳＡ））を使用して、細胞を除去した。次いで、１０％ウシ胎仔血清を含有する、等容量の細胞培養培地をさらに添加することによって、トリプシンを中和した。細胞計数および生存率解析をそれぞれ、ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＡｃＴ１０Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）およびトリパンブルー排除アッセイを使用して実施した。
２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施するために、ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＰＣＨ６２７；約２７回の集団倍加時）を解凍し、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号：ＳＨ３００３４．０１、ロット番号：１３４−７９４４））を補ったＨｙＱ（登録商標）Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号：ＳＨ３０２６５．０１、ロット番号：ＡＳＡ２８１１０）、または４ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号：ＳＨ３００３４．０１、ロット番号：１３４−７９４４）を補ったＲＰＭＩｌ６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号：ＳＨ３０２５５．０１）のいずれかの中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）培養フラスコ（ｎ＝３）中、３６ｍＬの培地中に、２４〜４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（各条件につき、ｎ＝３）。培養物を、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に、約２４時間置いた。同じ日に、培養物に新鮮培地を再供給して、非付着性デブリを除去し、次いで、インキュベーターに戻した。翌日、馴化培地を収集、プールし、１１４０×Ｇで１５分間遠心分離し、細胞デブリを除去し、次いで、無菌の遠心分離用チューブに移して、−８０℃で短期間保管した。
（実施例２）
分泌因子の二次元（２−Ｄ）ＳＤＳ ＰＡＧＥによる分離（図１）
馴化培地および対照培地の凍結した一定分量（試料）を、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に、解析のために送った。使用前に、試料を解凍し、室温まで加温した。約５０ｍＬの各試料を凍結乾燥し、次いで、２００マイクロＬのＳＤＳ Ｂｏｉｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（５％ドデシル硫酸ナトリウム、５％ベータメルカプトエタノールエタノール、１０％グリセロールおよび６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）および２ｍＬの超純水の中に再溶解させた。次いで、試料を、６〜８，０００ＭＷＣＯメンブランを使用して、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０に対して、４℃で２日間透析した。最後の透析は、水のみを使用して実施した。試料を再度、凍結乾燥し、２００マイクロＬのＳＤＳ Ｂｏｉｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に再溶解させ、沸騰水浴中で５分間加熱してから、ゲルに添加した。
二次元ゲル電気泳動を、以下のＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｐ．Ｈ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５０巻：４００７〜４０２１頁、１９７５年）の方法に従って実施した。最初に、等電点電気泳動を、内径２．０ｍｍのガラス製チューブ中で、２．０％アンフォライン、ｐＨ３．５〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、２０，０００ボルト−時間で実施した。次いで、５０ｎｇのＩＥＦ内部標準（トロポミオシン）を、各試料に添加した。トロポミオシンの標準は、ゲル上の基準点として使用され、ＭＷ３３，０００およびｐＩ５．２のより低いポリペプチドのスポットを有する二重線として移動する。このセットのアンフォラインためのチューブゲルのｐＨ勾配を、表面ｐＨ電極を使用して決定した。
緩衝液０（１０％グリセロール、５０ｍｍジチオスレイトール、２．３％ＳＤＳ、０．０６２５Ｍ ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８）中で１０分間平衡化した後、各チューブゲルを、濃縮用ゲルの上部に封着した。この濃縮用ゲルは、それ自体、１２％アクリルアミドスラブゲル（厚さ１．０ｍｍ）の上部に置かれている。ＳＤＳスラブゲルの電気泳動を、２５ｍＡで約５時間実施した。以下のタンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を、分子量の標準として、単一のウエルに、ゲルのアガロース部分において添加した（このアガロースは、チューブゲルとスラブゲルとの間に流し込まれている）：ミオシン（２２０，０００ダルトン）、ホスホリラーゼＡ（９４，０００ダルトン）、カタラーゼ（６０，０００ダルトン）、アクチン（４３，０００ダルトン）、炭酸脱水素酵素（２９，０００ダルトン）、およびリゾチーム（１４，０００ダルトン）。銀染色後、標準は、アクリルアミドスラブゲルの塩基性の縁部上に、バンドとして出現する（ＯａｋｌｅｙらＡｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５巻：３６１〜３６３頁、１９８０年）。次いで、ゲルを、２枚のセロハン紙の間で、酸性の端部を左にして乾燥させた（図１）。ゲルを、質量分析による解析に使用する意図がある場合には、ゲルを、Ｏ’ＣｏｎｎｅｌｌおよびＳｔｕｌｔｓ（Ｏ’ＣｏｎｎｅｌｌおよびＳｔｕｌｔｓ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１８巻：３４９〜３５９頁、１９９７年）の銀染色の方法を使用して染色する。
結果から、提供した方法を使用すると、ヒトＡＢＭ−ＳＣを、動物血清の非存在下で培養して、分泌タンパク質に富む馴化培地を生成することができ、そのようなタンパク質を、個別に同定および単離することができることが示されている。あるいは、そのようにして生成した馴化培地はまた、発現タンパク質を分子量の範囲に基づいて分画することによって処理することもできる。タンパク質の濃縮および分画についての技法は、当業者であれば、周知しており、日常的に使用している。これらの技法には、親和性クロマトグラフィー、中空繊維ろ過、２Ｄ ＰＡＧＥ、および低吸収限外ろ過等の技法がある。
（実施例３Ａ）
ヒトＡＢＭ−ＳＣによる再生促進性サイトカインの分泌
ヒトＡＢＭ−ＳＣを、ＡＦＧｌ０４培地を含有する細胞培養「Ｔ型」フラスコ中、６，０００生存細胞／ｃｍ２で、三つ組みで蒔いた。細胞を２４時間付着および平衡化させた後、培地を完全に交換し、フラスコを７２時間インキュベートした。培地を収集、遠心分離し、市販の比色分析ＥＬＩＳＡアッセイキットを使用するサイトカインの解析まで、−８０℃で保管した。分泌サイトカインの放出の解析のために、姉妹フラスコを、１０ｍｇ／ｍＬ ＴＮＦ−アルファで処理した。これは、７２時間のインキュベーションの最後の２４時間の間に添加した。それぞれについて、細胞および上清の３ロットのフラスコを、独立に基礎条件および刺激条件について調製、処理および保管し、それぞれ、基礎条件フラスコＡ、ＢおよびＣ、または刺激条件フラスコＡ、ＢおよびＣと指定した。
結果から、ＡＢＭ−ＳＣは、継代培養すると、潜在的に、血管新生、炎症および創傷治癒を増大することが知られている、治療濃度のいくつかの増殖因子およびサイトカインを分泌することが示されている。図１１を参照されたい。したがって、ＡＢＭ−ＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、いくつかのサイトカインおよび増殖因子を一貫して分泌することが示されており；これらには、血管新生促進因子（例えば、ＳＤＦ−１アルファ、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８およびアンジオゲニン）、免疫調節物質（例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−８）、ならびに瘢痕阻害物質／創傷治癒調節物質（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびアクチビン−Ａ）がある。さらに、これらの因子のうちのいくつかの放出は、急性の組織傷害の経過の間に放出される炎症性サイトカインとして知られている、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）によっても調節される。
（実施例３Ｂ）
分泌因子の固相捕捉および同定（表１Ａ，１Ｂおよび１Ｃ）
馴化培地を、サイトカイン、プロテアーゼおよび可溶性受容体等の、種々のタンパク質の存在について、ＲＡＹＢＩＯ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）を使用する固相抗体捕捉タンパク質アレイによってスクリーニングした。手短にいうと、使用前に、馴化培地の凍結した一定分量を解凍し、室温まで加温した。アレイのメンブランを、８ウエルのトレイ（Ｃシリーズ１０００）のウエル中に置いた。各ウエルに、２ｍＬの１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を添加し、次いで、室温で３０分間インキュベートして、メンブランをブロックした。次いで、各容器から、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒをデカントし、次いで、メンブランを、（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いて１：１０に希釈した）馴化培地と共に、室温で１時間インキュベートした。新鮮な細胞培養培地を、ＰＢＳの代わりに陰性対照として使用した。次いで、各容器から、試料をデカントし、２ｍＬの１×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて室温で５分間振とうしながら３回洗浄した。次いで、１つのウエル中に、アレイのメンブランを、１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中で調製した１ｍＬのビオチン統合二次抗体と共に置き、室温で１時間インキュベートした。次いで、アレイをＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを用いて数回洗浄した。１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いて１：１０００に希釈した２ｍＬのＨＲＰ統合ストレプトアビジンを各メンブランに添加し、次いで、室温で２時間インキュベートした。次いで、メンブランを１×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを用いて数回洗浄した。化学発光のための検出試薬を、製造者（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）の指示に従って調製し、各メンブランに適用し、室温で２分間インキュベートした。次いで、メンブランをプラスチック製シート上に、タンパク質側を上にして置いた。次いで、メンブランの反対側を、別の一枚のプラスチック製シートを用いて覆った。メンブランから、気泡を、プラスチックのしわを伸ばすことによって一掃した。次いで、メンブランを、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ（商標）フィルム）に曝し、次いで、フィルム現像機を使用して現像した。
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、無血清細胞培養培地中で継代培養した場合のヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌されたサイトカイン、増殖因子、可溶性受容体およびマトリックスプロテアーゼの広範なリストを示す。培地上清濃縮物＃１＝４ｍＭ Ｌ−グルタミンを補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標））。培地上清濃縮物＃２＝４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有し、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補ったＲＰＭＩ−１６４０。
結果から、これらの条件下で培養した場合、組織の再生および免疫系の調節に重要な、多数の栄養性因子および可溶性受容体が、ＡＢＭ−ＳＣによって生成されることが実証されている。とりわけ、より早期の実験からは、基礎培地をインスリン、トランスフェリンおよびセレンで補うことが、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すレベル等の分泌タンパク質のレベルを達成するために必要であることが実証された。表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すタンパク質のレベルは、ＲＡＹＢＩＯ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用して査定した。値は、平均光学密度（Ｏ．Ｄ．）として表す。（試験試料については、Ｎ＝２。対照については、Ｎ＝４。）（＋）を付けて報告する値は、それぞれの陰性対照の平均Ｏ．Ｄ．値を２標準偏差超上回る、その特定の分析対象の平均Ｏ．Ｄ．値を指す。（−）を付けて報告する値は、それぞれの陰性対照の平均Ｏ．Ｄ．値を２標準偏差超は上回らない、その特定の分析対象の平均Ｏ．Ｄ．値を指す。
（実施例４）
成人骨髄由来体細胞の生理活性：
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、分泌因子によって増強された神経新生（図２）
最初に、コラーゲンの保存液を、ラット尾部コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を０．１Ｎ酢酸中に３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁することによって調製した。次いで、コラーゲンベースの培地を、本明細書に記載するように、若干の改変を加えた、Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７６巻、３号、１２７４〜１２７８頁（１９７９年３月）の記載に従って調製した。手短にいうと、ラット尾部コラーゲン溶液を、５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補ったＤＭＥＭ５×（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、ならびに緩衝溶液（４．７：２．０：３．３の比の０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２．２％ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））と混合することによって、コラーゲン培地を調製した。約５００マイクロＬのコラーゲン細胞懸濁液を、２４ウエル培養プレートの各ウエルに添加した。次いで、この２４ウエルプレートを、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に、１時間置いて、コラーゲン溶液を凝結させた。凍結したラットＰＣ−１２を解凍し、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ−１６４０およびＩｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（ＧＩＢＣＯ（商標））を補ったＨＥＰＥＳ（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））の中で洗浄し、２５℃、３５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、同一溶液中に、７５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で、１３６ｎｇ／ｍＬラットベータ−ＮＧＦ（β−ＮＧＦ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を有する状態と有しない場状態とで再懸濁した。これらは、濃縮ＲＰＭＩ−１６４０／ＩＴＳ非馴化培地（陰性対照として使用した）の１：５０希釈液、および濃縮ＲＰＭＩ−１６４０／Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（ＩＴＳ）馴化培地の１：５０希釈液である（培地は、実施例１の記載に従って馴化した；馴化培地および非馴化培地、陰性対照培地は、実施例１の記載に従って濃縮した）。次に、各コホートについて、１ｍＬの細胞懸濁液を、２つのゲル（１ｍＬのゲル）のそれぞれの表面にわたり均一に分注し、次いで、位相差顕微鏡によって確認した。次いで、プレートを、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に置いた。３日毎に、使用済み培地を、新鮮培地で交換した。第１０日に、画像を撮影した。
これらの結果から、ＰＣ１２の、ＮＧＦによる神経細胞への分化は、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって生成された馴化培地で補った場合、劇的に増大されることが実証されている。興味深いことに、培養物中の軸索および神経突起の数によって査定した場合、神経分化の程度は、馴化培地を単独で添加した場合には、顕著ではなかった。ＮＧＦ単独の存在下では、何らかの神経突起の伸長が観察されたが、培養物を馴化培地で補うことによって、神経突起の数および長さの両方が劇的に増加した。我々の研究室の以前の研究から、すべての標準的な公開されている試験済み実験条件下では、ＲＰＭＩ培地をインスリン、トランスフェリンおよびセレンで補うことが、ＰＣ１２の神経分化については決定的に重大な意味をもつことが示された。これらのデータから、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって馴化した培地は、神経突起の伸長を、ＲＰＭＩ／ＩＴＳ培地を単独で用いて、またはＮＧＦを含有するＲＰＭＩ／ＩＴＳ培地を用いて得られるレベルを上回って補うまたは誘導する構成成分を含有することが示されている。
（実施例５）
成人骨髄由来体細胞の生理活性：
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、マイトジェン誘導Ｔ細胞増殖の阻害
ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＲＥＣＢ８０１、約１８回の集団倍加時）およびｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ＲＥＣＢ９０６、約４３回の集団倍加時）を、７５ｃｍ２フラスコ中、４ｍＭグルタミンおよび１０％血清ロット選択、ガンマ線照射、ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））を補った完全培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ−Ａｌｐｈａ（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中に、６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で蒔き、加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮培地で交換した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、カタログ番号：ＰＴ２５０１、ロット番号：６Ｆ３８３７；Ｃａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手した；これは、現在、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄが所有する）を、７５ｃｍ２フラスコ中、１５ｍＬのＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ（商標）；Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に、６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で蒔き、加湿インキュベーター中、大気Ｏ２および５％ＣＯ２において、３７℃でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮なＭＳＣＧＭ（商標）で交換した。９６時間後に、培養物中のヒトＡＢＭ−ＳＣ（ｈＡＢＭ−ＳＣ）およびｈＭＳＣの両方を採集した。採集したｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣを、９６ウエルの丸底プレート中、ＲＰＭＩ完全培地（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中に、２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で蒔いた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１．２５マイクロＭ ＣａｒｂｏｘｙＦｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）中で標識し、ＲＰＭＩ完全培地中、２５０，０００細胞／ウエルで、ｈＭＳＣ、ロット番号：ＲＥＣＢ８０１のｈＡＢＭ−ＳＣ、ロット番号：ＲＥＣＢ９０６のｈＡＢＭ−ＳＣと一緒に、または単独で培養した。Ｔ細胞の増殖を刺激するために、培養物に、２．５または１０マイクロｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を接種した。次いで、細胞を７２時間後に採集し、ＣＤ３−ＰＣ７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、製造者の指示に従って染色し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＣ５００Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で、ＦｌｏｗＪｏ８．０ソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して解析した。分裂指数について、ＣＤ３＋細胞のみを解析した。図３を参照されたい。
これらの知見から、ｅｘＡＢＭ−ＳＣは、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害する能力を有し、したがって、Ｔ細胞媒介移植片拒絶、Ｔ細胞の調節不全が関与する自己免疫障害を抑制するための治療剤として、または通常であれば免疫原性である皮膚製品に対する免疫寛容の状況を誘導するために有用であり得ることが実証されている。したがって、同種異系の皮膚製品の外科的適用を待つ熱傷患者を治療するために、そのような細胞によって生成された同種異系のヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣまたは組成物の使用を想定することができるであろう。そのような実施形態では、最初に、解放創を、そのような細胞によって生成されたｅｘＡＢＭ−ＳＣまたは組成物を用いて治療することが、創傷床の再構築を、宿主細胞を惹起して傷害部位まで移動させることによって支援するためのみならず、また、同種異系の皮膚または皮膚代用物の長期の生着を可能にする環境を提供するためにも作用し得る。
（実施例６）
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のための、水性ビヒクル中におけるブタＡＢＭ−ＳＣの再構成
ブタＡＢＭ−ＳＣを、６０細胞／ｃｍ２で播種し、第４日に、再供給し、全部で６日間増殖させた。細胞を収集し、その後に使用するまで凍結した。凍結した一定分量のブタＡＢＭ−ＳＣを解凍し、ＤＰＢＳＧ（４．５％グルコースを補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐａｈｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）））中で洗浄し、２５℃、３５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＤＰＢＳＧ中に、約５０，０００／マイクロＬの濃度で再懸濁した。細胞計数および生存率アッセイをそれぞれ、ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＡｃＴ１０Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）の使用およびトリパンブルー排除によって実施した。次いで、細胞懸濁液を、１ｃｃツベルクリンシリンジ中に充填した。
（実施例７）
成人骨髄由来体細胞の生理活性：
切開創傷の、同種異系のブタＡＢＭ−ＳＣを用いた治療
２頭のＹｕｃａｔａｎブタ、体重５７ｋｇ〜７８ｋｇに麻酔を施し、無菌手術に備えた。４つの、長さ約５０ｍｍの切開創傷を、２頭の動物（第３および４）の両側に、脊椎傍および胸部領域の皮膚に沿って、メスの刃を用いて、動物１頭当たり全部で８つ設けた。エピネフリンを浸漬させた無菌ガーゼを病変部位中に挿入することによって、出血を止めた。次いで、ガーゼを約１０〜２０分後に取り除き、各創傷を、ブタＡＢＭ−ＳＣを１２回に分けて切開部の周りに均等間隔で注射して単回投与し、創傷床自体にも追加の１０〜３００マイクロＬを適用して治療した。同様に、対照の創傷には、ビヒクル（ＤＰＢＳＧ）のみを注射した。次いで、創傷をＳｔｅｒｉ−Ｓｔｒｉｐｓ（商標）（３Ｍ）用いて閉じ、動物を、保護用のアルミニウム製ジャケットを用いて覆った。ジャケットを、毎日数回点検して、安定かつ適切な位置に確実に保った。創傷の包帯剤を、毎日モニターし、変化を第０、１、３、５および７日に写真撮影した。第７日には、病理組織診断のために、動物を安楽死させた。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を調製し、Ｈ＆Ｅによって染色した。組織形態計測的スコア化を、熟練の獣医病理学者が、治療群に関して盲検で実施した。
創傷治療７日後に、同種異系のブタＡＢＭ−ＳＣを用いて治療した病変は、目に見える瘢痕化の徴候はほとんど示さなかった（図４）が、一方、ビヒクルを用いて治療した病変は、瘢痕化の目に見える徴候を示した。創傷の組織形態計測的解析は、ＡＢＭ−ＳＣを用いて治療した創傷においては、組織マクロファージ（組織球）の著しい低下を示したが、一方、査定した、その他の組織学的スコアのいずれにおいても顕著な差は見られなかった。
再上皮化の程度（創傷治癒率のおおよその指標）について、類似の組織切片をスコア化すると、ＡＢＭ−ＳＣを用いて治療した切片は、切開部位に再配置する上皮細胞量の著しい増加を示した（図５）。
（実施例８）
液体、半固体または固体様の治療剤としてのｉｎ ｖｉｖｏ投与のための、コラーゲンビヒクル中でのヒトＡＢＭ−ＳＣの生理活性（図６〜９）
ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＰＣＨ６１０；約２７回の集団倍加）を、コラーゲンベースの生物分解性ビヒクル中で再構成し、４℃で保管した場合、少なくとも２４時間は、（ゲル収縮アッセイにおける細胞の生理活性によって実証される）高い細胞生存率を保持する。このように保管すると、コラーゲン溶液は、液体として留まり、生存率の顕著な喪失を伴わず、懸濁状態で細胞を保存する（図６）。次いで、創傷修復のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、細胞の生理活性を査定することができる。このアッセイを実施するために、最初に、コラーゲンの保存液を、ラット尾部コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を０．１Ｎ酢酸中に３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁することによって調製した。コラーゲン培地を、本明細書に記載するように、若干の改変を加えた、Ｂｅｌｌら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７６巻、３号、１２７４〜１２７８頁（１９７９年３月））の記載に従って調製した。手短にいうと、ラット尾部コラーゲン溶液を、５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補ったＤＭＥＭ５×（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）；カタログ番号：３０−００４−Ｃ１）、ならびに緩衝溶液（４．７：２．０：３．３の比の０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２．２％ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））と混合することによって、コラーゲン培地を調製した。凍結したヒト成人骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）を解凍し、ＤＭＥＭ１×中で洗浄し、２５℃、３５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＤＭＥＭ１×中に、約７２，０００全細胞／マイクロＬの濃度で再懸濁した。次いで、５０マイクロリットルの細胞懸濁液を、２ｍＬのコラーゲン培地に添加し、穏やかに粉砕し（すなわち、穏やかにピペット操作で上下させて、コラーゲン培地中に細胞の均一な懸濁液を得）、約１，８００細胞／マイクロＬの最終細胞濃度を得た。次いで、細胞懸濁液を、約４〜８℃で一晩保管した。翌日、液体の細胞懸濁液を、１５ｍＬ円錐管から移し、２４ウエルの細胞培養プレート中に、約５００マイクロＬ／ウエルで分注した。次いで、プレートを、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に１時間置いて、コラーゲンを半固体のゲルに凝固させた。次いで、ゲルを、２４ウエルプレートから、使い捨ての無菌のへら（ＶＷＲ）を使用して取り出し、１２ウエルの培養プレートに移した。次いで、ゲルを、１つのウエル当たり１．０ｍＬのＤＭＥＭ１×中に浮かべた。陰性対照として、ゲルを、細胞なしで、記載に従って調製した。各条件について、３つのウエルに播種した（ｎ＝３）。
ゲル収縮が用量依存性である程度を評価するために、類似のアッセイを実施した。この場合、ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＲＥＣＢ８１９；約４３回の集団倍加時）を、低温保管から取り出した直後に、コラーゲン溶液中に、異なる細胞濃度で再構成した（図７）。最初に、コラーゲンの保存液を、ラット尾部コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を０．１Ｎ酢酸中に３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁することによって調製した。
次いで、コラーゲン培地を、本明細書に記載するように若干の改変を加えた、Ｂｅｌｌら（１９７９年）の記載に従って調製した。手短にいうと、ラット尾部コラーゲン溶液を、５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補ったＤＭＥＭ５×（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ（商標））、ならびに緩衝溶液（４．７：２．０：３．３の比の０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２．２％ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）））と混合することによって、コラーゲン培地を調製した。凍結したヒト成人骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）を解凍し、ＤＭＥＭ１×中で洗浄し、２５℃、３５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＤＭＥＭ１×中に、約４０，０００、８０，０００および２００，０００の生存細胞／マイクロＬの濃度で再懸濁した。５０マイクロリットルの各細胞懸濁液を、２ｍＬのコラーゲン培地に添加し、穏やかに粉砕した。約５００マイクロＬのコラーゲン細胞懸濁液を、２４ウエル培養プレートの各ウエルに添加した。次いで、プレートを加湿した、３７℃の３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に１時間置いて、コラーゲン溶液を凝固させた。次いで、ゲルを、プレートから、使い捨ての無菌のへら（ＶＷＲ）を使用して取り出し、１２ウエルの培養プレートに移した。ゲルを、１つのウエル当たり１．０ｍＬのＤＭＥＭ１×中に浮かべた。
陰性対照として、ゲルを、最も高い濃度のｈＡＢＭ−ＳＣ（５×ｌ０６／ｍＬ）を使用して、細胞を（生物学的活性を排除するために）熱不活性化する以外は、上記の記載に従って調製した。最初に、最初の細胞懸濁液を、水を含有する加熱ブロック中、ＤＭＥＭ１×培地中で４０分かけて７０℃まで加熱すること（熱伝達）によって、熱不活性化細胞を調製した。各条件について、３つのウエルに播種した（ｎ＝３）。
ゲルが長時間にわたり収縮する程度を決定するために、最初または出発時の表面積パーセントを、フラットベッドスキャナを使用して第０、２４、４８および７２時間にとらえたデジタル画像から計算した。各画像から、ゲルの直径を、水平方向および垂直方向の両方で測定し、次いで、平均した。結果から、ゲル収縮の速度および程度の両方が、用量依存性の様式で影響を受けたことが実証されている（図７）。
これらの半固体のゲル中でヒトＡＢＭ−ＳＣから生成された特定の分泌タンパク質のレベルを決定するために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ゲルの周囲の液体培地から収集した、馴化細胞培養上清上で（培養の第３日に）実施した（図８）。上清を、無菌の１５ｍＬ円錐管に移し、１１４０×ｇで１５分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。次いで、上清を、２ｍＬクライオバイアルに移し、短期の保管のために−８０℃に移した。アッセイの当日、使用前に、上清を解凍し、室温まで平衡化させた。ＥＬＩＳＡ解析を、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、アクチビン−Ａ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２を検出するために実施した（ＥＬＩＳＡは、製造者の指示に従って実施し；すべてのキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入した）。結果から、治療上意味のあるレベルの栄養因子を、これらの半固体の新生組織（ｎｅｏｔｉｓｓｕｅ）によって生成させることができ、これらのレベルを、細胞濃度を加減することによって制御することができることが実証されている。熱不活性化細胞のみを含有する培養物中では、測定した栄養因子の検出可能なレベルは認められなかった。アッセイ条件間における統計学的比較を、一元配置分散分析によって決定した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
また、ヒトＡＢＭ−ＳＣを、コラーゲン溶液中で再構成して、外用治療剤として使用することができるであろう、大型フォーマットの半固体の構造を構築することもできる（図９）。そのような構造を構築するために、最初に、コラーゲンの保存液を、ラット尾部コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を０．１Ｎ酢酸中に３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁することによって調製した。ラット尾部コラーゲン溶液を、５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補ったＤＭＥＭ５×（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、ならびに緩衝溶液（６：２：２の比の０．２８６Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１．１％ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））と混合することによって、水性コラーゲン培地を調製した。凍結したｈＡＢＭ−ＳＣを解凍し、１×ＤＭＥＭ中で洗浄し、次いで、２５℃、３５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、１×ＤＭＥＭ中に、約９０，０００細胞／マイクロＬの濃度で再懸濁した。次いで、約１．１ｍＬの細胞懸濁液を、２０ｍＬコラーゲン培地に添加し、穏やかに粉砕して、５×１０６細胞／ｍＬの最終細胞濃度を達成した。コラーゲンの最終濃度は、１．８ｍｇ／ｍＬであった。次いで、細胞懸濁液を、１０ｃｍペトリ皿（形成皿）中に分注した。分注したコラーゲン溶液中の細胞の有効用量は、約１００×１０６生存細胞であった。次いで、細胞懸濁液を含有する１０ｃｍ形成皿を、加湿した３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）中に１時間置いて、コラーゲン溶液を凝固させた。次いで、半固体のゲルを、１０ｃｍ形成皿から、注意深く取り出し、１５ｃｍペトリ皿（培養皿）に移し、写真撮影した。
ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびコラーゲンに由来する固体様の新生組織を構築するためには、上記で記載した半固体の構造を、３７℃の加湿細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２）中に戻して、さらに２日間置くことができる（図１０）。固体様の新生組織を形成するために、最終コラーゲン溶液が（１．８ｍｇ／ｍＬに代わって）１．４ｍｇ／ｍＬである以外は、上記の記載に従って調製した半固体のゲルを、１０ｃｍ形成皿の縁部から注意深く取り外し、１５ｃｍ培養皿中、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を含有する、約８２ｍＬの１×ＤＭＥＭ中に浮かべた。次いで、半固体のゲルを、３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中に移して、さらに４８時間、出発コラーゲン基質を含まない、マトリックスの固体様構造へのリモデリングを促進した。次いで、固体様の新生組織を、１５ｃｍ培養皿から取り出して、写真撮影した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。マッソントリクローム染色による新生組織の組織学的解析から、マトリックスは、新たに合成されたヒトのコラーゲンおよびプロテオグリカンに富むことが実証されている（図１０Ｃ）。対照のコラーゲンのゲルは、この方法によっては染色しない。コラーゲンおよびプロテオグリカンは、青色に染色する。
これらの研究の結果から、ＡＢＭ−ＳＣ凍結貯蔵物を、解凍時に分注し、コラーゲンベースの液体培地中で再構成することができ、これは、液体の懸濁液、半固体の構築物または固体様の新生組織として治療に使用することができるであろうことが示されている。細胞懸濁液は、そのようにして調製し、約４〜１０℃で保管した場合、満足な細胞生存率を２４時間超維持しながら、液体として留まる。したがって、臨床応用に向けてＡＢＭ−ＳＣを処方するために、そのような方法を利用することは、細胞を投与する臨床医に相当な自由度をもたらすであろう。この懸濁液は、液体の注射剤として投与することができ、またはそうでなければ、創傷床に外用として適用することができるであろう。後者の場合、液体の細胞懸濁液を、創傷の外形に成型し、次いで、（例えば、約３７度Ｃまで加温して）半固体の構造に凝結させることが想定されるであろう。あるいは、この懸濁液を、半固体の構築物または固体様の新生組織を製造するように使用することもできるであろう。
また、これらのデータから、これらの方法によって調製した場合、得られた組成物もそれぞれ、種々の型の創傷、特に、皮膚が関与する創傷の修復を媒介するために重要な生理活性を示すことが示されている。
したがって、コラーゲンベースの液体培地中で調製したｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、またはそのような細胞によって生成された組成物は、解放創を治療するために外用として、または顔の若返りのための皮膚充填材の注射用代替物として使用することができるであろう。
半固体の形態では、ｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはそのような細胞によって生成された組成物は、損傷した全厚みの皮膚が外科的に除去された重度の熱傷患者を治療するために外用として使用し、したがって、皮膚代替物として作用することができるであろう。
ｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって生成された固体の新生組織を、ヒト死体皮膚（ＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標））、ブタ皮膚（ＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標））およびその他の動物由来構築物（ＩＮＴＥＧＲＡ（商標））の代替物として、外科的に使用することができるであろう。さらに、また、これらのデータから、これらの種々の構築物のそれぞれの効力を、細胞またはこれらの細胞によって生成された組成物の用量を変化させることによって制御することができることも示されている。
（実施例９）
ｈＡＢＭ−ＳＣを用いて治療したラットにおける、心機能の改善
ヒトＡＢＭ−ＳＣの、心筋梗塞後の動物への投与から、（ＡＢＭ−ＳＣ等の）ＣＦ−ＳＣが、血管新生を刺激し、線維症を低減することによって、心機能を改善し、心臓組織の損傷の修復を増強することが実証されている。図１５を参照されたい。冠状動脈を閉塞する、したがって、心臓の病変（すなわち、心臓の損傷部位）を生み出すことによる、急性心筋梗塞のラットモデルを活用した。病変ラットに、ｈＡＢＭ−ＳＣまたはビヒクルのいずれかを心臓内に注射した。
心機能による方法：雌雄両方のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約３月齢）に、正中胸骨切開によって、左前下行枝（ＬＡＤ）の周りに絹製の結紮糸を常置することにより、実験的に誘導した心筋梗塞を起こした。この手順の５日後、ラットに、シクロスポリンＡ治療の標準的な投与計画を開始し、これを研究の持続期間にわたって継続した。梗塞後第７〜８日に、ラットに麻酔を施し、挿管し、肋間を切開して、心臓の心尖部を暴露させた。次いで、超音波Ｍｉｌｌａｒカテーテルを、心室壁を通して挿入し、一定期間の圧力を約３０〜６０秒間の期間にわたって測定し、記録した。梗塞の生成および心機能の圧力／時間測定のこのモデルは、心機能に対する細胞療法の効果を査定することができる、標準的な十分に特徴付けられたモデルである（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｈｍｓｅｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．、１０５巻（１４号）：１７２０〜６頁（２００２年）を参照されたい）。
試験組成物を、３０ゲージの、死腔の少ない針を付けた、１００マイクロＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して送達した。２〜３分にわたって、それぞれ２０マイクロＬを５回注射した。４回の注射は、目に見える梗塞の周りに等距離で実施し、第５の注射は、変色領域によって決定された梗塞部位の中心内部に直接施した。注射後、切開部を縫合して閉じ、気胸を低減し、動物を人工呼吸器から離し、抜管した。注射４週間後（梗塞５週間後）、動物に再度麻酔を施し、心臓を正中胸骨切開によって暴露させ、Ｍｉｌｌａｒカテーテルを挿入した。Ｄｐ／ｄｔ測定値を、上記の記載に従って得、その後、ラットは、大量失血によって安楽死させた。
心機能からの結果（図１３）：治療４週間後、ＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、有意により高い＋ｄｐ／ｄｔ（圧力の正の最大変化率）値を示した（Ａ）。第４週の＋ｄｐ／ｄｔ値から第０週の値を差し引くことによって表した（「デルタ＋ｄｐ／ｄｔ」）、研究期間の間の心機能の変化からは、ビヒクル治療ラットは、研究期間の間に心機能を低下させた（負のデルタ）が、一方、いずれかの細胞調製物を用いて治療した動物は、心機能の有意な改善を示すことが実証された（Ｂ）。
ビヒクル治療ラットと比較して、ＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、有意により低いタウ値を示し（Ｃ）、このことから、左心室コンプライアンスの増加が示唆されている。タウは、等容性の左心室圧力の減衰の時定数である。圧力の負の最大変化率（−ｄｐ／ｄｔ）については、第４週の−ｄｐ／ｄｔ値から第０週の値を差し引くことによって表した（「デルタ−ｄｐ／ｄｔ」）、研究期間の間の心機能の変化からは、ビヒクル治療ラットは、研究期間の間に心機能を低下させた（負のデルタ）が、一方、細胞調製物を用いて治療した動物は、心機能の有意な改善を示すことが実証された（Ｄ）。［分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１］
心臓構造による方法：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、左前下行枝（ＬＡＤ）の周りに絹製の結紮糸を常置することによって、実験的に誘導した心筋梗塞を起こした。動物に、シクロスポリンＡ治療の標準的な投与計画（１０ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．、毎日）を与え、これを研究の持続期間にわたって継続した。
梗塞後第７〜８日に、ラットに麻酔を施し、挿管し、肋間を切開して、心臓の心尖部を暴露させた。心機能に到達、その後、被験物質を、３０ゲージの、死腔の少ない針を付けた、１００マイクロＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して送達した。２〜３分にわたって、それぞれ２０マイクロＬを５回注射した。４回の注射は、目に見える梗塞の周りに等距離で実施し、第５の注射は、変色領域によって決定された梗塞部位の中心内部に直接施した。注射後、切開部を縫合して閉じ、気胸を低減し、動物を人工呼吸器から離し、抜管した。注射４週間後（梗塞５週間後）、動物に再度麻酔を施し、心臓を正中胸骨切開によって暴露させ、心機能を入手した。機能測定完了後、ラットを、大量失血によって安楽死させた。最初、ラットに、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）との混合物を使用して、深く麻酔を施した。次いで、胸腔を外科的に暴露させ、心臓を解体し、１０％中性緩衝ホルマリン中に浸漬固定した。次いで、心臓全体を３つの部分に分け、包埋用の型の中に正しい位置で置き、パラフィン包埋処理した。次いで、心臓組織の６μｍの薄片を作り、ヘモトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）、またはマッソントリクロームによって染色した。また、それぞれの心臓からの少なくとも６つの切片もそれぞれ、ヘモトキシリン／エオシン、およびトリクロームを用いて染色した。具体的には、トリクローム染色によって、コラーゲン（青色）対筋肉組織（赤色）の視覚化が可能になる。コラーゲンが、瘢痕組織の存在（再生の不在）を示すことから、コラーゲンの、正常な心筋に対する比を決定した。半定量的スコア化のスケールを考案し、０を、検出可能なコラーゲンなしとし、５を、最大／重度とした。次いで、染色した切片を、組織形態計測的スコア化のために、委員会認定の病理学者に送った。
各スライドが、心室（２）の１／３遠位の心室中部領域（１）からの心室、および心室の心尖部（３）の両方の横断面の様子を示す、心臓の３つの横断面を含有した。組織形態計測的解析のために、以下の段階付けスキームを使用した。
組織損傷の場所：左心室（ＬＶ）、右心室（ＬＶ）、両心室（ＢＶ）。
影響を受けた心室の損傷のパーセント（傷害のサイズ）：パーセントで示す（０〜１００％）
心室の実験的に損傷した領域の厚さスコア：推定したミリメートル厚さに基づいて１〜４の段階で示す。組織切片中の既知の目印と比較する（例えば、平均的な赤血球は、直径７ミクロンであり；平均的な心筋線維束は、直径３０ミクロンである）。段階１（０．５ｍｍ未満）；段階２（０．５ｍｍ〜１ｍｍ）；段階３（１ｍｍ〜１．５ｍｍ）；段階４（１．５ｍｍ＋）。
組織損傷領域における新血管新生：（０〜４の段階、正常（０）〜最初の組織損傷の全領域にわたる新血管新生（４）。
最初の血管損傷：血栓症および／または残存する血管デブリの除去の結果生じた炎症を伴う、以前から存在する血管の変性／壊死を含み、０〜４の段階で表し、０を、血管の損傷が存在しない状態とし、４を、影響を受けた領域全体にわたる血管の損傷とする。
組織損傷領域内の線維症の程度：線維症なし（０）から、梗塞の手順によって引き起こされた損傷の最初の領域の線維症および瘢痕化の、２０％ずつ増加するレベル（４）まで、０〜４の段階で表す。例えば、２０％の心室の線維症には（１）の段階を割り当て、４０％の心室の線維症には（２）の段階を割り当て、６０％には（３）を割り当て、６０％超には（４）を割り当てる。
心臓構造からの結果：その後、ラットを堵殺し、心臓組織の薄片を作り、染色した。委員会認定の獣医病理学者が、半定量的スコア化を実施し（図１５）、心筋梗塞７日後にビヒクルまたはＡＢＭＳＣを与えたラットの心臓の梗塞のサイズの変化を評価した。病理組織診断解析からは、ｈＡＢＭ−ＳＣを与えたラットにおいて、ビヒクルと比較して、梗塞のサイズの有意な減少が示された。
あらかじめ設定したスケールによると、ｈＡＢＭ−ＳＣを与えたラットは、ビヒクル対照よりも約２点低い組織学的スコアを示した。図１４は、典型的な梗塞のサイズの減少の例を示す。病理組織診断解析から、ｈＡＢＭ−ＳＣは、梗塞の区域において、線維症を低減し、血管新生を増加させることが決定され（図１５）、これは、再生促進活性と一致する。したがって、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いて治療したラットは、心臓組織構造の劇的な改善を示すことが観察された。図１４および１５を参照されたい。
（実施例１０）
成人骨髄由来体細胞は、免疫媒介応答を抑制する
パートＩ：一方向性ＭＬＲ（混合性リンパ球反応）アッセイにおける、マイトジェン誘導Ｔ細胞増殖の抑制。
方法：ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ（それぞれロット番号：ＲＥＣＢ８０１およびＲＥＣＢ９０６）を、７５ｃｍ２フラスコ中、１５ｍＬの完全培地、すなわち、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（カタログ番号：ＳＨ３００３４．０１．ロット番号：１３４−７９４４、（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ））を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号：１２４９１−０１５、ロット番号：１２１６０３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））、または４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有し、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（ＩＴＳ）（ＧＩＢＣＯ（商標）；；カタログ番号：５１３００−０４４、ロット番号：１３４９２６４）を補ったＨｙＱ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）カタログ番号：ＳＨ３０２５５．０１、ロット番号：ＡＲＣ２５８６８）等中で、６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で蒔き、加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮培地で交換した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、以前のＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＰＴ２５０１、ロット番号：６Ｆ３８３７）を、７５ｃｍ２フラスコ中、１５ｍＬのＭＳＣＧＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中に、６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で蒔き、加湿インキュベーター中、大気Ｏ２および５％ＣＯ２において、３７℃でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮ＭＳＣＧＭ（商標）で交換した。９６時間後に、培養物中のｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣの両方を採集した。採集したｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣを、９６ウエルの丸底プレート中、ＲＰＭＩ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に、２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で蒔いた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１．２５μＭ ＣａｒｂｏｘｙＦｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）中で標識し、ＲＰＭＩ完全培地中、２５０，０００細胞／ウエルで、ｈＭＳＣ、ＲＥＣＢ８０１、ＲＥＣＢ９０６と一緒に、または単独で培養した。Ｔ細胞の増殖を刺激するために、培養物に、２．５または１０マイクログラム／ｍＬのフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を接種した。次いで、細胞を７２時間後に採集し、ＣＤ３−ＰＣ７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、製造者の指示に従って染色し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＣ５００Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用して解析した。分裂指数について、ＣＤ３＋細胞のみにゲートをかけて解析した。
結果：同種異系のヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、一方向性ＭＬＲアッセイにおいて、マイトジェン誘導Ｔ細胞の増殖を抑制する。図１６を参照されたい。
パートＩＩ：同種異系のブタＡＢＭ−ＳＣは、二方向性ＭＬＲ誘発アッセイにおいて、Ｔ細胞媒介免疫応答を惹起しない。
方法：ブタ全血を、第０日（治療前）にイムノアッセイのために、かつ剖検時（治療後第３日または第３０日）に細胞免疫応答解析のために収集した。各動物からのＰＢＭＣを、ｐＡＢＭ−ＳＣ、マイトジェンＣｏｎＡと共に、または培地単独で培養した。試料を、フローサイトメトリーによって解析し、増殖量を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用して計算した。
全血試料を、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）−２％ブタ血清を用いて１：１に希釈した。希釈血液を、（２：１の希釈血液対Ｆｉｃｏｌｌの比で）Ｆｉｃｏｌｌ上に重ね、３５０×Ｇで３０分間遠心分離し、遠心分離の回転を制動ゼロで止めた。得られた上部層を吸引した。中間層は、所望の単核細胞を含有し、これを、各試料についてプールし、ＤＰＢＳ−２％ブタ血清を用いて３回洗浄した。洗浄後、ペレットを、２０ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液中に再懸濁し、３分間インキュベートして、残余の赤血球細胞を除去し、次いで、２５０×Ｇで５分間遠心分離した。ペレットを、２０ｍＬのＤＰＢＳ−２％ブタ血清中で洗浄し、５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ブタ血清、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１×Ｐｅｎｎ−Ｓｔｒｅｐ）中に再懸濁した。細胞を、遠心分離により、２０×１０６細胞／ｍＬの濃度で凍結し、氷冷した凍結用培地（ブタ血清中の１０％ＤＭＳＯ）中に再懸濁し、即時に２ｍＬクライオバイアルに添加し、変速凍結フリーザー（ｃｒｙｏｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）中に置いた（凍結速度＝−２５℃／分、−４０℃まで、＋１５℃／分、−１２．０℃まで、−１℃／分、−４０℃まで、−１０℃／分、−１２０℃まで）。細胞は、バイアル１本当たり２ｍＬの一定分量で、液体窒素の蒸気相中に使用まで保管した。
第０日に、各試験条件について、研究テンプレートに従って、ｐＡＢＭ−ＳＣを、９６ウエル培養皿中、ＡＦＧ−１０４培地中に、１０，０００細胞／ウエルの濃度で蒔いた。プレートを、低いＯ２（４〜５％）、約５％ＣＯ２、残部は窒素を有する加湿インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートした。
翌日、ＰＢＭＣを、ＣＦＳＥ（カルボキシ−フルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）を用いて標識した。手短にいうと、ＰＢＭＣのバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地を用いて洗浄し、細胞を３００×Ｇで遠心分離し、ＤＰＢＳ中に再懸濁した。細胞濃度を加減して、１０×１０６細胞／ｍＬとし、０．６２５ｍＭの最終濃度のＣＦＳＥと共に、５分間インキュベートした。細胞を即時に４０ｍＬの氷冷ＤＰＢＳ／５％ブタ血清中で洗浄し、３００×Ｇで１０分間遠心分離した。細胞を再度２５ｍＬのＤＰＢＳ／５％ブタ血清中で洗浄し、前回と同様に遠心分離した。細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地中で洗浄した。この洗浄は、３回目でありかつ最終回でもあった。細胞濃度を加減して、５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度とした。以下の研究テンプレートに従って、標識したＰＢＭＣを、アッセイプレートに添加した。ＡＦＧ−１０４培地を吸引し、１００マイクロＬのＲＰＭＩ完全培地で交換した。１００マイクロＬのＲＰＭＩ完全培地を、非刺激ウエルに添加し、ＲＰＭＩ完全培地中に２０マイクロｇ／ｍＬ ＣｏｎＡを有する１００マイクロＬの培地を、刺激ウエルに添加し、４．５％グルコース−ＲＰＭＩ完全培地を、ビヒクルの細胞に添加した。研究テンプレートに従って、９６ウエルプレート中に、１ウエル当たり５００，０００標識ＰＢＭＣを蒔いた。プレートを、３７℃、大気Ｏ２（高いＯ２）、加湿して、５％ＣＯ２、窒素なしで、５日間インキュベートした。与えられた各血液試料について、すべての条件を、３つ組みで完了した。サブセットの血液試料について、ビヒクル刺激を完了したが、培地単独と有意に異なることはなかった。同時培養５日後、フローサイトメトリーのために、細胞を９６ウエルプレートからフローチューブへ移すことによって、細胞を採集した。間接染色を、標準的なプロトコールに従って実施した。使用した一次抗体は、ビオチン統合マウス抗−ブタＣＤ３モノクローナル抗体であり；続いて、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７二次試薬に曝した。細胞を、２００マイクロＬの流し洗浄緩衝液中に再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００装置上で解析した。
結果：収集した試料について、分裂指数を、ベースライン、および治療後第３日または第３０日において計算し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、培地、ビヒクル、ｐＡＢＭ−ＳＣまたはＣｏｎＡを用いて誘発した。ＣｏｎＡを用いて刺激したＣＤ３＋細胞については、第３日または第３０日における、すべての動物からの平均分裂指数は、治療前および剖検時における、ビヒクルおよびｐＡＢＭ−ＳＣ治療動物からのＣＤ３＋細胞の分裂指数よりも有意により高かった（＊ｐ＜０．０５）。図１７を参照されたい。
（実施例１１）
臨床開発
最初の急性心筋梗塞から３０〜６０日後の成人コホートに、心内膜心筋注射により投与した、単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの安全性を評価するために、第１相、非盲検、用量増加研究が行われた。この研究の第１の目的は、ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的心臓マッピングシステム（ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によって案内されるＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを使用して、複数の心内膜心筋注射によって送達された単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの安全性および実現可能性を調査することであった。第２の目的は、左心室容積、寸法、心筋梗塞のサイズおよび電圧によって測定される、単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの予備的な有効性を調査することであった。
研究プロトコールにより、試験対象を、安全性について頻繁にモニターして１２カ月間追跡する。有効性の査定は、第９０日および第６月の追跡調査来院時に実施される。意図する研究集団は、先行する３０日以内に急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を発症し、経皮的血管再生による治療が成功し、ＴＩＭＩ ＩＩまたはより高い血流を回復し、心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定した場合、３０％以上の左室駆出分画を示す、３０〜７５歳齢の同意した成人である。
選択および除外基準：この研究の選択基準は、（１）３０〜７５歳齢であること（すべて）；（２）（心筋灌流イメージング［ＳＰＥＣＴ］によって確認されたＭＩと一致するＥＣＧ変化に加えて、正常レベルと比較して、心特異的トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）酵素濃度の倍加を引き起こした、最も最近のＭＩとして定義される）ＡＭＩから３０〜６０日が経過していること；（３）経皮的血管再生が成功し、梗塞領域へのＴＩＭＩ ＩＩまたはより高い血流を回復したこと；（４）出産可能な女性の場合、妊娠検査（血清＿ｈＣＧ）が負であること（投与前２４時間以内）；（５）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定した場合、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）が、＞３０％であること；（６）ベースラインにおいて、心臓酵素試験（ＣＰＫ、ＣＰＫ ＭＢ、ｃＴｎＩ）が正常範囲内であること；（７）通院可能でなければならないことを含む。
この研究の除外基準は、（１）登録６カ月以内の、経皮的または外科的な血管再生を必要とする場合がある顕著な冠状動脈の狭窄；（２）左心室（ＬＶ）の血栓（移動性または壁在性）；（３）高いグレードの房室ブロック（ＡＶＢ）；（４）ＡＭＩ後＞４８時間の、頻繁な、再発性、持続性（＞３０秒）または非持続性の心室頻脈；（５）心臓内のマッピングおよび注射の手順の間に対象の安全を妨げる恐れがある臨床的に顕著な心電図上の異常；（６）制御されてない心拍数を伴う心房細動；（７）重度の心臓弁疾患（例えば、大動脈狭窄、僧帽弁狭窄、弁の交換を必要とする重度の心臓弁機能不全）；（８）心臓弁交換の病歴；（９）突発性心筋症；（１０）重度の末梢血管疾患；（１１）正常上限（ＵＬＮ）の＞３倍の肝臓酵素（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＡＳＴ］／アラニンアミノトランスフェラーゼ［ＡＬＴ］）；（１２）＞２．０ｍｇ／ｄＬの血清クレアチニン；（１３）先行する３年以内の活性な癌の病歴（基底細胞癌を除く）；（１４）過去の骨髄移植；（１５）既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染；（１６）胸部Ｘ線（ＣＸＲ）または血液培養による、同時感染または敗血症の証拠；（１７）登録前３０日以内の実験的臨床治験への参加；（１８）登録前６カ月以内のアルコールまたは娯楽的薬物の乱用；（１９）登録前１４日以内の大規模な外科手術または大外傷；（２０）既知の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス［ＳＬＥ］、多発性硬化症）；（２１）プロトロンビン（ＰＴ）または部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）の、検査正常値と比較した、臨床的に顕著な上昇；（２２）血小板減少（＜５０，０００／ｍｍ３の血小板数）；（２３）先行する３カ月以内の、抗糖尿病薬治療計画の変更、またはＨｂＡｌｃ＞７．０％として定義される、不適切に制御されているＩ型またはＩＩ型糖尿病；（２４）収縮期血圧（ＳＢＰ）＞１８０ｍｍＨｇおよび／または拡張期血圧（ＤＢＰ）＞１００ｍｍＨｇとして定義される、制御されていない高血圧；（２５）ＡＭＩ＞２４時間後の向イオン性薬物の使用；（２６）治験責任者の意見によると、対象を過度の危険に曝すまたは研究の目的を妨げる恐れがある、血行動態不安定、不安定な不整脈および挿管等のその他の併存する状態；（２７）治験責任者の意見によると、対象の、プロトコールに従う能力を妨げる、対象の安全を損なうまたは研究結果の解釈を妨げる恐れがある何らかのその他の主要な病気；ならびに（２８）適切なＣＴスキャン評価のための造影剤注射に対する禁忌症（アレルギーまたは損なわれた腎機能のいずれか）を含む。
研究薬物の投与量および投与：同一コホートの対象には、３日より短い間隔では投与せず、以前のコホートのすべての対象について、少なくとも３週間の安全性データを精査してから、次のコホートの投与までに、約４週間の間隔をあける。
コホート 用量
コホート１ ３０×ｌ０６細胞
コホート２ １００×ｌ０６細胞
コホート３ ３００×１０６細胞
コホート４ ３００×１０６細胞またはＭＴＤ
投与当日には、ベースライン評価の完了後およびＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的マッピングシステム（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｂａｒ、ＣＡ）を用いた経皮的心室マッピングの直後に、ｈＡＢＭ−ＳＣの複数、逐次の注射を、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを使用して、経皮的にＬＶから接近して心筋中に直接送達する。
研究手順：予定されているｈＡＢＭ−ＳＣ投与前２１日以内に、見込みがある対象から同意を得、スクリーニングを行う。投与は、ＡＭＩから３０〜６０日後以内に行わなければならない。また、適格性を決定するためのスクリーニング手順は、病院のＳＯＰが追加（すなわち、カテーテル処置の直前）の試験を必要としない限り、ベースラインの値としても使用する。治療の有効性についてのベースラインの試験は、６分間歩行試験、ＮＹＨＡ分類、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）濃度についての血液分析、心エコー、左右の心臓カテーテル処置、心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）、およびＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的マッピングからなる。入院当日には、追加のベースラインの血液試験（出産可能な女性対象の場合、妊娠検査［血清＿ｈＣＧ］を含む）を行い、適格性を確認する。投与の当日（研究第０日）には、対象に、ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的心臓マッピングを行い、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを左心室中に留置する。ｈＡＢＭ−ＳＣの用量を、複数、逐次の心内膜心筋注射により、（ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）によって画定された）損傷した心筋組織中に投与する。ｈＡＢＭ−ＳＣの投与後、起こり得る壁内の穿孔を検出するために心エコーを実施し、対象を集中治療室（ＩＣＵ）に直接入れて、連続心臓遠隔測定によりモニターしながら、最短２４時間観察する。合併症のない安定な対象は、ＩＣＵから、レベルのより低い病室に移し（心臓モニターを行う）、次いで、投与手順から７２時間経過すると退院帰宅させる。合併症を有する対象は、ＩＣＵに留め、安定し、レベルのより低い病室に移すのが適切になるまで、最適な医療管理下に置く。安全性評価を、ｈＡＢＭ−ＳＣの投与後第７、１４、２１、６０および９０日、ならびに第６および１２月に実施する。有効性の評価を、手順後第９０日および第６月に実施し、これには、それぞれ、コントラスト増強心エコー、心筋の再灌流および生存率の解析（ＳＰＥＣＴ）、左右の心臓カテーテル処置（第９０日のみ）、６分間歩行試験、ＮＹＨＡ分類、ならびにＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的マッピング（第９０日のみ）によって測定される、左心室の容積、寸法、心筋梗塞のサイズおよび電圧が含まれる。
この研究の安全性エンドポイントは、（１）研究プロトコール中に詳述する有害事象；（２）ＣＢＣ、ＣＭＰ、ＣＰＫ／ＣＰＫ ＭＢ、ｃＴｎｌ、ＰＴ／ＰＴＴおよびＨＬＡ抗体解析を含めた血液または血液構成成分の、ベースラインからの臨床的に顕著な変化；（３）心電図（ＥＣＧ）または心臓の遠隔測定によって査定された心臓の電気的な活動の、ベースラインからの臨床的に顕著な変化；（４）２４時間ホルター心電図によって査定された心臓の電気的な活動の、ベースラインからの臨床的に顕著な変化；（５）（手順後の）心エコー図によって査定された周術期心筋穿孔；ならびに（６）集中的な神経学的検査を含めた身体検査によって査定された肉体的および心理的な状況の、ベースラインからの臨床的に顕著な変化を含む。脳血管アクシデント（脳卒中）と一致する徴候および症状が観察される場合には、神経学的な助言を得て、さらに評価する
有効性のエンドポイント：モニターすべき有効性のエンドポイントは、（１）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、ベースラインと比較した収縮末期容量および／または拡張末期容量；（２）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、ベースラインと比較した心筋梗塞のサイズ；（３）コントラスト増強２−Ｄ心エコーによって測定される、ベースラインと比較した収縮末期寸法および／または拡張末期寸法；（４）ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡ ＸＰ（商標）電気機械的マッピングによって測定される、ベースラインおよび（主要な実験室から提供された）以前の対照と比較した、ｈＡＢＭ−ＳＣを注射した心筋領域における活動電位電圧の振幅；（５）左右の心臓カテーテル処置によって決定される、ベースラインと比較した心拍出量および圧力勾配；（６）６分間歩行試験によって査定される、ベースラインと比較した生活の質；ならびに（７）定期身体検査を実施する医師によって査定される、ベースラインと比較した、機能による心血管疾患のクラス（ＮＹＨＡ機能分類スキーム）を含む。
ｈＡＢＭ−ＳＣの心内膜心筋への送達：ｈＡＢＭ−ＳＣは、心室チャンバー内部から、カテーテルにより案内された直接的な注射によって心筋へ送達される。ｈＡＢＭ−ＳＣの心内膜心筋への送達は、ＮＯＧＡ（商標）Ｃａｒｄｉａｃ Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎ ｖｉｖｏにおける、インタクトな心筋の物理的、機械的および電気的な特性の三次元視覚化のための最も高度なシステムの１つ；Ｂｉｏｓｅｎｓｅ−Ｗｅｂｓｔｅｒ製、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｂａｒ、ＣＡ）の援助によって達成される。実際の注射は、Ｃｏｒｄｉｓ ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）／カテーテルを用いて実施する。ＮＯＧＡ（商標）システムによって、左心室の心機能のリアルタイムの観測、心臓組織の損傷の検出、カテーテルの尖端の観察および留置が可能になる。ＡＭＩ後の患者の衰弱した心臓の状態を考慮して、（心臓切開による送達または直接的な心臓内への送達と比較した場合）比較的非侵襲性の送達システム、すなわち、ＮＯＧＡ（商標）マッピングシステムと併用するＭＹＯＳＴＡＲ（商標）Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔｈｅｔｅｒを、ｈＡＢＭ−ＳＣの投与のために選択した。
予備的な結果：５人の患者から、予備的な結果が得られている。最初の３人の患者は、最初の用量群（３０×１０６細胞）に含まれ、残りの２人の患者は、第２の漸増用量（１００×１０６細胞）を投与された。全体的に、ｈＡＢＭ−ＳＣは、すべての患者において耐用性良好であり、数人の患者において認められた心機能の改善の何らかの傾向を示した。以下に、より詳細な結果を論じる。
安全性に関する知見：いずれの患者においても、（治療の前および後の抗体プロファイリングによって測定した場合）同種異系の免疫応答は見出されなかった。
心機能の査定：ＮＯＧＡ電気機械的マッピング：機能のマッピングを、治療時および細胞治療後第９０日において実施した。代表的な単極性電圧マップが、第１用量コホートの第２患者から得られた。明確な電圧の不足を、梗塞領域において認めることができた（データ示さず）。１５回の細胞注射を、梗塞の辺縁部において、単極性電圧を案内として使用して実施した。追跡第９０日に、単極性電圧の明確な改善を認めることができ、梗塞の区域中に正常に近い電圧が広がっていた。類似の程度の電圧の改善を、第１、３および４患者においても認めた（データ示さず）。
心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）：灌流イメージングを、ベースライン時、細胞治療後第９０日および第６月において、以前に公開されている方法に従って実施した。
すべての画像を、デジタルでとらえ、解析した。この解析から、２４時間の洗い出し再スキャンと併せて、基礎条件およびアデノシンストレス条件下において、駆出分画、灌流不足のサイズおよび心室容積を導いた。以下に、各時点における、各患者についての結果を論じる。
灌流不足：一般に、灌流不足のサイズは、全体的な梗塞のサイズを示すと考えられているが、これは、治療患者については、追跡の６カ月にわたり、減少する、または未変化に留まるのいずれかであった。全心室壁の４〜５％未満までに解消した不足を意味する「臨床的に顕著である」とみなされる不足の減少を、２人の患者が示した。これらの症例の両方において、改善した領域は、ＮＯＧＡマッピングによって測定された電圧の改善した領域に対応した。ＮＯＧＡマッピングは、研究段階であるとみなされているが、このデータは、単極性電圧が、梗塞サイズの測定に代わることができるという仮説の妥当性を支持している。
駆出分画（ＥＦ）：一般に、研究した患者における駆出分画は、改善するか、または比較的未変化に留まった。１人の患者は、全体的なＥＦの顕著な（６カ月の間に６３％から５０％への）減少を経験したが、この患者は、細胞治療の過程の間に、細胞の完全な用量が実際に心内膜心筋に投与されたか否かが疑われる重大な有害事象を経験した。２人の患者は、この患者群について予想された増加をはるかに上回るＥＦの増加を示した。プラセボ対照を欠くことから、この改善の機構についての何らかの結論を導くことはできない。
拡張末期容量（ＥＤＶ）：ＥＤＶを、ベースライン時ならびに治療後第９０日および第６月において測定した。一般に、ＥＤＶは、すべての患者において、６カ月の追跡期間にわたり未変化に留まった。このことから、これらの患者においては、顕著なリモデリングは生じなかったことが示唆されている。
図１８は、３人の患者における、ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いた治療９０日後に得た測定値と比較することによる、心臓の修復された灌流不足のサイズの変化を示す。図１９は、ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いた治療９０日後に得た測定値と比較することによる、３人の患者において測定した心臓の駆出分画の変化を示す。
（実施例１２）
赤血球細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成のための、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびそれに由来する組成物
骨髄の微小環境が、造血を支持および調節するために必要なマトリックス分子、増殖因子およびサイトカインの必須の組合せをもたらすことはよく知られている（Ｄｅｘｔｅｒら、１９８１年）。造血細胞の自己複製および系列によって制限される分化を推進することが知られている、栄養因子の全部ではないにしても、大部分が、間葉系支持細胞に由来する（Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙら、１９８５年）。ＲｏｅｃｋｌｅｉｎおよびＴｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ（１９９５年）は、これらの細胞の比較的純粋な集団の内部であっても、造血を示差的に支持する亜集団を単離することができることを示した。これらの以前の刊行物に記載されている不死化クローンとは異なり、本明細書の記載に従って活用するｈＡＢＭ−ＳＣは、これらに限定されないが、ＩＬ−６（Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８９年）、ＬＩＦ（Ｃｏｒｙら、１９９１年）、ＳＤＦ−１（Ｈｏｄｏｈａｒａら、２０００年）、ＳＣＦ（Ｄａｉら、１９９１年）、アクチビン−Ａ（Ｓｈａｏら、１９９２年）、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−ＩＩ（Ｍｉｈａｒａｄａら、２００６年）を含めた、赤血球新生を誘導および維持するために重要な多くの因子を分泌する、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０／ＣＤ４９ｃ同時陽性、非造血性の支持細胞の純粋な集団である（図２０）。
造血前駆体（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血細胞（ＣＢＣ）または方向付けされた赤芽球前駆体（ＢＦＵ−Ｅ））の出発集団から赤血球細胞を生成するために、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよび／またはそのような細胞によって生成された組成物を活用して、造血前駆体の赤芽球への増殖および分化のために必要な、またはそうした増殖および分化を補うために必要な赤血球新生因子の「カクテル」を送達することによって、赤血球新生を、誘導、増強および／または維持することができる。図２０を参照されたい。
（実施例１３）
細胞由来組成物および栄養因子の生成、単離、精製および包装
二段階のダウンストリームバイオプロセスが、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣによって生成された分泌増殖因子、サイトカイン、可溶性受容体およびその他の巨大分子等の組成物を、製造、収集および精製するために開発されている。細胞によって生み出された化学量論比等で生成された、分泌細胞組成物のこのカクテルは、再生促進性の治療用細胞培養試薬として、かつ／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞および組織の再生を研究するための研究ツールとして絶大な可能性を有する。そのような組成物はまた、懸濁培地中の出発赤血球前駆細胞集団の増殖および系列に適した分化を支持するための、細胞自体の代替物としても使用することができる。
無血清馴化培地の生成
凍結保存されたヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：Ｐ２５−Ｔ２Ｓ１Ｆ１−５）を解凍し、１リットルの、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ カタログ番号：ＳＨ３０２５５．０１）を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号：１２４９１−０１５、ロット：２８４１７４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））中に再懸濁する。
細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標）ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）ｔｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ（カタログ番号：３３１２、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ））中に、１ｃｍ２当たり２０，０００〜２５，０００細胞の密度で播種する。ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）ｔｅｎ ｃｈａｍｂｅｒユニットの一方のポートに、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｉｌｌｉｎｇ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）カタログ番号：３３３３、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ））を付け、他方のポートには、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｉｌｌｉｎｇ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ３７ｍｍ、０．１μＭ ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）カタログ番号：３２８４、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ））を付ける。
培養物を、３７℃±１℃のインキュベーター中に置き、血液ガス混合物（５±０．２５％ＣＯ２、４±０．２５％Ｏ２、残部は窒素（ＧＴＳ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ））を用いて、５±０．５時間通気する。播種２４±２時間後、培地を除去し、１リットルの新鮮培地で交換し、前記の記載に従って通気する。約７２±２時間後、生物学的安全キャビネット内で、無血清馴化培地を、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）ｔｅｎ ｃｈａｍｂｅｒユニットから無菌的に取り出し、１リットルのＰＥＴＧ瓶に移す。それに続いて、無血清馴化培地を、接線フローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって処理する。
無血清馴化培地の単離および精製
接線フローろ過（ＴＦＦ）を、上記の記載に従ってＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）ｔｅｎ ｃｈａｍｂｅｒユニットから回収した無血清馴化培地のリザーバ上で実施する。１００キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン製中空繊維（カタログ番号：Ｍ１ＡＢＳ−３６０−０１Ｐ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ））を利用した。馴化した無血清のリザーバ（貯留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ））を、中空繊維の管腔を管腔の面に対して接線方向に通して再循環させる。１００ｋＤ以下の分子量を有する分子は、管腔を通過して、２リットルのＰＥＴＧ瓶中に入り；この画分は、透過物またはろ液と呼ばれる。貯留物は、容積が約５０ｍＬ未満まで減少するまで連続して再循環させる。それに続いて、貯留物は廃棄し、さらなる処理のために、透過物は保持する。得られた透過物（約１リットル）は、低分子量の分子を含有する清澄な、無血清溶液であり、細胞デブリおよび大型の巨大分子は含まない。これを、本明細書では、第１画分と呼ぶ。
それに続いて、第１画分に対して、１０キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン製中空繊維（カタログ番号：Ｍ１１Ｓ−３６０−０１Ｐ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ））を使用して、追加のＴＦＦを行う。引き続き、第１画分を貯留物として使用し、中空繊維の管腔を管腔の面に対して接線方向に通して再循環させる。≦１０ｋＤのより小型の分子（すなわち、アンモニア、乳酸等）が、管腔を通過することが可能である。貯留物の容積が１００ｍＬまで減少したら、溶液のダイアフィルトレーションを開始する。１リットルの、フェノールレッドを含まないアルファ−ＭＥＭ（ＨＹＣＬＯＮＥ、カタログ番号：ＲＲｌ１２３６．０１（ＨＹＣＬＯＮＥ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ））を、貯留物のリザーバに、透過物がポンプで汲みだされる速度と同一の速度で添加し；したがって、リザーバの容積を一定に維持する。得られた貯留物は、分子量が１０ｋＤから１００ｋＤまでの範囲の小型分子のみを含有し；これを、本明細書では、第２画分と呼ぶ。
第２画分に対して、５０キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン製中空繊維（カタログ番号：Ｍ１５Ｓ−３６０−０１Ｐ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ））を使用して、追加のＴＦＦを行うことによって、第２画分をさらに処理することができる。したがって、第２画分を、中空繊維の管腔を管腔の面に対して接線方向に通して再循環させる。≦５０ｋＤのより小型の分子が、管腔を通過する。両方の処理ストリームを、産物として保持する。得られた透過物／ろ液は、主として、１０ｋＤ〜５０ｋＤの分子で構成され（第３画分）、一方、貯留物は、５０ｋＤ〜１００ｋＤの範囲の巨大分子を含む（第４画分）。
それぞれの得られた画分を、６０ｍＬ ＰＥＴＧ瓶（カタログ番号：２０１９−００６０、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）中で凍結する。
それに続いて、そのような単離タンパク質画分に対して、さらなる無菌的ダウストリーム処理および包装を行うことができる。この場合、そのような組成物を、透析、凍結乾燥し、ＬＹＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）（ＢＩＯＬＹＰＨ（商標）製、Ｈｏｐｋｉｎｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ）等の乾燥状態の生体適合性マトリックス中に再構成することができる。
（実施例１４）
ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢＣ）の単離、凍結保存および増殖
系列が方向付けされた赤血球細胞（ＣＦＵ−Ｅまたは網状赤血球）の大規模な生成物を、幹細胞または赤芽球前駆体（例えば、臍帯血細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞およびＢＦＵ−Ｅ）の出発集団から、以下に記載する方法を利用して製造することができる。
健常な満期出産新生児から臍帯血をヘパリン処置血液収集袋中に収集する。塩化アンモニウム溶解溶液を臍帯血に添加し、次いで、この混合物を、室温、３００×ｇで１５分間遠心分離することによって、清浄な有核細胞調製物を作製する。上清を、細胞ペレットから吸引し、細胞ペレットを、５％ヒト血清アルブミンを有するＢＳＳＤ（洗浄溶液）中で洗浄する。細胞を再度、室温、３００×ｇで１５分間遠心分離し、洗浄溶液を、細胞ペレットから吸引によって除去する。ＣＤ３４＋細胞を、ＭＡＳＣ ＬＳカラム（ＭＡＣＳ（登録商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する磁気細胞分離によって、確立されたプロトコールを使用して分離する。それに続いて、ＣＤ３４＋ＣＢＣを、ＣＳＭ−５５中に、約２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、速度制御フリーザーを使用して凍結保存する。
ＢＳＳＤ（４．５％デキストロースを有する平衡塩類溶液）を、以下のように調製する。平衡塩類溶液であるＳｔｅｒｉｌｅ Ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ；Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に、４５０±０．５グラムのデキストロース（ＥＭＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ ＮＪ ＵＳＡ）を添加し、ＢＳＳを用いて１０．０リットルの最終容量とする。
ＣＳＭ−５５（凍結保存用培地５％ＤＭＳＯ、５％ＨＳＡ）を、以下のように調製する。２リットルの瓶中で、１．４リットルのＢＳＳＤを、４００ｍＬの２５％ＨＳＡ（２５％ヒト血清アルブミン溶液、ＺＬＢ Ｂｅｈｒｉｎｇ製、ＩＬ、ＵＳＡ）および２００ｍＬの５０％ＤＭＳＯ（５０％ジメチルスルホキシド、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｉｒｖｉｎｅ Ｃａ ＵＳＡ）と組み合わせる。
洗浄溶液を、４００ｍＬのＢＳＳＤと１００ｍＬの２５％ＨＡＳとを用いて調製する。
懸濁培地中でのＣＤ３４＋ＣＢＣの増殖
それに続いて、細胞を、１．０Ｕ／ｍＬ組換えヒトＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：２８７−ＴＣ）、１０個ＬＹＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）／Ｌを補ったＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）Ｈ３００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に再懸濁し、使い捨てのＨＹＣＬＯＮＥ（商標）、灌流ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ ＣＯＮＴＡＩＮＥＲ（商標）（バイオリアクター）または等価物中に、１．０×１０６／ｍＬの細胞濃度で接種する。培養物を、新鮮培地の連続的な流れを使用して、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２残部は窒素に、３週間維持する。第１４日に、Ｍｉｈａｒａｄａら、２００６年の記載に従って、培養物に、糖質コルチコイドアンタゴニストであるミフェプリストンを補って、除核を加速させる。新鮮培地の連続的な流れは、第２１日の採集まで、これらの条件下で、一定速度で維持する。
ヒトＡＢＭ−ＳＣフィーダー層上でのＣＢＣの増殖
凍結保存したヒトＡＢＭ−ＳＣを解凍し、１．０Ｕ／ｍＬ組換えヒトＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：２８７−ＴＣ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ロット選択、ガンマ線照射、ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ１６４０（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））中に再懸濁し、４０層のｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆａｃｔｏｒｙ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃で、５％ＣＯ２、４％Ｏ２および残部は３７℃の窒素下に維持する。第５日には、２分の１の容量の使用済み培地を、培養物から除去し、１．０×１０６ＣＢＣ／ｍＬと共に、２分の１の容量の新鮮培地をさらに添加することによって補充する。それに続いて、新鮮培地の不連続な流れ（オン−オフ−オン）を与えて、培地条件が、新鮮（オン）から馴化（オフ）へ、さらに再度新鮮培地（オン）に戻っての間を循環するのを可能にする。第１４日には、上記の記載に従って、培養物に、糖質コルチコイドアンタゴニストであるミフェプリストンを補って、除核を加速させる。同時培養を、第２１日の採集まで、これらの条件下で維持する。
（実施例１５）
ＡＢＭ−ＳＣは、スカベンジャー受容体およびアンタゴニストを分泌し、腫瘍壊死因子−アルファのレベルを用量依存性の様式で減少させる
背景：本発明の実施形態は、対象の有害な免疫活性（炎症または自己免疫活性等）を、治療有効量のｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣによって生成された組成物を送達することによって、治療、低減または予防するための方法および組成物を含む。本発明の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて天然に存在する分泌組成物または分泌組成物の基礎レベルの生成を利用する、ｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはそれによって生成された組成物の活用を含む。あるいはまた、本発明の実施形態は、ｅｘＡＢＭ−ＳＣを操作して、（例えば、ＴＮＦ−アルファ等の炎症促進性因子の投与によって）生成される組成物の分量および種類を調節（上方制御または下方制御）することによる、ｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはそれによって生成された組成物の活用も含む。
例えば、現在までに、ｅｘＡＢＭ−ＳＣが、サイトカインである腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）に関する少なくとも１つのスカベンジャー受容体、およびインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の少なくとも１つのアンタゴニスト、およびサイトカインであるインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の少なくとも１つの結合タンパク質（アンタゴニスト）を生成することが見出されている。したがって、本発明の実施形態は、治療上有用なタンパク質を未変性の形態で一貫して分泌する安定な細胞集団（ｅｘＡＢＭ−ＳＣ等）の使用および投与のための方法および組成物を含む。
本明細書で使用する場合、用語「安定な細胞集団」は、単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した細胞集団を意味し、この細胞集団は、生存哺乳動物生物体（マウス、ラット、ヒト、イヌ、ウシ等）中に導入した場合、新しい（１つまたは複数の）細胞型（（１つまたは複数の）神経細胞、（１つまたは複数の）心筋細胞、（１つまたは複数の）骨細胞、（１つまたは複数の）肝細胞等）に分化している細胞の検出可能な生成を生じることはなく、当該細胞集団中の細胞は、検出可能なレベルの少なくとも１つの治療上有用な組成物（可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す組成物等）を分泌し続ける、またはそうした組成物を分泌する能力もしくはそうした組成物の分泌を誘導する能力を維持し続ける。
本発明の目的では、「スカベンジャー受容体」は、（膜に結合している、または細胞外環境中に遊離しているのいずれかの）任意の可溶性のまたは分泌された受容体であって、その同族のリガンドに結合およびそれを中和することが可能である受容体を意味することを意図する。
また、上記に列挙した炎症促進性因子に加えて、本開示を考慮すると、本発明の細胞集団によって生成される組成物の濃度および種類を操作するためには、本発明の細胞集団は、現在知られているまたは今後発見もしくは同定される因子も、任意の数、種類、組合せおよび／または異なる濃度で処理することができることが理解される。例えば、本発明の細胞集団は、好ましくは、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータおよびレプチン等の因子を用いて処理することができる。しかし、好ましい因子のこの短いリストには、本発明の細胞集団を処理するために使用することができる異なる組成物の数に関して制限的である意図もなく、かつそのように解釈してもならない。また、（短い例として、核酸、脂質、炭水化物等のその他の生物学的巨大分子、ならびにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および亜酸化窒素（ＮＯ）等の小型分子および化学物質等を含めた）多くのその他の型の化合物も、本発明の細胞集団を操作するために使用することができることが理解されるように、これらの組成物がタンパク質に制限されることもない。
方法：酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（これについても以下に記載する）中で使用するために、無血清馴化培地の生成を、以下の記載に従って実施した。凍結保存されたヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：ＭＦＧ−０５−１５；約４３回の集団倍加時）を解凍し、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（カタログ番号：ＳＨ３００３４．０１．ロット番号：１３４−７９４４、（ＨＹＣＬＯＮＥ（Ｃ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ））を補ったＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号：１２４９１−０１５、ロット番号：１２１６０３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ））中に、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを有する状態と有しない場状態とで再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）培養フラスコ（培養表面が、特許されているマイクロ波プラズマ処理を用いて処理されている；米国特許第６，６１７，１５２号を参照されたい）（ｎ＝３）中、３６ｍＬの培地中に、１０，０００、２０，０００、４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（各条件につき、ｎ＝３）。４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した熱不活性化細胞を、陰性対照として使用した。一定分量を無菌チューブへ移し、それを、（効率的な熱伝達のために）水を含有する７０℃の加熱ブロック中で、約４０分間インキュベートすることによって、細胞を熱不活性化した。培養物を、３７℃の加湿した、３つのガスを有するインキュベーター（４％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部は窒素）中に、約２４時間置いた。次いで、同じ日に、培養物に、新鮮培地を再供給して、非付着性デブリを除去し、インキュベーターに戻した。第３日に、細胞培養培地を、２０ｍＬのＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って濃縮した。手短にいうと、濃縮器を、１１４０×Ｇで４５分間遠心分離した。濃縮した上清（１００×最終濃度）を、清浄な２ｍＬクライオバイアルに移し、後の使用まで、−８０℃で保管した。
これらの接着培養物中のヒトＡＢＭ−ＳＣから生成された特定の分泌タンパク質のレベルを決定するために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、第３日に、上記の記載に従って収集した、１００×濃縮の、馴化した細胞培養の上清上で実施した。アッセイの当日、使用前に、上清を解凍し、室温まで平衡化させた。ＥＬＩＳＡ解析を実施して、ＴＮＦ−α、可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ｓＴＮＦ−ＲＩ）、可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−ＩＲＡ）およびＩＬ−２受容体アルファを検出した（製造者の指示に従って実施し；すべてのキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入した）。
結果から、臨床上意味のあるレベルの分泌スカベンジャー受容体（例えば、ｓＴＮＦ−ＲＩ）および受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−ＩＲＡ）が、これらの接着培養物によって生成され、これらのレベルを、細胞の濃度または用量を加減することによって制御することができることが実証されている（図２１〜２３）。重要なことには、また、これらのデータから、細胞が、それらが置かれた炎症性の環境に応答することも実証されている。例えば、強力な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−アルファを用いて処置すると、細胞は、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ（図２２Ｂ）およびＩＬ−ＩＲＡ（図２３）の分泌を上方制御する。興味深いことに、これらの試料培養物中、ＴＮＦ−アルファのレベルは、細胞の播種密度を増加させる毎に有意に減少した（図２１）。このことから、ＴＮＦ−アルファ自体が、ＡＢＭ−ＳＣまたはＡＢＭ−ＳＣが分泌した因子のいずれかによって何らかの方法で捕捉されたことが示唆されている。
ｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの両方が、ＴＮＦ−アルファに結合し、その生物学的活性を中和することができることは十分に確立されている。測定可能なレベルのＴＮＦ受容体の両方の形態およびＴＮＦ−アルファ自体のそれぞれが、細胞播種密度が増加する毎に有意に減少していることから、このアッセイ系では、ＡＢＭ−ＳＣ由来のｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩが、ＴＮＦ−アルファに結合し、それをマスクしている可能性が高い。
熱不活性化細胞のみを含有する培養物中では、測定した可溶性受容体および受容体アンタゴニストの検出可能なレベルは認められなかった。アッセイ条件間における統計学的比較を、一元配置分散分析によって決定した。
（実施例１６）
骨形成誘導アッセイ：ヒトＡＢＭ−ＳＣ細胞は、約２５回の集団倍加を超えて増殖させた細胞集団を標準的な骨誘導条件に曝した場合または約３０回の集団倍加を超えて増殖させた細胞集団を増強した骨誘導条件に曝した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、骨分化の性質を示さない
方法：ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣを、１ウエル当たり、以降Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ（商標））と呼ぶ、ＭＳＣＧＭ（商標）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＰＴ−４１０５）を補った、２．４ｍＬのＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＢＭ（商標）；Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＰＴ−３２３８）を有する６ウエル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３５１６）中に、３１００細胞／ｃｍ２で播種した。約４時間後、ＭＳＣＧＭ（商標）を、適切な試験条件に変化させた。陰性対照のウエルは、ＭＳＣＧＭ（商標）単独または５ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＮｏｇｇｉｎ／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：７１９−ＮＧ）を補ったＭＳＣＧＭ（商標）のいずれかを再供給したウエルであった。試験ウエルは、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＯＩＭ；Ｌｏｎｚａ カタログ番号：ＰＴ−３９２４およびＰＴ−４１２０）単独（標準的な骨誘導条件）または５ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＮｏｇｇｉｎ／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒを補ったＯＩＭ（増強した骨誘導条件）のいずれかを用いて処理したウエルであった。次いで、培養物を、加湿した、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持し、新鮮培地を、３〜４日毎に２週間再供給した。１４日後、培養物を処理して、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｌｉｑｕｉｃｏｌｏｒキット（Ｓｔａｎｂｉｏ、カタログ番号：０１５０−２５０）を製造者の指示に従って使用してカルシウムを決定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダーを使用して、５５０ｎｍで、皿を読み取った。
結果：研究ロット番号：ＭＣＢ１０９由来のヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣを、標準的な骨誘導条件（ＯＩＭのみ）下または増強した骨誘導条件（ＯＩＭおよびモルフォゲンであるノギン；ＯＩＭ＋ノギン）下で培養した。陰性対照の培養物を、増殖培地単独（ＭＳＣＧＭ（商標））またはノギンを補ったＭＳＣＧＭ（商標）（ＭＳＣＧＭ（商標）＋ノギン）のいずれかの中で維持した。
約１６回の集団倍加時のＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ培地にノギンを補った場合、約６倍のカルシウム沈着の増加を示した（すなわち、約１６回の集団倍加時のＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ条件下では、約５マイクログラムのカルシウム／ウエルを沈着し、ＯＩＭ＋ノギンの条件下では、約３０マイクログラム／ウエルを沈着した）。ＡＢＭ−ＳＣは、標準的なＯＩＭ条件下では、約１６回の集団倍加を超えると、検出可能なレベルのカルシウムを沈着する能力を喪失したが、これは、ノギンを補うことによって逆転させることができた（すなわち、約２５集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ条件下では、検出可能なカルシウムを沈着しなかったが、一方、これらの同じ細胞は、ＯＩＭ＋ノギンの条件下では、約５マイクログラムのカルシウム／ウエルを沈着した）。対照的に、約３０回の集団倍加を超えると（例えば、約３５および４３回の集団倍加時）、ｅｘＡＢＭ−ＳＣは、試験した条件（標準的なＯＩＭまたは増強したＯＩＭ）のいずれの下でも、検出可能なレベルのカルシウムを沈着しなかった。
（実施例１７）
ＡＢＭ−ＳＣによる、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）およびＩＬ−１８ 結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の発現
方法：約４３回の細胞集団倍加を経たヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：Ｐ１７−Ｔ２Ｓ１Ｆ１−５）を解凍し、ブレフェルジンＡを３マイクログラム／ｍＬ（１×）で補ったＡＦＧ増殖培地中に、播種し、加湿した、５％ＣＯ２インキュベーター中に、３７℃で２４時間置いた。次いで、培養細胞を、培養フラスコから、ブタトリプシンを使用して除去し、洗浄し、フローサイトメトリーのために、ＣＡＬＴＡＧ ＦＩＸ ＆ ＰＥＲＭ（登録商標）染色プロトコール（ＣＡＬＴＡＧ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ；これは、現在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の一部である）に従って調製した。細胞を、ＦＩＴＣ統合マウス抗−ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１１−７０１５、クローンＣＲＭ１７）抗体、そのまま、または無標識ウサギ抗−ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、カタログ番号：１８９３−１、クローンＥＰ１０８８Ｙ）、１：１０に希釈、のいずれかを用いて、いずれの場合も、室温で４５分間染色した。次いで、ＦＩＴＣ−ウサギＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−ウサギ抗体を使用して、ＩＬ−１８ＢＰを検出した。アイソタイプ対応の対照を、陰性対照として含めた（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
結果：ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−アルファ等の炎症性シグナルの非存在下であっても、基礎レベルのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；図２４Ａ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；図２４Ｂ）を発現させる。
（実施例１８）
ヒトＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１３の発現を減少させ、かつ同時に、ＩＬ−２の発現を増加させる
方法：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１）マイトマイシンＣ処理した、同一ドナー（レスポンダー＋自己）からのＰＢＭＣ、または２）マイトマイシンＣ処理した、異なるドナー（レスポンダー＋刺激者）由来のＰＢＭＣのいずれかを有する２４ウエルプレート中、５％ヒト血清アルブミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、０．０５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００マイクロｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で同時培養した。各起源からのＰＢＭＣをそれぞれ、４×１０５細胞／ウエルで播種した。各条件について、培養物に、ヒトＡＢＭ−ＳＣを４０，０００細胞／ウエルの播種密度で補う場合と、補わない場合とを設けた。培養物を、加湿した、５％ＣＯ２インキュベーター中に、３７℃で７日間維持して、培地を馴化した。馴化した細胞培養物の上清を収集し、種々のサイトカインの存在について、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ（商標）９−Ｐｌｅｘアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して解析した。統計学的解析を、一元配置分散分析（分散の解析）によって実施した。
結果：混合性ＰＢＭＣ反応について予想されるように、同種異系のＰＢＭＣ（レスポンダー＋刺激者）の同時培養の結果、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１３のレベルの著しい増加が生じた。しかし、ヒトＡＢＭ−ＳＣを用いて誘発した場合、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−アルファの両方が有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、このことから、ＡＢＭ−ＳＣを治療に活用して、慢性炎症障害または移植片拒絶を、炎症性媒介物質の局限的なまたは血清のレベルを低下させることによって治療できるであろうことが示唆されている。図２５Ａ、ＢおよびＣを参照されたい。
ＡＢＭ−ＳＣが、自己性の（レスポンダー＋自己）および同種異系の（レスポンダー＋刺激者）の両方の混合性ＰＢＭＣ培養物において、ＩＬ−２の発現上昇を誘導し（Ｐ＜０．００１）、かつ同時にＰＢＭＣの増殖を抑制する点は、注目に値する。この結果は、Ｔ細胞増殖の促進におけるＩＬ−２の重要性を考慮すると、幾分か矛盾するように思えるが、最近になって、マウスにおいて、ＩＬ−２経路の混乱の結果、免疫不全ではなく、リンパ系の過形成および自己免疫が生じることが示されており、このことから、ＩＬ−２の主要な生理学的役割が、Ｔ細胞応答を、増強するのではなく、制限または調整するものであり得ることが示唆されている（Ｎｅｌｓｏｎ、「ＩＬ−２， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」、Ｊｏｕｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２巻：３９８３〜３９８８頁（２００４年））。さらに、ＩＬ−２はまた、現在、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、Ｔ細胞応答を抑制することによる自己寛容の促進に関して決定的に重大な意味をもち、これが生じる機構は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の増殖および成熟を通してであることも知られている。したがって、ＡＢＭ−ＳＣを治療に利用して、Ｔ調節性細胞の成熟を、ＩＬ−２の上方制御の誘導を通して間接的に支持することによって、Ｔ細胞寛容を誘導することができるであろうことが企図される。
（実施例１９）
ヒトＡＢＭ−ＳＣは、マイトジェン誘導末梢血単核細胞の増殖を阻害する
方法：ヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、５％ＣＯ２下の加湿インキュベーター中で９６時間培養し、次いで、９６ウエル丸底プレート上に、ＲＰＭＩ完全培地（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中に、２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で継代した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、独立に、ＲＰＭＩ完全培地中、２５０，０００細胞／ｍＬで、またはＡＢＭ−ＳＣのロットＲＥＣＢ８０１（約１９回の集団倍加まで継代培養）もしくはＲＥＣＢ９０６（約４３回の集団倍加まで継代培養）と共にいずれかで培養した。ＰＢＭＣの増殖を刺激するために、培養物に、２．５マイクロｇ／ｍＬフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を接種した。培養５６時間後、細胞を、チミジン−［メチル−３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎｇ Ｅｌｍｅｒ、１マイクロＣｉ／ウエル）でパルスした。細胞を、第７２時に、Ｆｉｌｔｅｒｍａｓｔｅｒハーベスターを使用して、ガラスフィルター上に採集した。フィルターを、Ｏｍｎｉｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅｒ中で、ＮＸＴ ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンターを使用して読み取った。ヒト間葉系幹細胞を、陽性対照として含めた（ヒト間葉系幹細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手した；これは、現在、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄが所有する）。統計学的解析を、一元配置分散分析（分散の解析）によって実施した。
結果：ＰＢＭＣの誘導増殖は、ＡＢＭ−ＳＣのいずれのロットを用いてチャンレンジした場合も、有意に減少した（Ｐ＜０．００１）。図２６を参照されたい。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、陽性対照として含めた。これらのデータから、ＡＢＭ−ＳＣは、全ＰＢＭＣ集団のマイトジェン誘導増殖を阻害するのみならず、このアッセイ系中のＡＢＭ−ＳＣの存在は、調製物中の種々の細胞亜集団（例えば、単核球、顆粒球、リンパ球）の増殖も誘導しないことが示唆されている。
参考文献

Claims (94)

  1. １つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を器官、組織または対象に投与する方法であって、前記器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  2. １つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を器官、組織または対象に投与する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される前記１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  3. １つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を器官、組織または対象に投与する方法であって、前記器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  4. １つまたは複数の生物学的組成物の治療上有用な量を器官、組織または対象に投与する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される前記１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することとを含むステップによって骨髄から得られる方法。
  5. 組織の損傷を予防し、または損傷組織を修復、治療もしくはその再生を促進する方法であって、器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  6. 器官、組織または対象における組織の損傷を予防し、または損傷組織を修復、治療もしくはその再生を促進する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  7. 器官、組織または対象における組織の損傷を予防し、または損傷組織を修復、治療もしくはその再生を促進する方法であって、前記器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  8. 器官、組織または対象における組織の損傷を予防し、または損傷組織を修復、治療もしくはその再生を促進する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  9. 器官、組織または対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、前記器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  10. 器官、組織または対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  11. 器官、組織または対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、前記器官、組織または対象に骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を投与することを含み、前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  12. 器官、組織または対象の炎症、免疫または自己免疫活性を治療または低減する方法であって、
    （ａ）骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物を単離することと、
    （ｂ）前記器官、組織または対象に前記１つまたは複数の生物学的組成物を投与することとを含み、
    前記ＣＦ−ＳＣが多能的分化能を有さず、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することとを含むステップによって骨髄から得られる方法。
  13. 前記ＣＦ−ＳＣが、
    ａ）ＣＤ２９、
    ｂ）ＣＤ５９、
    ｃ）ＣＤ１４７、
    ｄ）ＣＤ１６６、および
    ｅ）テロメラーゼ
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現し、
    前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｆ）ＣＤ１１ｃ、
    ｇ）ＣＤ１４、
    ｈ）ＣＤ３３、
    ｉ）ＣＤ６２Ｐ、
    ｊ）ＣＤ８０、
    ｋ）ＳＴＲＯ−１、
    ｌ）ＨＬＡクラスＩＩ、
    ｍ）ＣＤ１７８、
    ｎ）ｐ５３、および
    ｏ）ｐ２１
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現しない、請求項１、２、５、６、９または１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記低酸素条件が約５％酸素である、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記低酸素条件が、
    ａ）約２０％未満の酸素、
    ｂ）約１５％未満の酸素、
    ｃ）約１０％未満の酸素、
    ｄ）約５％未満の酸素、
    ｅ）約１〜１０％の酸素、
    ｆ）約２〜７％の酸素、
    ｇ）約３〜６％の酸素、
    ｈ）約４〜６％の酸素、および
    ｉ）約４〜５％の酸素
    からなる群から選択される、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記低い細胞播種密度が約２００細胞／ｃｍ２未満である、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記低い細胞播種密度が約１００細胞／ｃｍ２未満である、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記低い細胞播種密度が約５０細胞／ｃｍ２未満である、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記低い細胞播種密度が約３０細胞／ｃｍ２未満である、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記低い細胞播種密度が、
    ａ）約２５００細胞／ｃｍ２未満、
    ｂ）約１０００細胞／ｃｍ２未満、および
    ｃ）約５００細胞／ｃｍ２未満
    からなる群から選択される、請求項３、４、７、８、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記多能的分化能の欠如が、前記ＣＦ−ＳＣが骨細胞に分化できないことを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記多能的分化能の欠如が、骨誘導条件下での前記ＣＦ−ＳＣの治療の後に、前記ＣＦ−ＳＣが検出可能なレベルのカルシウムを沈着できないことを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記治療が、
    ａ）デキサメタゾン、
    ｂ）アスコルビン酸、および
    ｃ）βグリセロリン酸
    からなる群から選択される１つまたは複数の成分を含有する培地への前記ＣＦ−ＳＣの曝露を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記治療がノギンへの曝露をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記多能的分化能の欠如が、前記ＣＦ−ＳＣが軟骨細胞に分化できないことを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記多能的分化能の欠如が、前記ＣＦ−ＳＣが脂肪細胞に分化できないことを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＣＦ−ＳＣが単分化能を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＣＦ−ＳＣが実質的な自己複製能を有する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ＣＦ−ＳＣが複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞倍加を通してほぼ一定の集団倍加速度を維持する、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記ＣＦ−ＳＣが、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉性幹細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）または線維芽細胞でない、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記骨髄がヒト骨髄である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞集団が、
    ａ）少なくとも約１５回の集団倍加、
    ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加、
    ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加、
    ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加、
    ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加、
    ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加、
    ｇ）少なくとも約４５回の集団倍加、および
    ｈ）少なくとも約５０回の集団倍加
    からなる群から選択される集団倍加回数を経ている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記器官、組織または対象がヒトである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ａ）神経の損傷、疾患または障害、
    ｂ）心臓の損傷、疾患または障害、
    ｃ）皮膚の損傷、疾患または障害、
    ｄ）歯周部の損傷、疾患または障害、
    ｅ）顎顔面の損傷、疾患または障害、
    ｆ）骨格筋の損傷、疾患または障害、
    ｇ）靭帯の損傷、疾患または障害、
    ｈ）肺の損傷、疾患または障害、
    ｉ）肝臓の損傷、疾患または障害、
    ｊ）腎臓の損傷、疾患または障害、
    ｋ）尿生殖器系の損傷、疾患または障害、
    ｌ）膀胱の損傷、疾患または障害、
    ｍ）内分泌の損傷、疾患または障害、
    ｎ）造血系の損傷、疾患または障害、
    ｏ）膵臓の損傷、疾患または障害、
    ｐ）糖尿病、
    ｑ）眼の損傷、疾患または障害、
    ｒ）網膜の損傷、疾患または障害、
    ｓ）胃腸の疾患または障害、
    ｔ）脾臓の損傷、疾患または障害、
    ｕ）免疫系の損傷、疾患または障害、
    ｖ）自己免疫性の損傷、疾患または障害、
    ｗ）炎症性の損傷、疾患または障害、
    ｘ）過剰増殖性の損傷、疾患または障害、および
    ｙ）癌
    からなる群から選択される、細胞、器官または組織の損傷、または疾患および障害を治療または予防するために用いられる、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記損傷が器官または組織の移植の経過の間に器官または組織で予防される、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記細胞が遺伝子操作される、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記細胞が組換え核酸分子の導入によって遺伝子操作される、請求項３６に記載の方法。
  38. 精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）との薬学的に許容される混合物を含む組成物であって、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１０６を発現しない組成物。
  39. 精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物との薬学的に許容される混合物を含む組成物であって、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない組成物。
  40. 精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）との薬学的に許容される混合物を含む組成物であって、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる組成物。
  41. 精製された天然に存在するかまたは単離された組換え細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物との薬学的に許容される混合物を含む組成物であって、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる組成物。
  42. 前記細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質が、
    ａ）コラーゲン、
    ｂ）エラスチン、
    ｃ）フィブロネクチン、
    ｄ）ラミニン、
    ｅ）エンタクチン（ニドゲン）、
    ｆ）ヒアルロン酸、
    ｇ）ポリグリコール酸（ＰＧＡ）
    ｈ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、
    ｉ）フィブリン、
    ｊ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、
    ｋ）トロンビン、
    ｌ）アンチトロンビン、
    ｍ）組織因子ＶＩＩａの補因子（第ＩＩＩ因子）、
    ｎ）プロテインＣ、
    ｏ）プロテインＳ、
    ｐ）プロテインＺ、
    ｑ）プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害因子、
    ｒ）ヘパリン補因子ＩＩ、
    ｓ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、
    ｔ）第ＶＩＩ因子、
    ｕ）第ＶＩＩＩ因子、
    ｖ）第ＩＸ因子、
    ｗ）第Ｘ因子、
    ｘ）第ＸＩ因子、
    ｙ）第ＸＩＩ因子、
    ｚ）第ＸＩＩＩ因子、
    ａａ）フォンウィルブラント因子、
    ａｂ）プレカリクレイン、
    ａｃ）高分子キニノーゲン、
    ａｄ）プラスミノーゲン、
    ａｅ）プラスミン、
    ａｆ）組織プラスミノーゲン活性化因子、
    ａｇ）ウロキナーゼ、
    ａｈ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、および
    ａｉ）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−２
    からなる群から選択される分子の１つまたは複数の完全長、または選択的プロセシングされたアイソフォーム、タンパク分解断片もしくはサブユニットを含む、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 精製された天然に存在するかまたは単離された組換えサイトカインまたはケモカインをさらに含む、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ＣＦ−ＳＣが、
    ａ）ＣＤ２９、
    ｂ）ＣＤ５９、
    ｃ）ＣＤ１４７、
    ｄ）ＣＤ１６６、および
    ｅ）テロメラーゼ
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現し、
    前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｆ）ＣＤ１１ｃ、
    ｇ）ＣＤ１４、
    ｈ）ＣＤ３３、
    ｉ）ＣＤ６２Ｐ、
    ｊ）ＣＤ８０、
    ｋ）ＳＴＲＯ−１、
    ｌ）ＨＬＡクラスＩＩ、
    ｍ）ＣＤ１７８、
    ｎ）ｐ５３、および
    ｏ）ｐ２１
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現しない、請求項３８または３９に記載の組成物。
  45. 前記低酸素条件が約５％の酸素である、請求項４０または４１に記載の組成物。
  46. 前記低酸素条件が、
    ａ）約２０％未満の酸素、
    ｂ）約１５％未満の酸素、
    ｃ）約１０％未満の酸素、
    ｄ）約５％未満の酸素、
    ｅ）約１〜１０％の酸素、
    ｆ）約２〜７％の酸素、
    ｇ）約３〜６％の酸素、
    ｈ）約４〜６％の酸素、および
    ｉ）約４〜５％の酸素
    からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の組成物。
  47. 前記低い細胞播種密度が約２００細胞／ｃｍ２未満である、請求項４０または４１に記載の組成物。
  48. 前記低い細胞播種密度が約１００細胞／ｃｍ２未満である、請求項４０または４１に記載の組成物。
  49. 前記低い細胞播種密度が約５０細胞／ｃｍ２未満である、請求項４０または４１に記載の組成物。
  50. 前記低い細胞播種密度が約３０細胞／ｃｍ２未満である、請求項４０または４１に記載の組成物。
  51. 前記低い細胞播種密度が、
    ａ）約２５００細胞／ｃｍ２未満、
    ｂ）約１０００細胞／ｃｍ２未満、および
    ｃ）約５００細胞／ｃｍ２未満
    からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の組成物。
  52. 前記ＣＦ−ＳＣが単分化能を有する、請求項３８から５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記ＣＦ−ＳＣが実質的な自己複製能を有する、請求項３８から５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記ＣＦ−ＳＣが複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞倍加を通してほぼ一定の集団倍加速度を維持する、請求項３８から５３のいずれかに記載の組成物。
  55. 前記ＣＦ−ＳＣが、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉性幹細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）または線維芽細胞でない、請求項３８から５４のいずれか一項に記載の組成物。
  56. 前記骨髄がヒト骨髄である、請求項３８から５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記細胞集団が、
    ａ）少なくとも約１５回の集団倍加、
    ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加、
    ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加、
    ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加、
    ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加、
    ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加、
    ｇ）少なくとも約４５回の集団倍加、および
    ｈ）少なくとも約５０回の集団倍加
    からなる群から選択される集団倍加回数を経ている、請求項３８から５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記器官、組織または対象がヒトである、請求項３８から５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記方法が、
    ａ）神経の損傷、疾患または障害、
    ｂ）心臓の損傷、疾患または障害、
    ｃ）皮膚の損傷、疾患または障害、
    ｄ）歯周部の損傷、疾患または障害、
    ｅ）顎顔面の損傷、疾患または障害、
    ｄ）骨格筋の損傷、疾患または障害、
    ｘ）靭帯の損傷、疾患または障害、
    ｅ）呼吸器の損傷、疾患または障害、
    ｆ）肝臓の損傷、疾患または障害、
    ｇ）腎臓の損傷、疾患または障害、
    ｈ）尿生殖器系の損傷、疾患または障害、
    ｉ）膀胱の損傷、疾患または障害、
    ｊ）内分泌系の損傷、疾患または障害、
    ｋ）造血系の損傷、疾患または障害、
    ｌ）膵臓の損傷、疾患または障害、
    ｍ）糖尿病、
    ｎ）眼の損傷、疾患または障害、
    ｏ）網膜の損傷、疾患または障害、
    ｐ）胃腸の疾患または障害、
    ｑ）脾臓の損傷、疾患または障害、
    ｒ）免疫系の損傷、疾患または障害、
    ｓ）自己免疫性の損傷、疾患または障害、
    ｔ）炎症性の損傷、疾患または障害、
    ｕ）過剰増殖性の損傷、疾患または障害、および
    ｖ）癌
    からなる群から選択される、細胞、器官または組織の損傷、疾患および障害を治療するために用いられる、請求項３８から５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記細胞が遺伝子操作されている、請求項３８から５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記細胞が組換え核酸分子の導入によって遺伝子操作される、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記薬学的に許容される混合物が半固体または固体のマトリックスを形成する、請求項３８から６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 請求項３８から６２のいずれか一項に記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物が液体である方法。
  64. 前記液体が注射によって適用される、請求項６３に記載の方法。
  65. 請求項３８から６４のいずれか一項に記載の組成物で損傷組織を治療する方法であって、前記組成物は液体として適用されるが、その後、半固体または固体のマトリックスを形成する方法。
  66. 前記ＣＦ−ＳＣまたは前記ＣＦ−ＳＣによって産生される１つまたは複数の生物学的組成物が、
    ａ）損傷を受けた器官または組織への注射、
    ｂ）損傷を受けた器官または組織への塗布、
    ｃ）損傷を受けた器官または組織の近位への注射、
    ｄ）損傷を受けた器官または組織の近位への塗布、
    ｅ）静脈内投与、および
    ｆ）器官または組織の灌流
    からなる群から選択される手段によって投与される、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  67. 前記ＣＦ−ＳＣまたは前記ＣＦ−ＳＣによって産生される１つまたは複数の生物学的組成物が、
    ａ）有害免疫応答、
    ｂ）線維化、
    ｃ）有害な組織リモデリング、
    ｄ）器官または組織の虚血、および
    ｅ）細胞死
    からなる群から選択される１つまたは複数の生物学的作用を阻害または低減する、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  68. 前記有害免疫応答が、
    自己免疫応答、
    炎症、
    免疫細胞増殖、
    免疫細胞活性化、
    免疫細胞脱顆粒、および
    Ｔ細胞媒介免疫応答
    からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法または組成物。
  69. 前記ＣＦ−ＳＣまたは前記ＣＦ−ＳＣによって産生される１つまたは複数の生物学的組成物が、血管新生を刺激または増強する、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  70. 新しい赤血球の生成をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで誘導、増強および／または維持する方法であって、前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）との共培養によって達成され、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  71. 新しい赤血球の生成をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで誘導、増強および／または維持する方法であって、前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物との共培養によって達成され、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣがＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない方法。
  72. 前記ＣＦ−ＳＣが、
    ａ）ＣＤ２９、
    ｂ）ＣＤ５９、
    ｃ）ＣＤ１４７、
    ｄ）ＣＤ１６６、および
    ｅ）テロメラーゼ
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現し、
    前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｆ）ＣＤ１１ｃ、
    ｇ）ＣＤ１４、
    ｈ）ＣＤ３３、
    ｉ）ＣＤ６２Ｐ、
    ｊ）ＣＤ８０、
    ｋ）ＳＴＲＯ−１、
    ｌ）ＨＬＡクラスＩＩ、
    ｍ）ＣＤ１７８、
    ｎ）ｐ５３、および
    ｏ）ｐ２１
    からなる群から選択される１つまたは複数の分子をさらに発現しない、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. 新しい赤血球の生成をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで誘導、増強および／または維持する方法であって、前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）との共培養によって達成され、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  74. 新しい赤血球の生成をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで誘導、増強および／または維持する方法であって、前記誘導、増強または維持が、造血前駆細胞と、骨髄由来の自己複製性コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団によって産生される１つまたは複数の生物学的組成物との共培養によって達成され、前記ＣＦ−ＳＣが正常な核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、
    ｉ）組織培養処理表面に付着させると骨髄細胞が接着性コロニー形成単位を生成するように、前記骨髄細胞を低酸素条件下でインキュベートすることと、
    ｉｉ）前記接着性コロニー形成単位の細胞を低い細胞播種密度で継代培養することと
    を含むステップによって骨髄から得られる方法。
  75. 前記低酸素条件が約５％酸素である、請求項７３または７４に記載の方法。
  76. 前記低酸素条件が、
    ａ）約２０％未満の酸素、
    ｂ）約１５％未満の酸素、
    ｃ）約１０％未満の酸素、
    ｄ）約５％未満の酸素、
    ｅ）約１〜１０％の酸素、
    ｆ）約２〜７％の酸素、
    ｇ）約３〜６％の酸素、
    ｈ）約４〜６％の酸素、および
    ｉ）約４〜５％の酸素
    からなる群から選択される、請求項７３または７４に記載の方法。
  77. 前記低い細胞播種密度が約２００細胞／ｃｍ２未満である、請求項７３または７４に記載の方法。
  78. 前記低い細胞播種密度が約１００細胞／ｃｍ２未満である、請求項７３または７４に記載の方法。
  79. 前記低い細胞播種密度が約５０細胞／ｃｍ２未満である、請求項７３または７４に記載の方法。
  80. 前記低い細胞播種密度が約３０細胞／ｃｍ２未満である、請求項７３または７４に記載の方法。
  81. 前記低い細胞播種密度が、
    ａ）約２５００細胞／ｃｍ２未満、
    ｂ）約１０００細胞／ｃｍ２未満、および
    ｃ）約５００細胞／ｃｍ２未満
    からなる群から選択される、請求項７３または７４に記載の方法。
  82. 前記ＣＦ−ＳＣが単分化能を有する、請求項７０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＣＦ−ＳＣが実質的な自己複製能を有する、請求項７０から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＣＦ−ＳＣが複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞倍加を通してほぼ一定の集団倍加速度を維持する、請求項７０から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＣＦ−ＳＣが、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉性幹細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）または線維芽細胞でない、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記骨髄がヒト骨髄である、請求項７０から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記細胞集団が、
    ａ）少なくとも約１５回の集団倍加、
    ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加、
    ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加、
    ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加、
    ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加、
    ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加、
    ｇ）少なくとも約４５回の集団倍加、および
    ｈ）少なくとも約５０回の集団倍加
    からなる群から選択される集団倍加回数を経ている、請求項７０から８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記細胞集団がヒトである、請求項７０から８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 炎症、免疫または自己免疫活性の前記治療または低減が、
    ａ）ＩＬ−１３の局所または全身レベルの低下、
    ｂ）ＴＮＦ−αの局所または全身レベルの低下、
    ｃ）ＩＬ−２の局所または全身レベルの増加、
    ｄ）局所または全身の免疫細胞増殖の減少、
    ｅ）局所または全身の免疫細胞活性化の減少、および
    ｆ）局所または全身の免疫細胞脱顆粒の減少
    からなる群から選択される１つまたは複数の変化をもたらす、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記免疫細胞増殖の減少が、
    ａ）単球、
    ｂ）顆粒球、
    ｃ）リンパ球、および
    ｄ）好中球
    からなる群から選択される１つまたは複数の細胞型の増殖の阻害を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ＩＬ−２の局所または全身レベルの増加がＴ細胞調節細胞の成熟を補助する、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記１つまたは複数の生物学的組成物が凍結乾燥される、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  93. 前記１つまたは複数の生物学的組成物が低温保存される、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  94. 前記１つまたは複数の生物学的組成物が、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合される、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
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