DE69637185T2

DE69637185T2 - Isolierte Stromazellen und Methoden zu deren Verwendung

Info

Publication number: DE69637185T2
Application number: DE69637185T
Authority: DE
Inventors: Darwin J Philadelphia Prockop; Ruth F Lansdowne Pereira; Dennis B Wynnewood Leeper; Michael D Wyncote O'Hara; Joseph Philadelphia Kulkosky; Donald Maple Glen Phinney; Alexander Laptev; Jose Gladwyn Caro
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2016-03-29
Also published as: DE69637185D1; DE69628452D1; JPH11509171A; EP1304112A1; ATE329603T1; ATE241369T1; DK0871457T3; ES2266715T3; EP0871457A4; HK1055255A1; EP0871457B1; HK1055390A1; EP1304113A1; EP1304113B1; DE69636260D1; WO1996030031A1; ES2200061T3; EP0871457A1; EP1304112B1; DE69628452T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von isolierten Stromazellen, die aus einer Knochenmarksprobe, welche von einem normalen, abgestimmten, syngenetischen Spender erhalten wurde, isoliert wurden, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit, einer Störung oder einem Zustand, gekennzeichnet durch einen Knochen- oder Knorpeldefekt, leidet, wobei der Spender syngenetisch mit dem Patienten ist und wobei das Medikament für die Verabreichung an den Patienten durch intravenöse Infusion bestimmt ist und die Verwendung von isolierten Stromazellen, die aus einer Knochenmarksprobe von einem Patienten isoliert wurden und die unter Bedingungen, welche in einer Replikation der Stromazellen in eine expandierte Kultur von Stromazellen resultieren, kultiviert worden sind, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, welcher an einer Krankheit, einer Störung oder einem Zustand leidet, der/die durch ein mutiertes, nicht funktionierendes oder unterexprimiertes Gen gekennzeichnet ist, welches in einem Defekt in dem Knochen oder dem Knorpel des Patienten resultiert, wobei das Medikament für die Verabreichung an den Patienten durch intravenöse Infusion bestimmt ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zusätzlich zu hämatopoetischen Stammzellen enthält Knochenmark "Stromazellen", die mesenchymale Vorläuferzellen sind (Friedenstein, A.J. et al., Exp. Hemat. 4: 267–274 (1976)), die durch ihre Anhaftungseigenschaften gekennzeichnet sind, wenn Knochenmarkszellen entfernt und auf Kunststoffschalen gesetzt werden. Innerhalb von etwa vier Stunden heften sich Stromazellen an das Kunststoff an und können so durch Entfernen der nicht-haftenden Zellen von den Schalen isoliert werden. Diese Knochenmarkszellen, die stark am Kunststoff haften, sind intensiv untersucht worden (Castro-Malaspina, H. et al., Blood 56: 289–301 (1980); Piersma, A.H. et al., Exp. Hematol. 13: 237–243 (1985); Simmons, P.J. und Torok-Storb, B., Blood 78: 55–62 (1991); Beresford, J.N. et al., J. Cell. Sci. 102: 341–351 (1992); Liesveld, J.L. et al., Blood 73: 1794–1800 (1989); Liesveld, J.L. et al., Exp. Hematol. 19: 63–70 (1990); und Bennett, J.H. et al., J. Call. Sci. 99: 131–139 (1991)). Der Ausdruck "haftende Zellen", wie hier verwendet, soll Stromazellen and der Ausdruck "nicht-haftende Zellen" soll hämatopoetische Vorläuferzellen bezeichnen.
Es wird angenommen, dass Stromazellen an der Bildung der Mikroumwelt bei dem Knochenmark in vivo beteiligt sind. Wenn isoliert, sind Stromazellen zunächst ruhend, aber fangen schliesslich an sich zu teilen, so dass sie in vitro kultiviert werden können. Expandierte Anzahlen von Stromazellen können etabliert und aufrechterhalten werden. Stromazellen sind dazu verwendet worden, Kolonien von fibroblastischen adipocytischen und osteogenetischen Zellen herzustellen, wenn sie unter entsprechenden Bedingungen kultiviert wurden. Wenn die haftenden Zellen in Anwesenheit von Hydrocortison oder anderen Selektionsbedingungen kultiviert werden, erhält man Populationen, die mit hämatopoetischen Vorläufern oder osteogenetischen Zellen angereichert sind (Carter, R.F. et al., Blood 79: 356–364 (1992) und Bienzle, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91: 350–354 (1994)).
Es gibt mehrere Beispiele für die Verwendung von Stromazellen. Das europäische Patent EP 0,381,490 offenbart Gentherapie unter Verwendung von Stromazellen. Insbesondere wird ein Verfahren zur Behandlung von Hämophilie offenbart. Stromazellen sind verwendet worden, um fibrose Gewebe, Knochen oder Knorpel herzustellen, wenn sie in vivo in ausgewählte Gewebe implantiert worden waren (Ohgushi, H. et al., Acte. Orthop. Scand. 60: 334–339 (1989); Nakahara, H. et al., J. Orthop. Res. 9: 465–476 (1991); Niedzwiedski, T. et al., Biomaterials 14: 115–121 (1993); und Wakitani, S. et al., J. Bone & Surg. 76A: 579–592 (1994)). In einigen Berichten wurden Stromazellen dazu verwendet, Knochen oder Knorpel in vivo herzustellen, wenn sie subkutan mit einer porösen Keramik (Ohgushi, H. et al., Acta Orthop. Scand. 60: 334–339 (1989)), intraperitoneal in einer Diffusionskammer (Nakahara, H. et al., J. Orthop. Res. 9: 465–476 (1991)), perkutan in einen operativ hervorgerufenen Knochendefekt (Niedzwiedski, T. et al., Biomaterials. 14: 115–121 (1993)) implantiert oder in einem Collagengel transplantiert wurden, um einen operativen Defekt in einem Gelenkknorpel zu reparieren (Wakitani, S. et al., J. Bone & Surg. 76A: 579–592 (1994)). Piersma A. H. et al., (Brit. J. Hematol. 54: 285–290 (1983)) offenbaren, dass Fibroblastenkolonie-bildende Zellen, die das hämatopoetischen Stroms bilden, sich nach intravenöser Knochenmarkstransplantation im Wirtsknochenmark niederlassen und dort verweilen. Stewart et al. (Blood 81: 2566–2571 (1993)) beobachteten vor kurzem, dass ungewöhnlich grosse und wiederholte Verabreichungen von Gesamt-Markzellen Langzeit-Verpflanzung von hämatopoetischen Vorläufern in Mäusen ergab, die nicht einer Knochenmarksentfernung unterzogen worden waren. Ausserdem haben Bienzle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 350–354 (1994)) erfolgreich Langzeit-Knochenmarkskulturen als Spenderzellen dazu verwendet, hämatopoetische Zellen in Hunden ohne Knochenmarksentfernung dauerhaft anzusiedeln. In einigen Berichten wurden Stromazellen entweder als Zellen verwendet, die eine Mikroumwelt für die Kultur von hämatopoetischen Vorläufern bilden (Anklesaria, PNAS USA 84: 7681–7685 (1987)), oder als Quelle für eine angereicherte Population von hämatopoetischen Stammzellen (Kiefer, Blood 78(10): 2577–2582 (1991)).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist so wie in den Ansprüchen definiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNG
1 zeigt eine schematische Darstellung der retroviralen Konstrukte pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ und pCOL2-lacZ. Die Kassetten der Genkonstrukte sind: LTR-Neo-Promotor-lacZ-LTR.
2 zeigt eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hierin verwendet, sind "Stromazellen", "Kolonie-bildende Fibroblasten", "Mark-Stromazellen", "haftende Zellen" und "MSCs" untereinander austauschbar verwendet und sollen die kleine Fraktion von Zellen im Knochenmark bezeichnen, die als Stammzell-ähnliche Vorläufer von Osteocyten, Chondrocyten und Adipocyten dienen kann und die über ihre Eigenschaft, an Kunststoffschalen anzuhaften, vom Knochenmark isoliert werden kann. Stromazellen können von jedem Tier abgeleitet werden. In einigen Ausführungsformen sind Stromazellen von Primaten abgeleitet, vorzugsweise Menschen.
Wie hierin verwendet, sollen "Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind," Erkrankungen, Störungen und Verfassungen bezeichnen, in denen defekte Gene und/oder nicht ausreichende Genexpression kausal mit der Krankheit oder Symptomen verknüpft ist. Individuen, die eine von mehreren wohlbekannten Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, haben, können durch einen Durchschnittsfachmann identifiziert werden. Beispiele für Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Gendefekt charakterisiert sind, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindeaminase-Defizienz, Hämophilie A und Hämophilie B. Die Verfahren und Mittel, um jede dieser Verfassungen zu diagnostizieren, sind wohlbekannt.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Erkrankung, Störung oder Verfassung, die durch einen Knochen-, Knorpel- oder Lungendefekt gekennzeichnet sind," Krankheiten, Störungen und Verfassungen bezeichnen, die durch eine genetische Mutation in einem Gen, das in Knochenzellen, Zellen, die Knorpel machen, oder Lungenzellen exprimiert wird, verursacht werden, so dass einer der Effekte einer solchen Mutation sich durch abnormale Struktur und/oder Funktion des Knochens, Knorpels bzw. der Lungen manifestiert.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Erkrankung, Störung oder Verfassung, die durch einen Defekt in der Dermis, Blutgefässen, Herz und Niere gekennzeichnet sind," Krankheiten, Störungen und Verfassungen bezeichnen, die durch eine genetische Mutation in einem Gen, das in Zellen der Dermis, Blutgefässen, Herz und Niere exprimiert wird, verursacht werden, so dass einer der Effekte einer solchen Mutation sich durch abnormale Struktur und/oder Funktion der Dermis, Blutgefässe, Herz- bzw. Niere manifestiert. Beispiele für Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Defekt in der Dermis charakterisiert sind, beinhalten, Verbrennungen, Wundliegen und diabetische Geschwüre.
Wie hierin verwendet, soll "Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Gendefekt eines Gens, das ein sezerniertes Protein codiert, gekennzeichnet sind," Erkrankungen, Störungen und Verfassungen bezeichnen, die gekennzeichnet sind durch einen Gendefekt, in dem das Gen, das defekt ist oder nicht ausreichend exprimiert wird, ein Protein codiert, das normalerweise sezerniert wird.
Wie hierin verwendet, soll "Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch vorteilhafte Proteine behandelt werden können," Krankheiten, Störungen und Verfassungen bezeichnen, die behandelt oder verhindert werden können durch die Anwesenheit eines Proteins, das die Ursachen und/oder Symptome, die die Krankheit, Störung oder Verfassung kennzeichnen, lindert, reduziert, verhindert oder die Linderung, Reduktion oder Verhinderung bewirkt. Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die mit Proteinen behandelt werden können, schliessen ein Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind sowie solche, die nicht durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, welche aber dennoch durch die Anwesenheit eines Proteins, dass die Ursachen und/oder Symptome, welche die Krankheit, Störung oder Verfassung kennzeichnen, lindert, reduziert, verhindert oder die Linderung, Reduktion oder Verhinderung bewirkt, behandelt oder verhindert werden können.
Wie hierin verwendet, sollen "immunologisch isoliert", "immunologisch geschützt", "immunologisch neutralisiert" und "eine Weise, welche sie physisch von dem Immunsystem des Empfängers isoliert", die Einkapselung, Eingrenzung oder andere physische Trennung der implantierten Zelle von dem Körper, in welchen sie implantiert ist, so dass die Zelle nicht dem Immunsystem des Körpers ausgesetzt ist und nicht durch dieses eliminiert werden kann, so dass Zellen, welche immunologisch isoliert sind, in einer Weise verabreicht werden, dass sie physiologisch vom Immunsystem des Empfängers isoliert sind. Beispiele von immunologischen Isolierungsmitteln beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf bekannte Technologien und Geräte, wie Mikroeinkapselung, biokompatible Matritzen, Diffusionskammern, implantierbare Kartuschen, Implantationsvorrichtung mit Membranteilen und andere Behälter mit Membranen. Vorzugsweise werden Zellen immunologisch isoliert durch das Erhalten von Ihnen mit Implantationsvorrichtung.
Wie hierin verwendet, sind "vorteilhaftes Protein" und "heterologes Protein" untereinander austauschbar und bezeichnen 1) Proteine, die ein Protein kompensieren können, das durch ein defektes Gen codiert wird und/oder nicht ausreichende Genexpression, die kausal mit der Erkrankung oder Symptomen der Erkrankungen, Störungen oder Verfassungen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, verknüpft sind, und 2) Proteine, deren Anwesenheit die Ursachen und/oder Symptome, die die Erkrankungen, Störungen und Verfassungen kennzeichnen, welche durch vorteilhafte Proteine behandelt werden können, lindert, reduziert, verhindert oder die Linderung, Reduktion oder Verhinderung bewirkt.
Wie hierin verwendet, soll "Genkonstrukt" fremde, rekombinante Nukleinsäuremoleküle bezeichnen, die codierende Sequenzen beinhalten, die vorteilhafte Proteine funktional verknüpft mit regulatorischen Elementen, die ausreichend für die Expression der codierenden Sequenzen in Stromazellen sind, codieren.
Wie hierin verwendet, soll "fremde rekombinante Nucleinsäuremoleküle" rekombinante Nucleinsäuremoleküle bezeichnen, die entweder nicht in Stromazellen vorhanden sind oder als Protein nicht in ausreichenden Mengen in Stromazellen exprimiert werden, bis diese in die Zelle eingeführt werden durch Mittel wie, aber nicht limitiert auf, klassische Transfektion (CaPO₄ oder DEAE-Dextran), Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermittelter Transfer, chemisch vermittelter Transfer, Liganden-vermittelter Transfer oder rekombinanter viraler Vektortransfer.
Wie hierin verwendet, soll "heterologes Gen" die codierende Sequenz des Genkonstrukts bezeichnen.
Wie hierin verwendet, sind die Begriffe "exogenes genetisches Material" und "exogenes Gen" untereinander austauschbar verwendet und sollen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und RNA, mRNA und Antisense-DNA und -RNA, die in die Stromazellen eingeführt werden, bezeichnen. Das exogene genetische Material kann heterolog sein oder eine zusätzliche Kopie oder Kopien von genetischem Material, das normalerweise in dem Individuum oder Tier vorhanden ist. Wenn Zellen als Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung in einem Verfahren zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen, Verfassungen oder Störungen verwendet werden, kann das exogene genetische Material, das zur Transformation der Zellen verwendet wird, Proteine codieren, die als Therapeutikum ausgewählt wurden zur Behandlung des Individuums und/oder, um die Zellen zugänglicher für die Transplantation zu machen.
Wie hierin verwendet, soll "transfizierte Stromazellen" Stromazellen bezeichnen, die mit einem Genkonstrukt versehen wurden mithilfe irgendeiner Technologie, die zur Einführung fremder Nukleinsäuremoleküle in Zellen verwendet wird, wie beispielsweise, aber nicht begrenzt auf klassische Transfektion (CaPO₄ oder DEAE-Dextran), Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermittelter Transfer, chemisch vermittelter Transfer, Liganden-vermittelter Transfer oder rekombinanter viraler Vektor-Transfer.
Einige hier beschriebene Aspekte gehen aus der Entdeckung hervor, dass einige Stromazellen, die in einen Patienten eingeführt werden, sich zu Knochen, Knorpel und Lunge entwickeln, während andere Vorläuferzellen bleiben, die Tochterzellen abwerfen, die sich zu Knochen, Knorpel und Lunge entwickeln. Diese Entdeckung ermöglicht die erfolgreiche Behandlung von Individuen, die unter Erkrankungen, Verfassungen und Störungen leiden, die assoziiert sind mit Defekten von Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, dadurch, dass man diese Individuen entweder mit Stromazellen von normalen passenden syngenetischen Spendern versorgt oder durch Isolierung von Stromazellen des Patienten, deren Kultivierung und genetischer Modifizierung, denjenigen genetischen Defekt zu korrigieren, der für die Erkrankungen, Verfassungen und Störungen verantwortlich ist, die mit den Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellendefekten assoziiert sind. Ähnlich wir davon ausgegangen, dass Stromazellen sich auch zu Zellen der Dermis, von Blutgefässen, Herz und Nieren entwickeln oder, dass sie Tochterzellen entwickeln, die dies tun.
Die Entdeckung, dass isolierte, kultivierte Stromazellen Gewebe, insbesondere Knochen-, Knorpel- und Lungengewebe, repopulieren, wenn sie in den Blutkreislauf eines Individuums verabreicht werden, macht sie geeignet für die Behandlung von Individuen, die an Erkrankungen, Verfassungen und Störungen leiden, die mit Defekten in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen assoziiert sind. Die Entdeckung, dass einige isolierte, kultivierte Stromazellen als Vorläuferzellen agieren, wenn sie in den Blutkreislauf eines Individuums verabreicht werden, die Tochterzellen produzieren, welche dann zu differenzierten Zellen ausreifen, macht dies besonders nützlich, weil es die langfristige und kontinuierliche Anwesenheit der gespendeten normalen oder genetisch modifizierten Zellen erlaubt, ohne die Notwendigkeit für eine fortgesetzte Verabreichung von Zellen. Ähnlich ermöglicht die Entwicklung von Stromazellen in Zellen der Dermis, von Blutgefässen, Herz und Niere oder das Auslösen von Tochterzellen die Behandlung der Erkrankungen durch das Beeinflussen der Gewebe durch ähnliche Mittel.
Demgemäss können Stromazellen eines passenden Spenders intravenös Individuen verabreicht werden, die an Erkrankungen leiden, welche Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen oder Dermis-, Blutgefäss-, Herz- oder Nierenzellen involvieren, um die Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen oder Dermis-, Blutgefäss-, Herz- oder Nierenzellen des Individuums vermehren oder zu ersetzen. Stromazellen eines passenden Spenders können intravenös Individuen verabreicht werden, die an einer Erkrankung leiden, die mit defekter Genexpression in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen oder Dermis-, Blutgefäss-, Herz- oder Nierenzellen assoziiert ist, um die Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen oder Dermis-, Blutgefäss-, Herz- oder Nierenzellen des Individuums zu ersetzen, die das normale Gen nicht exprimieren oder unzureichend exprimieren und/oder ein mutiertes Gen exprimieren. In Gentherapie-Protokollen können Stromazellen auch mit heterologen Genen transfiziert werden. Gemäss solchen Aspekten können Stromazellen eines passenden Spenders oder Stromazellen eines Individuums entfernt werden und genetisch verändert werden, bevor sie wieder in das Individuum zurückgeführt werden. Die Zellen können genetisch so verändert werden, dass ein Gen eingeführt wird, dessen Expression einen therapeutischen Effekt auf das Individuum hat. Entsprechend einigen hier beschriebenen Aspekten können Stromazellen eines Individuums genetisch so verändert werden, dass ein defektes Gen ersetzt wird und/oder ein Gen eingeführt wird, dessen Expression einen therapeutischen Effekt auf das Individuum hat.
In einigen hier beschriebenen Aspekten der Erfindung können Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, die Knochen betreffen und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, behandelt werden durch das Ergänzen, Erweitern und/oder Ersetzen von defekten oder unzureichenden Knochenzellen mit Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren. Die Zellen können von den Stromazellen eines normalen passenden Spenders abgeleitet werden oder von Stromazellen des zu behandelnden Individuums. Wenn sie von dem zu behandelnden Individuum stammen, können die Zellen genetisch so modifiziert werden, dass der Defekt korrigiert wird. Ein Beispiel für eine Erkrankung oder Störung, die Knochen betrifft und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist Osteogenesis imperfecta. Ein weiteres Beispiel für eine Erkrankung oder Störung, die Knochen betrifft und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist Osteoporose. Osteoporose wird häufig als multifaktorielle Erkrankung angesehen, zu der Umweltfaktoren wie Diät und Bewegung beitragen. Studien der Erkrankung bei Zwillingen, Grossfamilien und grossen Populationen zeigen jedoch, dass viele Individuen die Krankheit vorwiegend aufgrund eines genetischen Defekts entwickeln (siehe Morrison et al., Nature 367: 284–287 (1994)). Individuen, die an Osteogenesis imperfecta leiden, können Stromazellen eines normalen passenden Spenders verabreicht werden, welche die Knochenzellen in dem Individuum, die ein mutiertes Collagen-Gen haben, ersetzen. In solchen Ausführungsformen kompensieren die normalen Zellen die defekten Zellen. In einigen Ausführungsformen können die normalen Zellen auch aus den eigenen Stromazellen des Individuums hergestellt werden, da Zellen mit einem mutierten Collagendefekt einen Wachstumsnachteil haben, verglichen mit normalen Zellen, wenn sie in Kultur wachsen. Wenn Stromazellen eines Individuums mit Osteogenesis imperfecta in Kultur wachsen, werden sie daher allmählich mit normalen Zellen angereichert werden. Diese Ausführungsform wird besonders effektiv sein, wenn das Individuum ein Mosaik für das mutierte Collagen ist, so dass einige seiner oder ihrer Zellen das mutierte Collagen-Gen enthielten und andere nicht. In einer alternativen Ausführungsform werden Stromazellen, die von einem Individuum, das an Osteogenesis imperfecta leidet, isoliert und in die ein normales Gen für Collagen I in die islierten Stromazellen insertiert. Die transfizierten Zellen werden dann in das Individuum rückgeführt. Einige wenige Individuen, die an Osteoporose leiden, haben ebenfalls Mutationen in einem der beiden Gene für Collagen I, und die gleichen Ausführungsformen werden die defekten Zellen kompensieren. Bei den meisten Individuen mit Osteoporose sind die verantwortlichen Gene noch unbekannt, aber werden wahrscheinlich bald identifiziert. In diesen Individuen werden normale Zellen den Defekt kompensieren. Wenn die verantwortlichen Gene identifiziert und isoliert worden sind, wird eine alternative Ausführungsform darin bestehen, Stromazellen von einem Individuum zu isolieren, eine normale Kopie oder Kopien des mutierten Gens zu insertierten worden ist/sind und die Zellen in das Individuum zurückzuführen.
In einigen hier beschriebenen Aspekten können Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, die Knorpel betreffen und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, behandelt werden durch das Ergänzen, Erweitern und/oder Ersetzen von defekten Knorpelzellen mit Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren. Die Zellen können von den Stromazellen eines normalen passenden Spenders abgeleitet werden oder von Stromazellen des zu behandelnden Individuums. Falls sie von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die Zellen genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren. Ein Beispiel für eine Erkrankung oder Störung, die Knorpel betrifft und durch einen Gendefekt gekennzeichnet ist, ist Chondrodysplasie, die schweren Kleinwuchs, schwere Probleme mit Gelenken und verwandte Probleme verursacht. Individuen, die an Chondrodysplasie leiden, können Stromazellen von einem normalen passenden Spender verabreicht werden, die die Zellen ersetzen, die den Knorpel im Individuum produzieren, die ein mutiertes Collagen-Gen haben. In solchen Ausführungsformen werden die normalen Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer alternativen Ausführungsform können Stromazellen von einem Individuum, das an Chondrodysplasie leidet, isoliert werden, und ein normales Gen für Collagen II kann in die isolierten Stromazellen insertiert werden. Die transfizierten Zellen werden dann in das Individuum zurückgeführt. Die Ausführungsform mit dem Collagen II-Gen wird für 20 % bis 90 % der Individuen mit verschiedenen Varianten der schweren Chondrodysplasie nützlich sein. Die verbleibenden Individuen mit Chondrodysplasie haben Mutationen in anderen Collagen-Genen (Collagen X und X1), in anderen Genen (Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptor 3) und in noch nicht identifizierten Genen. In diesen Individuen werden normale Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer alternativen Ausführungsform können auch Stromazellen verwendet werden, die aus einem Individuum isoliert worden sind und in die eine normale Kopie oder Kopien des mutierten Gens insertiert worden ist/sind. Die transfizierten Stromazellen können dann in das Individuum zurückgeführt werden. Ein weiteres Beispiel einer Erkrankung oder Störung, die Knorpel betrifft, ist Osteoarthritis. Osteoarthritis ist eine heterogene Erkrankung sowohl in Hinsicht auf die Etiologie als auch die Manifestation. Einige Individuen entwickeln die Degeneration des Knorpels in Gelenken, die Osteoarthritis kennzeichnet, wegen eines Traumas oder wegen der Spätfolgen von Infektionen. Einige wenige Individuen entwickeln Osteoarthritis in mehreren Gelenken wegen Mutationen in dem Gen für Collagen II, ähnlich den Mutationen in dem Gen, das Chondrodysplasie verursacht. Solche Individuen können, müssen aber nicht Zeichen einer milden Chondrodysplasie zeigen. Die Ursache von Osteoarthritis in anderen Individuen ist nicht bekannt, aber Studien in Grossfamilien legen nahe, dass die Erkrankung vererbt wird und daher von Mutationen in bislang nicht identifizierten Genen verursacht wird. Daher werden die gleichen Ausführungsformen, die verwendbar sind, um mutierte Gene in Individuen mit Chondrodysplasie zu kompensieren, auch für viele Individuen mit Osteoarthritis nützlich sein.
In einigen hier beschriebenen Aspekten können Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, welche die Lungen betreffen und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, behandelt werden durch das Ergänzen, Erweitern und/oder Ersetzen von defekten Lungenzellen mit Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren. Die Zellen können von Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder von Stromazellen des zu behandelnden Individuums abgeleitet werden. Falls die Zellen vom zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können sie genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren. Ein Beispiel für eine Erkrankung oder Störung, welche die Lungen betrifft und durch einen genetischen Defekt charakterisiert ist, ist zystische Fibrose. Ein weiteres Beispiel für eine Erkrankung oder Störung, welche die Lungen betrifft und durch einen genetischen Defekt charakterisiert ist, ist Defizienz von α1-Antitrypsin. Individuen, die an zystischer Fibrose leiden, können Stromazellen verabreicht werden von einem normalen passenden Spender, die eine normale zystische Fibrose haben, um die Lungenzellen des Individuums mit dem mutierten zystischen Fibrosegen zu ersetzen oder zu ergänzen. In diesen Ausführungsformen werden die normalen Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer alternativen Ausführungsform werden Stromazellen von einem Individuum, das an zystischer Fibrose leidet, isoliert, und ein normales zystisches Fibrosegen wird in die isolierten Stromazellen insertiert. Die transfizierten Zellen werden dann in das Individuum zurückgeführt.
In einigen Aspekten können Individuen, die an Erkrankungen des Knochens, des Knorpels und der Lungen leiden, sowie solche, welche an Erkrankungen der Dermis, der Blutgefässe, des Herz und der Nieren leiden, durch isolierte Stromazellen, eine Erhöhung ihrer Anzahl und das systematische Verabreichen der expandierten verjüngten Stromazellen behandelt werden. Einige der verjüngten Stromazellen werden sich zu normalen Knochen-, Knorpel-, Lungen-, Dermis-, Blutgefäss-, Herz- oder Nierenzellen entwickeln. Normale Stromazellen expandieren schneller als defekte, und die expandierte, verjüngte Population wird einen grösseren Anteil an normalen Zellen darstellen. Tabelle 1 beschreibt Medien, die für die Kultur von expandierten, verjüngten Kulturen von isolierten Stromazellen verwendbar sind.
Zusätzlich zum Ersetzen der Zellen, welche defekt sind, mit reparierten Zellen oder normalen Zellen von passenden Spendern wird ferner die Verwendung zur Expression der gewünschten Proteine, welche sezerniert werden, beschrieben. Dies heisst, dass die Stromazellen isoliert werden können, mit einem Gen für das gewünschte Protein versehen werden können und in ein Individuum in dem das gewünschte Protein produziert und eingesetzt werden oder auf eine andere Weise ein therapeutischer Effekt erreicht werden. Dieser Aspekt betrifft eine Gentherapie, in der therapeutische Proteine einem Individuum verabreicht werden.
Gemäss einigen hierin beschriebenen Aspekten werden immunologisch isolierte transfizierte Stromazellen als Zelltherapeutika zur Behandlung von Krankheiten, Störungen und Verfassungen verwendet, die durch einen Gendefekt und/oder Krankheiten, Störungen und Verfassungen, welche durch die Proteine behandelt werden können, gekennzeichnet sind. Insbesondere werden Genkonstrukte, welche heterologe Gene umfassen, welche vorteilhafte Proteine kodieren, in Stromazellen eingeführt. Die transfizierten Stromazellen werden dann immunologisch isoliert und in ein Individuum implantiert, welches einen Nutzen daraus ziehen wird, wenn das Protein exprimiert wird und durch die Zelle in den Körper sezerniert wird.
Immunologisch isolierte Stromazellen sind besonders nützlich in zelltherapeutischen Zusammensetzungen, denn zusätzlich zu der Tatsache, dass sie geeignete Wirte für die Expression von heterologen Genen und die Produktion von heterologen Proteinen sind, verhalten sich Stromazellen vorteilhaft, wenn sie immunologisch isoliert sind. Immunologisch isolierte Stromazellen weisen eine sehr hohe Lebensfähigkeit auf, wenn sie an Stellen, die eine direkte vaskuläre Blutversorgung ermangeln, implantiert werden. Zudem können Stromazellen leicht und einfach erhalten werden, sie expandieren schnell in Kultur, was sie zu einer guten Quelle für eine angemessene Versorgung mit brauchbaren Zellen für immunologisch isolierte Zelltherapeutika macht.
Demgemäss können Genkonstrukte, die Nukleotidsequenzen enthalten, die heterologe Proteine codieren, in Stromazellen eingeführt werden. Das heisst, die Zellen werden genetisch verändert, um ein Gen einzuführen, dessen Expression einen therapeutischen Effekt auf das Individuum hat. Entsprechend einigen hier beschriebenen Aspekten können Stromazellen eines Individuums oder eines anderen Individuums oder eines nicht-humanen Tiers genetisch verändert werden, um das defekte Gen zu ersetzen und/oder ein Gen einzuführen, dessen Expression einen therapeutischen Effekt auf das Individuum hat.
Demgemäss sind Stromazellen geeignet, um transfizierte Zellen herzustellen, welche immunologisch isoliert werden können und heterologe vorteilhafte Gene exprimieren, welches Mittel zum Korrigieren von genetischen Defekten und/oder zum Herstellen von therapeutischen Proteinen zur Verfügung stellt. Stromazellen können mit relativer Leichtigkeit isoliert werden und isolierte Stromazellen können kultiviert werden, so dass die Anzahl der verfügbaren Zellen steigt. Stromazellen können transfiziert werden, immunologisch isoliert werden und implantiert werden mit einem hohen Grad an Lebensfähigkeit in Stellen, welche eine direkte Blutversorgung ermangeln, wie subkutane Stellen. In einigen Ausführungsformen können Stromazellen immortalisiert sein wie durch SV40 Virus oder Proteine mit transformierenden Eigenschaften.
In einigen hier beschriebenen Aspekten können Individuen, die an einer genetischen Erkrankung oder Störung leiden, durch Ergänzen, Erweitern und/oder Ersetzen des defekten oder unzureichenden Gens dadurch behandelt werden, dass immunologisch isolierte Stromazellen bereitgestellt werden, die Genkonstrukte enthalten, die normale funktionierende Kopien des defizienten Gens beinhalten. Dieser Aspekt betrifft Gentherapie, in der das Individuum mit Genen versorgt wird, für die sie hinsichtlich Anwesenheit und/oder Funktion defizient sind. Die Gene, die mit dem Zelltherapeutikum bereitgestellt werden, kompensieren das defekte Gen des Individuums. Solche Gene codieren vorzugsweise Proteine, die sezerniert werden.
Stromazellen werden transfiziert und immunologisch isoliert. In einigen Ausführungsformen sind Stromazellen transfiziert mit Genen, für die das Individuum, das behandelt werden soll, an einer kompletten Abwesenheit einer nicht mutierten Kopie des Gens leidet oder an einer Abwesenheit oder ungenügenden Expression einer nicht mutierten Form des Proteins leidet. Stromazellen werden mit einer nicht mutierten Kopie des Gens in einer exprimierbaren Form transfiziert. Das heisst, dass das Protein, welches durch das transfizierte Gen kodiert wird, durch die Stromazelle exprimiert werden wird, vorzugsweise als ein sezerniertes Protein. Beispiele von Erkrankungen, Störungen oder Verfassungen, in welchen die defekten Gene oder die ungenügende Genexpression kausal mit einer Erkrankung oder Symptomen verbunden ist, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindeaminasedefizienz, Hämophilie A und Hämophilie B. Andere genetische Erkrankungen, welche unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren behandelt werden können, schliessen ein: α₁-Antitrypsindefizienz, Fabray-Krankheit, familiäre Hypercholesterolämie, Gauchers-Erkrankung, Lesch-Nyhan-Syndrom, Ahornsirup-Krankheit, Ornithintranscarbamylase-Defizienz, Phenylketonurie, Sandhoff-Erkrankung, Tay-Sachs-Erkrankung und von Willebrand-Krankheit. Durch das Einführen normaler Gene in einer exprimierbaren Form, welche Wachstumshormon, Insulin, Adenindeaminase oder einen geeigneten Blutgerinnungsfaktor kodieren, können Individuen, welche an einer Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindeaminase-Defizienz bzw. Hämophilie leiden, mit Mitteln zur Kompensation der genetischen Defekte und zur Eliminierung, Minderung oder Reduzierung von einigen oder aller Symptome, welche mit einer solchen Erkrankung verbunden sind, versorgt werden. Die Tabellen IV und V enthalten Teillisten der Erkrankungen, Störungen und Verfassungen, welche unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Zusätzlich zum Ersetzen von Genen, welche defekt sind, mit funktionierenden Genen wird ferner die Verwendung zur Expression von gewünschten sezernierten Proteinen, welche einen biologisch aktiven therapeutischen oder prophylaktischen Effekt ausüben, beschrieben. Solche Proteine werden vorzugsweise durch die Zellen sezerniert. Das heisst, dass Stromazellen isoliert, mit einem Gen für ein gewünschtes Protein versehen, immunologisch isoliert und in ein Individuum eingeführt werden können, in welchem das gewünschte Protein produziert würde und einen therapeutischen Effekt ausübt oder auf eine andere Weise erzielt. Dieser Aspekt bezieht sich auf eine Gentherapie, in welcher therapeutische Proteine einem Individuum verabreicht werden. Gemäss diesen Aspekten sind die isolierten Stromazellen Vektoren für das Einbringen therapeutischer Gene in ein Individuum als auch Wirte für solche Gene, wenn die Zellen dem Individuum verabreicht werden.
In solchen Ausführungsformen werden Stromazellen mit Genen, welche Proteine kodieren, welche einen therapeutischen Effekt bei der Expression in einem Individuum, welches behandelt werden soll, aufweisen, kodieren. Eher als das therapeutische Protein direkt und bei einer Reihe von Zeitintervallen zu verabreichen, werden Mittel zum kontinuierlichen Verabreichen eines therapeutischen Proteins durch das Verabreichen von Zellen, welche das Protein produzieren, bereitgestellt. Stromazellen werden mit einem Gen, welches das Protein in einer exprimierbaren Form kodiert, transfiziert. Das heisst, dass das Protein, welches durch das transfizierte Gen kodiert wird, durch die Stromazellen exprimiert wird, vorzugsweise als sezerniertes Protein. Beispiele von therapeutischen Proteinen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Adipositasfaktor (Considine, R.V. et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 2986–2988; Arner, P., N. Engl. J. Med., 1995, 333, 382; Emorine, L. et al., Trends Pharmacol. Sci., 1994, 15, 3; Flier, J. S., Cell, 1995, 80, 15, Lowell, B.B., et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 923; and Rink, T.J. et al., Nature, 1994, 372, 406), Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, Erythropoietin, Interleukin-2 und Interleukin-1 Rezeptorantagonistprotein. Tabellen IV und V enthalten Teillisten von Erkrankungen, Störungen oder Verfassungen, welche unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, und enthält die Namen von Proteinen, welche durch ein Genkonstrukt beliefert werden können.
In allen Fällen, in denen ein Genkonstrukt in die Stromazellen transfiziert wird, ist das heterologe Gen funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die notwendig sind, um Expression der Gene in den Stromazellen zu erreichen. Solche regulatorischen Sequenzen beinhalten einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal.
Das Genkonstrukt wird vorzugsweise als Expressionsvektor bereitgestellt, der die codierende Sequenz für ein heterologes Protein enthält, die funktionell mit essentiellen regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, so dass die codierende Sequenz von der Zelle exprimiert wird, wenn der Vektor in die Zelle transfiziert wird. Die codierende Sequenz ist funktionell mit dem regulatorischen Element verknüpft, das notwendig für die Expression dieses Gens in den Zellen ist. Die Nukleotidsequenz, die das Protein codiert, kann cDNA, genomische DNA, synthetisierte DNA oder ein Hybrid daraus oder ein RNA-Molekül, wie beispielsweise mRNA sein.
Das Genkonstrukt, das die Nukleotidsequenz beinhaltet, die das vorteilhafte Protein codiert, funktionell verknüpft mit den regulatorischen Elementen, kann in der Zelle verbleiben als funktionierendes cytoplasmatisches Molekül, funktionierendes episomales Molekül oder es kann in die chromosomale DNA der Zelle integrieren. Exogenes genetisches Material kann in die Zellen eingeführt werden, wo es als separates genetisches Material in Form eines Plasmids verbleibt. Als Alternative kann lineare DNA, die in das Chromosom integrieren kann, in die Zelle eingeführt werden. Beim Einführen der DNA in die Zelle können Reagenzien hinzugefügt werden, die die Integration der DNA in die Chromosomen fördert. DNA-Sequenzen, die verwendbar sind, um die Integration zu fördern, können ebenfalls in dem DNA-Molekül enthalten sein. Als Alternative kann RNA in die Zelle eingeführt werden.
Die regulatorischen Elemente, die für Genexpression notwendig sind, schliessen ein: einen Promotor, ein Initiations-Codon, ein Stopp-Codon und ein Polyadenylierungssignal. Es ist notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in den Zellen, die aus den Stromazellen nach Infusion in das Individuum entstehen, funktionsfähig sind. Darüber hinaus ist es notwendig, dass diese Elemente funktionell mit der Nukleotidsequenz verknüpft sind, die das Protein codiert, so dass die Nukleotidsequenz in den Stromazellen exprimiert werden kann und somit das Protein produziert werden kann. Initiations-Codons und Stopp-Codon werden allgemein als Teil der Nukleotidsequenz, die das Protein codiert, angesehen. Es ist jedoch notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in den Zellen, die aus Stromazellen entstehen, funktionsfähig sind. In ähnlicher Weise müssen auch Promotoren und Polyadenylierungssignale, die verwendet werden, in den Stromazellen oder Zellen, die aus Stromazellen entstehen, funktionsfähig sein. Beispiele für verwendbare Promotoren schliessen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Promotoren, die in vielen Zellen aktiv sind, wie beispielsweise der Cytomegalievirus-Promotor, SV40-Promotoren und retrovirale Promotoren. Andere Beispiele für verwendbare Promotoren schliessen ein, sind aber nicht begrenzt auf gewebespezifische Promotoren, das heisst, Promotoren, die in einigen Geweben funktionieren, aber nicht in anderen; ausserdem Promotoren von Genen, die normalerweise in Stromazellen exprimiert werden, mit oder ohne spezifischen oder allgemeinen Verstärkersequenzen. In einigen Ausführungsformen werden Promotoren verwendet, die konstitutiv Gene in Stromazellen exprimieren, mit oder ohne Verstärkersequenzen. Verstärkersequenzen werden in diesen Ausführungsformen bereitgestellt, wenn dies geeignet oder wünschenswert ist.
Entsprechend einiger Ausführungsformen sind gewünschte Gene für die Transfektion in Stromazellen funktionell mit dem menschlichen Procollagen I-Promotor, dem menschlichen Procollagen II-Promotor und dem menschlichen Procollagen III-Promotor verknüpft. In einigen Ausführungsformen sind die Gene mit relativ kurzen 5'-Fragmenten von entweder dem COL1A1- oder dem COL2A1-Gen verknüpft, das den Promotor zusammen mit Teilen der 5'-translatierten und/oder nicht-translatierten Sequenzen des Gens umfasst. In einigen Ausführungsformen ist das zu transfizierende Gen funktionell verknüpft mit einer Sequenz, die ein 1,9 kb SphI-HindIII-Fragment vom 5'-Ende des humanen COL1A1 enthält. Das Fragment enthält von –476 bp bis +1440 bp des COL1A1-Gens und umfasst deshalb den Promotor (476 bp), Exon 1 (222 bp) und den grössten Teil des Intron 1 (1223 bp von insgesamt 1453 bp). In einigen Ausführungsformen ist das zu transfizierende Gen funktionell verknüpft mit einer Sequenz, die ein Fragment des 5'-Endes des menschlichen COL2A1 enthält. In einigen Ausführungsformen enthält das Fragment –4,0 kb des COL2A1-Promotors und das gesamte COL2A1-Gen das eine oder mehrere Exons und Introns nacheinander von Exon 1 bis Exon 15 und Intron 1 bis Intron 14. Einige Konstrukte können so ausgeführt sein wie in der ebenfalls anhängigen US-Seriennummer 08/184,260 , eingereicht am 18. Januar 1994, mit dem Titel "Verfahren zur gezielten DNA-Insertion in das Genom" gelehrt wird, die hiermit durch Verweis aufgenommen wird.
Beispiele für Polyadenylierungssignale, die verwendbar sind, um die vorliegende Erfindung auszuführen, schliessen ein, sind aber nicht limitiert auf das menschliche Collagen I-Polyadenylierungssignal, das menschliche Collagen II-Polyadenylierungssignal und SV40-Polyadenylierungssignal.
Um das exogene genetische Material in einem Expressionsvektor zu exprimieren, müssen die regulatorischen Elemente funktionell mit der Nukleotidsequenz verknüpft sein, die das Protein codiert. Um die Proteinproduktion zu maximieren, können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die gut für die Genexpression in den gewünschten Zellen geeignet sind. Darüber hinaus können Codons ausgewählt werden, die am effizientesten in der Zelle transkribiert werden. Der Durchschnittsfachmann kann exogenes genetisches Material in Form von Expressionsvektoren herstellen, die in den gewünschten Zellen funktionsfähig sind.
Man wird ausserdem in Erwägung gezogen, regulatorische Elemente auszuwählen, um eine gewebsspezifische Expression des Proteins zu ermöglichen. So können z. B. spezifische Promotoren zur Verfügung gestellt werden, so dass das heterologe Gen nur in Gewebe exprimiert wird, in dem die immunologisch isolierten Stromazellen implantiert sind.
Das heterologe Protein enthält vorzugsweise eine Signalsequenz, die den Transport und die Sezernion des heterologen Proteins in den Stromazellen leitet. Die Signalsequenz wird im Allgemeinen weiter bearbeitet und bei der Sezernion des reifen Proteins von der Zelle entfernt.
Zusätzlich zur Versorgung der Zellen mit genetischem Material, das entweder 1) genetische Defekte in den Zellen korrigiert, 2) Proteine codiert, die sonst nicht in ausreichenden Mengen und/oder in funktionsfähiger Verfassung vorhanden wären, so dass das genetische Material den genetischen Defekt des Individuums korrigiert, und/oder 3) kodiert Proteine, welche als Therapeutika in der Behandlung oder Prävention eines bestimmten Krankheitszustands oder Störung oder Prävention eines damit assoziierten bestimmten Krankheitszustands oder Störung oder Symptomen verwendbar sind, kann genetisches Material auch in die Stromazellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingeführt werden, um ein Mittel für die selektive Termination solcher Zellen bereitzustellen, sofern eine solche Termination wünschenswert wird. Solche Mittel für die gezielte Zerstörung von Zellen können in Stromazellen eingeführt werden, die auch in anderer Weise genetisch modifiziert werden sollen, als auch in solche, in die kein weiteres exogenes genetisches Material eingeführt werden soll.
Isolierte Stromazellen werden mit genetischem Material ausgestattet, das sie spezifisch empfänglich für Zerstörung macht. Zum Beispiel können die Stromazellen mit Genen ausgestattet werden, die einen Rezeptor codieren, auf den spezifisch mit einem cytotoxischen Agens abgezielt werden kann. Eine expressionsfähige Form eines Gens, das dazu verwendet werden kann, selektiv Zelltod zu induzieren, kann in die Zellen eingeführt werden. In einem solchen System sind Zellen, die das Protein exprimieren, das durch das Gen codiert wird, empfänglich für die gezielte Abtötung unter bestimmten Bedingungen oder in der Anwesenheit oder Abwesenheit spezifischer Agenzien. Zum Beispiel kann eine expressionsfähige Form eines Herpesvirus-Thymidinkinase (herpes tk)-Gens in die Zellen eingeführt werden und dazu verwendet werden, selektiven Zelltod zu induzieren. Wenn das exogene genetische Material, das (herpes tk)-Gen beinhaltet, in das Individuum eingeführt wird, wird herpes tk produziert werden. Wenn es wünschenswert oder notwendig ist, die implantierten Zellen zu töten, kann dem Individuum das Medikament Gangcyclovir verabreicht werden, und dieses Medikament wird die selektive Tötung von jeder Zelle, die herpes tk produziert, bewirken. Auf diese Weise kann ein System bereitgestellt werden, das die selektive Zerstörung der implantierten Zellen erlaubt.
Durchschnittsfachmänner können Individuen, welche an genetischen Erkrankungen, wie die in Tabellen IV und V aufgelisteten, leiden, einschliesslich Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindeaminasedefizienz und Hämophilie, routinemässig unter Verwendung von Standarddiagnostizierverfahren identifizieren.
Stromazellen können durch das Entfernen von Knochenmarkszellen von einem Spender und Platzieren der Zellen in einem sterilen Behälter mit Kunststoffoberfläche oder einer anderen geeigneten Oberfläche, mit der die Zellen in Kontakt kommen, gewonnen werden. Die Stromazellen werden sich innerhalb von 30 Minuten bis ungefähr 3 Tagen an die Kunststoffoberfläche anheften. Nach mindestens 30 Minuten, vorzugsweise ungefähr vier Stunden können die nicht-haftenden Zellen entfernt und verworfen werden. Die haftenden Zellen sind Stromazellen, die sich zu Beginn nicht teilen. Nach ungefähr 2–4 Tagen beginnen die Zellen jedoch sich zu vermehren und können mithilfe von Standard-Zellkulturtechniken kultiviert werden, um ihre Anzahl zu erhöhen.
Gemäss bevorzugten Ausführungsformen können Stromazellen im Medium, das mit 2–20 % fötalem Kälberserum ergänzt wurde oder serumfreiem Medium mit oder ohne zusätzliche Ergänzungen kultiviert werden.
Isolierte Stromazellen können mit wohlbekannten Techniken transfiziert werden, die für den Durchschnittsfachmann leicht erhältlich sind. Fremde Gene können durch Standardverfahren, welche für die Einführung von Genkonstrukten in Zellen verwendet werden, in Stromazellen eingeführt werden, die die Proteine exprimieren werden, die durch die Gene codiert sind. In einigen Ausführungsformen werden die Zellen transfiziert durch Calciumphosphat-Präzipitationstransfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermittelten Transfer, chemisch vermittelten Transfer, Liganden-vermittelten Transfer oder Transfer mit rekombinanten viralen Vektoren.
In einigen Ausführungsformen werden rekombinante Adenoviren-Vektoren dazu verwendet, DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden rekombinante Retrovirus-Vektoren dazu verwendet, DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden Standard-CaPO₄-, DEAE-Dextran- oder Lipidträger-vermittelte Transfektionstechniken angewandt, um gewünschte DNA in sich teilende Zellen einzufügen. Standard-Antibiotikumresistenz-Selektionstechniken können verwendet werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektionieren. In einigen Ausführungsformen wird die DNA direkt in die Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. In ähnlicher Weise können auch wohlbekannte Elektroporations- oder Teilchenbeschuss-Techniken dazu verwendet werden, fremde DNA in isolierte Stromazellen einzuführen. Ein zweites Gen wird normalerweise co-transfiziert oder ist mit dem therapeutischen Gen verknüpft. Das zweite Gen ist häufig ein selektionierbares Antibiotikumresistenz-Gen. Transfizierte Zellen können dadurch selektioniert werden, dass die Zellen in einem Antibiotikum wachsen, das die Zellen abtötet, die das selektionierbare Gen nicht aufnehmen. In den meisten Fällen, in denen die zwei Gene, die nicht verknüpft sind und co-transfiziert wurden, werden die Zellen, die die Antibiotikabehandlung überleben, beide Gene in sich haben und werden beide von ihnen exprimieren.
Nach der Isolierung der Stromazellen können die Zellen bei Isolierung oder nachdem sie kultiviert worden sind, verabreicht werden. Isolierte Stromazellen, die bei Isolierung verabreicht werden, werden innerhalb einer Stunde nach Isolation verabreicht. Im Allgemeinen können Stromazellen direkt bei Isolierung verabreicht werden in Situationen, in denen der Spender gross und der Empfänger ein Kleinkind ist. Vorzugsweise werden Stromazellen vor der Verabreichung kultiviert. Isolierte Stromazellen können von 1 Stunde bis zu über einem Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen vor der Verabreichung für einen Zeitraum kultiviert, der ausreicht, um es ihnen zu ermöglichen sich von nicht-zyklischen in replizierende Zellen umzuwandeln. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 3–30 Tage, vorzugsweise 5–14 Tage und besonders bevorzugt 7–10 Tage kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate, besonders bevorzugt 3–6 Monate kultiviert.
Wenn die Zellen transfiziert werden, werden entweder 1) isolierte nicht-cyclisierende Stromazellen zunächst transfiziert und dann als nicht-cyclisierende Zellen verabreicht, 2) isolierte nicht-cyclisierende Stromazellen werden zuerst transfiziert, dann für einen Zeitraum kultiviert, der ausreicht, um von nicht-cyclisierenden zu replizierenden Zellen zu konvertieren, und dann verabreicht, 3) isolierte nicht-cyclisierende Stromazellen werden zuerst für einen Zeitraum kultiviert, der ausreicht, um sie von nicht-cyclisierenden zu replizierenden Zellen zu konvertieren, dann transfiziert und danach verabreicht, oder 4) isolierte nicht-cyclisierende Stromazellen werden zunächst für einen Zeitraum kultiviert, der ausreicht, um von nicht-cyclisierenden zu replizierenden Zellen zu konvertieren, dann transfiziert, dann kultiviert und dann verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden Stromazellen isoliert, transfiziert und unmittelbar verabreicht. Vorzugsweise werden Stromazellen vor Transfektion und/oder Verabreichungen kultiviert. Isolierte Stromazellen können für 3–30 Tage, in einigen Ausführungsformen für 5–14 Tage, in einigen Ausführungsformen für 7–10 Tage vor Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen können für 3–30 Tage, in einigen Ausführungsformen für 5–14 Tage, in einigen Ausführungsformen für 7–10 Tage vor Verabreichung kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 3–30 Tage, in einigen Ausführungsformen für 5–14 Tage, in einigen Ausführungsformen für 7–10 Tage vor Transfektion kultiviert werden und bei Transfektion zusätzlich für 3–30 Tage, in einigen Ausführungsformen für 5–14 Tage, in einigen Ausführungsformen für 7–10 Tage vor Verabreichen kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis ein Jahr, in einigen Ausführungsformen für 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen für 3–6 Monate vor Transfektion kultiviert. Transfizierte Stromazellen können für 4 Wochen bis ein Jahr, in einigen Ausführungsformen für 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen für 3–6 Monate vor Verabreichen kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis ein Jahr, in einigen Ausführungsformen für 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen für 3–6 Monate vor Transfektion kultiviert und bei Transfektion weitere 4 Wochen bis ein Jahr, in einigen Ausführungsformen für 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen für 3–6 Monate vor Verabreichung kultiviert.
Isolierte Stromazellen können mit wohlbekannten Techniken transfiziert werden, die dem Durchschnittsfachmann einfach zur Verfügung stehen. In einigen Ausführungsformen werden rekombinante adenovirale Vektoren dazu verwendet, DNA mit den gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden Standard-CaPO₄-, DEAE-Dextran- oder Lipidträgervermittelte Transfektionstechniken verwendet, um die gewünschte DNA in sich teilende Zellen einzufügen. Standard-Antibiotikaresistenz-Selektionstechniken können verwendet werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektionieren. In einigen Ausführungsformen wird die DNA direkt in die Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. In ähnlicher Weise können auch bekannte Elektroporations- oder Teilchenbeschusstechniken verwendet werden, um fremde DNA in isolierte Stromazellen einzuführen.
Für die Verabreichung von Stromazellen werden die isolierten Stromazellen von den Kulturschalen entfernt, mit Kochsalzlösung gewaschen, zu einem Pellet zentrifugiert und in einer Glukoselösung resuspendiert, die dem Patienten infundiert wird. In einigen Ausführungsformen wird vor der Infusion eine Knochenmarksentfernung vorgenommen, um im Knochen Raum für die eingeführten Zellen zu schaffen. Knochenmarksentfernung kann durch Röntgenbestrahlung des zu behandelnden Individuums erreicht werden, durch die Verabreichung von Medikamenten wie Cyclophosphamid oder durch die Kombination von Röntgenstrahlung und Verabreichung von Medikamenten. In einigen Ausführungsformen wird die Knochenmarksentfernung durch Verabreichung von Radioisotopen bewirkt, von denen bekannt ist, dass sie metastatische Knochenzellen abtöten, wie beispielsweise radioaktives Strontium, Samarium-135 oder Holmium-166 (siehe Applebaum, F.R. et al., 1992, Blood 80(6): 1608–1613), die hiermit durch Verweis aufgenommen wird.
Wenn eine Knochenmarksentfernung dem Verabreichen von Stromazellen vorausgeht, muss die Verabreichung von Stromazellen von der Verabreichung von nicht-haftenden Zellen, die Blutzellenvorläufer enthalten, die notwendig für das Überleben sind, begleitet werden. Solche nicht-haftenden Zellen können aus der gleichen Probe geborgen werden, die auch als Ausgangsmaterialien für die Isolierung von Stromazellen verwendet und aufbewahrt wurde, oder sie können von einer anderen Probe abgeleitet werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die nicht-haftenden Zellen vom Empfänger/Patienten bereitgestellt. Vor den Massnahmen, die die Knochenmarksentfernung hervorrufen, wird eine Probe vom Patienten/Empfänger-Knochenmark gewonnen und aufbewahrt. Die gesamte Probe kann verwendet werden oder die nicht-haftenden Zellen können isoliert und zusammen mit isolierten Stromazellen zum Verabreichen verwendet werden. Nicht-haftende Zellen, die im Zusammenhang mit der Verabreichung von Stromazellen verabreicht werden, können getrennt vor oder nach der Stromazellenverabreichung verabreicht werden oder können vor der Verabreichung mit isolierten Stromazellen vermischt werden.
Knochenmarksentfernung ist optional. In einigen Ausführungsformen wird eine partielle, aber nicht vollständige Knochenmarksentfernung vor Verabreichung der Stromazellen bewirkt. In einigen Ausführungsformen werden Stromazellen ohne Knochenmarksentfernung verabreicht.
Zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht werden pro Infusion verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden zwischen ungefähr 1–5 × 10⁶ und 1–5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht intravenös infundiert. In einigen Ausführungsformen werden zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht intravenös infundiert. In einigen Ausführungsformen werden 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht infundiert. In einigen Ausführungsformen werden 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht infundiert.
In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von Zellen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind 3–7 Verabreichungen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen.
In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1–5 × 10⁸ und 1–5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen.
In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von zwischen ungefähr 1–5 × 10⁸ und 1–5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen in einem Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 3–5 × 10⁹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 1–3 × 10¹¹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen.
Stromazellen in Diffusionskammern werden in Benayahu, D et al. (1989) J. Cell Physiol. 140: 1–7 und Mardon, H.J. et al. (1987) Cell Tissue Res. 250: 157–165 beschrieben.
Nach dem Einbringen des Genkonstrukts in die Stromazellen können die Zellen sofort oder nachdem sie kultiviert wurden immunologisch isoliert werden. Stromazellen können implantiert werden, nachdem sie immunologisch isoliert sind. Stromazellen können durch jede Anzahl von wohlbekannten Verfahren immunologisch isoliert werden unter Verwendung von einfach verfügbaren Ausgangsmaterialien und/oder Vorrichtungen. Stromazellen können mikroeingekapselt werden unter Verwendung von vielen Mikroeinkapselungsprotokollen einschliesslich der beispielsweise in US-Patent 4,391,909 , US-Patent 4,806,355 , US-Patent 4,942,129 und US-Patent 5,334,640 offenbarten.
Stromazellen können in Kammern mit diffundierbaren bzw. durchlässigen Membranen verabreicht werden oder in Microbeads eingekapselt werden. In einer weiteren Ausführungsform sind die Stromazellen in einer Hohlfaser wie sie von Amicon, Inc. (Beverly MA) erhältlich ist, enthalten. Diese Fasern werden beispielsweise zum Herstellen von Kartuschen für die Dialyse verwendet. Ein Ende kann von unter der Haut hervorgezogen werden und seine Grösse kann reduziert werden, wenn die Dosierungen des von den Zellen hergestellten Proteins reduziert werden sollen. Der Oberflächenbereich der Fasern ist sehr hoch. Zudem können die Zellen in der Faser periodisch ausgeschwemmt werden und ersetzt werden. Hohlfasern sind auf den Seiten 50 bis 51 von Amicon, Inc. Publikation Nr. 323 beschrieben.
Ähnlich ermöglicht die Inkorporation von transfizierten Stromazellen in biokompatible Matrizes die Sezernierung bzw. Sekretion des vorteilhaften Proteins an das Individuum, wobei die Zellen in einem immunologisch isoliertem Zustand bleiben. Beispiele für biokompatible Matrizes sind beispielsweise in US-Patent 4,902,295 und US-Patent 4,997,443 offenbart. In einigen Ausführungsformen werden die transfizierten Stromazellen immunologisch isoliert durch das Einschliessen derselben in Gewebeimplantatsystemen, die Membrananordnungen sind. Das heisst, dass die Zellen in Containern, welche mindestens eine poröse Membran enthält, aufrechterhalten werden. Die Zellen innerhalb der Membrananordnung sind immunologisch isoliert, wobei die vorteilhaften Proteine den Individuen durch ein Passieren durch die Membran zur Verfügung gestellt werden können. Implantationsvorrichtungen, welche Membrananordnungen sind, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf die in US-Patent 5,314,471 und US-Patent 5,344,454 beschriebenen. Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Implantationsvorrichtung bereitgestellt, welche zwei Ringanordnungen umfasst. Jede Ringanordnung umfasst eine zirkulären Kunststoffring und eine 0,3 micron Millipore- Membran, welche den Bereich des Kreises bedeckt. Transfizierte Stromazellen werden zwischen die beiden Ringanordnungen angeordnet, welche am Umfang miteinander verbunden sind. Die konstruierte Implantationsvorrichtung wird vorzugsweise subkutan implantiert.
In manchen bevorzugten Implanatationsvorrichtungen werden 10⁴ bis 10¹¹ Zellen zur Verfügung gestellt.
Immunologisch isolierte Zellen können subkutan oder intraperitoneal implantiert werden. Alternativ können sie in der Nähe von Organen und Geweben, zu denen das vorteilhafte Protein vorzugsweise geliefert wird, befestigt oder auf einer anderen Weise implantiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Implantationsvorrichtungen subkutan oder intraperitoneal implantiert.
Die Erfindung ist insbesondere brauchbar, um jene Erkrankungen, Störungen und Verfassungen zu behandeln, welche relative kleine Mengen von Protein, vorzugsweise sezerniertem Protein, benötigen. Beispiele beinhalten Wachstumsfaktor, Adipositasfaktor und Faktor IX, welche jeweils sehr kleine Mengen an Protein benötigen, um zu funktionieren. Die Tabellen IV und V enthalten Teillisten von Erkrankungen, Verfassungen und Störungen, welche unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Es ist bevorzugt, dass Stromazellen vor der immunologischen Isolation kultiviert werden. Stromazellen können von einer Stunde bis über ein Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die Stromazellen für eine Zeitspanne, die ausreicht, um sie von nicht-zyklierenden zu replizierenden Zellen umzuwandeln, kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen für 3–30 Tage, vorzugsweise 5–14 Tage, mehr bevorzugt 7–10 Tage, kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen für 4 Wochen bis ein Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate, mehr bevorzugt 3 bis 6 Monate, kultiviert.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen entweder 1) isolierte, nicht-zyklisierende Stromazellen, die zuerst transfiziert werden und dann immunologisch isoliert werden, dann als nicht-zyklisierende Zellen implantiert werden, 2) isolierte, nicht-zyklisierende Stromazellen, die zuerst transfiziert werden, dann für eine Zeitdauer kultiviert werden, die ausreicht, um sie von nicht-zyklisierenden zu replizierenden Zellen umzuwandeln, dann immunologisch isoliert werden und dann implantiert werden, 3) isolierte nicht-zyklisierende Stromazellen, die zuerst für einen Zeitraum, der ausreicht um von nicht-zyklisierenden Zellen zu replizierenden Zellen umzuwandeln, kultiviert werden, dann transfiziert werden, dann immunologisch isoliert werden und dann implantiert werden, oder 4) isolierte, nicht-zyklisierende Stromazellen, die zuerst kultiviert werden für einen Zeitraum, der ausreicht, um von nicht-zyklisierenden zu replizierenden Zellen umzuwandeln, dann transfiziert werden, dann kultiviert werden, dann immunologisch isoliert werden und dann implantiert werden. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen isoliert, transfiziert, immunologisch isoliert und implantiert. Es wird bevorzugt, dass Stromazellen vor und nach der Transfektion kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 3 bis 30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5 bis 14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7 bis 10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen können für 3 bis 30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5 bis 14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7 bis 10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 3 bis 30 Tage in einigen Ausführungsformen 5 bis 14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7 bis 10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden und nach der Transfektion zusätzlich für 3 bis 30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5 bis 14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7 bis 10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3 bis 6 Monate vor der Transfektion kultiviert. Transfizierte Stromazellen können für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3 bis 6 Monate vor der Implantation kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3 bis 6 Monate vor der Transfektion kultiviert und nach der Transfektion weiter für vier Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3 bis 6 Monate vor der Implantation kultiviert.
Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft das Behandeln von Patienten, welche an einer Erkrankung, Störung oder Verfassung leiden, die durch einen Knochen- oder Knorpeldefekt gekennzeichnet ist. Er umfasst die Schritte des Identifizierens eines Individuums mit einem Knochen- oder Knorpeldefekt, das Erhalten einer Knochenmarksprobe von einem normalen, passenden, syngenetischen Spender und das Verabreichen der Knochenmarksprobe an den Patienten mittels intravenöser Infusion.
Wie oben erwähnt, kann die Knochenmarksprobe für die Transplantation von einem passenden Spender stammen. Ein Durchschnittsfachmann kann passende Spender unter Anwendung von Standardtechniken und Kriterien einfach identifizieren.
Knochenmarksproben für Transplantation können von einem passenden Spender mit Standardtechniken gewonnen werden. In einigen Ausführungsformen wird vor der Infusion eine Knochenmarksentfernung vorgenommen, um im Knochen Raum für die eingeführten Zellen zu schaffen. Knochenmarksentfernung kann durch Röntgenbestrahlung des zu behandelnden Individuums erreicht werden, durch Verabreichung von Medikamente wie Cyclophosphamid oder durch eine Kombination von Röntgenbestrahlung und Medikamentenverabreichung. In einigen Ausführungsformen wird die Knochenmarksentfernung durch Verabreichung eines Radioisotops bewirkt, das bekannt dafür ist, metastatische Knochenzellen zu töten, wie beispielsweise radioaktives Strontium, Samarium-135 oder Holmium-166 (siehe Applebau, F.R. et al., 1992, Blood 80(6): 1608–1613).
Knochenmarksentfernung ist optional. In einigen Ausführungsformen wird eine partielle, aber nicht komplette Knochenmarksentfernung vor der Knochenmarkstransplantation bewirkt. In einigen Ausführungsformen wird das Knochenmark ohne jede Knochenmarksentfernung verabreicht. Bevorzugt wird, dass die Anzahl der Zellen, die für eine Knochenmarkstransplantation zur Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankungen verwendet wird, diejenige übersteigt, die normalerweise für andere Behandlungen verwendet wird. Zwischen dem 3- bis 10-fachen der normalen Knochenmarksdosis pro 100 kg Körpergewicht wird pro Infusion verabreicht.
In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von Zellen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind 3–7 Verabreichungen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen vorgesehen.
In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1–5 × 10⁸ und 1–5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen.
In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von zwischen ungefähr 1–5 × 10⁸ und 1–5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen in einem Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind mehrere Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht vorgesehen über einen Zeitraum von 3–7 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 3–5 × 10⁹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 1–3 × 10¹¹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen. In einigen Ausführungsformen sind 5 Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen vorgesehen über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Zellen von einer transgenen Mauslinie, die ein menschliches Mini-Gen für Collagen I in einer gewebsspezifischen Weise exprimiert, wurden dazu verwendet, um zu sehen, ob mesenchymale Vorläuferzellen vom Mark, die in Kultur expandiert wurden, nach intravenöser Infusion in bestrahlte Mäuse als Langzeitvorläufer von Knochen und anderen Bindegeweben dienen kann. Das Markergen bestand aus einem intern deletierten Mini-Gen für die menschliche Proα1(I)-Kette des Procollagen I, das die Synthese verkürzter Proα1(I)-Ketten bewirkt (Khillan, J.S. et al, J. Biol. Chem. 266: 23373–23379 (1991); Pereira, R. et al., J. Clin. Invest. 91: 709–716 (1983); und Solokov, B.P. et al., Biochemistry 32: 9242–9249 (1993)). Zellen, die das Gen exprimieren, wurden von einer Linie von transgenen Mäusen gewonnen, in denen die Anzahl der Kopien für das menschliche Mini-Gen relativ zum endogenen Mausgen ungefähr 100 zu 1 betrug und das Gleichgewichtsniveau die mRNA-Mengen des menschlichen Mini-Gens relativ zur mRNA des endogenen Mausgens in den meisten Geweben ungefähr 0,5:1 betrug.
Spenderzellen von Mark, die teilweise mit mesenchymalen Vorläufern angereichert waren, wurden nach Standardprotokollen präpariert (Friedenstein, A.J. et al., Exp. Hemat. 4: 267–274 (1976); Castro-Malaspina, H. et al., Blood 56: 289–301 (1980); Piersma, A.H. et al., Exp. Hematol. 13: 237–243 (1985); Simmons, P.J. und Torok-Storb, B., Blood 78: 55–62 (1991); Beresford, J.N. et al., J. Cell Sci. 102: 341–351 (1992); Liesveld, J.L. et al., Blood 73: 1794–1800 (1989); Liesveld, J.L. et al., Exp. Hematol. 19: 63–70 (1990); und Bennett, J.H. et al., J. Cell. Sci. 99: 131–139 (1991)). Kurz gesagt wurden die Enden der langen Knochen von transgenen Mäusen abgeschnitten und das Mark mit einer mit α-MEM (Sigma) mit 10 % fötalem Kälberserum (Atlanta Biologicals) gefüllten Spritze unter Druck extrahiert. Ungefähr 10 Zellen mit Kern wurden auf einer 175 cm²-Kunststoffkulturflasche in 25 ml α-MEM mit 10 % fötalem Kälberserum ausplattiert. Nach 4 Stunden wurden die nicht-haftenden Zellen verworfen, indem das Medium ersetzt wurde. Foci, die zwei bis vier Fibroblasten-ähnliche Zellen enthielten, erschienen in 2 bis 3 Tagen, die Foci wuchsen zu nahezu konfluenten Kolonien in ca. 1 Woche. Die Ausbeute betrug ungefähr 10⁷ Zellen pro Flasche nach Trypsin-Verdauung. Gemäss Phasenkontrastmikroskopie waren die meisten Zellen Fibroblasten-ähnlich, aber auch einige wenige Makrophagen und Adipocyten wurden beobachtet.
Ungefähr 10⁵ der kultivierten haftenden Zellen wurden vermischt mit 6 × 10⁵ nicht-haftenden Zellen, die durch Inkubation von Mark von normalen Mäusen für 4 Stunden auf 175 cm²-Flaschen unter den gleichen Bedingungen gewonnen wurden, wie sie für die ursprüngliche Isolation der haftenden Zellen verwendet worden ist. Die Mischung von ungefähr 7 × 10⁵ Zellen in 0,2 bis 0,4 ml α-MEM und 10 % fötalem Kälberserum wurde in die Schwanzvene jeder Empfängermaus injiziert.
Acht Wochen alte Mäuse von der gleichen Inzucht-FVB/N-Linie wurden durch Bestrahlung mit einem ¹³⁷Cu-Bestrahlungsgerät (Atomic Energy of Canada, Ltd.) darauf vorbereitet, Spenderzellen zu erhalten. Die Einheit hatte eine Dosisrate von 116 cG/min mit einer parallel entgegengesetzten Strahlenkonfiguration (engl: parallel opposed beam configuration). Jedes Tier erhielt 9,0 Gy in zwei Abschnitten mit einem 4-Stunden-Zwischenraum (4,5 Gy + 4,5 Gy) (O'Hara, M.D. et al., Exp. Hemat. 19: 878–881 (1991)). Ein bis 2 Stunden nach dem zweiten Bestrahlungsabschnitt wurde die Mischung aus markierten haftenden Zellen und normalen nicht-haftenden Zellen intravenös injiziert. Bestrahlte Kontrollmäuse, die keine Zellinfusion erhielten, starben nach 10 bis 13 Tagen an Markversagen.
Um das Schicksal der Spenderzellen zu verfolgen, wurden zwei PCR-Bestimmungen für das menschliche COL1A1 Mini-Gen und das endogene Maus-COL1A1-Gen entwickelt. Mit einer Zwei-Primer-Bestimmung waren die Werte für das Verhältnis von menschlichem zum Maus-Gen linear über einen Bereich von 10^–4 bis ungefähr 10⁺¹ und betrugen deshalb ungefähr 10⁶ bis 10^–1 Spenderzellen pro Empfängerzelle. Mit der Drei-Primer-Bestimmung waren die Werte über einen Bereich von ungefähr 10^–3 bis 10⁺² linear und deshalb ungefähr 10^–5 bis 1 Spenderzelle pro Empfängerzelle.
Messungen von bestrahlten Mäusen nach einem Tag zeigten nur Spuren von Spenderzellen in Mark, Milz, Knochen, Lunge oder Hirn (Tabelle 1). Geringfügig höhere Werte wurden nach sieben Tagen gesehen. Nach 30 Tagen und 150 Tagen machten die Nachkommen der Spenderzellen 2,0 bis 12 % der Zellen in Mark, Milz, Knochen und Lunge aus (Tabelle 1). Nach 150 Tagen machten sie ausserdem 1,5 bis 5,0 % der Zellen im Schwertfortsatz aus, der unter dem Mikroskop von irgendwelchem mineralisiertem oder faserigem Gewebe freipräpariert worden war. Obwohl die Durchschnittswerte einen Rückgang zwischen 1 und 5 Monaten zu zeigen schienen, gab es keinen statistisch signifikanten Rückgang in den kombinierten Werten für Mark, Milz, Knochen und Lunge zwischen diesen beiden Zeitabschnitten (Tabelle 1). Untersuchungen von nicht-bestrahlten Mäusen zeigten nur sehr geringe Werte von Donorzellen zu den gleichen Zeitpunkten (< 0,0001 bis 0,05 %). In situ PCR-Bestimmungen an Lungengewebsschnitten zeigten, dass Nachkommen der Spenderzellen gleichmässig im Parenchym von sowohl Alveolen als auch Bronchien verteilt waren.
Um zu bestätigen, dass Nachkommen der Spenderzellen im Knorpel vorhanden waren, wurden Chondrocyten aus Schwertfortsatz- und Gelenksknorpel durch Verdau mit 0,5 mg/ml bakterieller Collagenase (Sigma) in DMEM bei 37 °C über Nacht isoliert. PCR-Messungen deuteten an, dass die Nachkommen der Spenderzellen 2,5 % der isolierten Chondrocyten ausmachten.
Um festzustellen, ob die Spenderzellen in den Geweben, die sie bevölkern, zu funktionsfähigen mesenchymalen Zellen werden, wurden Gewebe von den Empfängermäusen durch RT-PCR auf die Expression des menschlichen Mini-Gens für Collagen I, das in den Spenderzellen enthalten ist, untersucht. In drei Mäusen, die nach 150 Tagen untersucht wurden, wurde das Mini-Gen im Knochen exprimiert, einem Gewebe, in dem mehr als die Hälfte des synthetisierten Proteins Collagen I ist. Die Expression im Knochen wurde durch eine ähnliche Untersuchung an Knochenzellen, die aus dem Femur isoliert worden waren und für eine Woche kultiviert wurden, bestätigt. Die Expression des Mini-Gens für Collagen I war in Mark, Milz und Lunge, Geweben, in denen die Syntheserate für Collagen I geringer ist als in Knochen, variabler. Wie erwartet, wurde das Mini-Gen nicht im Knorpel exprimiert, einem Gewebe, in dem über die Hälfte des synthetisierten Proteins Collagen II ist, aber in dem keine Synthese von Collagen I stattfindet. Das Mini-Gen für Collagen I wurde auch nicht in Kulturen von Chondrocyten der Empfängermäuse exprimiert, die das Markergen enthielten und die Collagen II synthetisieren, aber nicht Collagen I.
Frühere Berichte haben gezeigt, dass Untersuchungen an den Zellen mit cytochemischen Markern oder mRNAs andeuteten, dass die Zellen Collagen I, Collagen III, Fibronectin, alkalische Phosphatase und Osteopontin synthetisieren, aber keine Eigenschaften aufweisen, die charakteristisch für Makrophagen, Granulocyten, T-Lymphocyten, B-Lymphocyten oder endotheliale Zellen sind. Die Ergebnisse hier zeigen, dass die expandierten Kulturen von haftenden Zellen nach intravenöser Injektion in bestrahlte Mäuse mehrere Bindegewebe effizient bevölkern. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Zellen als echte Vorläuferzellen für diese Gewebe dienen, da sie das Markergen für Collagen I in einer gewebsspezifischen Art und Weise exprimieren und diffus in das mesenchymale Parenchym der Lunge eingebaut werden.
Beispiel 2
Bedingungen für die Isolierung und Kultivierung von MSCs
Bedingungen für die Kultivierung von MSCs, so dass sie expandieren, aber ihren Stammzell-ähnlichen Phänotyp behalten, wurden untersucht. Tabelle 1 zeigt, dass die Ko-Kultivierung von MSCs mit Knochenstückchen die Zahl der Zellen, die nach einer Woche erhalten wurden, erhöht. Gleichzeitig verringerte die Ko-Kultivierung mit Knochen das Level an alkalischer Phosphatase (APase) in den Zellen, eine Beobachtung, die nahe legt, dass die Zellen nicht zu Osteoblasten differenzierten. Ausserdem gab es einen Rückgang in den Leveln von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP), eine Beobachtung, die nahe legt, dass die Zellen nicht zu Osteoklasten differenzierten. Ähnliche Effekte wurden mit sekundären Kulturen der MSCs beobachtet. Die Ergebnisse deuten daher an, dass die Ko-Kultivierung mit Knochenstücken verbesserte Bedingungen für die Expansion von MSCs bieten kann. Ausserdem kann das Medium von kultivierten Knochenstücken eine wichtige Quelle für Cytokine und Wachstumsfaktoren für die Expansion von MSCs in Kultur sein.
In ähnlichen Experimenten wurde herausgefunden, dass sekundäre Kulturen von MSCs für lange Zeiträume aufrechterhalten werden können. MSCs können in Kultur über mehr als 4 Monate durch Trypsinisierung und Wiederausplattieren passagiert werden. In stationären Phase-Kulturen sind die Zellen bemerkenswert stabil. In einem Experiment blieb eine stationäre Kultur für über 4 Monate lebensfähig bei Wiederfütterung ungefähr einmal pro Woche. In einem weiteren Experiment blieben die Zellen überlebensfähig, als sie durch einen Fehler für 1 Monat ohne Wiederfütterung im Inkubator belassen wurden.
Stabile Transfektion von MSCs mit einem retroviralen Vektor
Um Virus für die Infektion von MSCs zu erhalten, wurde der LNCZ-retrovirale Vektor (Miller, A.D. und Rosman, G.J., Bio Techniques 7, 980–990 (1989) so modifiziert, dass der Promotor für den Cytomegalovirus (pCMV) die Expression des lacZ-Gens trieb (1). Der Vektor wurde stabil in eine amphotrope Maus-Verpackungszelllinie (PA317) transfiziert. Konstitutive Virus-produzierende Klone wurden durch G418-Selektion isoliert, und der Überstand dieser Klone wurde für die Infektion von MSCs verwendet. Primärkulturen-MSCs (3 Tage alt) wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit frischem Überstand der produzierenden Linie mit dem höchsten Titer infiziert. Färben der Zellen 5 Tage später zeigte, dass ungefähr 15–20 % der Zellen typischerweise das lacZ-Gen exprimierten. Mehrere Kulturen von infizierten Zellen wurden einer Selektion mit G418 (0,44 μg/ml aktive Konzentration) für 5 Tage unterzogen. Die meisten der Zellen, die sich erholten, fuhren fort, das lacZ-Gen zu exprimieren. Modifikationen des LNCZ wurden auch konstruiert, so dass die Expression des lacZ-Gens vom Promotor des COL1A1-Gens und vom Promotor des COL2A1-Gens (pCOL2A1) getrieben wird. Expression des lacZ-Gens in primären Kulturen von MSCs wurde mit beiden Konstrukten erfolgreich erzielt.
Ersatz von Knochenzellen in transgenen Mäusen mit normalen MSCs
MSCs aus normalen Mäusen wurden in transgene Mäuse, die hohe Level des mutierten COL1A1-Gens (Tabellen II und III) exprimieren, infundiert. Einen Monat nach der Infusion von normalen MSCs in die Osteoimperfecta (OI)-Mäuse (Tabelle II) machten Nachfahren der Spenderzellen 10 bis 45 % der Knochenzellen in den Empfängermäusen aus, die mit der maximal tolerierbaren Dosis von Röntgenstrahlen (700 centi-Gray oder cGy) bestrahlt worden waren. Ähnliche Werte wurden mit Mäusen erhalten, die mit der halben der maximal tolerierbaren Dosis von Röntgenstrahlung (350 cGy) bestrahlt worden waren. Die Verringerung der Dosis auf ein Viertel (175 cGy) reduzierte die Werte in vier Mäusen jedoch auf 0 %, 5 %, 10 % und 40 %. Ähnliche Werte erhielt man, wenn OI-transgene Mäuse mit hohen Zahlen von Gesamt-Markzellen, von denen die MSCs nicht entfernt worden waren infundiert wurden (Tabelle III).
In fünf Empfängermäusen, in denen die Synthese von Proα1(1)-Ketten untersucht wurde (Tabellen II und III), wurde der Ersatz der Knochenzellen des Empfängers durch normale Spender-MSCs begleitet durch einen Anstieg des Verhältnisses von normalen Proα1(1)-Ketten zu mutierten Proα1(1)-Ketten im Knochen. Der Ersatz durch normale Zellen wurde also durch die erwarteten Veränderungen auf der Proteinebene begleitet.
Beispiel 3
Langzeit-Expression der menschlichen Gene für hGH, Faktor IX oder Ob in stabil transfizierten MSCs
MSCs wurden aus Mäusen isoliert und unter den Bedingungen wie in Pereira, R.F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4857–4861 (1995), das hiermit durch Verweis aufgenommen wird, beschrieben, kultiviert. MSCs werden mit retroviralen Vektoren infiziert oder mit nackter DNA transfiziert, um Klone zu erhalten, die die Gene für das menschliche Wachstumshormon (hGH), das menschliche Fettsuchtprotein (Ob) oder das Gen für den menschlichen Faktor IX zu exprimieren. Da bereits ein lacZ-Gen erfolgreich mit einem retroviralen Vektor in Maus-MSCs eingeführt wurde, werden Varianten desselben Vektors verwendet. Gleichzeitig werden MSCs mit Elektroporation (Andreason, G.L. und Evans, G.A., (1988) BioTechniques 6: 650–660 und Toneguzzo, F. et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 703–706), Lipofectamin und nuklearer Injektion (Mercer, W.E. et al., (1992) in Antisense Strategies, Ann. N. Y. Acad. Sci. Biol. 660: 209–218) stabil transfiziert, so dass auch grössere endogene Gene verwendet werden können. Des Weiteren werden einige der möglichen Nachteile von Retroviren bei Verwendung einer alternativen Einführungsmethodik vermieden.
Standardbedingungen für Isolierung und Kultivierung sind: Gesamtmark wird aus den Tibiae und Femuren von 6 bis 10 Wochen alten FVB/N-Mäusen gewonnen durch Abschneiden der Enden von den Knochen und Auspressen des Marks mit einer Spritze, die 1 bis 2 ml eiskaltes α-MEM und 10 % fötales Rinderserum (FRS) enthält. Die vereinigten Markzellen werden durch sanftes Schütteln gleichmässig verteilt und in einem automatischen Zähler (Coulter, Model ZM) gezählt. Von 5 × 10⁶ bis 5 × 10 Zellen mit Kern werden in 25 ml α-MEM mit 10 % FRS auf 75 cm²-Kulturflaschen ausplattiert. Nach 4 Stunden oder 3 Tagen entfernt man die nicht-haftenden Zellen durch Ersetzen des Mediums. Die haftenden Zellen werden expandiert als primäre Kulturen für 10 bis 12 Tage mit einer erneuten Fütterung ungefähr alle 4 Tage. Die Zellen werden durch Verdau mit 0,25 % Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für 5 Minuten bei 37 °C, gefolgt durch sanftes Abkratzen, zurückgewonnen. Die Zeilen werden mit α-MEM mit 10 % FRS verdünnt und bei einer Dichte von 3 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen pro 9,5 cm² in 6-Well-Platten ausplattiert. Unter diesen Bedingungen beträgt die Verdopplungszeit der Zellen 19 bis 22 Stunden. Die sekundären Kulturen werden ungefähr alle 4 Tage erneut gefüttert und durch Trypsinieren und Ausplattieren unter den gleichen Bedingungen passagiert.
Herstellung von Genkonstrukten
Der Retrovirus-Vektor LNCX wird als Ausgangskonstrukt verwendet. Günstige Klonierungsstellen in dem Konstrukt werden dazu verwendet, die modifizierten Konstrukte pRSV-lacZ, pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ und pCOL2-lacZ (1) anzufertigen. Der pCOL1-Promotor ist ein 1,4 kb-Fragment, das 476 bp des Promotors enthält, das erste Exon und den grössten Teil des ersten Introns des menschlichen COL1A1-Gens. Es wurde gezeigt, dass der Promotor in transgenen Mäusen eine promotorlose Form des COL2A1-Gens in einer sehr gewebsspezifischen und entwicklungsspezifischen Weise exprimiert (Sokolov, B.P. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 9622–9629 ). Der COL2A1-Promotor ist ein 1 kb-Fragment des menschlichen COL2A1-Gens (Ala-Kokko, L., et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 14175–14178), der eine gewebsspezifische Expression vermittelt (Bradham, D.M., et al., (1994) J. Cell Physiol. 158: 61–68). Das lacZ-Gen wird durch das hGH-Gen (Nichols Laboratories) ersetzt; das OB-Gen (Considine, R.V., et al, (1995) J. Clin. Invest. 95: 2986–2988) oder das menschliche Faktor IX-Gen (Genetic Therapy, Inc.).
Verwendung des Retrovirus-Vektors
Retrovirus-produzierende Zelllinien.
Um produzierende Zelllinien zu etablieren, wurden amphotrope Retrovirus-verpackende Mauszellen PA317 verwendet. Die Zellen wurden bei 20%-iger Konfluenz in 100 mm-Schalen durch die Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren (Promega) transfiziert unter Verwendung von 15 μg Plasmid-DNA, die durch Verdau mit ScaI, das die pBR322-Region des Retrovirus-Vektors schneidet, linearisiert war. Einen Tag nach der Transfektion wurde G418 (GIBCO/BRL) in einer aktiven Konzentration von 1 mg/ml dem Medium hinzugefügt. Neomycin-resistente Kolonien erschienen nach 7 bis 10 Tagen Selektion und wurden durch Klonierung mit mechanischen Ringen isoliert. Die Klone wurden expandiert und individuelle Klone wurden auf ihre Fähigkeit, lacZ zu exprimieren, durch direkte Anfärbung von duplizierten Wells getestet. Der Virustiter, der von den positiven Zellen produziert wurde, wurde durch einzelne Zugabe von 50 μl des Mediums zu HT-1080 menschlichen Tumorzellen, die in 6-Well-Mikrotiterplatten mit 3 ml Medium pro Well und in der Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren auf 20 % Konfluenz angewachsen waren, gemessen. Der Titer wurde durch Bestimmung der Zahl von HT-1080-Zellen, die sich positiv für die Expression des lacZ-Gens anfärbten, gemessen. Typischerweise war der Titer 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁶.
Retrovirusinfektion von Maus-MSCs
Primäre Kulturen von Maus-MSCs wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach 3 Tagen wurden die nicht-haftenden Markzellen verworfen und frisches Medium dazugegeben. Die Zellen wurden dann in Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren durch Zugabe % Volumens von frischem Überstand des Mediums von stabil transfizierten produzierenden Zellen, das den höchsten Titer von Virusproduktion aufwies, mit dem Retrovirus infiziert. Die Infektion wurde an zwei zusätzlichen aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Die Zellen wurden dann entweder direkt für die lacZ-Expression gefärbt oder in grössere Schalen verteilt und einer Selektion mit 0,4 mg/ml G418 (aktive Konzentration) unterworfen. Ungefähr 15 bis 20 % der primären Kulturen waren positiv für lacZ, und die meisten Zellen, die die G418-Selektion überlebten, waren positiv für lacZ.
Lipofectamin-Transfektion
Primäre Kulturen von MSCs wurden 10 Tage lang in 10 % FRS enthaltendem α-MEM wachsen gelassen. Nach Trypsinierung und leichtem Abschaben wurden die Zellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Well ausgesät. Die Zellen wurden 2 Tage lang wachsen gelassen, dann 2-mal mit PBS gewaschen und mit einem DNA-Lipofectaminkomplex inkubiert. Der DNA-Lipofectaminkomplex wurde wie folgt hergestellt: 6 μl Lipofectamin (GIBCO/BRL) wurden mit 1 μg LINCZ-DNA in 200 μl α-MEM gemischt, bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und dann zu einem Well auf einer 6-Well-Platte, das die MSCs in 800 μl α-MEM enthielt, hinzugefügt. Nach 6 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde der DNA-Lipofectaminkomplex durch 2 ml 10 % FRS enthaltendem α-MEM ersetzt. Die Zellen wurden für lacZ angefärbt oder einer G418-Selektion nach 18 Stunden Inkubation in FRS enthaltendem Medium unterzogen. Man erhielt positive Klone, die jedoch sehr langsam wuchsen, offensichtlich, weil die Zelldichte nach der G418-Selektion zu niedrig war. Um diese Situation zu vermeiden, können drei verschiedene Strategien angewandt werden: (a) Zellen werden in höheren Dichten ausgesät; (b) Ko-Kultivierungseinsätze für Zellkulturen werden früh im Selektionsprozess über die überlebenden Klone platziert und frische MSCs oder Knochenstückchen (siehe Tabelle 1) werden auf täglicher Basis in die Einsätze gegeben, um die notwendigen Zellfaktoren für Wachstumsstimulation zur Verfügung zu stellen; (c) zu einem Zeitpunkt, an dem die Selektion mit G418 viele der nicht-transfizierten Zellen getötet hat, werden die Kulturen erneut ausgesät mit MSCs, die mit einer Variante des Retrovirus LNCX (1) infiziert worden waren, in dem das lacZ-Gen durch das selektierbare Gen für Thymidinkinase ersetzt wurde. Die stabil mit Retrovirus transfizierten MSCs werden daher dazu verwendet, die Cytokine, Wachstumsfaktoren und Zellinteraktionen, die für das anfängliche Wachstum der transfizierten MSCs während der Selektion in G418 notwendig sind, zur Verfügung zu stellen. Wir können dann die Zellen, die mit dem Retrovirus infiziert sind, durch negative Selektion mit Gangcyclovir entfernen.
Zufuhrverfahren
Nukleare Injektionen
Nukleare Injektionen sind sehr effizient als Mittel zur Transfektion einiger Zellen. Zellen wurden in 60 mm-Schalen ausplattiert, die ein 22 × 22 mm-Deckgläschen enthielten, das mit einem Kreis markiert war, um die Region für Mikroinjektion zu beschreiben. Zellen wurden für 5 Tage in einem Medium mit 0,1 % CS inkubiert, um einen Wachstumsstopp vor der Mikroinjektion zu induzieren. Unter diesen Bedingungen inkorporierten zwischen 8 und 15 % der Zellen [³H]-Thymidin während einer 24-ständigen Markierung zwischen Tag 5 und 6. Mikroinjektion wurde unter Verwendung eines Zeiss Axiovert-invertierten Mikroskops durchgeführt, das mit einem Eppendorf-Mikroinjektor und -Mikromanipulator ausgestattet war, unter Verwendung kommerziell erhältlicher Glaskapillaren-Femtospitzen (Eppendorf). Alle Zellen innerhalb der beschriebenen Region des Deckgläschens (normalerweise 150–200) wurden mit DNA in Konzentrationen, die von 0,01–10 μg/ml in 10 mM Trispuffer (pH 7,6) reichten, in den Kern mikroinjiziert. Die injizierten Zellen werden expandiert und wie oben beschrieben untersucht.
Elektroporation
MSCs werden mit 0,25 % Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann durch Abschaben abgeerntet. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 4000 g für 10 Minuten pelletiert und dann zweimal durch Resuspendieren des Pellets in eiskaltem PBS (pH 7,4) gewaschen. MSCs werden auf 2 × 10⁶ Zellen pro 0,8 ml resuspendiert und in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Abstand) aliquotiert. Die Zellen werden 10 Minuten auf Eis inkubiert, DNA wird zur Suspension hinzugegeben (5–50 μg), und die Zellen werden für zusätzliche 10 Minuten abgekühlt. Die Zellsuspension wird dann elektroporiert unter Verwendung eines kommerziellen Geräts (BioRad Gene Pulser; Modell 1652076) bei einer empirisch bestimmten Feldstärke, die den höchsten Prozentsatz an Zellen, die die exogen hinzugefügte DNA einbehalten, ergibt. Um die angemessene Feldstärke für MSCs zu ermitteln, wurden Titrationen im Bereich von 0,25–2,5 kv/cm durchgeführt. Die Elektroporationseffizienz wurde durch Einführen eines lacZ-Gens (LNCZ-Vektor) und anschliessendes Färben der Zellen 48 bis 72 Stunden nach der Elektroporation ermittelt.
Messungen
hGH
Expression des hGH-Gens wurde ermittelt, indem das Medium von Zellklonen, die in 6-Well-Mikrotiterplatten gewachsen waren, durch einen ELISA (engl: enzyme linked immuno absorbant assay) mit einem kommerziell erhältlichen Kit (GIBCO/BRL) gemessen wurde. Bei dieser Messung werden 0,1 ml des 2-fach-Verdünnungspuffers pro Well einer Mikrotiterplatte zugegeben. Nach 5 Minuten werden 0,1 ml der Testprobe hinzugefügt und die Platte wird für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Wells werden 5-mal gewaschen und 0,2 ml des primären Antikörpers werden pro Well hinzugefügt. Die Proben werden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und 5-mal gewaschen. Dann werden 0,2 ml des Substratpuffers hinzugefügt, der das O-Phenylendiaminsubstrat enthält. Die Proben werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und die Reaktion wird durch Hinzufügen von 0,1 ml 2 N Schwefelsäure abgestoppt. Die Absorbanz der Probe wird bei 490 nm gemessen.
Ob-Protein
Zellen werden auf die Expression des Ob-Gens mit einem Protein-Radioimmunoassay des Zellmediums untersucht. Der primäre Antikörper für das menschliche Ob-Protein wurde in Kaninchen erzeugt, gegen ein rekombinantes Protein, das in einem E. coli-Expressionssystem synthetisiert und bis zur Homogenität aufgereinigt worden war. Das menschliche Protein ist sehr homolog zu dem der Maus, und deshalb sollten antimenschliche Antikörper mit dem Mausprotein kreuzreagieren. Wenn sie dies nicht tun, wird die kurze Maus-cDNA (619 nt) in E. coli exprimiert, das Protein aufgereinigt und Antikörper hergestellt. Als Alternative werden synthetische Peptide von der Maussequenz gekauft und diese werden zur Herstellung der Antikörper verwendet. Für die Messung wurde rekombinantes menschliches Ob-Protein mit ¹²⁵Iod durch das Bolton-Hunter-Verfahren, gefolgt durch Gelfiltrationsaufreinigung mit Sephadex G-25, radioaktiv markiert. Die spezifische Aktivität, die erhalten wurde, betrug 30 μCi/μg. Messproben (0,2 ml) wurden mit primärem Antiserum (1:2000-Verdünnung) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Triton X-100 für 16 Stunden bei 4 °C in einem Gesamtvolumen von 0,4 ml präinkubiert. ¹²⁵I-Ob-Protein (30000 cpm in 100 μl tragend) wurde dann hinzugefügt und die Inkubation für weitere 24 Stunden fortgeführt. Das gebundene Ob-Protein (12±1 %; nicht-spezifische Bindung 1,4±0,1 %) wurde durch Zusetzen von 0,1 ml Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Serum (Antibodies, Inc., Davis, CA), 0,1 ml normalem Kaninchenserum (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) und 0,1 ml 10%-igem Polyethylenglycol immunpräzipitiert. Die Reaktionsgefässe wurden 15 Minuten zentrifugiert (2200 Upm) und die nicht-gebundene Markierung abgeschüttet und das Pellet in einem Packard 5000 Gamma-Zähler (Downers Grove, IL) gezählt. Die Konzentration des Ob-Proteins in nicht bekannten Proben wurde unter Anwendung von Rodbard's ungewichteter Vier-Parameter-Funktion berechnet. Die Detektionsgrenze für diese Messung ist 0,39 ng/ml. Die Varianz innerhalb einer Messung beträgt 11,6 % bei 12 ng/ml mit einer Varianz zwischen den Messungen von 20,8 % bei 13,1 ng/ml.
Menschlicher Faktor IX
Die Expression des Gens für Faktor IX wird mit einem kommerziell erhältlichen ELISA (American Bioproducts Company) unter Bedingungen gemessen werden, die denen ähnlich sind, die auch für den hGH-Assay (oben) verwendet wurden. Wie durch Smith et al. (74) berichtet, reichte die Standardkurve von 1–50 ng/ml^–1, und die Sensitivitätsgrenze war 1 ng/ml^–1. Der Test zeigte keine Kreuzreaktion mit Faktor IX der Maus.
Beispiel 4
Anhaltende Expression der drei Gene in physiologisch wichtigen Mengen durch systemische Infusion von stabil transfizierten MSCs in Mäusen
Experimente mit den OI-transgenen Mäusen (Tabellen II und III) zeigten, dass kultivierte MSCs nach systemischer Infusion als Stammzell-ähnliche Vorläufer von Knochen, Knorpel und anderen mesenchymalen Geweben dienen können. MSCs, die hGH, das Ob-Protein oder Faktor IX exprimieren, werden deshalb in bestrahlte und nicht-bestrahlte Mäuse infundiert, um die anhaltende Expression der Gene in vivo zu evaluieren.
Infusion von MSCs
Zunächst werden MSCs unter Bedingungen, wie in Tabelle II beschrieben, in Mäuse infundiert (3 Wochen alte Mäuse: 300 oder 700 Gray-Bestrahlung; intraperitoneale Injektion; 1 × 10⁶ MSCs; und 2 × 10⁸ Gesamt-Markzellen). Zusätzlich wird die intravenöse Infusion mit der intraperitonealen verglichen; und geringere Level von Röntgenstrahlung werden angewandt. Ausserdem werden Zellen durch Kaiserschnitt in Embryos infundiert. In vorläufigen Versuchen wurden 50 μl von 5 × 10⁴ ES injiziert in das Amnion von sieben 13 Tage alten Embryos; 6 von 7 wurden als lebensfähige Jungtiere geboren. Die intrauterine Injektion von MSCs ist daher möglich.
Wachstumskurven
Effektive in-vivo-Expression von hGH sollte die Wachstumsrate von Mäusen erhöhen und die Expression des Ob-Proteins sollte Hungern induzieren. Daher werden Gewicht und Grösse der behandelten Mäuse und Kontroll-Wurfgeschwistern überwacht.
Messungen der Genexpression
Blut wird aus dem retro-orbitalen Plexus der Mäuse nach 1 Woche, 1 Monat, 3 Monaten, 5 Monaten, 10 Monaten und 20 Monaten nach der Infusion der MSCs gewonnen. hGH und Faktor IX werden mit ELISA gemessen, und das Ob-Protein wird mit einem Radioimmunassay gemessen. Falls ein messbarer Anstieg von menschlichem Faktor IX mit ELISA erzielt wird, wird zusätzlich das in Smith, T.A.G., et al., (1993) Nature Genet. 5: 397–402, das hiermit durch Verweis aufgenommen wird, beschriebene Verfahren verwendet, um biologisch aktiven menschlichen Faktor IX zu messen. Bei diesem Verfahren wurde menschlicher Faktor IX zunächst in einem Mikrotiter-Well mit dem monoklonalen Antikörper BGIX1 eingefangen und dann mit Faktor X1a aktiviert. Der aktive Faktor IX in Kombination mit Faktor VIII konvertierte Faktor X zu Xa. Faktor Xa spaltete ein chromogenes Substrat S2765, das ein gelbes Produkt ergab. BGIX1-beschichtete Mikrotiterplatten und Faktor VIII wurden von Elcatech, Inc. (Winston-Salem, NC) gekauft. Faktor X1a wurde von Enzyme Research Labs, Inc. (South Bend, IN) gekauft. Faktor X, Phospholipidlösung, S2765 und der Thrombin-Inhibitor 1-2581 wurden von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH) gekauft. Vier Puffer wurden hergestellt: A: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7,5; B: 150 mM Tris, 5 mM CaCl₂, 10 mg/ml^–1 Gelatine, pH 7,6; C: 50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 7,5; D: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,4. Der Faktor VIII/X-Reaktionsmix wurde frisch hergestellt durch Mischen von gleichen Mengen der folgenden Vorratslösungen: Faktor VIII: 5 U ml^–1 in Puffer A; Faktor X: 1 U ml^–1 in Puffern; 1-2581: 34 μg/ml^–1 in Puffer A; CaCl2: 25 mM in Wasser; sowie Phospholipid. Plasmaproben wurden in Puffer A verdünnt, und 100 μl wurden in jedes Mikrotiter-Well gefüllt. Die Platte wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann fünfmal mit Puffer B gewaschen. 100 μl von Faktor XIa (2 μg/ml^–1 in Puffer C) wurden zu jedem Well hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wurden 100 μl von S2765 (0,5 mM in Puffer D) zu jedem Well hinzugefügt, und die Platte wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 10 % abgestoppt wurde. Absorptionen bei 405 nm wurden mit einem BioRad Mikrotiterplatten-Leser bestimmt. Die Standardkurve, hergestellt mit Verdünnungen von normalem menschlichem vereinigtem Plasma, war linear von 3–25 ng/ml. Die Messung zeigte keine Kreuzreaktion mit Mausfaktor IX. Faktor IX-Levels von 250 ng/ml oder 5 % der Normalwerte werden allgemein als therapeutisch angesehen und 100 bis 150 ng/ml werden als vorteilhaft betrachtet.
Beispiel 5
Anhaltende Expression der Gene auf physiologisch wichtigen Niveaus durch das Platzieren der MSCs in subkutane Diffusionskammern.
Zellen, die in subkutane Diffusionskammern implantiert sind, haben zumindest zwei verschiedene Vorteile für die Therapie von Patienten: (a) Immunantworten werden umgangen; und (b) wenn sie in Kapseln in Mäuse implantiert werden, (Benayahu, D., et al (1989) J. Cell Physiol. 140, 1–7, in Ratten (Mardon, H.J., et al. (1987) Cell Tissue Res. 250, 157–165), oder Kaninchen (Friedenstein, A.J., et al. (1987) Cell Tissue Kinet. 20, 263–272, überleben sie für mindestens sechs Wochen (Wakitani, S., et al. (1994) J. Bone and J.T. Surgery 76A, 579–592), offensichtlich, weil sie als Knochen, fibröses Gewebe oder Knorpel, der keine Vaskularisierung benötigt, fortbestehen (Benayahu, D., et al. (1989) Supra, Mardon, H.J., et al. (1987) Supra, Owen, M. and Friedenstein, A.J. (1988) In: Cell and Moleclular Biology of Invertebrate Hard Tissues, Wiley Chicester, CIBA Foundation Symposium, 136, 42–60, A.J., et al. (1987) Supra.
Vorbereitung der Kammern
Diffusionskammern werden mit kommerziell erhältlichen Bestandteilen bestückt (Millipore Corp.) und wie in vorhergehenden Berichten verwendet (Benayahu, D., et al. (1989) Supra, Mardon H.J. et al. (1987) Supra. Kurzgefasst, werden Membranfilter mit einer Porengrösse von 0,3 μm mit Acryloidkleber auf eine Seite von jeder der beiden Kunststoffringe geklebt. Die beiden Ringe werden dann zusammengeklebt, um eine Kammer zu bilden, wobei die Abmessungen 9 mm Innendurchmesser und 2 mm Dicke mit einem Volumen von etwa 127 mm³ sind. Von 10⁴ bis 10⁷ MSCs werden in den Kammern durch ein Loch in einem Ring inokuliert und das Loch wird mit einem kegelförmigen Kunststoffpfropfen, der mit Kleber beschichtet ist, versiegelt. Die Kammern werden in Mäuse entweder auf dem Rücken subkutan oder unter Anästhesie intraperitoneal implantiert. Anfangs werden eine oder mehrere Kammern in frisch entwöhnte Mäuse (3 Wochen) eingeführt. Anschliessend werden die Kammern in eine Wochen alte Mäuse eingebracht. Für die Experimente mit den eine Woche alten Mäusen werden kleinere Kammern von Scheiben (5 mm, I.D.), die aus Kunststoffspitzen von Mikropipetten herausgeschnitten wurden, hergestellt.
Untersuchungen
Blut wird aus dem retroorbitalen Plexus eine Woche, einen Monat, 3 Monate, 5 Monate, 10 Monate und 20 Monate nach der Implantation der Kammern erhalten. Das Plasma wird auf hGH, Ob Protein und Faktor IX, wie vorstehend beschrieben, untersucht.
Beispiel 6
Bezugnehmend auf 2 kann die Diffusionskammer (1) eine Kammertrommel (3) mit zwei Enden, einem ersten Ende (5) und einem zweiten Ende (7) aufweisen. Die Trommel kann einen oder mehrere Ringe, welche mit nicht-giftigen Mitteln aneinander befestigt sind, umfassen. Die Kammer ist an jedem Ende mit einem Filter, einem ersten Filter (9) und einem zweiten Filter (11) ausgerüstet. Die Filter sind für Faktoren porös, wie die Faktoren, die zwischen der Kammer und dem Säugetier passieren können. Die Filterporengrösse kann etwa 0,25 μm oder kleiner, vorzugsweise etwa 0,1 μm, sein. Die Filter können aus Kunststoff, Teflon, Polyester oder jeglichem inerten Material, welches stark, flexibel und fähig chemikalischen Behandlungen zu widerstehen ist, hergestellt sein. Die Filter können in ihrer Position mit Gummidichtringen befestigt sein, die auch eine festere Versiegelung bewirken können. Optional kann der Trommelteil der Kammer eine Öffnung (13) aufweisen, welche von einem Deckel verschlossen sein kann (nicht gezeigt). Der Deckel kann vom Typus des Aufschraubens sein aus selbst versiegelndem Gummi und kann für die Öffnung passend gemacht sein. Das Einbringen der Zellen in die Kammerinhalte kann daher durch den Eintritt in die Öffnung durch das Entfernen des Deckels und das Einführen der Zellen unter Verwendung einer gewöhnlichen Nadel und Spritze durchgeführt werden. Die Kammer kann aus jedem Stoff wie und nicht beschränkt auf Kunststoff, Teflon, Lucite bzw. Plexiglas, Titan oder jeglichem inerten Material, welches ungiftig für und gut toleriert von Säugetieren ist. Zusätzlich sollte die Kammer in der Lage sein, Sterilisation zu überleben.

Die Kammer kann durch folgende nicht-limitierende Weisen implantiert werden: Beispielsweise subkutan oder intraperitoneal. Die Kammer kann nach etwa 24 bis etwa 30 Stunden nach der Implantation entfernt werden. Alternativ kann eine wiederbefüllbare Kammer verwendet werden, so dass die Kammer für Behandlungen wiederverwendet werden kann und nach den Behandlungen gelehrt wird. Tabelle I: Bedingungen für das Wachstum von primären und sekundären Kulturen von MSCs

MSCs	Kultivierungsbedingungen	Zellen pro Well X10⁵	APase^a (mmol min/mg)	TRAP^a (mmol min/mg)
primär	Standard^a	2,0	426	144
	ko-kultiviert^b	6,41	22,3	102
	ko-kultiviert^c	6,94	42,0	105
	(Matrigel)
sekundär^d	Standard	1,33	2052	75
	ko-kultiviert	7,40	362	60,6
	ko-kultiviert	5,08	506	59,2
	(Matrigel)

^a Gesamt-Markzellen (20 × 10⁶) von 6 Wochen alten Mäusen wurden in individuelle 9,5 cm²-Wells in 2 ml 10%igem FCS und α-MEM kultiviert. Nicht-haftende Zellen wurden am Tag 3 entfernt und die Inkubation in frischem Medium bis Tag 7 fortgesetzt. APase und TRAP wurden wie in Referenz 55 beschrieben gemessen.
^b Ko-kultiviert mit Knochenstücken (zur Hälfte Femur und zur Hälfte Tibia) in Zellkultureinsätzen (23 mm; 3 μm Porengrösse; Becton Dickinson).
^c Ebenso wie ^b, mit Einsätzen, die mit Matrigel beschichtet waren.
^d Primärkulturen wurden am Tag 10 mit 0,25 % Trypsin und 1 mM EDTA 5 Minuten in 37 °C abgelöst, gefolgt durch sanftes Abkratzen. Zellen aus einem Well (2 × 10⁵) wurden 1:4 verdünnt und in 9,5 cm²-Wells 7 Tage kultiviert mit Mediumwechsel an Tag 3 und Tag 6.
^e APase (20, 54)- und TRAP (55)-Aktivitäten sind angegeben in mg pro Gesamtprotein.

Empfänger-Mäuse	Röntgen-Strahlung	Spenderzellen^a			Knochenersatz nach 1 Monat(%)	Rückgang in mutierten Proα1(1)-Ketten
Empfänger-Mäuse	(cG)	MSCs	Gesamt-Mark		Knochenersatz nach 1 Monat(%)	Rückgang in mutierten Proα1(1)-Ketten
transgen (3 Wochen alt)	700	0,7 × 10⁶ (N)^a	15 × 10⁶ (TG)^ab	10 bis 45 % (n = 3)	26 bis 73 % (n = 3)
transgen (3 Wochen alt)	350	1,2 × 10⁶ (N)	2 × 10⁶ (TG)	28 bis 60 % (n = 4)
transgen (3 Wochen alt)	175	1,2 × 10⁶ (N)	2 × 10⁶ (TG)	0 bis 40 % (n = 4)

^a (N): normal; (TG): transgen
^b MSCs vor Infusion aus Gesamt-Markzellen durch Inkubation auf Kunststoff-Kulturschalen für 4 Stunden bei 37 °C entfernt.

Empfänger-Mäuse	Röntgen-Strahlung	Spenderzellen^a			Knochenersatz nach 1 Monat (%)	Rückgang in mutierten Proα1(1)-Ketten
Empfänger-Mäuse	(cG)	MSCs	Gesamt-Mark		Knochenersatz nach 1 Monat (%)	Rückgang in mutierten Proα1(1)-Ketten
transgen (3 Wochen alt)	700		5 × 10⁶ (N)	20 bis 38 % (n = 3)
transgen (3 Wochen alt)	350		16 × 10⁶ (N) (n = 3)	50 bis 78 % (n = 3)	21 bis 24 % (n = 2)
transgen (3 Wochen alt)	350		5 × 10⁶ (N)	22 bis 45 % (n = 4)

^a (N): Gesamt-Mark von normalen Mäusen ohne Behandlung, um MSCs zu entfernen.

Claims

Verwendung von isolierten Stromazellen, die aus einer Knochenmarksprobe, welche von einem normalen, abgestimmten, syngenetischen Spender erhalten wurde, isoliert wurden, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit, einer Störung oder einem Zustand, gekennzeichnet durch einen Knochen- oder Knorpeldefekt, leidet, wobei der Spender syngenetisch mit dem Patienten ist und wobei das Medikament für die Verabreichung an den Patienten durch intravenöse Infusion bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für die Verabreichung an einen Patienten, der einer Knochenmarksablation vor der Verabreichung der isolierten Stromazellen ausgesetzt war, bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die isolierten Stromazellen mit einem Genkonstrukt, das ein Herpes-Thymidinkinase-Gen umfaßt, wobei das Gen funktionell mit regulatorischen Sequenzen verbunden ist und durch die Stromazellen exprimiert wird, transfiziert wurden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand durch einen Defekt im Knochen des Patienten gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand Osteogenesis imperfecta oder Osteoporose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand durch einen Defekt im Knorpel des Patienten gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand Chondrodysplasie oder Osteoarthritis ist.
Verwendung von isolierten Stromazellen, die aus einer Knochenmarksprobe von einem Patienten isoliert wurden und die unter Bedingungen, welche in einer Replikation der Stromazellen in eine expandierte Kultur von Stromazellen resultieren, kultiviert worden sind, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, welcher an einer Krankheit, einer Störung oder einem Zustand leidet, der/die durch ein mutiertes, nicht funktionierendes oder unterexprimiertes Gen gekennzeichnet ist, welches in einem Defekt in dem Knochen oder dem Knorpel des Patienten resultiert, wobei das Medikament für die Verabreichung an den Patienten durch intravenöse Infusion bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament für die Verabreichung an einen Patienten, der einer Knochenmarksablation vor der Verabreichung der Stromazellen ausgesetzt war, bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand durch einen Defekt im Knochen des Patienten gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand Osteogenesis imperfecta oder Osteoporose ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand durch einen Defekt in dem Knorpel des Patienten gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Krankheit, die Störung oder der Zustand Chrondrodysplasie oder Osteoarthritis ist.