ES2200061T3 - Celulas estromales aisladas y procedimientos para el uso de las mismas. - Google Patents

Celulas estromales aisladas y procedimientos para el uso de las mismas.

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ES2200061T3 ES96912514T ES96912514T ES2200061T3 ES 2200061 T3 ES2200061 T3 ES 2200061T3 ES 96912514 T ES96912514 T ES 96912514T ES 96912514 T ES96912514 T ES 96912514T ES 2200061 T3 ES2200061 T3 ES 2200061T3
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Ruth F. Pereira
Dennis B. Leeper
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Joseph Kulkosky
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Alexey Laptev
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Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR PACIENTES QUE PADECEN UNA ENFERMEDAD, UN TRASTORNO O UNA AFECCION QUE SE CARACTERIZA POR UN DEFECTO EN EL CARTILAGO DEL HUESO O EL PULMON. LOS PROCEDIMIENTOS INCLUYEN LA ETAPA DE ADMINISTRACION INTRAVENOSA DE CELULAS ESTROMATICAS AISLADAS A PARTIR DE INDIVIDUOS SINGENEICOS NORMALES, O LA ADMINISTRACION INTRAVENOSA DE CELULAS ESTROMATICAS AISLADAS A PARTIR DEL PACIENTE DESPUES DE LA CORRECCION DEL DEFECTO GENETICO EN LAS CELULAS AISLADAS. SE DESCRIBEN DISPOSITIVOS DE IMPLANTE QUE INCLUYEN UN RECIPIENTE QUE PRESENTA AL MENOS UNA SUPERFICIE DE MEMBRANA Y CELULAS ESTROMATICAS AISLADAS A PARTIR DE MEDULA OSEA QUE INCLUYEN UN CONSTRUCTO GENETICO. EL CONSTRUCTO GENETICO EN LAS CELULAS ESTROMATICAS INCLUYE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UNA PROTEINA BENEFICIOSA UNIDA DE FORMA OPERABLE A ELEMENTOS REGULADORES QUE ACTUAN EN CELULAS ESTROMATICAS. SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR INDIVIDUOS CON ENFERMEDADES, TRASTORNOS O AFECCIONES, INCLUYENDO DICHOS PROCEDIMIENTOS INTRODUCIR EN DICHOS INDIVIDUOS CELULAS ESTROMATICAS QUE SE ADMINISTRAN DE MANERA QUE SE AISLAN FISICAMENTE DEL SISTEMA INMUNE DEL RECEPTOR, Y QUE INCLUYEN UN CONSTRUCTO GENETICO QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UNA PROTEINA BENEFICIOSA UNIDA DE FORMA OPERABLE A ELEMENTOS REGULADORES QUE ACTUAN EN CELULAS ESTROMATICAS.

Description

Células estromales aisladas y procedimientos para el uso de las mismas.
Campo de la invención
La presente invención trata de composiciones que comprenden células estromales aisladas, y del uso de células estromales en la preparación de medicamentos para el tratamiento de individuos que tienen enfermedades asociadas al tejido óseo, cartilaginoso o pulmonar y enfermedades asociadas a defectos genéticos y/o enfermedades o dolencias que pueden ser tratadas mediante la administración o aporte de proteínas beneficiosas.
Antecedentes de la invención
Además de las células madre hematopoyéticas, la médula ósea contiene "células estromales" que son células precursoras mesenquimales (Friedenstein, A.J. y col., Exp. Hemat. 4:267-274 (1976)) que se caracterizan por sus propiedades adherentes cuando se extraen las células de la médula ósea y se colocan en recipientes de plástico. Al cabo de aproximadamente cuatro horas, las células estromales se adhieren al plástico y pueden ser así aisladas eliminando las células no adherentes de los recipientes. Estas células de la médula ósea que se adhieren firmemente al plástico se han estudiado extensamente (Castro-Malaspina, H. Y col., Blood 56:289-301 (1980), Piersma, A.H. y col., Exp. Hematol 13:237-243 (1985); Simmons, P.J. y Torok-Strob, B., Blood 78:55-62 (1991); Beresford, J.N. y col., J. Cell. Sci. 102:342-351 (1992); Liesveld, J.L. y col., Blood 73:1794-1800 (1989); Liesveld, J.L. y col., Exp. Hematol. 19:63-70 (1990); y Hennett, J.H. y col., J. Cell. Sci. 99:131-139 (1991)). Tal como se usa en la presente invención, el término "células adherentes" se refiere a células estromales y el término "células no adherentes" se refiere a células precursoras hematopoyéticas.
Se cree que las células estromales participan en la creación del microambiente de la médula ósea in vivo. Cuando son aisladas, las células estromales son inicialmente quiescentes pero comienzan eventualmente a dividirse de forma que se pueden cultivar in vitro. Se puede establecer y mantener un extenso número de células estromales. Se han empleado células estromales para generar colonias de células fibroblásticas, adipocíticas y osteogénicas cuando son cultivadas en las condiciones adecuadas. Si las células adherentes son cultivadas en presencia de hidrocortisona u otras condiciones de selección, se obtienen poblaciones enriquecidas en precursores hematopoyéticos o células osteogénicas (Carter, R.F. y col., Blood 79:356-364 (1992) y Bienzle, D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:350-354 (1994)).
Existen varios ejemplos del uso de células estromales. La Patente Europea EP 0,381,490 describe una terapia génica empleando células estromales. En concreto, se describe un procedimiento para el tratamiento de la hemofilia. Se han empleado las células estromales para producir tejido fibroso, óseo o cartilaginoso cuando se implantan en tejidos selectivos in vivo (Ohgushi, H. y col., Acte. Orthop. Scand. 60:334-339 (1989); Nakahara, H. y col., J. Orthop. Res. 9:465-476 (1991); Niedzwiedski, T. y col., Biomaterials 14:115-121 (1993); y Wakitani, S. y col., J. Bone & Surg. 76A:570-592 (1994)). En algunos informes, las células estromales se empleaban para generar hueso y cartílago in vivo cuando se implantaban por vía subcutánea con una cerámica porosa (Ohgushi, H. y col., Acte. Orthop. Scand. 60:334-339 (1989)), vía intraperitoneal en una cámara de difusión (Nakahara, H. y col., J. Orthop. Res. 9:465-476 (1991)), vía percutánea en un defecto óseo inducido quirúrgicamente (Niedzwiedski, T. y col., Biomaterials 14:115-121 (1993)), o se trasplantaban en un gel de colágeno para reparar un defecto quirúrgico en el cartílago de una articulación (Wakitani, S. y col., J. Bone & Surg. 76A:570-592 (1994)). Piersma, A.H. y col. (Brit. J. Hematol. 54:285-290 (1983)) describen que tras el trasplante vía intravenosa de médula ósea, las células formadoras de colonias de fibroblastos, que componen el estroma hematopoyético, se alojan y permanecen en la médula ósea del huésped. Stewart y col., (Blood 81:2566-2571 (1993)) observaron recientemente que administraciones anormalmente abundantes y repetidas de células de médula total produjeron un injerto a largo plazo de precursores hematopoyéticos en ratones que no habían sido sometidos a una ablación de la médula. También, Bienzle y col., (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:350-354 (1994)) emplearon con éxito cultivos a largo plazo de médula ósea como células de donante para poblar permanentemente de células hematopoyéticas a perros sin ablación de la médula. En algunos informes, las células estromales se emplearon como células que establecieran un microambiente para el cultivo de precursores hematopoyéticos (Anklesaria, PNAS USA 84:7681-7685 (1987)) o bien como fuente de una población enriquecida en células madre hematopoyéticas (Kiefer, Blood 78(10):2577-2582 (1991)).
Resumen de la invención
Un aspecto de la presente invención trata del uso de células estromales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren una enfermedad, trastorno, o dolencia caracterizado por un gen mutado, no funcionante o con una expresión menor de lo normal que da como resultado un defecto en los huesos, cartílago o pulmones del paciente. Las células estromales de este aspecto de la invención se obtienen de una muestra de médula ósea del paciente o de un donante singénico, las células adherentes son aisladas de la muestra, dichas células adherentes se transfectan con una copia normal de dicho gen mutado, no funcionante o expresado por debajo de lo normal que está ligada funcionalmente a elementos reguladores funcionales y las células adherentes transfectadas se administran al paciente por vía intravenosa.
Breve descripción de la figura
La Figura 1 muestra un esquema de las construcciones retrovirales pCMV-lac Z, pCOL1-lac Z, y pCOL2-lac Z. Las cassettes de las construcciones génicas son: LTR-Neo-promotor-Lac Z-LTR.
Descripción detallada de la invención
Tal como se emplea en la presente invención, "células estromales", "fibroblastos formadores de colonias", "células estromales de médula", "células adherentes" y "MSCs" se emplean indistintamente y se refieren a la pequeña fracción de células de la médula ósea que pueden servir como precursores, tipo célula madre, de osteocitos, condrocitos, y adipocitos y que se pueden aislar de la médula ósea gracias a su capacidad de adherirse a recipientes de plástico. Las células estromales pueden derivar de cualquier animal. En algunas formas de realización, las células estromales derivan de primates, preferiblemente humanos.
Tal como se emplea en la siguiente invención, "enfermedades, trastornos y dolencias caracterizados por un defecto génico" se refiere a enfermedades, trastornos o dolencias en los que los genes defectuosos y/o la expresión insuficiente del gen están relacionados con la causa de la enfermedad o los síntomas. Los individuos que tienen cualquiera de las diversas enfermedades, trastornos o dolencias bien conocidos caracterizados por un defecto génico pueden ser identificados por los expertos en la materia. Ejemplos de enfermedades, trastornos y dolencias caracterizados por un defecto génico incluyen, pero no están limitados a, la deficiencia de la hormona de crecimiento, diabetes, deficiencia de adenin deaminasa, hemofilia A y hemofilia B. Los procedimientos y medios para diagnosticar cada una de estas dolencias son bien conocidos.
Tal como se emplea en la presente invención, el término "enfermedad, trastorno o dolencia caracterizado por un defecto del hueso, cartílago o pulmón", se refiere a enfermedades, trastornos y dolencias que están causados por una mutación genética de un gen que se expresa en las células del hueso, en las células que fabrican cartílago y en las células del pulmón de forma que uno de los efectos de tal mutación se manifiesta por una estructura y/o función anormal del hueso, cartílago y pulmón respectivamente.
Tal como se usa en la presente invención, "enfermedades, trastornos y dolencias caracterizados por un defecto génico de un gen que codifica una proteína secretada" se refiere a enfermedades, trastornos y condiciones caracterizados por un defecto génico en las que el gen que es defectuoso o que se encuentra expresado de forma insuficiente codifica una proteína que es normalmente secretada.
Tal como se usa en la presente invención, "enfermedades, trastornos y dolencias que pueden ser tratados con proteínas beneficiosas" se refiere a enfermedades, trastornos y dolencias que se pueden tratar o prevenir con la presencia de una proteína que alivia, reduce previene o que origina el alivio, reducción o prevención de las causas y/o síntomas que caracterizan la enfermedad, trastorno o dolencia. Enfermedades, trastornos y dolencias que se pueden tratar con proteínas incluyen enfermedades, trastornos y dolencias caracterizadas por un defecto génico.
Tal como se emplea en la presente invención, "proteína beneficiosa" y "proteína heteróloga" son intercambiables y se refieren a 1) proteínas que pueden compensar la ausencia de una proteína codificada por genes defectuosos y/o la expresión insuficiente de un gen que se encuentra ligado causalmente a la enfermedad o a los síntomas en enfermedades, trastornos o dolencias caracterizados por un defecto génico y 2) proteínas cuya presencia alivia, reduce o previene, las causas y/o síntomas que caracterizan enfermedades, trastornos o condiciones que pueden ser tratados con proteínas beneficiosas.
Tal como se emplea en la presente invención, "construcción génica" se refiere a moléculas recombinantes exógenas de ácidos nucleicos que incluyen secuencias que codifican proteínas beneficiosas ligadas funcionalmente a elementos reguladores suficientes para la expresión de la secuencia codificante en células estromales.
Tal como se emplea en la presente invención, "moléculas recombinantes exógeno de ácidos nucleicos" se refiere a moléculas recombinantes de ácidos nucleicos que o bien no están presentes en células estromales o bien no se expresan como proteínas en cantidad suficiente en las células estromales hasta que no se introducen en la célula por medios tales como, pero no limitados a, la transfección clásica (CaPO_{4} o DEAE dextrano), electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada químicamente, transferencia mediada por ligando o transferencia mediada por un vector viral recombinante.
Tal como se emplea en la presente invención, "gen heterólogo" se refiere a la secuencia codificante de la construcción génica.
Tal como se emplea en la presente invención, los términos "material genético exógeno" y "gen exógeno" se emplean indistintamente y se refieren al ADN genómico, cADN, ADN sintético y ARN, mARN y ADN y ARN antisentido que se introducen en la célula estromal. El material genético exógeno puede ser heterólogo o una copia o copias adicionales de material genético que se encuentra normalmente en el individuo o el animal. Cuando las células se emplean como componentes de una composición farmacológica para tratar enfermedades, dolencias o trastornos humanos, el material genético exógeno que se emplea para transformar las células puede codificar proteínas seleccionadas como elementos terapéuticos empleadas para tratar al individuo y/o para preparar mejor las células para el trasplante.
Tal como se emplea en la presente invención, "células estromales transfectadas" se refiere a células estromales a las que se ha provisto de una construcción génica empleando cualquier técnica para introducir moléculas exógenas de ácidos nucleicos en las células tal como, pero no limitadas a, la transfección clásica (CaPO_{4} o DEAE dextrano), electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada químicamente, transferencia mediada por ligando o transferencia mediada por un vector viral recombinante.
Algunos aspectos de la presente invención surgen del descubrimiento de que algunas células estromales que se introducen en un paciente se diferencian hacia hueso, cartílago y pulmón mientras que otras células se mantienen como células precursoras que generan células hijas que se diferencian hacia hueso, cartílago y pulmón. Este descubrimiento permite el tratamiento con éxito de individuos que sufren enfermedades, dolencias y trastornos asociados con defectos en células de hueso, cartílago o pulmón proporcionando a dichos individuos células estromales de un donante normal, singénico o aislando células estromales del paciente, cultivándolas y modificándolas genéticamente para corregir cualquier defecto genético responsable de las enfermedades, dolencias o trastornos asociados con defectos en las células de hueso, cartílago o pulmón.
El descubrimiento de que células estromales aisladas y cultivadas repueblan tejido, en concreto tejido óseo, cartilaginoso y pulmonar, cuando se administran en el torrente sanguíneo de un individuo las hace adecuadas para su uso en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades, dolencias y trastornos asociados con defectos en las células de hueso, cartílago y pulmón. El descubrimiento de que algunas células estromales aisladas y cultivadas, cuando se administran en el torrente sanguíneo de un paciente, actúan como células precursoras que producen células hija que maduran entonces hacia células diferenciadas hace la invención particularmente útil porque permite la presencia continuada y a largo plazo de células normales de un donante o células modificadas genéticamente sin la necesidad de una readministración continua de células.
Por consiguiente, las células estromales de un donante compatible se pueden administrar vía intravenosa a individuos que sufren enfermedades asociadas con una expresión génica defectuosa en células de hueso, cartílago o pulmón, con el objeto de reemplazar las células de hueso, cartílago o pulmón del individuo que no expresan o expresen por debajo de lo normal un gen normal y/o expresen un gen mutado. Las células estromales también se pueden transfectar con genes heterólogos en protocolos de terapia génica. De acuerdo con tales aspectos de la invención, las células estromales de un donante compatible o las células estromales de un individuo se pueden extraer y alterar genéticamente antes de reintroducir las células en el individuo. Las células se pueden alterar genéticamente para introducir un gen cuya expresión tiene efectos terapéuticos sobre el individuo. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, las células estromales de un individuo se pueden alterar genéticamente para reemplazar un gen defectuoso y/o para introducir un gen cuya expresión tiene efectos terapéuticos sobre el individuo.
En algunos aspectos de la invención, células que expresen correctamente un gen normal se pueden usar para la preparación de un medicamento para tratar a individuos que sufren enfermedades y trastornos que afectan al hueso y que se caracterizan por un defecto genético en los que dichas células complementan, aumentan y/o reemplazan células óseas defectuosas o deficientes. Las células pueden derivar de células estromales de un donante normal compatible o de células estromales del individuo a tratar. Si derivan del individuo a tratar, las células pueden ser modificadas genéticamente para corregir el defecto. Un ejemplo de una enfermedad o trastorno que afecta al hueso y que se caracteriza por un defecto genético es la osteogénesis imperfecta. Otro ejemplo de una enfermedad o trastorno que afecta al hueso y que se caracteriza por un defecto genético es la osteoporosis. La osteoporosis se considera frecuentemente como una enfermedad multifactorial en la que contribuyen factores ambientales tales como la dieta y el ejercicio. Sin embargo, estudios de la enfermedad en gemelos, familias y poblaciones amplias demuestran que muchos individuos desarrollan la enfermedad principalmente debido a un defecto genético (véase Morrison y col., Nature 367:284-287 (1994)). Se pueden emplear células estromales de un donante normal compatible para la preparación de un medicamento para reemplazar las células óseas que tienen un gen del colágeno mutado en un individuo que sufre osteogénesis imperfecta. En tales formas de realización, las células normales compensarán las células defectuosas. En algunas formas de realización, las células normales se pueden preparar a partir de las células estromales del propio individuo, puesto que las células con una mutación del colágeno tienen un crecimiento que se encuentra en desventaja comparado con las células normales cuando se crecen en cultivo. Por lo tanto, si las células estromales de un individuo con osteogénesis imperfecta se crecen en cultivo, se irán enriqueciendo gradualmente en células normales. Esta forma de realización será particularmente eficaz si el individuo es un mosaico para el colágeno mutado de forma que alguna de sus células contienen el gen del colágeno mutado y otras no. En una forma de realización alternativa, se emplean las células estromales aisladas de un individuo que sufre osteogénesis imperfecta, en las que se ha insertado un gen para el colágeno I. Las células transfectadas se pueden entonces reintroducir en el individuo. Algunos individuos que sufren osteoporosis también tienen mutaciones en uno de los dos genes del colágeno I y las mismas formas de realización compensarán las células defectuosas. En la mayoría de los individuos con osteoporosis, los genes responsables son aún desconocidos pero probablemente sean identificados pronto. En estos individuos, las células normales compensarán el defecto. También, cuando los genes responsables sean identificados y aislados, una forma de realización será emplear las células estromales que han sido aisladas del individuo, y en las que se ha insertado una copia, o copias, normal del gen mutado, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del individuo, en el que dichas células transfectadas son adecuadas para su reintroducción en dicho individuo.
En algunos aspectos de esta invención, las células que expresan correctamente un gen normal se pueden emplear en la preparación de un medicamento para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades y trastornos que afectan al cartílago y que se caracterizan por un defecto genético, complementando, aumentando y/o reemplazando las células defectuosas. Las células pueden derivar de células estromales de un donante normal compatible o de células estromales provenientes del individuo a tratar. Si derivan del individuo a tratar, las células se pueden modificar genéticamente para corregir el defecto. Un ejemplo de una enfermedad o trastorno que afecta al cartílago y que se caracteriza por un defecto genético es la condrodisplasia que causa microsomía severa, problemas severos en las articulaciones y problemas relacionados. Se pueden administrar a los individuos que sufren condrodisplasia, células estromales de un donante normal compatible que van a reemplazar a las células productoras de cartílago del individuo que tienen mutado el gen del colágeno. Aquí, las células normales compensarán las células defectuosas. Las células estromales se pueden aislar a partir de un individuo que sufre condrodisplasia y se puede insertar un gen normal para el colágeno II en las células estromales aisladas. Las células transfectadas se reintroducen entonces en el individuo. La forma de realización con el gen del colágeno II será útil en el 20% al 90% de los individuos con distintos tipos de condrodisplasia severa. Los individuos restantes con condrodisplasia tienen mutaciones en otros genes del colágeno (colágeno X y XI), en otros genes (receptor del factor de crecimiento fibroblástico 3), y en genes aún sin identificar. En estos individuos, las células normales compensarán las células defectuosas. También, en una forma de realización alternativa, se pueden emplear células estromales aisladas a partir del individuo, y en las que se ha insertado una copia, o copias, normal del gen mutado. Las células estromales transfectadas se pueden entonces reintroducir en el individuo. Otro ejemplo de enfermedad o trastorno que afecta al cartílago es la osteoartritis. La osteoartritis es una enfermedad heterogénea en cuanto a su etiología como en cuanto a sus manifestaciones. Algunos individuos desarrollan la degeneración del cartílago de las articulaciones que caracteriza a la osteoartritis debido a un trauma o como secuela tardía de infecciones. Unos pocos individuos desarrollan osteoartritis en múltiples articulaciones debido a mutaciones en el gen del colágeno II similares a las mutaciones en el gen que causa la condrodisplasia. Estos individuos pueden mostrar o no signos de condrodisplasia leve. La causa de osteoartritis en otros individuos es desconocida, pero estudios en familias grandes sugieren que la enfermedad es heredada y, por lo tanto, causada por mutaciones en genes aún no identificados. Por lo tanto, la misma forma de realización que será útil para compensar los genes mutados en individuos con condrodisplasia también será útil para muchos individuos con osteoartritis.
En algunos aspectos de la invención, se pueden emplear células que expresan correctamente un gen normal en la preparación de un medicamento para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades y trastornos que afectan a los pulmones y que se caracterizan por un defecto genético, en los que dichas células complementan, aumentan y/o reemplazan las células defectuosas. Las células pueden derivar de células estromales de un donante normal compatible o de células estromales provenientes del individuo a tratar. Si derivan del individuo a tratar, las células se pueden modificar genéticamente para corregir el defecto. Un ejemplo de enfermedad o trastorno que afecta a los pulmones y que se caracteriza por un defecto genético es la fibrosis quística. Otro ejemplo de enfermedad o trastorno que afecta a los pulmones y que se caracteriza por un defecto genético es la deficiencia de \alpha1-antitripsina. Se pueden administrar a los individuos que sufren fibrosis quística, células estromales de un donante normal compatible que tiene un gen normal para la fibrosis quística para reemplazar o complementar las células pulmonares en el individuo que tiene mutado el gen de la fibrosis quística. Aquí, las células normales compensarán las células defectuosas. En una forma de realización alternativa, se pueden emplear células estromales de un individuo que sufre fibrosis quística y se puede insertar un gen normal de la fibrosis quística en las células estromales aisladas. Las células transfectadas se pueden entonces reintroducir en el individuo.
En algunos aspectos, las células estromales expandidas, rejuvenecidas, que han sido generadas a partir de células estromales aisladas, se pueden emplear en la preparación de un medicamento para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades del hueso, cartílago y pulmones. Algunas de las células estromales rejuvenecidas se diferenciarán a células normales de hueso, cartílago y pulmón. Las células estromales normales se expanden más rápidamente que las defectuosas y la población expandida rejuvenecida representará una mayor proporción de células normales. La Tabla I describe los medios útiles para cultivar cultivos expandidos y rejuvenecidos de células estromales aisladas.
Se pueden introducir en las células estromales construcciones de genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas heterólogas. Esto es, las células son genéticamente alteradas para introducir un gen cuya expresión tiene efectos terapéuticos en el individuo. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, las células estromales de un individuo o de otro individuo se pueden alterar genéticamente para reemplazar un gen defectuoso y/o para introducir un gen cuya expresión tiene efectos terapéuticos en el individuo.
En algunos aspectos de la invención, los individuos que sufren enfermedades y trastornos genéticos se pueden tratar complementando, aumentando y/o reemplazando los genes defectuosos o deficientes proporcionando células estromales inmunológicamente aisladas que contienen construcciones de genes que incluyen copias normales, funcionantes, del gen deficiente. Este aspecto de la invención trata de terapia génica en la que se proporcionan al individuo genes en los que es deficiente para su presencia y/o función. Los genes aportados por la terapia celular compensan el gen defectuoso en el individuo. Tales genes codifican preferiblemente proteínas que son secretadas.
En todos los casos en que se transfecta en una célula estromal una construcción génica, el gen heterólogo se encuentra funcionalmente ligado a secuencias reguladoras requeridas para conseguir la expresión del gen en la célula estromal. Estas secuencias reguladoras incluyen un promotor y una señal de poliadenilación.
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La construcción génica se proporciona preferiblemente como un vector de expresión que incluye la secuencia codificante para una proteína heteróloga funcionalmente ligada a secuencias reguladoras esenciales de forma que cuando se transfecta el vector en la célula, la célula expresará la secuencia codificante. La secuencia codificante se encuentra funcionalmente ligada a los elementos reguladores necesarios para la expresión de esa secuencia en las células. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede ser cADN, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido de los mismos o una molécula de ARN tal como mARN.
La construcción génica, que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína beneficiosa funcionalmente ligada a los elementos reguladores, puede permanecer presente en la célula como una molécula citoplásmica funcionante, como una molécula episomal funcionante o se puede integrar en el ADN cromosómico de la célula. El material genético exógeno se puede introducir en las células en las que permanece como material genético separado en forma de plásmido. Alternativamente, se puede introducir en la célula ADN lineal que se puede integrar en el cromosoma. Cuando se introduce ADN en la célula, se pueden añadir reactivos que promuevan la integración del ADN en los cromosomas. También se pueden incluir en la molécula de ADN secuencias de ADN útiles para promover la integración. Alternativamente, se puede introducir ARN en la célula.
Los elementos reguladores necesarios para la expresión génica incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, y una señal de poliadenilación. Es necesario que estos elementos sean funcionales en las células estromales o en las células que surgen a partir de las células estromales tras su infusión en un individuo. Además, es necesario que estos elementos están ligados funcionalmente a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína tal que la secuencia de nucleótidos se pueda expresar en células estromales y se pueda así producir la proteína. Los codones de iniciación y los codones de parada se consideran generalmente parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en las células estromales o en las células que surjan a partir de las células estromales. De forma similar, los promotores y las señales de poliadenilación empleados han de ser funcionales dentro de las células estromales o dentro de las células que surjan a partir de las células estromales. Ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, promotores que son activos en muchas células tales como el promotor del citomegalovirus, los promotores SV40 y los promotores retrovirales. Otros ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de tejido, es decir promotores que funcionan en algunos tejidos pero no en otros; también, promotores de genes normalmente expresados en células estromales con o sin secuencias de control específicas o generales. En algunas formas de realización, se emplean promotores que expresan constitutivamente genes en células estromales con o sin secuencias de control. Las secuencias de control se aportan en tales formas de realización cuando sea adecuado o conveniente.
De acuerdo con algunas formas de realización, los genes deseados para su transfección en células estromales están ligados funcionalmente al promotor del procolágeno humano I, al promotor del procolágeno humano II y al promotor del procolágeno humano III. En algunas formas de realización, los genes están ligados a fragmentos 5' relativamente cortos del gen COL1A1 o COL2A1 que comprenden el promotor junto con algunas de las secuencias 5' del gen, traducidas y/o no traducidas. En algunas formas de realización, el gen a transfectar está ligado funcionalmente a una secuencia que contiene un fragmento SPHI-HindIII de 1,9 kb del extremo 5' del COL1A1 humano. El fragmento contiene desde -476 pb hasta +1440 pb del gen COL1A1 y, por lo tanto, incluye el promotor (476 pb), el exón 1 (222 pb) y la mayoría del intrón 1 (1223 pb de un total de 1453 pb). En algunas formas de realización, el gen a transfectar está ligado funcionalmente a una secuencia que contiene un fragmento del extremo 5' del COL2A1 humano. En algunas formas de realización, el fragmento contiene -4,0 kb del promotor de COL2A1 y el gen completo COL2A1, uno o más exones o intrones secuencialmente del exón 1 al exón 15 y del intrón 1 al intrón 14. Algunas construcciones se pueden diseñar como se muestra en el documento pendiente U.S. con Número de Serie 08/184,260 archivado el 18 de enero, 1994 titulado "Procedimientos para dirigir la inserción de ADN en el genoma".
Ejemplos de señales de poliadenilación útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, la señal de poliadenilación del colágeno humano I, la señal de poliadenilación del colágeno humano II, y la señal de poliadenilación SV40.
Con objeto de expresar material genético exógeno en un vector de expresión, los elementos reguladores han de estar ligados funcionalmente a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Con objeto de maximizar la producción de proteína, se pueden seleccionar las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión del gen en las células deseadas. Además, se pueden seleccionar los codones transcritos más eficazmente en la célula. Los expertos en la materia pueden producir material genético exógeno en forma de vectores de expresión funcionales en las células deseadas.
También se contempla que los elementos reguladores puedan ser seleccionados para proporcionar una expresión de la proteína específica de tejido. Así, por ejemplo, se pueden proporcionar promotores específicos de forma que el gen heterólogo sólo se expresará en el tejido en que se implanten las células estromales inmunológicamente aisladas.
La proteína heteróloga incluye preferiblemente una secuencia señal que dirige el transporte y la secreción de la proteína heteróloga en la célula estromal. Las secuencias señal se procesan y eliminan generalmente durante la secreción de la proteína madura de la célula.
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Además de proporcionar células con material genético que 1) corrige los defectos genéticos en las células, y/o 2) codifica proteínas que de otra forma no se encontrarían presentes en cantidades suficientes y/o en estado funcional de forma que el material genético corrige los defectos genéticos del individuo, el material genético también se puede introducir en las células estromales empleadas en la presente invención para proporcionar una forma de eliminar selectivamente estas células si esto es conveniente. Tales medios para poder destruir estas células se pueden introducir en las células estromales que son, de lo contrario, modificadas genéticamente al igual que aquellas en las que no se introduce más material genético exógeno.
De acuerdo con la invención, las células estromales aisladas son proporcionadas con material genético que las hace específicamente susceptibles a la destrucción. Por ejemplo, las células estromales se pueden proporcionar con genes que codifican un receptor que puede ser específicamente el objetivo de un agente citotóxico. Se puede introducir en las células la forma expresable de un gen que se puede emplear para inducir muerte celular selectiva. En un sistema tal, las células que expresan la proteína codificada por el gen son susceptibles de muerte selectiva en condiciones específicas o en presencia o ausencia de agentes específicos. Por ejemplo, una forma expresable del gen de una timidín quinasa del virus herpes (herpes tk) se puede introducir en las células y se puede emplear para inducir muerte celular selectiva. Cuando el material genético exógeno que incluye el gen de (herpes tk) se introduce en el individuo, se producirá herpes tk. Si es conveniente o necesario matar las células implantadas, se puede administrar ganciclovir al individuo y el fármaco causará la muerte selectiva de cualquier célula que produzca herpes tk. Así, se puede proporcionar un sistema que permite la destrucción selectiva de las células implantadas.
Las células estromales se pueden obtener tras la extracción de las células de la médula ósea de un donante y la colocación de las células en un contenedor estéril con una superficie de plástico u otra superficie apropiada con la que entren en contacto las células. Las células estromales se van a adherir al plástico al cabo de entre 30 minutos y 3 días. Tras al menos 30 minutos, preferiblemente aproximadamente 4 horas, las células no adheridas se pueden extraer y descartar. Las células adheridas son células estromales que inicialmente no se dividen. Sin embargo, tras aproximadamente 2-4 días las células comienzan a proliferar y pueden ser cultivadas para incrementar su número empleando técnicas estándar de cultivo celular.
De acuerdo con formas de realización preferidas, las células estromales se cultivan en medio complementado con 2-20% de suero de ternera fetal o medio sin suero con o sin suplementos adicionales.
Las células estromales aisladas se pueden transfectar empleando técnicas bien conocidas y a las que pueden tener acceso fácilmente los expertos en la materia. Se pueden introducir genes exógenos en las células estromales mediante procedimientos estándar para introducir construcciones génicas en células que expresarán las proteínas codificadas por los genes. En algunas formas de realización, las células se transfectan por transfección por precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE dextrano, electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposoma, transferencia mediada químicamente, transferencia mediada por ligando o transferencia por vector viral recombinante.
En algunas formas de realización, los vectores adenovirales recombinantes se emplean para introducir ADN con las secuencias deseadas en las células estromales. En algunas formas de realización, se emplean vectores retrovirales recombinantes para introducir ADN con las secuencias deseadas en las células estromales. En algunas formas de realización, se emplean las técnicas de transfección estándar CapO_{4}, DEAE dextrano o mediada por un vehículo lipídico para incorporar el ADN deseado en las células en división. Las técnicas estándar de selección por resistencia a antibióticos se pueden emplear para identificar y seleccionar las células transfectadas. En algunas formas de realización, se introduce el ADN directamente en las células mediante microinyección. De forma similar, las técnicas bien conocidas de electroporación o bombardeo de partículas se pueden emplear para introducir ADN exógeno en las células estromales aisladas. Generalmente se cotransfecta o se encuentra ligado al gen terapéutico un segundo gen. El segundo gen es, con frecuencia, un gen de selección por resistencia a antibióticos. Las células transfectadas se pueden seleccionar creciéndolas con un antibiótico que matará las células que no adquieran el gen de selección. En la mayoría de los casos en que los dos genes no están ligados y se cotransfectan, las células que sobreviven al tratamiento antibiótico tienen ambos genes en ellas y expresan ambos.
Tras aislar las células estromales, estas células pueden ser administradas tras su aislamiento o bien tras haber sido cultivadas. Las células estromales aisladas administradas tras su aislamiento se administran dentro de la primera hora, aproximadamente, tras su extracción. Generalmente, las células estromales se pueden administrar inmediatamente tras su aislamiento en situaciones en las que el donante es grande y el receptor es un niño. Se prefiere que las células estromales se cultiven antes de administrarlas. Las células estromales aisladas se pueden cultivar desde 1 hora hasta a lo largo de un año. En algunas formas de realización preferidas, las células estromales aisladas se cultivan antes de su administración durante un periodo de tiempo suficiente para permitir a las células que no se encuentran en división convertirse en células replicantes. En algunas formas de realización, las células estromales aisladas se cultivan durante 3-30 días, preferiblemente 5-14 días, más preferiblemente 7-10 días. En algunas formas de realización, las células estromales aisladas se cultivan entre 4 semanas y un año, preferiblemente entre 6 semanas y 10 meses, más preferiblemente 3-6 meses.
Si las células se transfectan, 1) las células estromales aisladas, que no se encuentran en división se transfectan primero y se administran a continuación como células que no se encuentran en división, 2) las células estromales aisladas, que no se encuentran en división se transfectan primero, a continuación se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para convertir las células que no se encuentran en división en células en replicación y se administran entonces, 3) las células estromales aisladas, que no se encuentran en división se cultivan primero durante un periodo de tiempo suficiente para convertir las células que no se encuentran en división en células en replicación, se transfectan y se administran entonces, o 4) las células estromales aisladas, que no se encuentran en división se cultivan primero durante un periodo de tiempo suficiente para convertir las células que no se encuentran en división en células en replicación, se transfectan, se cultivan y se administran entonces. En algunas formas de realización, las células estromales se aíslan, se transfectan y se administran inmediatamente. Se prefiere que las células estromales sean cultivadas antes de transfectarlas y/o administrarlas. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas formas de realización 5-14 días, en algunas formas de realización 7-10 días antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas formas de realización 5-14 días, en algunas formas de realización 7-10 días antes de la administración. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas formas de realización 5-14 días, en algunas formas de realización 7-10 días antes de la transfección y tras la transfección, se cultivan además durante 3-30 días, en algunas formas de realización 5-14 días, en algunas formas de realización 7-10 días antes de la administración. En algunas formas de realización, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas formas de realización de 6 semanas a 10 meses, en algunas formas de realización 3-6 meses antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas formas de realización de 6 semanas a 10 meses, en algunas formas de realización 3-6 meses antes de la administración. En algunas formas de realización, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas formas de realización de 6 semanas a 10 meses, en algunas formas de realización 3-6 meses antes de la transfección y tras la transfección, se cultivan además de 4 semanas a un año, en algunas formas de realización de 6 semanas a 10 meses, en algunas formas de realización 3-6 meses antes de la administración.
Las células estromales aisladas se pueden transfectar empleando técnicas bien conocidas y a las que tienen fácil acceso los expertos en la materia. En algunas formas de realización, se emplean vectores adenovirales recombinantes para introducir ADN con las secuencias deseadas en las células estromales. En algunas formas de realización, se emplean las técnicas de transfección estándar CapO_{4}, DEAE dextrano o mediada por un vehículo lipídico para incorporar el ADN deseado a las células en división. Las técnicas estándar de selección por resistencia a antibióticos se pueden emplear para identificar y seleccionar las células transfectadas. En algunas formas de realización, se introduce el ADN directamente en las células mediante microinyección. De forma similar, las técnicas bien conocidas de electroporación o bombardeo de partículas se pueden emplear para introducir ADN extraño en las células estromales aisladas.
Para la administración de las células estromales, se extraen las células estromales aisladas de los recipientes de cultivo, se lavan con salino, se centrifugan hasta obtener un pellet y se resuspenden en una solución de glucosa que se infunde al paciente. En algunas formas de realización, se emprende una ablación de la médula ósea previa a la infusión con objeto de liberar espacio en la médula para las células introducidas. La ablación de la médula ósea se puede llevar a cabo sometiendo a radiación X al paciente a tratar, administrándole fármacos como ciclofosfamida o mediante una combinación de radiación X y la administración de fármacos. En algunas formas de realización, la ablación de médula ósea se lleva a cabo mediante la administración de radioisótopos que se sabe destruyen las células ósea metastáticas como, por ejemplo, estroncio radioactivo, ^{135}Samario u ^{166}Holmio (véase, Applebaum, F.R. y col., 1992 Blood 80(6):1608-1613).
Si la ablación de la médula ósea precede a la administración de las células estromales, la administración de células estromales debe ir acompañada de la administración de células no adherentes que comprenden precursores de células sanguíneas necesarias para la supervivencia. Estas células no adherentes se pueden guardar de la misma muestra empleada como material inicial para el aislamiento de las células estromales y que fueron almacenadas o bien pueden provenir de una muestra diferente. En algunas formas de realización preferidas, las células no adherentes son proporcionadas por el receptor/paciente. Previo a los procedimientos que generan la ablación de la médula ósea, se recoge y almacena una muestra de médula ósea del paciente/receptor. Se puede emplear la muestra en su totalidad o bien se pueden aislar las células no adherentes y se pueden emplear para administrarlas junto con las células estromales aisladas. Las células no adherentes administradas junto con las células estromales se pueden administrar de forma independiente, antes o después de la administración de las células estromales o se pueden mezclar con las células estromales aisladas antes de administrarlas.
La ablación de la médula ósea es opcional. Por ejemplo, se puede realizar una ablación de la médula ósea parcial pero no completa antes de la administración de las células estromales o las células estromales se pueden administrar sin ablación de la médula ósea.
Es preferible que se administren entre 10^{7} y 10^{13} células por 100 kg de peso por infusión. En algunas formas de realización, se infunden vía intravenosa entre 1-5 x 10^{8} y 1-5 x 10^{12} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se infunden vía intravenosa entre 1 x 10^{9} y 5 x 10^{11} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se infunden 4 x 10^{9} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se infunden 2 x 10^{11} células por 100 kg de peso.
En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de células. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 3-7 administraciones a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones a lo largo de 5 días consecutivos.
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En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 10^{7} y 10^{13} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 1-5 x 10^{8} y 1-5 x 10^{12} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 1 x 10^{9} y 5 x 10^{11} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de 4 x 10^{9} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de 2 x 10^{11} células por 100 kg de peso.
En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 10^{7} y 10^{13} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 1-5 x 10^{8} y 1-5 x 10^{12} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 1 x 10^{9} y 5 x 10^{11} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de 4 x 10^{9} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de 2 x 10^{11} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 3-5 x 10^{9} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 4 x 10^{9} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 1-3 x 10^{11} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 2 x 10^{11} células a lo largo de 5 días consecutivos.
Como se indicó arriba, la muestra de médula ósea para trasplantar puede provenir de un donante compatible. Los expertos en la materia pueden identificar fácilmente donantes compatibles empleando las técnicas y criterios estándar.
Las muestras de médula ósea para trasplante se pueden obtener de donantes compatibles mediante técnicas estándar. En algunas formas de realización, la ablación de la médula ósea se lleva a cabo antes de la infusión con objeto de dejar espacio en el hueso para las células introducidas. La ablación de la médula ósea se puede llevar a cabo sometiendo a radiación X al paciente a tratar, administrándole fármacos como ciclofosfamida o mediante una combinación de radiación X y la administración de fármacos. En algunas formas de realización, la ablación de médula ósea se lleva a cabo mediante la administración de radioisótopos que se sabe destruyen las células óseas metastáticas como, por ejemplo, estroncio radioactivo, ^{135}Samario u ^{166}Holmio (véase, Applebaum, F.R. y col., 1992 Blood 80(6):1608-1613).
La ablación de la médula ósea es opcional. En algunas formas de realización, se puede realizar una ablación de la médula ósea parcial pero no completa previa al trasplante de médula ósea. En algunas formas de realización, la médula ósea se administra sin ablación de la médula ósea.
Es preferible que el número de células empleadas en el trasplante de médula ósea para el tratamiento de enfermedades del hueso y el cartílago exceda el número empleado normalmente para otros tratamientos. Se administra, en infusión, entre 3 y 10 veces la dosis normal de médula ósea por 100 kg de peso.
En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de células. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 3-7 administraciones a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones a lo largo de 5 días consecutivos.
En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 10^{7} y 10^{13} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 1-5 x 10^{8} y 1-5 x 10^{12} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de entre 1 x 10^{9} y 5 x 10^{11} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de 4 x 10^{9} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realiza una sola administración de 2 x 10^{11} células por 100 kg de peso.
En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 10^{7} y 10^{13} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 1-5 x 10^{8} y 1-5 x 10^{12} células por 100 kg de peso. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de entre 1 x 10^{9} y 5 x 10^{11} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de 4 x 10^{9} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan múltiples administraciones de 2 x 10^{11} células por 100 kg de peso a lo largo de 3-7 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 3-5 x 10^{9} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 4 x 10^{9} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 1-3 x 10^{11} células a lo largo de 5 días consecutivos. En algunas formas de realización, se realizan 5 administraciones de 2 x 10^{11} células a lo largo de 5 días consecutivos.
Ejemplos Ejemplo 1
Se emplearon células de una línea de ratón transgénico que expresan un mini-gen humano del colágeno I de forma tejido-específica para ver si las células precursores mesenquimales de médula que se expanden en cultivo sirven como precursores a largo plazo de hueso y otros tejidos conectivos tras su infusión intravenosa en ratones irradiados. El gen marcador consistía en un mini-gen delecionado internamente para la cadena pro\alpha1(I) del procolágeno I humano que origina la síntesis de cadenas pro\alpha1(I) acortadas (Khillian, J. S. y col., J. Biol. Chem. 266:23373-23379 (1991); Pereira, R. Y col., J. Clin. Invest. 91:709-716 (1983); y Sokolov, B. P. Y col., Biochemistry 32:9242-9249 (1993)). Las células que expresan el gen se obtuvieron a partir de una línea de ratón transgénico en la que el número de copias del mini-gen humano en relación con el gen endógeno del ratón era aproximadamente 100 a 1, y el estado de equilibrio de los niveles de mARN del mini-gen humano en relación con el mARN del gen endógeno del ratón era aproximadamente 0,5:1 en la mayoría de los tejidos.
Las células del donante provenientes de médula parcialmente enriquecida en precursores mesenquimales se prepararon mediante protocolos estándar (Friedenstein, A. J. y col., Exp. Hemat. 4:267-274 (1976); Castro-Malaspina, H. Y col., Blood 56:289-301 (1980); Piersma, A. H. Y col., Exp. Hematol. 13:237-243 (1985); Simmons, P. J. y Torok-Storb, B., Blood 78:55-62 (1991); Beresford, J. N. y col., J. Cell. Sci. 102:341-351 (1992); Liesveld, J. L. y col., Blood 73:1794-1800 (1989); Liesveld, J. L. y col., Exp. Hematol. 19:63-70 (1990); y Bennet, J. H. Y col., J. Cell. Sci. 99:131-139 (1991)). Brevemente, los extremos de los huesos largos de los ratones transgénicos se cortaron, y se extrajo la médula con una jeringuilla presurizada rellena de \alpha-MEM (Sigma) con un 10% de suero de ternera fetal (Atlanta Biologicals). Se plaquearon aproximadamente 10^{7} células nucleadas en frascos de cultivo de plástico de 175 cm^{2} en 25 ml de \alpha-MEM con un 10% de suero de ternera fetal. Tras 4 horas, se descartaron las células no adherentes cambiando el medio. Aparecieron focos con dos a cuatro células tipo fibroblasto en 2 a 3 días, y los focos crecieron hasta formar colonias casi confluentes en aproximadamente 1 semana. El rendimiento era aproximadamente 10^{7} células por frasco tras la digestión con tripsina. Por microscopía de contraste de fases, la mayoría de las células eran similares a fibroblastos, pero también se veían algunos macrófagos y adipocitos.
Se mezclaron aproximadamente 10^{5} de las células adherentes cultivadas con 6 x 10^{5} células no adherentes obtenidas incubando la médula de ratones normales durante 4 h en un frasco de 175 cm^{2} en las mismas condiciones que se emplearon para el aislamiento inicial de las células adherentes. La mezcla de aproximadamente 7 x 10^{8} células en 0,2 a 0,4 ml de \alpha-MEM con un 10% de suero de ternera fetal se inyectó en la vena de la cola de cada ratón receptor.
Ratones de ocho semanas de la misma línea consanguínea PVB/N se prepararon para recibir las células del donante mediante irradiación con un irradiador de ^{137}Cu (Atomic Energy of Canada, Ltd.). La unidad tenía un índice de dosis de 116 cG/min con una configuración del haz en paralelo y opuesto. Cada animal recibió 9,0 Gy en dos fracciones con un intervalo de 4 h (4,5 Gy + 4,5 Gy) (O'Hara, M.D. y col., Exp. Hemat. 19:878-881 (1991)). Una a 2 h tras la segunda fracción de radiación, la mezcla de células adherentes marcadas y células no adherentes normales se inyectó vía intravenosa. Los ratones control irradiados que no recibieron infusión de células murieron tras 10 a 13 días por fallo medular.
Para seguir el destino de las células del donante, se desarrollaron dos ensayos de PCR para el mini-gen COL1A1 humano y el gen COL1A1 endógeno del ratón. Con un ensayo de dos cebadores, los valores de la relación entre el gen humano y el de ratón eran lineales sobre un intervalo de entre aproximadamente 10^{-4} y 10^{-1} y, por lo tanto, de entre aproximadamente 10^{-4} y 10^{-1} células del donante por célula del receptor. Con el ensayo de tres cebadores, los valores eran lineales sobre un intervalo de entre aproximadamente 10^{-3} y 10^{+2} y, por lo tanto, de entre aproximadamente 10^{-5} y 1 células del donante por célula del receptor.
Ensayos en ratones irradiados tras un día sólo mostraron trazas de células del donante en médula, bazo, hueso, pulmón o cerebro (Tabla 1). Se observaron niveles ligeramente mayores a los siete días. A los 30 días y a los 150 días, la progenie de las células del donante suponían entre 2,0 y 12% de las células de la médula, bazo, hueso y pulmón (Tabla I). A los 150 días, también suponían entre 1,5 y 5,0% de las células del cartílago xifoides que se disecó, liberó de cualquier tejido mineralizado o fibroso y observó al microscopio. Aunque los valores medios parecían mostrar una disminución entre los meses 1 y 5, no hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores combinados de médula, bazo, hueso y pulmón entre los dos periodos de tiempo (Tabla I). Ensayos en ratones no radiados revelaron solamente niveles bajos de células del donante en los mismos puntos (< 0,0001 a 0,05%). El ensayo de PCR in situ en cortes de tejido pulmonar demostró que la progenie de las células del donante estaba uniformemente distribuida por el parénquima tanto de los alvéolos como de los bronquios.
Para confirmar que la progenie de las células del donante estaba presente en el cartílago, se aislaron condrocitos de cartílagos xifoides y articular por digestión a 37ºC toda la noche con 0,5 mg/ml de colagenasa bacteriana (Sigma) en DMEM. Los ensayos de PCR indicaron que la progenie de las células del donante suponía un 2,5% de los condrocitos aislados.
Para determinar si las células del donante se convertían en células mesenquimales funcionales en los tejidos que poblaban, se estudió la expresión del mini-gen humano del colágeno I, presente en las células del donante, por RT-PCR, en tejidos de los ratones receptores. En tres ratones estudiados a los 150 días, el mini-gen se expresaba en hueso, un tejido en el que más de la mitad de la proteína sintetizada es colágeno I. Se confirmó la expresión en hueso mediante un ensayo similar en células óseas aisladas del fémur y cultivadas durante 1 semana. La expresión del mini-gen del colágeno I era más variable en médula, bazo y pulmón, tejidos en los que la tasa de síntesis de colágeno I es menor que en el hueso. Tal y como se esperaba, el mini-gen no se expresó en cartílago, un tejido en el que aproximadamente la mitad de la proteína sintetizada es colágeno II pero en el que no hay síntesis de colágeno I. El mini-gen del colágeno I tampoco se expresó en cultivos de condrocitos provenientes de los ratones receptores que contenían el gen marcador y que sintetizaban colágeno II pero no colágeno I.
Informes anteriores han mostrado que ensayos de las células con marcadores citoquímicos o de mARN indicaron que las células sintetizaban colágeno I, colágeno III, fibronectina, fosfatasa alcalina y osteopontina, pero no tenían rasgos característicos de macrófagos, granulocitos, linfocitos T, linfocitos B o células endoteliales. Los resultados demuestran aquí que tras la inyección intravenosa en ratones irradiados, los cultivos expandidos de células adherentes pueblan de forma eficaz diversos tejidos conectivos. Los resultados también demuestran que las células sirven como verdaderas células precursoras para estos tejidos, puesto que expresan el gen marcador del colágeno I de forma dependiente de tejido, y fueron incorporadas de forma difusa en el parénquima mesenquimal del pulmón.
Ejemplo 2 Condiciones de cultivo y aislamiento de MSCs
Se han estudiado las condiciones para cultivar las MSCs de forma que se expandan pero mantengan su fenotipo tipo célula madre. La Tabla I muestra que el co-cultivo con trozos de hueso incrementó el número de células obtenidas al cabo de una semana. Al mismo tiempo, el co-cultivo con hueso disminuyó los niveles de fosfatasa alcalina (Apasa) en las células, una observación que sugiere que las células no se diferenciaron a osteoblastos. También se observó una disminución de los niveles de fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), una observación que sugiere que las células no se diferenciaron a osteoblastos. Se observaron efectos similares con cultivos secundarios de MSCs. Por lo tanto, los resultados sugieren que el co-cultivo con trozos de hueso puede proporcionar mejores condiciones para la expansión de MSCs. También, el medio de los trozos de hueso cultivados puede constituir una importante fuente de citoquinas y factores de crecimiento para la expansión de las MSCs en cultivo.
En experimentos relacionados, se ha visto que los cultivos secundarios de MSCs se pueden mantener durante largos periodos de tiempo. Las MSCs se pueden pasar en cultivo durante más de 4 meses, tripsinizándolas y volviendo a plaquearlas. Las células son increíblemente estables en cultivos en fase estacionaria. En un experimento, cultivos estacionarios se mantuvieron viables durante más de 4 meses aportando nutrientes aproximadamente una vez por semana. En otro experimento, las células se mantuvieron viables cuando, por descuido, se dejaron en un incubador sin aportar nutrientes durante un mes.
Transfección estable de MSCs con un vector retroviral
Para obtener virus para la infección de MSCs, el vector retroviral LNCZ (Miller, A.D. y Rosman, G.J. (1989) Biotechniques 7, 980-990) se modificó de forma que el promotor del citomagelovirus (pCMV) conducía la expresión del gen lacZ (Fig. 1). El vector se transfectó de forma estable en una línea murina de células empaquetadoras de virus anfotrópicos (PA317). Los clones productores, constitutivamente, de virus se aislaron por selección con G418, y se empleó el sobrenadante de los clones para infectar las MSCs. Los cultivos primarios de MSCs (de 3 días) se infectaron durante tres días consecutivos con sobrenadante fresco proveniente de la línea productora con el mayor título. La tinción de las células 5 días más tarde indicó que aproximadamente 15-20% de las células por regla general expresaban el gen lacZ. Diversos cultivos de las células infectadas se seleccionaron con G418 (concentración activa de 0,4 \mug/ml) durante 5 días. La mayoría de las células recuperadas seguían expresando el gen lacZ. También se construyeron modificaciones de LNCZ de forma que la expresión del gen lacZ era conducida por el promotor del gen COL1 A1 y el promotor del gen COL2 A1 (pCOL2A1). La expresión del gen lacZ se obtuvo con éxito en cultivos primarios de MSCs con ambas construcciones.
Sustitución de las células óseas en ratones transgénicos por MSCs normales
Se infundieron MSCs de ratones normales en los ratones transgénicos que expresaban altos niveles del gen COL1 A1 mutado (Tablas II y III). Un mes tras la infusión de las MSCs normales en los ratones con osteogénesis imperfecta (OI) (Tabla II), la progenie de las células del donante constituía entre 10 y 45% de las células del hueso en el ratón receptor que había sido irradiado con la dosis máxima tolerada de rayos X (700 centi-Gray o cGy). Se obtuvieron valores similares con ratones irradiados con la mitad de la dosis máxima tolerada de rayos X (350 cGy). Sin embargo, la reducción a una cuarto de la dosis (175 cGy) redujo los valores en cuatro ratones a 0%, 5%, 10% y 40%. Se obtuvieron resultados similares cuando se infundieron a los ratones transgénicos OI grandes cantidades de células de médula ósea total de la que no se extrajeron las MSCs (Tabla III).
En cinco ratones receptores en los que se examinó la síntesis de cadenas pro\alpha1(1) (Tablas II y III), la sustitución de las células óseas del receptor por MSCs normales de un donante se acompañó de un incremento de la relación entre las cadenas normales de pro\alpha1(1) y las cadenas mutadas de pro\alpha1(1) en el hueso. Por lo tanto, la sustitución por células normales se acompañó de los cambios esperados en los niveles de proteína.
Ejemplo 3 Expresión a largo plazo de los genes humanos de hGH, factor IX u Ob en MSCs transfectadas de forma estable
Se aíslan MSCs de ratones y se cultivan en las condiciones descritas por Pereira, R.F. y col., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4857-4861. Las MSCs se infectan con vectores retrovirales o se transfectan con ADN desnudo para obtener clones que expresen los genes de la hormona del crecimiento humana (hGH), la proteína humana de la obesidad (Ob), o el gen del factor IX humano. Como se ha introducido con éxito un gen lacZ en MSCs de ratón con un vector retroviral, se emplean variantes del mismo vector. Al mismo tiempo, las MSCs se transfectan de forma estable por electroporación (Andreason, G.L y Evans, G.A. (1988) Biotechniques 6, 650-660 y Toneguzzo, F., y col., (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 703-706), lipofectamina e inyección nuclear (Mercer, W.E., y col., (1992) en: Antisense Strategies, Ann. N. Y. Acad. Sci. Biol. 660, 209-218) de forma que se pueden emplear los grandes genes endógenos. Además, se evitan algunas de las potenciales desventajas de los retrovirus empleando un procedimiento alternativo de introducción.
Las condiciones estándar para el aislamiento y cultivo son las siguientes: la médula total se obtiene de las tibias y fémures de ratones PVB/N de 6 a 10 semanas, cortando los extremos de los huesos se extrae la médula con una jeringuilla que contiene 1 a 2 ml de \alphaMEM frío con un 10% de suero bovino fetal (FBS). Las células de la médula recogidas se disgregan mezclándolas con suavidad y se cuentan en un contador automático (Coulter modelo ZM). Se plaquean de 5 x 10^{6} a 5 x 10^{7} células nucleadas en 25 ml de \alphaMEM y 10% de FBS en frascos de cultivo de 75 cm^{2}. Tras 4 horas o 3 días, las células no adherentes se eliminan cambiando el medio. Las células adherentes se expanden como cultivos primarios durante 10 a 12 días añadiendo nutrientes aproximadamente cada 4 días. Las células se recuperan por digestión con 0,25% de tripsina y EDTA 1 a 5 mM durante 5 min a 37ºC seguido de un suave raspado. Las células se diluyen con \alphaMEM con 10% de FBS y se vuelven a plaquear a una densidad de entre 3 x 10^{4} y 1 x 10^{5} células en placas de 6 pocillos de 9,5 cm^{2}. En estas condiciones, las células se duplican en 19 a 22 horas. Se añaden nutrientes a los cultivos secundarios aproximadamente cada 4 días, se tripsinizan y se vuelven a plaquear en las mismas condiciones.
Preparación de las construcciones génicas
El vector retroviral LNCX se emplea como construcción parental. Se emplean los sitios de clonaje adecuados para preparar las construcciones modificadas pRSV-lacZ, pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ y pCOL2-lacZ (Fig. 1). El promotor pCOL1 es un fragmento de 1,4 kb que contiene 476 pb del promotor, el primer exón y la mayoría del primer intrón del gen COL1A1 humano. Se ha visto que el promotor expresa, en ratones transgénicos, una forma sin promotor del gen COL2A1 de una forma altamente específica de tejido y desarrollo (Sokolov, B.P. y col., (1995) J. Biol. Chem. 270, 9622-9629). El promotor COL2A1 es un fragmento de 1 kb del gen del COL2A1 humano (Ala-Kokko, L., y col., (1991) J. Biol. Chem. 266, 14175-14178) que confiere un expresión tejido-específica (Bradham, D.M., y col., (1994) J. Cell Physiol. 158, 61-68). El gen lacZ se sustituye por el gen hGH (Nichols Laboratories); el gen OB (Considins, R.V., y col., (1995) J. Clin. Invest. 95, 2986-2988) o el gen del factor IX humano (Genetic Therapy, Inc.).
Uso del vector retroviral Líneas celulares productoras de retrovirus
Para establecer líneas celulares productoras, se emplearon células murinas empaquetadoras de retrovirus anfotrópicos PA317. Las células se transfectaron al 20% de su confluencia en recipientes de 100 mm por el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico (Promega) empleando 15 \mug de plásmido de ADN que se encontraba linealizado por digestión con ScaI que corta en la región pBR322 del vector retroviral. Un día tras la transfección se añadió G418 (GIBCO/BRD) al medio en una concentración activa de 1 mg/ml. Aparecieron colonias resistentes a la neomicina de 7 a 10 días tras la selección y se aislaron mediante clonaje de tipo mecánico. Los clones se expandieron y se probó la capacidad de clones individuales para expresar lacZ tiñendo directamente pocillos duplicados. Los títulos de virus producidos por las células positivas se determinaron añadiendo solamente 50 \mul de medio a las células tumorales humanas HT-1080 en confluencia al 20% en placas de 6 pocillos con 3 ml de medio por pocillo y en presencia de
4\mug/ml de polibreno. El título se evaluó determinando el número de células HT-1080 que se tiñeron positivamente para la expresión del gen lacZ. Por regla general, el título fue de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{6}.
Infección retroviral de MSCs de ratón
Se prepararon cultivos primarios de MSCs de ratón como se ha descrito arriba. Tras 3 días, las células no adherentes de la médula se descartaron y se añadió medio nuevo. Las células se infectaron entonces con retrovirus en presencia de 4 \mug/ml de polibreno añadiendo ¼ del volumen de sobrenadante fresco proveniente de las células productoras transfectadas de forma estable que tenían el mayor título de producción de retrovirus. La infección se repitió dos días sucesivos más. Las células se tiñeron entonces directamente para ver la expresión de lacZ o se dividieron en mayores recipientes y seleccionaron con 0,4 mg/ml de G418 (concentración activa). Aproximadamente entre 15 y 20% de los cultivos primarios fueron positivos para lacZ y la mayoría de las células que sobrevivieron a la selección por G418 eran positivas para lacZ.
Transfección con lipofectamina
Los cultivos primarios de MSCs se crecieron durante 10 días en \alphaMEM con un 10% de FBS. Tras tripsinizar y raspar suavemente las células, éstas se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 10^{5} células por pocillo. Las células se crecieron durante 2 días, se lavaron entonces 2 veces con PBS y se incubaron con un complejo de ADN-lipofectamina. El complejo de ADN-lipofectamina se preparó como sigue: se mezclaron 6 \mul de lipofectamina (GIBCO/BRL) con 1 \mug de ADN LINCZ en 200 \mul de \alphaMEM, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se añadió a un pocillo de una placa de 6 pocillos con MSCs en 800 \mul de \alphaMEM. Tras 6 h de incubación a 37ºC, se sustituyó el complejo de ADN-lipofectamina por 2 ml de \alphaMEM con un 10% de FBS. Las células se tiñeron para lacZ o se seleccionaron con G418 tras 18 h de incubación en medio con FBS. Se obtuvieron clones positivos, pero crecieron lentamente, aparentemente porque la densidad celular era demasiado baja tras la selección con G418. Para evitar esta situación, se pueden emplear tres estrategias diferentes: (a) las células se plaquean en mayor densidad; (b) se colocarán insertos para cultivo celular sobre los clones que sobrevivan, de forma temprana en el proceso de selección, y se pondrán en los insertos MSCs frescas o trozos de hueso (véase Tabla I) diariamente para proporcionar los factores celulares necesarios para estimular el crecimiento; (c) a la vez que la selección con G418 está matando muchas células no transfectadas, los cultivos se vuelven a sembrar con MSCs infectadas con una variante del virus LNCX (Fig. 1) en la que el gen lacZ se sustituye con un gen de selección de la timidín quinasa. Por lo tanto, las MSCs transfectadas de forma estable con retrovirus se emplean para proporcionar las citoquinas, factores de crecimiento e interacciones necesarias requeridas para el crecimiento inicial de las MSCs transfectadas durante la selección con G418. Las células infectadas se pueden entonces eliminar por selección negativa con ganciclovir.
Procedimientos de transfección Inyecciones nucleares
Las inyecciones nucleares son muy eficientes como medio de transfección de algunas células. Las células se plaquearon en recipientes de 60 mm con un cubreobjetos de 22 x 22 mm marcado con un círculo para delinear el área de microinyección. Las células se incubaron en medio con 0,1% de CS durante 5 días para inducir una parada de crecimiento antes de la microinyección. En estas condiciones entre 8 y 15% de las células incorporaron [^{3}H]timidina durante un marcaje continuo de 24 h entre los días 5 y 6. La microinyección se realizó con un microscopio invertido Axiovert de Zeiss equipado con un microinyector y micromanipulador de Eppendorf que emplea capilares de vidrio femtotips adquiridos en el mercado (Eppendorf). En todas las células dentro del área delineada del cubreobjetos (generalmente 100-200) se microinyectó en el núcleo ADN a concentraciones que variaban entre 0,01 y 10 \mug/\mul en tampón Tris 10 mM (pH 7,6). Las células inyectadas se expandirán y probarán como se describe arriba.
Electroporación
Las MSCs se tratan con tripsina y EDTA 1 a 5 mM durante 5 min a temperatura ambiente y se recogen entonces raspándolas. Las células se centrifugan a 4,000 x g durante 10 min, y se lavan dos veces resuspendiendo el pellet en PBS frío. Las MSCs se resuspenden a 2 x 10^{6} células en 0,8 ml y se hacen alícuotas en cubetas de electroporación (espacio de 0,4 cm). Las células se incuban 10 min en hielo, se añade el ADN a la suspensión (5-50 \mug), y las células se enfrían durante 10 min más. La suspensión se electropora entonces con un aparato comercial (BioRad Gene Pulser; modelo 1652076) a un campo de fuerza determinado de forma empírica que produce el mayor porcentaje de células que retienen el ADN exógeno añadido. Para determinar el campo de fuerza apropiado para las MSCs, se realizaron titulaciones de 0,25 a 2,5 kv/cm. La eficiencia de la electroporación se monitorizó introduciendo el gen lacZ (vector LNCZ) y tiñendo después las células 48 a 72 h tras la electroporación.
Ensayos hGH
La expresión del gen de la hGH se monitorizó ensayando el medio de clones de células crecidas en placas de 6 pocillos mediante un ensayo de inmunoabsorción ligada a una enzima con un kit disponible en el mercado (GIBCO/BRL). En este ensayo, se añaden 0,1 ml de tampón diluyente 2 x por pocillo de una placa microtiter. Tras 5 min, se añaden 0,1 ml de la muestra en ensayo y la placa se incuba a 37ºC durante 30 min. Los pocillos se lavan 5 veces y se añaden 0,2 ml de anticuerpo primario por pocillo. Las muestras se incuban a 37ºC durante 30 min, y se lavan 5 veces. Se añaden entonces 0,2 ml de tampón sustrato que contiene el sustrato O-fenilendiamina. Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 30 min y la reacción se para añadiendo 0,1 ml de ácido sulfúrico 2 N. Se mide la absorbancia de la muestra a 490 nm.
Proteína Ob
Se determina la expresión del gen OB en las células mediante un radioinmunoensayo proteico del medio de las células. El anticuerpo primario para la proteína OB humana se produjo en ratones contra la proteína recombinante sintetizada en un sistema de expresión de E. coli y se purificó para su homogeneización. La proteína humana es altamente homóloga a la proteína de ratón y, por lo tanto, los anticuerpos anti-humano deberían reaccionar de forma cruzada con la proteína de ratón. Si no lo hacen, el cADN corto de ratón (619 nt) se expresa en E. coli, la proteína se purifica y se preparan los anticuerpos. De forma alternativa, se adquieren péptidos sintéticos con la secuencia de ratón y se emplean para preparar estos anticuerpos. Para el ensayo, se radiomarcó la proteína Ob humana recombinante con ^{125}Yodo por el método de Bolton-Hunter seguido de filtrado y purificación en gel empleando Sephadex G-25. La actividad específica obtenida fue 30 \muCi/\mug. Las muestras del ensayo (0,2 ml) se preincubaron con un antisuero primario (dilución 1:2000) en tampón fosfato salino que contenía Triton X-100 0,1% durante 16 h a 4ºC en un volumen total de 0,4 ml. Se añadió entonces la proteína ^{125}I-Ob (30,000 cpm transportadas en 100 \mul) y la incubación continuó 24 h más. La proteína Ob unida (12 \pm 1%; unión inespecífica 1,4 \pm 0,1%) se inmunoprecipitó añadiendo 0,1 ml suero de oveja anti-IgG de conejo (Antibodies, Inc., Davis, CA), 0,1 ml de suero normal de conejo (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), y 0,1 ml de polietilenglicol al 10%. Los tubos se centrifugaron durante 15 min (2200 rpm), y el marcaje no unido se decantó y el pellet se contó en un contador gamma Packard 5000 (Downers Grove, IL). La concentración de proteína Ob en las muestras desconocidas se calculó empleando el modelo logístico de cuatro parámetros de Rodbard. El límite de detección de este ensayo es 0,39 ng/ml. La varianza intrínseca al ensayo es 11,6% a 12 ng/ml con una varianza entre ensayos de 20,8% a 13,1 ng/ml.
Factor humano IX
La expresión del gen del factor humano IX se determinará por un ELISA disponible en el mercado (American Bioproducts Company) en condiciones similares a las que se emplean para la determinación de hGH (arriba). Tal como informaron Smith y col., (74), la curva patrón variaba entre 1 y 50 ng/ml^{-1} y el límite de sensibilidad era de 1 ng/ml^{-1}. El ensayo no reaccionó de forma cruzada con el factor IX de ratón.
Ejemplo 4 Expresión mantenida de los tres genes en niveles fisiológicamente importantes por infusión sistémica de MSCs transfectadas de forma estable en ratones
Experimentos con los ratones transgénicos OI (Tablas II y III) han demostrado que las MSCs cultivadas pueden servir como precursores, tipo célula madre, de hueso, cartílago y otros tejidos mesenquimales tras su infusión sistémica. Por lo tanto, las MSCs que expresan hGH, la proteína Ob o el factor IX se infunden en ratones irradiados y no irradiados para evaluar la expresión sostenida de los genes in vivo.
Infusión de MSCs
Inicialmente, las MSCs se infunden en los ratones en las mismas condiciones que las que se describen en la Tabla II (ratones de 3 semanas: radiación con 300 ó 700 Gray; inyección vía intraperitoneal; 1 x 10^{6} MSCs; y 2 x 10^{8} células de médula total). Además, se compara la infusión intravenosa con la intraperitoneal; y se emplean niveles más bajos de radiación de rayos X. También, las células se infunden en embriones por sección Cesárea. En ensayos preliminares, se inyectaron 50 \mul de 5 x 10^{4}ES en el amnios de siete embriones de 13 días; 6 de 7 se desarrollaron como crías viables. Por lo tanto, la inyección intrauterina de MSCs es factible.
Curvas de crecimiento
La expresión eficaz de hGH in vivo debería incrementar la tasa de crecimiento de los ratones y la expresión de la proteína Ob debería inducir inanición. Por lo tanto, el peso y el tamaño de los ratones tratados y de los controles provenientes de la misma camada se monitorizan.
Ensayo para la expresión de genes
La sangre se obtiene del plexo retroobital de los ratones al cabo de 1 semana, 1 mes, 3 meses, 5 meses, 10 meses, y 20 meses tras la infusión de las MSCs. La hGH y el factor IX se determinan por ELISA, y la proteína Ob se determina por radioinmunoensayo. Además, si se obtienen por ELISA incrementos medibles de factor IX humano, el procedimiento descrito por Smith, T.A.G., y col., (1993) Nature Genet. 5 397-402, para determinar el factor IX humano con actividad biológica. En este procedimiento, el factor IX humano se captura primero en un pocillo de una placa microtiter con el anticuerpo monoclonal, BGIX1, y se activa entonces por el factor XIa. El factor IX activo, en combinación con el factor VIII, convierte el factor X en Xa. El factor Xa corta el sustrato cromogénico, S2765, dando lugar a un producto amarillo. Las placas microtiter tapizadas con BGIX1 y el factor VIII se adquirieron en Elcatech, Inc. (Winston-Salem, NC). El factor XIa se adquirió en Enzyme Research Labs, Inc. (South Bend, IN). El factor X, la solución de fosfolípidos, S-2765, y el inhibidor de la trombina, 1-2581, se adquirieron en Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). Se prepararon cuatro tampones: A, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA 1%; pH 7,5; B, Tris 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, gelatina 10 mg/ml^{-1}, pH 7,6; C, Tris 50 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,5; D, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,4. La mezcla de la reacción factor VIII/X se preparó en el momento mezclando cantidades iguales de los stocks siguientes: factor VIII, 5 U ml^{-1} en tampón A, factor X, 1 U ml^{-1} en tampones; 1-2581, 34 \mug/ml^{-1} en tampón A; CaCl_{2}, 25 mM en agua; y fosfolípidos. Las muestras de plasma se diluyeron en tampón A y se añadieron 100 \mul a cada pocillo de la placa microtiter. La placa se incubó durante 90 min a temperatura ambiente y se lavó 5 veces con buffer B. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de factor XIa (2 \mug/ml^{-1} en tampón C). Tras 30 min a 37ºC, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de S2765 (0,5 mM en tampón D) y la placa se incubó 10 min a temperatura ambiente antes de parar la reacción añadiendo ácido acético hasta una concentración final de 10%. Se determinaron las absorbancias a 405 nm con un lector de microplacas de Bio-Rad. La curva patrón, preparada con diluciones de una mezcla de plasmas humanos normales, fue lineal de 3 a 25 ng/ml^{-1}. El ensayo no reaccionó de forma cruzada con el factor IX de ratón. Niveles de factor IX de 250 ng por ml o el 5% de lo normal se consideran generalmente terapéuticos y de 100 a
150 ng/ml se consideran beneficiosos.
\newpage
TABLA I Condiciones para el crecimiento de cultivos primarios y secundarios de MCSs 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 MSCs \+ Condiciones de cultivo \+ Células por pocillo \+
Apasa ^{a}  \+  TRAP ^{a} \cr  \+ \+ \+ (mmol min/mg) \+ (mmol
min/mg)\cr  \+ \+ x10 ^{5} \+\+\cr  Primarios \+ Estándar ^{a}  \+
2,0 \+ 426 \+ 144\cr  \+ Co-cultivo ^{b}  \+ 6,41 \+
22,3 \+ 102\cr  \+ Co-cultivo ^{c}  \+ 6,94 \+ 42,0
\+ 105\cr  \+ (Matrigel)\+\+\+\cr  Secundarios ^{d}  \+ Estándar \+
1,33 \+ 2052 \+ 75\cr  \+ Co-cultivo \+ 7,40 \+ 362
\+ 60,6\cr  \+ Co-cultivo \+ 5,08 \+ 506 \+ 59,2\cr 
\+
(Matrigel)\+\+\+\cr}
^{a}Células de médula total (20 x 10^{6}) de ratones de 6 semanas se cultivaron en pocillos de 9,5 cm^{2} en 2 ml de \alphaMEM con 10% de FCS. Las células no adherentes se eliminaron el día 3 y la incubación continuó con medio nuevo hasta el día 7. Se determinaron la Apasa y la TRAP tal como se describe en la referencia 55.
^{b}Co-cultivo con trozos de hueso (la mitad fémur y la otra mitad tibia) en insertos de cultivo celular (23 mm; tamaño de poro 3 \mum; Becton Dickinson).
^{c}Lo mismo que b, con insertos recubiertos con Matrigel.
^{d}Los cultivos primarios se despegaron en el día 10 con 0,25% de tripsina y EDTA 1 mM durante 5 min a 37ºC seguido de un raspado suave. Las células provenientes de un pocillo (2 x 10^{5}) se diluyeron 1:4 y se cultivaron en pocillos de 9,5 cm^{2} durante 7 días cambiando el medio en los días 3 y 6.
^{e}Las actividades de Apasa (20,54) y TRAP (55) eran por mg de proteína total.
TABLA II Experimentos con (a) ratones transgénicos como receptores; (b) MSCs normales como células donantes; y (c) dosis decreciente de rayos X
Ratones Receptores Rayos X Células Sust. Dism.
(cG) Donantes^{a} medular cadenas
MSCs Médula mes 1 (%) pro\alpha1 (1)
compl. mutadas
Transgénico 700 0,7x10^{6} 15x10^{6} 10 a 45% 26 a 73%
(3 sem) (N)^{a} (TG)^{ab} (n=1) (n=2)
Transgénico 350 1,2x10^{6} 2x10^{6} 28 a 60%
(3 sem) (N) (TG) (n = 4)
Transgénico 175 1,2x10^{6} 2x10^{6} 0 a 40%
(3 sem) (N) (TG) (n = 4)
^{a}(N), normal; (TG), transgénico.
^{b}MSCs extraídas de médula ósea total antes de su infusión e incubadas en recipientes de cultivo de plástico durantes 4 h a 37ºC.
\newpage
TABLA III
Experimentos con (a) ratones transgénicos como receptores; (b) células de médula total como células donantes (incremento de 10 veces); y (c) dosis decreciente de rayos x
Ratones Rayos Células Sust. Dism.
Receptores X (cG) Donantes^{a} medular cadenas
MSCs Médula mes 1 (%) pro\alpha1 (1)
compl. mutadas
Transgénico 700 5x10^{6} 20 a 38% 21 a 24%
(3 sem) (N)^{a} (n=3) (n=2)
Transgénico 350 16x10^{6} 50 a 78%
(3 sem) (N) (n=3) (n=3)
Transgénico 175 5x10^{6} 22 a 45%
(3 sem) (N) (n=4)
^{a}(N) médula total de ratones normales sin ningún tratamiento para extraer las MSCs.

Claims (8)

1. El uso de células estromales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que sufre una enfermedad, trastorno o dolencia caracterizado por un gen mutado, no funcionante o expresado por debajo de lo normal que da como resultado un defecto en hueso, cartílago o pulmones de dicho paciente, en el que:
(i) dichas células estromales se han obtenido de la médula de dicho paciente;
(ii) dichas células estromales se transfectan con una copia normal de dicho gen que está ligado funcionalmente a elementos reguladores funcionales; y
(iii) dichas células estromales son adecuadas para su infusión intravenosa; y
(iv) se confiere un efecto terapéutico en la localización de dicho defecto.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho paciente es sometido a una ablación de la médula ósea previa a la administración de dichas células estromales.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho medicamento comprende además células precursoras hematopoyéticas de una muestra de médula ósea de un donante que no sufre una enfermedad, trastorno o dolencia caracterizado por un defecto en hueso, cartílago o pulmón, y que es singénico con dicho paciente.
4. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha células estromales se van a administrar sin células precursoras hematopoyéticas.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas células estromales se transfectan con una construcción génica que comprende un gen de la timidín quinasa del virus herpes, en la que dicho gen está ligado funcionalmente a secuencias reguladoras y se expresa en dichas células estromales.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho defecto en hueso es osteogénesis imperfecta u osteoporosis.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el defecto en cartílago es condrodisplasia u osteoartritis.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el defecto en pulmón es fibrosis quística.
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