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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Implantat, das isolierte Stromazellen
umfasst, Behälter,
die isolierte Stromazellen, die mit exogener DNA transfiziert sind,
umfassen, ihre Verwendung für
die Behandlung von Individuen, die an Zuständen leiden, die durch das
Verabreichen oder das Abgeben von vorteilhaften Proteinen behandelt
werden können.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zusätzlich zu
hämatopoietischen
Stammzellen enthält
Knochenmark „Stromazellen", die mesenchymale
Vorläuferzellen
sind (Frisedenstein, A. J. of al., Exp. Hemat. 4: 267-274 (1976),
die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist), die durch ihre Adhärenzeigenschaften
charakterisiert sind, wenn Knochenmarkszellen entfernt und auf Plastikschalen
gegeben werden. Innerhalb von ca. vier Stunden adhärieren die
Stromazellen an das Plastik und können so durch das Entfernen
von nicht-adhärierten
Zellen von dem Schälchen
isoliert werden. Diese Knochenmarkszellen, die fest an Plastik adhäriert sind,
wurden umfassend untersucht (Castro-Malaspina, H. et al., Blood
56: 289-301 (1980); Piersma, A. H. et al, Exp. Hematol 13: 237-243
(1985); Simmons, O. J. und Torok-Storb, B., Blood 78: 55-62 (1991);
Beresford, J. N. et al., J. Cell. Sci. 102: 341-351 (1992); Liesveld,
J. L. et al., Blood 73: 1794-1800 (1989); Liesveld, J. L. et al.,
Exp. Hematot. 19: 63-70 (1990); und Bennett, J. H. et al., J. Call.
Sci. 99: 131-139 (1991)). So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „adhärente Zellen" Stromazellen, und
der Begriff „nicht-adhärente Zellen" bedeutet hämatopoietische
Vorläuferzellen.
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Es
wird angenommen, dass Stromazellen in der Bildung der Mikroumgebung
mit dem Knochenmark in vivo teilnehmen. Wenn sie isoliert sind,
sind Stromazellen anfänglich
ruhend, aber sie beginnen schließlich, sich zu teilen, so dass
sie in vitro kultiviert werden können.
Erweiterte Zahlen von Stromazellen können etabliert und aufrechterhalten
werden. Stromazellen wurden verwendet, um Kolonien von fibroblastischen
adipozytischen und osteogenen Zellen zu bilden, wenn sie unter geeigneten
Bedingungen kultiviert werden. Wenn die adhärenten Zellen in der Anwesenheit
von Hydrocortison oder anderen selektiven Bedingungen kultiviert werden,
können
Populationen hinsichtlich hämatopoietischen
Vorläufern
oder osteogenen Zellen erhalten werden (Carter, R. F. et al., Blood
79: 356-364 (1992) und Bienzle, D. of al., Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 91: 350-354 (1994)).
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Es
gibt einige Beispiele für
die Verwendung von Stromazellen. Das europäische Patent
EP 0 381 490 offenbart Gentherapie
unter Verwendung von Stromazellen. Insbesondere ist ein Verfahren
zur Behandlung von Hämophilie
offenbart. Stromazellen wurden verwendet, um fibröses Gewebe,
Knochen oder Knorpel, wenn sie in selektive Gewebe in vivo implantiert
werden, zu bilden (Ohgushi, H. et al., Acte. Orfhop. Scand. 60:
334-339 (1989); Nakahara, H. et al., J. Orfhop. Res. 9: 465-476 (1991); Niedzwiedski,
T. et al., Biomaterials 14: 115-121 (1993); und Wakitani, S. et
al., J. Bone & Surg.
76A: 579-592 (1994)). In einigen Berichten wurden Stromazellen verwendet,
um Knochen oder Knorpel in vivo zu bilden, wenn sie subkutan zusammen
mit einer porösen
Keramik (Ohgushi, H. et al. Acta. Orthop. Scand. 60: 334-339 (1989)),
intraperitoneal in eine Diffusionskammer (Nakahara, H. et al., J.
Orfhop. Res. 9: 465-476 (1991)), perkutan in einem chirurgisch induzierten Knochendefekt
(Niedzwiedski, T. et al., Biomaterials. 14: 115-121 (1993)), oder
innerhalb eines Kollagen-Gels transplantiert wurden, um einen chirurgischen
Defekt in einem Gelenkknorpel zu reparieren (Wakitani, S. et al., J.
Bone & Surg.
76A: 579-592 (1994)). Piersma, A. H. et al., Brit. J. Hematol. 54:
285-290 (1983) offenbaren, dass sich nach intravenöser Knochenmarkstransplantation
die Fibroblasten koloniebildenden Zellen, die das hämatopoietische
Stroma ausmachen, festsetzen und in dem Knochenmark des Wirts verbleiben.
Stewart et al. (Blood 81: 2566-2571 (1993)) beobachteten kürzlich,
dass ungewöhnlich
große
und wiederholte Verabreichungen von Gesamtknochenmarkszellen zur
Langzeit-Verpflanzung
von hämatopoietischen
Vorläufern
in Mäusen
führen,
die noch keine Markablation bzw. Markablösung durchgemacht haben. Außerdem verwendeten
Bienzle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 350-354 (1994))
erfolgreich Langzeitknochenmarkskulturen als Spenderzellen, um dauerhaft
hämatopoietische
Zellen in Hunden ohne Marksablation zu besiedeln. In einigen Berichten
wurden Stromazellen entweder als Zellen verwendet, die eine Mikroumgebung
für die
Kultur von hämatopoietischen
Vorläufern
etablieren (Ankelsaria, PNAS USA 84: 7681-7685 (1987)) oder als
eine Quelle einer angereicherten Population von hämatopoietischen
Stammzellen (Kiefer, Blood 78(10): 2577-2582 (1991)).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Implantat-Vorrichtung,
umfassend einen Behälter mit
mindestens einer Membranoberfläche,
wobei der Behälter
darin enthaltene Knochenmarks Bindegewebszellen, die ein Genkonstrukt
umfassen, immunologisch isoliert, wobei das Genkonstrukt eine Nukleotidsequenz,
die ein vorteilhaftes Protein kodiert, operativ mit regulatorischen
Elementen verbunden, die in der Bindegewebszelle wirksam sind, umfasst.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUR
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1 zeigt
schematisch die retroviralen Konstrukte pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ und
pCOL2-lacZ. Die Kassetten der Genkonstrukte sind: LTR-Neo-Promotor-LacZ-LTR.
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2 ist
eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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So
wie hier verwendet, werden „Stromazellen", „koloniebildende
Fibroblasten", „Markstromazellen", „adhärente Zellen" und „MSCs" austauschbar verwendet
und betreffen die kleine Fraktion von Zellen im Knochenmark, die
als Stammzellähnliche
Vorläufer
von Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten dienen können, und
die aus Knochenmark durch ihre Fähigkeit,
an Plastikschalen zu adhärieren,
isoliert werden können. Stromazellen
können
von irgendeinem Tier abgeleitet sein. In einigen Ausführungsformen
sind die Stromazellen von Primaten, vorzugsweise Menschen, abgeleitet.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind" Krankheiten, Störungen und Zustände, in
denen defekte Gene und/oder unzureichende Genexpression ursächlich mit
der Erkrankung oder den Symptomen verknüpft ist. Individuen, die irgendeine/n von
mehreren gut bekannten Erkrankungen, Störungen oder Zuständen aufweisen,
die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, können vom Fachmann identifiziert
werden. Beispiele von Erkrankungen, Störungen und Zuständen, die
durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf, Wachstumshormonmangel, Diabetes, Adenindesaminasemangel, Hämophilie
A und Hämophilie
B. Die Verfahren und Mittel zum Diagnostizieren jedes der Zustände sind
gut bekannt.
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So
wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Erkrankung, Störung oder
Zustand, gekennzeichnet durch einen Knochen-, Knorpel- oder Lungendefekt" Erkrankungen, Störungen und
Zustände,
die durch eine genetische Mutation in einem Gen verursacht werden,
das von Knochenzellen, Zellen, die Knorpel bilden, oder Lungenzellen
exprimiert werden, so dass eine der Wirkungen einer solchen Mutation
durch eine abnormale Struktur und/oder Funktion jeweils des Knochens,
des Knorpels und der Lungen manifestiert wird.
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So
wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Erkrankung, Störung oder
Zustand, gekennzeichnet durch einen Defekt in der Dermis, den Blutgefäßen, dem
Herzen und der Niere" Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die durch eine genetische Mutation in einem Gen verursacht werden,
das durch Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Niere
exprimiert wird, so dass sich eine der Wirkungen einer solchen Mutation
in einer abnormalen Struktur und/oder Funktion jeweils der Dermis,
der Blutgefäße, des
Herzens und der Niere manifestiert. Beispiele von Erkrankungen,
Störungen
und Zuständen,
die durch einen Defekt in der Dermis gekennzeichnet sind, schließen Verbrennungen,
Wundliegen und diabetische Geschwülste ein.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die durch einen Gendefekt eines Gens gekennzeichnet sind, das ein
segregiertes Protein kodiert" Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, in dem das Gen, welches
ein defektes Gen ist oder unzureichend exprimiert wird, ein Protein
kodiert, das normalerweise segregiert wird.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die mit vorteilhaften Proteinen behandelt werden können" Erkrankungen, Störungen und
Zustände,
die durch die Anwesenheit eines Proteins, das die Ursachen und/oder
Symptome, welche die Erkrankung, die Störung oder den Zustand kennzeichnen,
gelindert, verringert, verhindert werden oder die Linderung, die
Verringerung oder die Verhinderung verursacht, behandelt oder verhindert
werden können.
Erkrankungen, Störungen
und Zustände,
die durch solche Proteine behandelt werden können, schließen Erkrankungen,
Störungen
und Zustände
ebenso ein, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, wie jene,
die nicht durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, aber die dennoch
durch die Anwesenheit eines Proteins, das die Ursachen und/oder
Symptome, welche die Erkrankung, die Störung oder den Zustand kennzeichnen,
lindert, verringert, verhindert oder die Linderung, die Verringerung
oder die Verhinderung verursacht, behandelt oder verhindert werden
können.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „immunologisch
isoliert", „immunologisch
geschützt", „immunologisch neutralisiert" und „eine Weise,
die sie physikalisch aus dem Immunsystem des Empfängers isoliert" die Verkapselung,
die Eingrenzung und andere physikalische Trennung einer implantierten
Zelle aus dem Körper,
in den sie implantiert ist, so dass die Zelle nicht gegenüber dem
Immunsystem des Körpers
ausgesetzt ist und nicht durch das Immunsystem des Körpers isoliert
werden kann, so dass Zellen, die immunologisch isoliert sind, in
einer Weise verabreicht werden, die sie physikalisch von dem Immunsystem
des Empfängers
isoliert. Beispiele von immunologischer Isolierung schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf, gut bekannte Techniken und Vorrichtungen, wie Mikroverkapselung,
bioverträgliche
Matrizes, Diffusionskammern, implantierbare Kartuschen bzw. Kassetten,
Implantat-Vorrichtungen mit Membrananordnungen und andere Behälter mit Membranen.
Es ist bevorzugt, dass Zellen immunologisch durch ihre Aufrechterhaltung
in Implantat-Vorrichtungen isoliert sind.
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So
wie hier verwendet, werden „vorteilhaftes
Protein" und „heterologes
Protein" austauschbar
verwendet und bedeuten 1) Proteine, die das Protein kompensieren
können,
das von defekten Genen kodiert und/oder durch unzureichende Genexpression
gebildet wird, die ursächlich
mit der Erkrankung oder den Symptomen der Erkrankung, den Störungen und
Zuständen
verbunden sind, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, und
2) Proteine, deren Anwesenheit die Ursachen und/oder Symptome, welche
die Erkrankungen, Störungen
und Zustände
kennzeichnen, die mit den vorteilhaften Proteinen behandelt werden
können,
lindern, verringern oder verhindern, oder die Linderung, die Verringerung
oder die Verhinderung bewirken.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „Genkonstrukt" fremde rekombinante
Nukleinsäuremoleküle, die
kodierende Sequenzen einschließen,
die vorteilhafte Proteine funktional verknüpft mit regulatorischen Elementen
kodieren, die für
die Expression der kodierenden Sequenz in Stromazellen ausreichend
sind.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „fremde
rekombinante Nukleinsäuremoleküle" rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die
entweder nicht in Stromazellen anwesend sind oder die nicht als
Proteine in ausreichend hohen Mengen in Stromazellen exprimiert
werden, bis sie in die Zelle durch Mittel, wie, aber nicht beschränkt auf,
klassische Transfektion (CaPO4 oder DEAE-Dextran),
Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem Transfer,
chemisch vermitteltem Transfer, Liganden-vermitteltem Transfer oder
rekombinantem viralen Vektortransfer eingeführt werden.
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So
wie hier verwendet, bedeutet „heterologes
Gen" die kodierende
Sequenz des Genkonstrukts.
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So
wie hier verwendet, werden die Begriffe „exogenes genetisches Material" und „exogenes
Gen" austauschbar
verwendet und betreffen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und
RNA, mRNA und Antisense-DNA und -RNA, die in die Stromazelle eingeführt werden.
Das exogene genetische Material kann heterolog sein oder eine zusätzliche
Kopie oder Kopien von genetischem Material, das normalerweise in
dem Individuum oder dem Tier gefunden wird, darstellen. Wenn die
Zellen als ein Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung
in einem Verfahren zur Behandlung von humanen Erkrankungen, Zuständen oder
Störungen
verwendet werden, dann kann das exogene genetische Material, das
verwendet wird, um die Zellen zu transformieren, Proteine kodieren,
die als Therapeutika ausgewählt
werden, um das Individuum zu behandeln, und/oder um die Zellen geeigneter
für die
Transplantation zu machen.
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So
wie hier verwendet, bedeuten „transfizierte
Stromazellen" Stromazellen,
an die ein Genkonstrukt durch irgendeine Technologie bereitgestellt
wurde, die verwendet wird, um fremde Nukleinsäuremoleküle in Zellen einzuführen, wie,
aber nicht beschränkt
auf, klassische Transfektion (CaPO4 oder
DEAE Dextran), Elektropora tion, Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem
Transfer, chemisch vermitteltem Transfer, Liganden-vermitteltem
Transfer oder rekombinantem viralen Vektortransfer.
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Einige
Aspekte der vorliegenden Erfindung stammen von der Entdeckung, dass
einige Stromazellen, die in einen Patienten eingeführt werden,
einen Knochen, einen Knorpel und eine Lunge entwickeln, während andere
Vorläuferzellen
bleiben, die Tochterzellen bilden, die sich zu einem Knochen, einem
Knorpel und einer Lunge entwickeln. Diese Entdeckung erlaubt die
erfolgreiche Behandlung von Individuen, die an Erkrankungen, Zuständen und
Störungen
leiden, die mit Defekten in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen
assoziiert sind, entweder durch das Bereitstellen von Stromazellen
von einem normalen, passenden synergistischen Spender an die Individuen
oder durch Isolieren von Stromazellen aus dem Patienten, ihr Kultivieren
und ihr genetisches Modifizieren, um den genetischen Defekt zu korrigieren,
der für
die Erkrankungen, Zustände
oder Störungen
verantwortlich ist, die mit den Defekten in den Knochen-, Knorpel-
oder Lungenzellen assoziiert sind. Genauso wird angenommen, dass
Stromazellen sich zu Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des
Herzens und der Nieren entwickelt werden, oder dass sie Tochterzellen
hervorbringen, die dies tun.
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Die
Entdeckung, dass isolierte, kultivierte Stromazellen, insbesondere
Knochen-, Knorpel- und Lungengewebe erneut bevölkern, wenn sie an die Blutbahn
eines Individuums verabreicht werden, macht sie geeignet für die Behandlung
von Individuen, die an Erkrankungen, Zuständen und Störungen leiden, die mit Defekten
in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen assoziiert sind. Die Entdeckung,
dass einige isolierte, kultiviert Stromazellen, wenn sie in die
Blutbahn eines Individuums verabreicht werden, als Vorläuferzellen
wirken, die Tochterzellen hervorbringen, die anschließend zu
differenzierten Zellen reifen, macht die Erfindung insbesondere
nützlich,
weil sie die Langzeit- und kontinuierliche Anwesenheit von gespendeten
normalen und genetisch modifizierten Zellen ohne die Notwendigkeit
für konti nuierliche
erneute Verabreichung der Zellen erlaubt. Genauso erlaubt die Entwicklung
von Stromazellen in Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des
Herzens und der Nieren, oder das Hervorbringen von Tochterzellen
die Behandlung von Erkrankungen durch ähnliche Mittel, die diese Gewebe
betreffen.
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Folglich
können
Stromazellen von einem passenden Spender intravenös an Individuen
verabreicht werden, die an Erkrankungen leiden, welche Knochen-,
Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz-
oder Nierenzellen betreffen, um die Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen,
oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz-
oder Nierenzellen eines Individuums zu erhöhen oder auszutauschen. Die
Stromazellen eines passenden Spenders können intravenös an Individuen
verabreicht werden, die an Erkrankungen leiden, die mit einer defekten
Genexpression in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-,
Blutgefäß-, Herz-
oder Nierenzellen assoziiert sind, um die Knochen-, Knorpel- oder
Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen
des Individuums auszutauschen, die ein normales Gen nicht exprimieren
oder unterexprimieren und/oder ein mutiertes Gen exprimieren. Die
Stromazellen können
auch mit heterologen Genen in Gentherapieprotokollen transfiziert
werden. Passende Spender-Stromazellen oder Stromazellen aus einem
Individuum können
entfernt und genetisch vor dem erneuten Einführen der Zellen in das Individuum
verändert
werden. Die Zellen können
genetisch verändert
werden, um ein Gen einzuführen,
dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum
aufweist. Stromazellen von einem Individuum können genetisch modifiziert
sein, um ein defektes Gen auszutauschen und/oder um ein Gen einzuführen, dessen
Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist.
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Individuen,
die an Erkrankungen und Störungen
leiden, die Knochen beeinflussen und die durch einen genetischen
Defekt gekennzeichnet sind, können
durch das Bereitstellen, Erhöhen
und/oder Austauschen von Defekten oder defekten Knochenzellen gegen
Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren, behandelt werden.
Die Zellen können
von Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder Stromazellen
von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von
dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die
Zellen genetisch modifiziert sein, um den Defekt zu korrigieren.
Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die Knochen betrifft,
und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist gestörte Knochenbildung
(imperfekte Osteogenese). Ein anderes Beispiel einer Erkrankung
oder Störung,
die den Knochen betrifft, und die durch einen genetischen Defekt
gekennzeichnet ist, ist Osteoporose. Osteoporose wird häufig als
eine auf vielen Faktoren beruhende Erkrankung erachtet, zu denen
Umweltfaktoren, wie Ernährung
und Bewegung, beitragen. Jedoch zeigen Untersuchungen der Erkrankung
in Zwillingen, großen Familien
und großen
Populationen, dass viele Individuen die Erkrankung primär aufgrund
eines genetischen Defekts entwickeln (siehe Morrison et al., Nature
367: 284-287 (1994)). Individuen, die an gestörter Knochenbildung leiden,
können
Stromazellen aus einem normalen passenden Spender verabreicht werden,
welche die Knochenzellen des Individuums, die ein mutiertes Kollagen-Gen
aufweisen, austauschen. In solchen Ausführungsformen werden die normalen
Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einigen Ausführungsformen können die
normalen Zellen aus den eigenen Stromazellen des Individuums hergestellt
werden, weil Zellen mit einem mutierten Kollagendefekt einen Wachstumsnachteil
im Vergleich zu normalen Zellen aufweisen, wenn sie in Kultur angezogen
werden: Wenn deshalb Stromazellen aus einem Individuum mit defekter
Knochenbildung in Kultur angezogen werden, werden schrittweise normale
Zellen angereichert. Diese Ausführungsform ist
insbesondere wirksam, wenn das Individuum ein Mosaik bezüglich des
mutierten Kollagens ist, so dass einige seiner oder ihrer Zellen
das mutierte Kollagen-Gen
enthalten, und andere nicht. In einer alternativen Ausführungsform
werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an gestörter Knochenbildung
leidet, und ein normales Gen für
Kollagen I wird in die isolierten Stromazellen eingebaut. Die transfizierten
Zellen werden anschließend
in das Individuum erneut eingeführt.
Einige wenige Individuen, die an Osteoporose leiden, weisen auch Mutationen
in einem der zwei Gene für
Kollagen I auf, und dieselben Ausführungsformen werden die defekten
Zellen kompensieren. In den meisten Individuen mit Osteoporose sind
die fehlerhaften Gene immer noch unbekannt, aber es ist wahrscheinlich,
dass sie bald identifiziert werden. In solchen Individuen werden normale
Zellen den Defekt kompensieren. Auch wenn die fehlerhaften Gene
identifiziert und isoliert werden, werden in einer alternativen
Ausführungsform
die Stromazellen aus dem Individuum isoliert, eine normale Kopie
oder Kopien des mutierten Gens wird/werden eingebaut, und die Zellen
werden in das Individuum erneut eingeführt.
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Individuen,
die an Erkrankungen und Störungen
leiden, die den Knorpel beeinflussen, und die durch einen genetischen
Defekt gekennzeichnet sind, können
durch Ergänzen,
Erhöhen
und/oder Austauschen von defekten Zellen, gegen Zellen, die ein
normales Gen korrekt exprimieren, behandelt werden. Die Zellen können von
Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder von Stromazellen
von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von
dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die
Zellen genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren.
Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die den Knorpel beeinflusst,
und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist Chondrodysplasie, die
schweren Zwergenwuchs, schwere Probleme mit den Gelenken und verwandte
Probleme verursacht. Individuen, die an Chondrodysplasie leiden,
können
Stromazellen von einem normalen passenden Spender verabreicht werden,
welche die Zellen ersetzen, die Knorpel in dem Individuum bilden,
die/der ein mutiertes Kollagen-Gen aufweist/en. In solchen Ausführungsformen
werden normale Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer
alternativen Ausführungsform
werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an Chondrodysplasie
leidet, und ein normales Gen für
Kollagen II wird in die isolierten Stromazellen eingebaut. Die transfizierten
Zellen werden anschließend
erneut in das Individuum eingeführt.
Die Ausführungsform
mit dem Kollagen II-Gen wird für
20 % bis 90 % der Individuen mit verschiedenen Arten von schwerer
Chondrodysplasie nützlich
sein. Die verbleibenden Individuen mit Chondrodysplasie weisen Mutationen
in anderen Kollagen-Genen (Kollagen X und XI), in anderen Genen
(Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor 3) und in noch nicht identifizierten
Genen auf. In solchen Individuen werden normale Zellen die defekten
Zellen kompensieren. Es wird auch eine alternative Ausführungsform
sein, die Stromazellen aus dem Individuum zu isolieren, eine normale Kopie
oder Kopien des mutierten Gens einzuführen und die Zellen erneut
in das Individuum einzuführen.
Ein anderes Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die
den Knorpel beeinflusst, ist Osteoarthritis. Osteoarthritis ist
eine heterogene Erkrankung, sowohl hinsichtlich der Ätiologie
als auch der Manifestationen. Einige Individuen entwickeln die Degeneration
von Knorpel in den Gelenken, die Osteoarthritis kennzeichnen, aufgrund
von Schmerzen oder dem späten
Auftreten von Folgeerkrankungen von Infektionen. Einige wenige Individuen
entwickeln Osteoarthritis aufgrund von Mutationen in dem Gen für Kollagen
II in vielen Gelenken, ähnlich
zu den Mutationen in dem Gen, das Chondrodysplasie verursacht. Solche
Individuen können
Zeichen einer milden Chondrodysplasie zeigen, oder auch nicht. Die
Ursache von Osteoarthritis in anderen Individuen ist unbekannt,
aber Studien in größeren Familien
legen nahe, dass die Erkrankung vererbt wird und deshalb Mutationen
in noch nicht identifizierten Genen ursächlich sind. Deshalb werden
dieselben Ausführungsformen,
die nützlich
sind, um mutierte Gene in Individuen mit Chondrodysplasie zu kompensieren,
auch für
viele Individuen mit Osteoarthritis nützlich sein.
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Individuen,
die an Erkrankungen und Störungen
leiden, welche die Lungen beeinflussen, und die durch einen genetischen
Defekt gekennzeichnet sind, können
durch Ergänzen,
Erhöhen
und/oder Austauschen defekter Zellen gegen Zellen, die ein normales
Gen korrekt exprimieren, behandelt werden. Die Zellen können von
Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder Stromazellen
von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von
dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die
Zellen genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren.
Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, welche die Lungen beeinflusst,
und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist zystische
Fibrose. Ein anderes Beispiel für
eine Erkrankung oder eine Störung,
welche die Lungen beeinflusst und durch einen genetischen Defekt
gekennzeichnet ist, ist der Mangel an α1-Antitrypsin. Individuen, die
an zystischer Fibrose leiden, können
Stromazellen aus einem normalen passenden Spender, die eine normale
zystische Fibrose aufweisen, verabreicht werden, um die Lungenzellen
in dem Individuum, die ein mutiertes zystisches Fibrose-Gen aufweisen,
auszutauschen oder zu ergänzen.
In solchen Ausführungsformen
werden die normalen Zellen die defekten Zellen kompensieren. In
einer alternativen Ausführungsform
werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an zystischer
Fibrose leidet, und ein normales zystisches Fibrose-Gen wird in
die isolierten Stromazellen eingeführt. Die transfizierten Zellen
werden anschließend
erneut in das Individuum eingeführt.
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In
einigen Aspekten können
Individuen, die an Erkrankungen des Knochens, des Knorpels und der Lungen
leiden, ebenso wie jene, die an Erkrankungen der Dermis, der Blutgefäße, des
Herzens und der Nieren leiden, durch isolierte Stromazellen behandelt
werden, die ihre Zahl vergrößern und
die systematisch an die vermehrten, erneuerten Stromazellen verabreicht
werden. Einige der erneuerten Stromazellen werden sich zu normale
Knochen-, Knorpel-, Lungen-, Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen
entwickeln. Normale Stromazellen vermehren sich schneller als defekte,
und die vermehrte, erneuerte Population wird eine größere Population
von normalen Zellen reflektieren. Tabelle 1 beschreibt Medien, die
nützlich
sind, um vermehrte, erneuerte Kulturen von isolierten Stromazellen
zu kultivieren.
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Zusätzlich zu
dem Austauschen von defekten Zellen gegen reparierte Zellen oder
normale Zellen von passenden Spendern, können diese Zellen auch verwendet
werden, um gewünschte
Proteine zu exprimieren, die segregiert werden. Dies bedeutet, dass
Stromazellen isoliert, mit einem Gen für ein gewünschtes Protein ausgestattet
und in ein Individuum eingeführt
werden können,
in dem das gewünschte
Protein gebildet wird und eine therapeutische Wirkung ausübt oder
auf andere Weise zeigt. Dieser Aspekt betrifft die Gentherapie, in
der therapeutische Proteine an ein Individuum verabreicht werden.
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Gemäß einigen
hier offenbarten Aspekten können
immunologisch isolierte, transfizierte Stromazellen als Zelltherapeutika
verwendet werden, um Erkrankungen, Störungen und Zustände zu behandeln,
die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, und/oder Erkrankungen,
Störungen
und Zustände,
die mit Proteinen behandelt werden können. Insbesondere werden Genkonstrukte,
die heterologe Gene umfassen, die vorteilhafte Proteine kodieren,
in Stromazellen eingeführt.
Die transfizierten Stromazellen werden anschließend immunologisch isoliert
und in ein Individuum implantiert, das den Vorteil genießen wird,
wenn das Protein exprimiert und durch die Zelle in den Körper segregiert
wird.
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Immunologisch
isolierte Stromazellen sind besonders nützlich in zelltherapeutischen
Zusammensetzungen, weil zusätzlich
zu der Tatsache, dass sie geeignete Wirte für die Vermehrung von heterologen
Genen und die Bildung heterologer Proteine sind, Stromazellen sich
gut entwickeln, wenn sie immunologisch isoliert sind. Immunologisch
isolierte Stromazellen weisen eine sehr große Vitalität auf, wenn sie an Orte implantiert werden,
die keine vaskuläre
Blutversorgung aufweisen. Darüber
hinaus können
Stromazellen einfach und unmittelbar erhalten werden, sie vermehren
sich rasch in Kultur, was sie zu einer guten Quelle einer adäquaten Ergänzung von
nützlichen
Zellen für
immunologisch isolierte Zelltherapeutika macht.
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Genkonstrukte,
die Nukleotidsequenzen umfassen, die heterologe Proteine kodieren,
können
in Stromazellen eingeführt
werden. Dies bedeutet, dass die Zellen genetisch verändert werden,
um ein Gen einzuführen,
dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum
aufweist. Gemäß einigen
hier beschriebenen Aspekten können
Stromazellen von einem Individuum oder von einem anderen Individuum
oder von einem nicht-humanen Tier genetisch verändert werden, um ein defektes
Gen auszutauschen und/oder um ein Gen einzuführen, dessen Expression eine
therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist.
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Stromazellen
sind nützlich,
um transfizierte Zellen herzustellen, die immunologisch isoliert
werden können
und die heterologe vorteilhafte Gene exprimieren, was das Mittel
liefert, genetische Defekte zu korrigieren und/oder therapeutische
Proteine zu bilden. Stromazellen können relativ einfach isoliert
werden, und isolierte Stromazellen können kultiviert werden, um
die Zahl der verfügbaren
Zellen zu erhöhen.
Stromazellen können
transfiziert, immunologisch isoliert und mit einem hohen Grad an
Vitalität
an Orten implantiert werden, die keine direkte Blutversorgung aufweisen,
wie subkutane Orte. In einigen Ausführungsformen können Stromazellen
immortalisiert werden, wie durch SV40-Virus oder Proteine mit transformierenden
Eigenschaften.
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Individuen,
die an genetischen Erkrankungen und Störungen leiden, können durch
Ergänzen,
Erhöhen und/oder
Austauschen von defekten oder defizienten Genen behandelt werden,
indem immunologisch isolierte Stromazellen mit Genkonstrukten bereitgestellt
werden, die normale, funktionelle Kopien des defizienten Gens einschließen. Dieser
Aspekt der Erfindung betrifft Gentherapie, in der das Individuum
mit Genen versorgt wird, hinsichtlich denen es bezüglich der
Anwesenheit und/oder Funktion defizient ist. Diese Gene, die in
dem Zelltherapeutikum bereitgestellt werden, kompensieren das defekte
Gen des Individuums. Solche Gene kodieren vorzugsweise Proteine,
die segregiert werden.
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Die
Stromazellen werden transfiziert und immunologisch isoliert. In
einigen Ausführungsformen
werden die Stromazellen mit Genen transfiziert, hinsichtlich denen
das zu behandelnde Individuum an einer vollständigen Abwesenheit einer nicht- mutierten Kopie des
Gens leidet, oder an der Abwesenheit oder unzureichenden Expression
einer nicht-mutierten Form des Proteins leidet. Stromazellen werden
mit einer nicht-mutierten Kopie des Gens in einer exprimierbaren
Form transfiziert. Dies bedeutet, dass das Protein, das durch das
transfizierte Gen kodiert wird, durch die Stromazellen exprimiert
wird, vorzugsweise als ein segregiertes Protein. Beispiele von Erkrankungen,
Zuständen
oder Störungen,
in denen defekte Gene oder unzureichende Genexpression ursächlich mit
der Erkrankung oder den Symptomen verbunden ist, schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf, Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindesaminasedefizienz,
Hämophilie
A und Hämophilie
B. Andere genetische Erkrankungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt werden können,
schließen
ein: α1-Antitrypsin-Defizienz,
Fabray-Erkrankung, familiäre
Hypercholesterolämie,
Gaucher'sche Erkrankung,
Lesch-Nyhan-Syndrom, Ahornsirup-Harnerkrankung. Ornithintranscarbamylase-Defizienz,
Phenylketonurie, Sandhoff-Erkrankung, Tay-Sachs-Erkrankung und von-Willebrand-Erkrankung.
Durch das Einführen
normaler Gene in exprimierbarer Form, die Wachstumshormon, Insulin,
Adenindesaminase oder einen geeigneten Blutgerinnungsfaktor kodieren,
können
an die Individuen, die an Wachstumshormon-Defizienz, Diabetes, Adenindesaminase-Defizienz
und Hämophilie
leiden, jeweils die Mittel bereitgestellt werden, um die genetischen
Defekte zu kompensieren und einige und alle der Symptome, die mit
solchen Erkrankungen assoziiert sind, zu eliminieren, zu lindern
oder zu verringern. Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen
von Erkrankungen, Zuständen
und Störungen,
die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden
können.
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Zusätzlich zu
dem Austauschen von defekten Genen gegen funktionelle Gene können gewünschte segregierte
Proteine ebenfalls exprimiert werden, die eine biologisch aktive
therapeutische oder prophylaktische Wirkung ausüben. Solche Proteine werden
vorzugsweise von den Zellen segregiert. Dies bedeutet, dass Stromazellen
isoliert, mit einem Gen für
ein gewünschtes
Protein ausgestattet, immunologisch isoliert und in ein Individuum
eingeführt
werden können,
innerhalb dem das gewünschte
Protein gebildet wird und eine therapeutische Wirkung zeigt oder
auf andere Weise ausführt.
Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Gentherapie, in der therapeutische
Proteine an ein Individuum verabreicht werden. Gemäß diesen
Aspekten der Erfindung sind die isolierten Stromazellen Vektoren
für das
Einführen
therapeutischer Gene in das Individuum, ebenso wie Wirte für solche
Gene, wenn die Zellen an ein Individuum verabreicht werden.
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In
solchen Ausführungsformen
werden die Stromazellen mit Genen transfiziert, die Proteine kodieren, die
eine therapeutische Wirkung aufweisen, wenn sie in dem zu behandelnden
Individuum exprimiert werden. Anstelle das therapeutische Protein
direkt und in einer Reihe von zeitlichen Intervallen zu verabreichen,
stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zum kontinuierlichen
Verabreichen eines therapeutischen Proteins durch Verabreichen von
Zellen, die das Protein bilden, bereit. Stromazellen werden mit
einem Gen transfiziert, das ein Protein in exprimierbarer Form kodiert.
Dies bedeutet, dass das Protein, das durch das transfizierte Gen kodiert
wird, von den Stromazellen exprimiert wird, vorzugsweise als ein
segregiertes Protein. Beispiele von therapeutischen Proteinen schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf, Fettleibigkeitsfaktor (Considine, R. V. et al., J. Clin. Invest.,
1995, 95, 2986-2988; Arner, P., N. Engl. J. Med., 1995, 333, 382;
Emorine, L. et al., Trends Pharmacol. Sci., 1994, 15, 3; Flier,
J. S., Cell, 1995, 80, 15; Lowell, B. B. et al., J. Clin. Invest.,
1995, 95, 923; und Rink, T. J. et al., Nature, 1994, 372, 406),
Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor, Granulozyten
Kolonie-stimulierenden Faktor, Erythropoietin, Interleukin-2- und
Interleukin-1-Rezeptorantagonistprotein.
Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen von Erkrankungen,
Zuständen
und Störungen,
die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden
können,
und sie enthalten die Namen der Proteine, die über ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt
verabreicht werden können.
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In
allen Fällen,
in denen ein Genkonstrukt in eine Stromazelle transfiziert wird,
ist das heterologe Gen funktionell mit regulatorischen Sequenzen
verbunden, die benötigt
werden, um Expression des Gens in der Stromazelle zu erreichen.
Solche regulatorischen Sequenzen schließen einen Promotor und ein
Polyadenylierungssignal ein.
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Das
Genkonstrukt wird vorzugsweise als ein Expressionsvektor bereitgestellt,
der eine kodierende Sequenz für
das heterologe Protein, funktionell verknüpft mit essentiellen regulatorischen
Sequenzen aufweist, so dass, wenn der Vektor in die Zelle transfiziert
wird, die kodierende Sequenz von der Zelle exprimiert wird. Die
kodierende Sequenz ist funktionell mit den regulatorischen Elementen
verbunden, die für
die Expression dieser Sequenz in den Zellen notwendig sind. Die
Nukleotidsequenz, die das Protein kodiert, kann cDNA, genomische
DNA, synthetische DNA oder ein Hybrid davon oder ein RNA-Molekül, wie mRNA,
sein.
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Das
Genkonstrukt, das die Nukleotidsequenz einschließt, die für das vorteilhafte Protein,
funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden, kodiert, kann
in der Zelle als ein funktionelles zytoplasmatisches Molekül, ein funktionelles
episomales Molekül
verbleiben, oder es kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert
werden. Exogenes genetisches Material kann in Zellen eingeführt werden,
wo es als getrenntes genetisches Material in der Form eines Plasmids
verbleibt. Alternativ dazu kann lineare DNA, die in das Chromosom
integrieren kann, in die Zelle eingeführt werden. Wenn DNA in die
Zelle eingeführt
wird, können
Reagenzien, welche die DNA-Integration in Chromosomen fördern, zugegeben
werden. DNA-Sequenzen,
die nützlich sind,
um die Integration zu fördern,
können
in das DNA-Molekül ebenfalls
eingeschlossen sein. Alternativ kann RNA in die Zelle eingeführt werden.
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Die
regulatorischen Elemente, die für
die Genexpression notwendig sind, schließen ein: einen Promotor, ein
Startkodon, ein Stoppkodon und ein Polyadenylie rungssignal. Es ist
notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in den Zellen,
die von den Stromazellen nach Infusion in ein Individuum abstammen, funktionell
sind. Darüber
hinaus ist es notwendig, dass diese Elemente funktionell mit der
Nukleotidsequenz verbunden sind, die das Protein kodiert, so dass
die Nukleotidsequenz in den Stromazellen exprimiert werden und somit
das Protein gebildet werden kann. Startkodons und Stoppkodon werden
für gewöhnlich als
Teil einer Nukleotidsequenz erachtet, die das Protein kodiert. Jedoch
ist es notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in
den Zellen, die von den Stromazellen abgeleitet sind, funktionell
sind. Genauso müssen
die verwendeten Promotoren und Polyadenylierungssignale innerhalb
der Stromazellen oder innerhalb der Zellen, die von den Stromazellen
abgeleitet sind, funktionell sein. Beispiele für Promotoren, die für die vorliegende
Erfindung nützlich
sind, schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf, Promotoren, die aktiv in vielen Zellen sind, wie der Zytomegalievirus-Promotor,
SV40-Promotoren und retrovirale Promotoren. Andere Beispiele von
Promotoren, die zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf, gewebespezifische Promotoren, d. h. Promotoren, die in einigen
Geweben funktionell sind, aber nicht in anderen; ebenso Promotoren
von jenen, die normalerweise in Stromazellen exprimiert werden,
mit oder ohne spezifische oder allgemeine Enhancersequenzen. In
einigen Ausführungsformen
werden Promotoren verwendet, die konstitutiv Gene in Stromazellen
exprimieren, mit oder ohne Enhancersequenzen. Enhancersequenzen
werden in solchen Ausführungsformen
bereitgestellt, wenn sie geeignet oder gewünscht sind.
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Gemäß einigen
Ausführungsformen
sind gewünschte
Gene für
die Transfektion in Stromazellen funktionell mit dem humanen Prokollagen-I-Promotor,
dem humanen Prokollagen-II-Promotor und dem humanen Prokollagen-III-Promotor
verbunden. In einigen Ausführungsformen
sind die Gene mit relativ kurzen 5'-Fragmenten des entweder COL1A1- oder
COL2A1-Gens verbunden, die den Promotor zusammen mit einigen der 5'-translatierten und/oder
-untranslatierten Sequenzen des Gens umfassen. In einigen Ausführungsformen
ist das zu transfizierende Gen funktionell mit einer Sequenz verbunden,
die ein 1,9 kb SphI-HindIII-Fragment von dem 5'-Ende
des humanen COL1A1 enthält.
Das Fragment enthält
von –476
bp bis –1440
bp des COL1A1-Gens und schließt
deshalb den Promotor (476 bp), Exon 1 (222 bp) und das meiste des
Introns 1 (1223 bp von insgesamt 1453 bp) ein. In einigen Ausführungsformen
ist das zu transfizierende Gen funktionell mit einer Sequenz verbunden,
die ein Fragment aus dem 5'-Ende
des humanen COL2A1 enthält.
In einigen Ausführungsformen
enthält
das Fragment –4,0
kb des COL2A1-Promotors
und das vollständige
COL2A1-Gen, das eine oder andere Exon und Introns in der Reihenfolge
von Exon1 bis Exon 15 und Intron 1 bis Intron 14. Einige Konstrukte
können
gestaltet werden, wie in der gleichzeitig anhängigen US-Seriennummer 08/184,260, eingereicht
am 18. Januar 1994, mit dem Titel „Methods of targeting DNA
insertion into genome",
die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, gelehrt wird.
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Beispiele
von Polyadenylierungssignalen, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung
nützlich sind,
schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf das humane Kollagen-II-Polyadenylierungssignal, das humane Kollagen-II-Polyadenylierungssignal
und das SV40-Polyadenylierungssignal.
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Damit
exogenes genetisches Material in einem Expressionsvektor exprimiert
wird, müssen
die regulatorischen Elemente funktionell mit der Nukleotidsequenz
verbunden sein, die das Protein kodiert. Um die Proteinherstellung
zu maximieren, können
regulatorische Sequenzen ausgewählt
werden, die für
Genexpression in den gewünschten
Zellen gut geeignet sind. Darüber
hinaus können
Kodons ausgewählt
werden, die in der Zelle am wirksamsten transkribiert werden. Der
Fachmann kann exogenes genetisches Material als Expressionsvektoren
herstellen, die in den gewünschten
Zellen funktionell sind.
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Es
ist auch vorgesehen, dass regulatorische Elemente ausgewählt werden
können,
um eine gewebespezifische Expression des Proteins bereitzustellen.
So können
z. B. spezifische Promotoren bereitgestellt werden, so dass das
heterologe Gen nicht nur in dem Gewebe exprimiert wird, in welches
die immunologisch isolierten Stromazellen implantiert werden.
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Das
heterologe Protein schließt
vorzugsweise eine Signalsequenz ein, die den Transport und die Sekretion
des heterologen Proteins in der Stromazelle steuert. Die Signalsequenzen
werden allgemein verarbeitet und nach Sekretion des reifen Proteins
aus der Zelle entfernt.
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Zusätzlich zu
dem Bereitstellen von Zellen mit genetischem Material, das entweder
1) genetische Defekte in den Zellen korrigiert, 2) Proteine kodiert,
die sonst nicht in ausreichenden Mengen und/oder einem funktionellen
Zustand anwesend sind, so dass das genetische Material genetische
Defekte in dem Individuum korrigiert und/oder 3) Proteine kodiert,
die als Therapeutika in der Behandlung oder Verhinderung eines bestimmten
Erkrankungszustands oder einer bestimmten Erkrankungsstörung oder
Symptomen nützlich
ist, die damit assoziiert sind, kann genetisches Material auch in
die Stromazellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
eingeführt
werden, um ein Mittel für
das selektive Beenden solcher Zellen bereitzustellen, sollte ein
solches Beenden wünschenswert
werden. Solche Mittel zum Abzielen auf Zellen für die Zerstörung können in Stromazellen eingeführt werden,
die auf andere Weise modifiziert werden, ebenso wie in jene, in welche
kein anderes exogenes genetisches Material eingeführt wird.
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Isolierte
Stromazellen werden mit genetischem Material ausgestattet, was sie
insbesondere empfänglich
für die
Zerstörung
macht. Zum Beispiel können
Stromazellen mit Genen ausgestattet werden, die einen Rezeptor kodieren,
auf den mit einem zytotoxischen Mittel spezifisch abgezielt werden
kann. Eine exprimierbare Form eines Gens, die verwendet werden kann,
um selektiven Zelltod zu induzieren, kann in die Zellen eingeführt werden.
In einem solchen System sind die Zellen, die das Protein exprimieren,
das durch das Gen kodiert wird, empfänglich für gezieltes Abtöten unter
spezifischen Bedingungen oder in der Anwesenheit oder Abwesenheit
von spezifischen Agentien. Zum Beispiel kann eine exprimierbare
Form eines Herpesvirus Thymidinkinase-(Herpes Tk)-Gens in die Zellen
eingeführt
werden und verwendet werden, um selektiven Zelltod zu induzieren.
Wenn das exogene genetische Material, welches das (Herpes Tk)-Gen
einschließt,
in das Individuum eingeführt
wird, wird Herpes Tk gebildet. Wenn es wünschenswert oder notwendig
ist, die implantierten Zellen abzutöten, kann das Arzneimittel
Gancyclovir an das Individuum verabreicht werden, und das Arzneimittel
wird das selektive Abtöten
jeder Zelle bewirken, die Herpes Tk bildet. Somit kann ein System
bereitgestellt werden, das die selektive Zerstörung von implantierten Zellen
erlaubt.
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Der
Fachmann kann Individuen identifizieren, die an genetischen Erkrankungen
leiden, wie jene, die in den Tabellen IV und V aufgelistet sind,
einschließlich
Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindesaminase-Defizienz und
Hämophilie,
wobei er standarddiagnostische Verfahren routinemäßig verwendet.
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Stromazellen
können
erhalten werden, indem Knochenmarkszellen aus einem Spender entfernt
werden und die Zellen in einen sterilen Behälter mit einer Plastikoberfläche oder
einer anderen geeigneten Oberfläche
gegeben werden, so dass die Zellen damit in Kontakt kommen. Die
Stromazellen werden an die Plastikoberfläche innerhalb von 30 Minuten
bis ungefähr
3 Tagen anheften. Nach mindestens 30 Minuten, vorzugsweise ungefähr 4 Stunden
werden die nicht-angehefteten Zellen entfernt und verworfen. Die
angehefteten Zellen sind Stromazellen, die anfänglich nicht-teilend sind.
Nach ungefähr
2-4 Tagen beginnen die Zellen jedoch zu proliferieren und können unter
Verwendung von Standardzellkulturtechniken kultiviert werden, um
ihre Zahl zu steigern.
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Gemäß bevorzugten
Ausführungsformen
werden die Zellen in Medium kultiviert, das mit 2-20 % fötalem Kälberserum
ergänzt
ist, oder in serumfreiem Medium mit oder ohne zusätzlichen
Ergänzungen.
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Isolierte
Stromazellen können
unter Verwendung von gut bekannten Techniken, die dem Fachmann zur
Verfügung
stehen, transfiziert werden. Fremdgene können in Stromazellen durch
Standardverfahren eingeführt
werden, die für
das Einführen
von Genkonstrukten in die Zelle verwendet werden, so dass sie die
Proteine exprimieren, die von den Genen kodiert werden. In einigen
Ausführungsformen
werden die Zellen durch Calciumphosphat-Präzipitationstransfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation,
Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem Transfer, chemisch vermitteltem
Transfer, Liganden-vermitteltem Transfer oder rekombinantem viralen
Vektortransfer transfiziert.
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In
einigen Ausführungsformen
werden rekombinante Adenovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten
Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen
werden rekombinante Retrovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten
Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen
werden Standard-CaPO4, DEAE-Dextran oder
Lipidträgervermittelte
Transfektionstechniken eingesetzt, um gewünschte DNA in teilende Zellen
einzuführen.
Standard-Antibiotika-Resistenz-Selektionstechniken können verwendet
werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektieren.
In einigen Ausführungsformen
wird DNA direkt in Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. Genauso
können gut
bekannte Elektroporations- oder Partikelbeschuss-Techniken verwendet werden, um Fremd-DNA
in isolierte Stromazellen einzuführen.
Ein zweites Gen wird für
gewöhnlich
ko-transfiziert oder mit dem therapeutischen Gen verbunden. Das
zweite Gen ist häufig
ein selektierbares Antibiotika-Resistenz-Gen.
Transfizierte Zellen können
durch Anziehen der Zellen in einem Antibiotikum selektiert werden,
das Zellen abtöten
wird, die das selektierbare Gen nicht aufgenommen haben. In den
meisten Fällen,
in denen die zwei Gene nicht miteinander verbunden und ko-transfiziert
werden, weisen die Zellen, welche die Antibiotikum-Behandlung überleben,
beide Gene in sich auf und exprimieren sie beide.
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Nach
dem Isolieren der Stromazellen können
die Zellen nach der Isolierung oder nachdem sie kultiviert wurden,
verabreicht werden. Isolierte Stromazellen, die nach der Isolierung
verabreicht werden, werden innerhalb einer Stunde nach der Isolierung
verabreicht. Im Allgemeinen können
Stromazellen unmittelbar nach der Isolierung verabreicht werden,
in Situationen, in denen der Spender erwachsen und der Empfänger ein
Kind ist. Es ist bevorzugt, dass Stromazellen vor der Verabreichung
kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 1 Stunde bis über ein
Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen
werden, die isolierten Stromazellen vor der Verabreichung für einen
Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, damit sie sich von nicht-teilenden
zu replizierenden Zellen umwandeln. In einigen Ausführungsformen
werden die isolierten Stromazellen für 3-30 Tage, vorzugsweise 5-14 Tage, weiter
bevorzugt 7-10 Tage kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten
Stromazellen für
4 Wochen bis zu einem Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate,
weiter bevorzugt 3-6 Monate kultiviert.
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Wenn
die Zellen transfiziert werden, werden entweder 1) isolierte, nicht-teilende
Stromazellen zuerst transfiziert und anschließend als nicht-teilende Zellen
verabreicht, 2) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst transfiziert,
anschließend
für einen
Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden
in replizierende Zellen umzuwandeln und anschließend verabreicht, 3) isolierte,
nicht-teilende Stromazellen
zuerst für
einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden
in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend transfiziert und anschließend verabreicht,
oder 4) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst für einen
Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden
in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend transfiziert, anschließend kultiviert
und anschließend
verabreicht. In einigen Ausführungsformen
werden Stromazellen isoliert, transfiziert und sofort verabreicht.
Es ist bevorzugt, dass Stromazellen vor der Transfektion und/oder
den Verabreichungen kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 3-30 Tage,
in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte
Stromazellen können
für 3-30
Tage, in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden.
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Isolierte
Stromazellen können
für 3-30
Tage, in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Transfektion und nach der Transfektion zusätzlich für 3-30 Tage,
in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen
werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr,
in einigen Ausführungsformen
6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor
der Transfektion kultiviert. Transfizierte Stromazellen können für 4 Wochen
bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu
10 Monaten, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen
können
isolierte Stromazellen für
4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu
10 Monaten, in einigen Ausführungformen
3-6 Monate vor der Transfektion und nach der Transfektion weiterhin
für 4 Wochen
bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungformen 6 Wochen bis zu
10 Monaten, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Verabreichung kultiviert werden.
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Isolierte
Stromazellen können
unter Verwendung von gut bekannten Techniken, die dem Fachmann einfach
zur Verfügung
stehen, transfiziert werden. In einigen Ausführungformen werden rekombinante
Adenovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle
einzuführen.
In einigen Ausführungsformen
werden Standard-CaPO4, DEAE-Dextran oder
Flüssigträger- vermittelte Transfektionstechniken
eingesetzt, um gewünschte
DNA in teilende Zellen einzuführen.
Standard-Antibiotika-Resistenz-Selektionstechniken können verwendet
werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektieren.
In einigen Ausführungsformen
wird DNA direkt in Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. Ebenso
können gut
bekannte Elektroporations- oder Partikelbeschuss-Techniken verwendet werden, um Fremd-DNA
in isolierte Stromazellen einzuführen.
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Für die Verabreichung
von Stromazellen werden die isolierten Stromazellen aus den Kulturschalen entfernt,
mit Salzlösung
gewaschen, zu einem Pellet zentrifugiert und in einer Glucoselösung resuspendiert, die
in den Patienten infundiert wird. In einigen Ausführungsformen
wird Knochenmarksablation vor der Infusion durchgeführt, um
Raum in dem Knochen für
die eingeführten
Zellen zu schaffen. Knochenmarksablation kann unter Verwendung von
Röntgenbehandlung
des zu behandelnden Individuums, dem Verabreichung von Arzneimitteln,
wie Cyclophosphamid oder durch eine Kombination von Röntgenbehandlung
und Arzneimittelverabreichung erreicht werden. In einigen Ausführungsformen
wird Knochenmarksablation durch Verabreichen von Radioisotopen erreicht,
von denen bekannt ist, dass sie metastatische Knochenzellen abtöten, wie
z. B. radioaktives Strontium, 135Samarium
oder 166Holmium (siehe Applebaum, F. R.
et al., 1992, Blood 80(6): 1608-1613, das hier durch Bezugnahme
eingeschlossen ist).
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Wenn
Knochenmarksablation der Verabreichung von Stromazellen vorhergeht,
muss die Verabreichung von Stromazellen durch die Verabreichung
von nicht-adhärenten Zellen
begleitet werden, die Blutzellvorläufer enthalten, die für das Überleben
notwendig sind. Solche nicht-adhärenten
Zellen können
aus der gleichen Probe gewonnen werden, die als Ausgangsmaterialien
in der Isolierung von Stromazellen verwendet werden, und sie können gelagert
werden, oder sie sind von einer anderen Probe abgeleitet. In einigen
bevorzugten Ausführungsformen
werden die nicht-adhärenten
Zellen von dem Empfänger/Patienten
bereitgestellt.
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Vor
den Verfahren, die Knochenmarksablation bilden, wird eine Probe
des Knochenmarks des Patienten/Empfängers erhalten und gelagert.
Die gesamte Probe kann verwendet werden, oder die nicht-adhärenten Zellen
können
isoliert und verwendet werden, um zusammen mit isolierten Stromazellen
verabreicht zu werden. Nicht-adhärente
Zellen, die zusammen mit der Verabreichung von Stromazellen verabreicht
werden, können
getrennt davon vorher oder nach der Stromazellverabreichung verabreicht
werden, oder sie können
mit den isolierten Stromazellen vor der Verabreichung gemischt werden.
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Die
Knochenmarksablation ist optional. In einigen Ausführungsformen
wird eine teilweise, aber nicht vollständige Knochenmarksablation
vor der Verabreichung von Stromazellen durchgeführt. In einigen Ausführungsformen
werden die Stromazellen ohne irgendeine Knochenmarksablation verabreicht.
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Zwischen
107 und 1013 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person werden pro Infusion verabreicht. In einigen Ausführungsformen
zwischen ungefähr
1-5 × 106 und 1-5 × 1012 Zellen
intravenös
pro 100 kg Körpergewicht
der Person infundiert. In einigen Ausführungsformen werden zwischen
ungefähr
1 × 109 und 5 × 1011 Zellen intravenös pro 100 kg Körpergewicht
der Person infundiert. In einigen Ausführungsformen werden 4 × 105 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert.
In einigen Ausführungsformen
werden 2 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert.
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In
einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von Zellen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen
werden mehrere Verabreichungen über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 3-7 Verabreichungen über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabreichungen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
-
In
einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von zwischen 107 und
1013 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1-5 × 108 und 1-5 × 1012 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne
Verabreichung von zwischen ungefähr
1 × 109 und 5 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von 4 × 109 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne
Verabreichung von 2 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
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In
einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von zwischen 107 und
1013 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1-5 × 108 und 1-5 × 1012 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache
Verabreichungen von zwischen ungefähr 1 × 109 und
5 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den
Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen
Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von 4 × 109 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von 2 × 1011 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen werden
5 Verabreichungen von 3-5 × 109 Zellen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabreichungen von 4 × 109 Zellen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabrei chungen von 1-3 × 1011 Zellen über den
Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen
Ausführungsformen werden
5 Verabreichungen von 2 × 1011 Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden
Tagen bereitgestellt.
-
Stromazellen
in Diffusionskammern sind beschrieben in Benayahu, D. et al. (1989)
J. Cell Physiol. 140: 1-7 und Mardon, H. J. et al. (1987) Cell Tissue
Res. 250: 157-165.
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Nach
dem Einführen
des Genkonstrukts in die Stromazellen können die Zellen sofort immunologisch, oder
nachdem sie kultiviert wurden, isoliert werden. Stromazellen können, nachdem
sie immunologisch isoliert wurden, implantiert werden. Stromazellen
können
immunologisch durch irgendeine der Vielzahl von bekannten Verfahren
isoliert werden, unter Verwendung von einfach zur Verfügung stehenden
Ausgangsmaterialien und/oder Vorrichtungen. Stromazellen können unter
Verwendung von vielen Mikroverkapselungsprotokollen mikroverkapselt
werden, einschließlich
jenen, die z. B. in dem US-Patent Nr. 4,391,009, dem US-Patent Nr. 4,806,355,
dem US-Patent Nr. 4,942,129 und dem US-Patent Nr. 5,334,640 offenbart
sind.
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Stromazellen
können
in Kammern mit diffundierbaren Membranen oder verkapselt in Mikrokügelchen verabreicht
werden. In einer anderen Ausführungsform
sind die Stromazellen in Hohlfasern enthalten, wie jenen, die von
Amicon, Inc. (Beverly MA) erhalten werden können. Diese Fasern werden z.
B. verwendet, um Kartuschen bzw. Kassetten für die Dialyse zu erhalten.
Ein Ende kann von unterhalb der Haut herausgezogen werden und in
der Größe verringert
werden, wenn die Dosierung des Proteins, das von den Zellen gebildet wird,
verringert werden soll. Der Oberflächenbereich der Fasern ist
sehr groß.
Weiterhin können
die Zellen in der Faser herausgespült und periodisch ausgetauscht
werden. Hohlfasern sind auf den Seiten 50/51 der Amicon, Inc. Veröffentlichung
Nr. 323 beschrieben.
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Genauso
wird der Einbau von transfizierten Stromazellen in bioverträgliche Matrizes,
die Sekretion von vorteilhaften Protein an ein Individuum erlauben,
während
die Zellen in einem immunologisch isolierten Zustand gehalten werden.
Beispiele von bioverträglichen
Matrizes sind z. B. in dem US-Patent Nr. 4,902,295 und dem US-Patent
Nr. 4,997,443 offenbart. In einigen Ausführungsformen sind transfizierte
Stromazellen durch ihre Einlagerung innerhalb von Gewebeimplantat-Systemen, die Membranzusammensetzungen
sind, immunologisch isoliert. Dies bedeutet, dass Zellen in Behältern aufrechterhalten
werden, die mindestens eine poröse
Membran einschließen.
Die Zellen innerhalb der Membranzusammensetzung sind immunologisch
isoliert, während
vorteilhafte Proteine an die Individuen bereitgestellt werden können, indem
sie durch die Membran passagieren. Implantat-Vorrichtungen, die
Membranzusammensetzungen sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf,
jene, die in dem US-Patent Nr. 5,314,471 und dem US-Patent Nr. 5,344,454
beschrieben sind. Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung wird eine Implantat-Vorrichtung bereitgestellt, die
zwei Ringzusammensetzungen umfasst. Jede Ringzusammensetzung umfasst
einen zirkulären
Plastikring und eine 0,3 Mikron Millipor-Membran, welche den Bereich
des Rings abdeckt. Transfizierte Stromazellen werden zwischen die
zwei Ringzusammensetzungen angeordnet, die miteinander am Umfang
in Verbindung stehen. Die hergestellte Implantat-Vorrichtung wird
vorzugsweise subkutan implantiert.
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In
einigen bevorzugten Implantat-Vorrichtungen werden 104 bis
1011 Zellen bereitgestellt.
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Immunologisch
isolierte Zellen können
subkutan oder intraperitoneal implantiert werden. Alternativ können sie
angeheftet oder auf andere Weise benachbart zu Organen und Geweben
implantiert werden, an die das vorteilhafte Protein vorzugsweise
verabreicht wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Implantat-Vorrichtungen
subkutan oder intraperitoneal implantiert.
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Die
Erfindung ist insbesondere nützlich,
um jene Erkrankungen, Störungen
oder Zustände
zu behandeln, die relativ kleine Proteinmengen benötigten,
am meisten bevorzugt segregiertes Protein. Beispiele schließen den
Wachstumsfaktor, den Fettsucht-Faktor und Faktor IX ein, die alle
sehr kleine Proteinmengen für
die Funktion benötigen.
Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen von Erkrankungen,
Zuständen
und Störungen,
die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden
können.
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Es
ist bevorzugt, dass die Stromazellen vor der immunologischen Isolierung
kultiviert werden. Stromazellen können von 1 Stunde bis über ein
Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden
die Stromazellen für
einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um ihnen zu erlauben,
dass sie sich von nicht-teilenden zu replizierenden Zellen umwandeln.
In einigen Ausführungsformen
werden die Stromazellen für
3-30 Tage, vorzugsweise 5-14 Tage, weiter bevorzugt 7-10 Tage kultiviert.
In einigen Ausführungsformen
werden die Stromazellen für
4 Wochen bis zu einem Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate,
weiter bevorzugt 3-6 Monate kultiviert.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
sind die Zellen entweder 1) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst transfiziert
und anschließend
immunologisch isoliert, anschließend als nicht-teilende Zellen
implantiert werden, 2) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die
zuerst transfiziert, anschließend
für einen
Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden
in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend werden sie immunologisch
isoliert und anschließend
implantiert, 3) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst
für einen
Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden
in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend werden sie transfiziert,
anschließend
immunologisch isoliert und anschließend implantiert, oder 4) isolierte,
nicht-teilende Stromazellen,
die zuerst für
einen Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von
nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, an schließend werden
sie transfiziert, anschließend
kultiviert, anschließend
immunologisch isoliert und anschließend implantiert. In einigen
Ausführungsformen
werden Stromazellen isoliert, transfiziert, immunologisch isoliert
und implantiert. Es ist bevorzugt, dass die Stromazellen vor und
nach der Transfektion kultiviert werden. Isolierte Stromazellen
können
aus kultivierten für
3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte
Stromazellen können
aus kultivierten für
3-30 Tage, in einigen
Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. Isolierte Stromazellen
können
aus kultivierten für
3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Transfektion und nach der Transfektion kultiviert
werden, zusätzlich
können
sie für
3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen
5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen
7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen können die
isolierten Stromazellen für
4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10
Monate, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen
können
für 4 Wochen
bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu
10 Monaten, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Implantation kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen
können
die isolierten Stromazellen für
4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10
Monate, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Transfektion und nach der Transfektion kultiviert
werden, weiterhin können
sie für
4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10
Monate, in einigen Ausführungsformen
3-6 Monate vor der Implantation kultiviert werden.
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Wie
oben erwähnt,
kann die Knochenmarksprobe für
die Transplantation von einem passenden Spender abgeleitet sein.
Der Fachmann kann einfach passende Spender unter Verwendung von
Standardtechniken und -kriterien identifizieren.
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Knochenmarksproben
für die
Transplantation können
von passenden Spendern durch Standardtechniken erhalten werden.
In einigen Ausführungsformen
wird eine Knochenmarksablation vor der Infusion unternommen, um
in dem Knochen Platz für
eingeführte
Zellen zu schaffen. Die Knochenmarksablation kann durch Röntgenbestrahlung
des zu behandelnden Individuums, dem Verabreichen von Arzneimitteln,
wie Cyclophosphamid oder durch eine Kombination von Röntgenbestrahlung
und Arzneimittelverabreichung erreicht werden. In einigen Ausführungsformen
wird die Knochenmarksablation durch Verabreichen von Radioisotopen,
von denen bekannt ist, dass sie metastatische Knochenzellen abtöten, wie
z. B. radioaktives Strontium, 135Samarium oder 166Holmium (siehe Applebaum, F. R. et al.,
1992, Blood 80(6): 1608-1613), durchgeführt werden.
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Knochenmarksablation
ist optional. In einigen Ausführungsformen
wird eine teilweise, aber nicht vollständige Knochenmarksablation
vor der Knochenmarkstransplantation durchgeführt. In einigen Ausführungsformen
wird das Knochenmark ohne eine Knochenmarksablation verabreicht.
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Es
ist bevorzugt, dass die Zahl der Zellen, die in der Knochenmarkstransplantation
für die
Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankung jene übersteigt,
die normalerweise für
andere Behandlungen verwendet wird. Zwischen 3- und 10-fach der
normalen Knochenmarksdosis pro 100 kg Körpergewicht der Person werden pro
Infusion verabreicht.
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In
einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von Zellen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen
werden mehrere Verabreichungen über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 3-7 Verabreichungen über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabreichungen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
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In
einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von zwischen 107 und
1013 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1-5 × 108 und 1-5 × 1012 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne
Verabreichung von zwischen ungefähr
1 × 109 und 5 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
wird eine einzelne Verabreichung von 4 × 109 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne
Verabreichung von 2 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
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In
einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von zwischen 107 und
1013 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1-5 × 108 und 1-5 × 1012 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache
Verabreichungen von zwischen ungefähr 1 × 109 und
5 × 1011 Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den
Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen
Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von 4 × 109 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden mehrfache Verabreichungen von 2 × 1011 Zellen
pro 100 kg Körpergewicht
der Person über
den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen werden
5 Verabreichungen von 3-5 × 109 Zellen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabreichungen von 4 × 109 Zellen über
den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In
einigen Ausführungsformen
werden 5 Verabrei chungen von 1-3 × 1011 Zellen über den
Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen
Ausführungsformen werden
5 Verabreichungen von 2 × 1011 Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden
Tagen bereitgestellt.
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BEISPIELE
-
Beispiel 1 – nicht
Teil der Erfindung
-
Zellen
aus einer transgenen Mauslinie, die ein humanes Minigen für Kollagen
I in einer gewebespezifischen Weise exprimiert, wurden verwendet,
um zu untersuchen, ob Vorläufer-mesenchymale
Zellen aus Knochenmark, die in Kultur vermehrt wurden, als Langzeitvorläufer von
Knochen und anderen Bindegeweben nach der intravenösen Infusion
in bestrahlte Mäuse
dienen können.
Das Markergen bestand aus einem inneren deletierten Minigen für die humane
Pro-α1(I)Kette
von Prokollagen I, welches die Synthese von verkürzten Pro-α1(I)Ketten bewirkte (Khillan,
J. S. et al., J. Biol. Chem. 266: 23373-23379 (1991); Pereira, R.
et al., J. Clin. Invest. 91: 709-716 (1983); und Sokolov, B. P.
et al., Biochemistry 32: 9242-9249
(1993)). Zellen, die das Gen exprimierten, wurden aus einer Linie
von transgenen Mäusen
erhalten, in denen die Kopienzahl des humanen Minigens relativ zu
dem endogenen Mausgen ungefähr
100:1 betrug, und die Fließgleichgewichtmengen
von mRNA des humanen Minigens relativ zu mRNA aus dem endogenen
Mausgen ungefähr
0,5:1 in den meisten Geweben betrugen.
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Spenderzellen
aus Mark, das teilweise hinsichtlich mesenchymaler Vorläufer angereichert
war, wurde durch Standardprotokolle hergestellt (Friedenstein, A.
J. of al., Exp. Hemat. 4: 267-274 (1976); Castro-Malaspina, H. et
al., Blood 56: 289-301 (1980); Piersma, A. H. et al., Exp. Hematol.
13: 237-243 (1985); Simmons, P. J. und Torok-Storb, B., Blood 78:
55-62 (1991); Beresford, J. N. et al., J. Cell. Sci. 102: 341-351
(1992); Liesveld, J. L. et al., Blood 73: 1794-1800 (1989); Liesveld,
J. L. et al., Exp. Hematot 19: 63-70 (1990); und Bennett, J. H.
et al., J. Call. Sci. 99: 131-139 (1991)). Kurz gesagt, wurden
die Enden von langen Knochen der transgenen Mäuse geschnitten, und das Mark
wurde mit einer unter Druck stehenden Spritze, die mit α-MEM (Sigma)
mit 10 % fötalem
Rinderserum (Atlanta Biologicals) gefüllt war, extrahiert. Ungefähr 107 kernhaltige Zellen wurden auf 175 cm2 Plastikkulturflaschen in 25 ml α-MEM mit
10 % fötalem
Rinderserum ausplattiert. Nach 4 h wurden nicht-adhärente Zellen
verworfen, indem das Medium ausgetauscht wurde. Foci, die zwei bis
vier Fibroblasten-ähnliche
Zellen enthielten, erschienen in 2 bis 3 Tagen, und die Foci wuchsen
zu nahezu konfluenten Kolonien in ungefähr 1 Woche. Die Ausbeute betrug
ungefähr
107 Zellen pro Flasche nach Trypsin-Spaltung.
In der Phasenkontrastmikroskopie waren die meisten der Zellen Fibroblasten-ähnlich,
aber einige wenige Makrophagen und Adipozyten wurden auch beobachtet.
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Ungefähr 105 der kultivierten adhärenten Zellen wurden mit 6 × 105 nicht-adhärenten Zellen
gemischt, die durch Inkubation von Mark aus normalen Mäusen für 4 h auf
175 cm2 Flaschen unter denselben Bedingungen
erhalten wurden, die für
die anfängliche
Isolierung der adhärenten
Zellen verwendet wurden. Das Gemisch aus ungefähr 7 × 105 Zellen
in 0,2 bis 0,4 ml α-MEM
und 10 % fötalem
Rinderserum wurde in die Schwanzvene jeder Empfängermaus injiziert.
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Acht
Wochen alte Mäuse
aus derselben Inzucht FVB/N-Linie wurden hergestellt, um die Spenderzellen
durch Bestrahlung mit einem 137Cu-Bestrahler
(Atomic Energy of Canada, Ltd.) zu erhalten. Die Einheit wies eine
Dosisrate von 116 cG/min mit einer parallel entgegengesetzten Bestrahlungskonfiguration
auf. Jedes Tier erhielt 9,0 Gy in zwei Fraktionen mit einem 4 h
Intervall (4,5 Gy + 4,5 Gy) (O'Hara,
M. D. et al., Exp. Hemat. 19: 878-881 (1991)). Eine bis 2 Stunden
nach der zweiten Bestrahlungsfraktion wurde das Gemisch von markierten
adhärenten
Zellen und normalen nicht-adhärenten
Zellen intravenös
injiziert. Die zur Kontrolle bestrahlten Mäuse, die keine Zellinfusion
erhielten, starben nach 10 bis 13 Tagen aufgrund von Markversagen.
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Um
das Schicksal der Spenderzellen zu verfolgen, wurden zwei PCR-Assays
aus dem humanen COL1A1-Minigen und dem Maus-endogenen COL1A1-Gen
entwickelt. Mit einem Zwei-Primer-Assay waren die Werte für das Verhältnis des
humanen und des Mausgens linear über
einem Bereich von 10–4 bis ungefähr 10+1 und deshalb von ungefähr 10–6 bis
10–1 Spenderzellen
pro Empfängerzelle.
Mit dem Drei-Primer-Assay waren die Werte linear über einem
Bereich von ungefähr
103 bis 10+2 und
deshalb ungefähr
10–5 bis
1 Spenderzelle pro Empfängerzelle.
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Assays
von bestrahlten Mäusen
nach einem Tag zeigten nur Spuren von Mengen der Spenderzellen im
Mark, der Milz, dem Knochen, der Lunge oder dem Gehirn (Tabelle
1). Geringfügig
höhere
Mengen wurden nach sieben Tagen beobachtet. Nach 30 Tagen und 150
Tagen machten Nachkommen der Spenderzellen 2,0 bis 12 % der Zellen
im Mark, der Milz, dem Knochen und der Lunge aus (Tabelle 1). Nach
150 Tagen machten sie außerdem
1,5 bis 5 % der Zellen im Xiphoid-Knorpel aus, der frei von irgendwelchem
mineralisierten oder fibrösen
Gewebe unter einem Mikroskop präpariert
wurde. Obwohl es schien, dass die durchschnittlichen Werte einen
Abfall zwischen dem 1. und dem 5. Monat zeigten, gab es keinen statisch
signifikanten Abfall in den kombinierten Werten für Mark,
Milz, Knochen und Lunge zwischen diesen zwei Zeiträumen (Tabelle
1). Assays von nicht-bestrahlten
Mäusen
zeigten nur sehr geringe Mengen der Spenderzellen an denselben Zeitpunkten (< 0,0001 bis 0,05
%). PCR in situ Assays von Gewebeschnitten der Lunge zeigten, dass
die Nachkommen der Spenderzellen gleichmäßig in dem Parenchym von sowohl
der Lunge als auch den Bronchien verteilt waren.
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Um
zu bestätigen,
dass Nachkommen der Spenderzellen im Knorpel anwesend waren, wurden
Chondrozyten aus dem Xiphoid und artikulären Knorpel durch Spalten bei
37°C über Nacht
mit 0,5 mg/ml bakterieller Kollagenase (Sigma) in DMEM isoliert.
PCR-Assays zeigten, dass Nachkommen der Spenderzellen 2,5 % der
isolierten Chondrozyten ausmachten.
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Um
zu bestimmen, ob die Spenderzellen funktionelle mesenchymale Zellen
in den Geweben geworden waren, die sie bevölkerten, wurden die Gewebe
der Empfängermäuse durch
RT-PCR hinsichtlich der Expression des humanen Minigens für Kollagen
I, das in den Spenderzellen enthalten ist, untersucht. In drei Mäusen, die
nach 150 Tagen untersucht wurden, wurde das Minigen im Knochen exprimiert,
einem Gewebe, in dem über
die Hälfte
des synthetisierten Proteins Kollagen I ist. Die Expression im Knochen
wurde durch einen ähnlichen
Assay an Knochenzellen bestätigt,
die vom Oberschenkel isoliert und für 1 Woche kultiviert wurden. Die
Expression des Minigens für
Kollagen I war variabler im Mark, der Milz und der Lunge; Geweben,
in denen die Rate von Kollagen I-Synthese geringer ist als im Knochen.
Wie erwartet, wurde das Minigen nicht im Knorpel exprimiert; einem
Gewebe, in dem die Hälfte
des synthetisierten Proteins Kollagen II ist, aber in dem es keine
Synthese von Kollagen I gibt. Das Minigen für Kollagen I wurde ebenfalls
nicht in Kulturen von Chondrozyten von den Empfängermäusen exprimiert, die das Markergen
enthielten und die Kollagen II, aber kein Kollagen I synthetisierten.
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Frühere Berichte
haben gezeigt, dass Assays von Zellen mit zytochemischen Markern
oder für
mRNAs zeigten, dass die Zellen Kollagen I, Kollagen III, Fibronectin,
alkalische Phosphatase und Osteopontin synthetisierten, aber sie
wiesen keine charakteristischen Merkmale von Makrophagen, Granulozyten,
T-Lymphozyten, B-Lymphozyten
oder endothelialen Zellen auf. Diese Ergebnisse hier zeigen, dass
nach intravenöser
Injektion in bestrahlte Mäuse,
die vermehrten Kulturen von adhärenten
Zellen wirksam verschiedene Bindegewebe besiedeln. Die Ergebnisse
zeigen auch, dass die Zellen als wahre Vorläuferzellen für diese
Gewebe dienen, weil sie das Markergen für Kollagen I in gewebespezifischer
Weise exprimierten, und weil sie diffus in das mesenchymale Parenchym
der Lunge eingebaut wurden.
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Beispiel 2
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Bedingungen für die Isolierung
und Kultur von MSCs.
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Es
wurden Kulturbedingungen von MSCs untersucht, so dass sie sich vermehrten,
aber den Stammzell-ähnlichen
Phänotyp
beibehielten. Tabelle I zeigt, dass eine Ko-Kultur von MSCs mit
Stücken
von Knochen die Zellzahl steigerte, die nach einer Woche erhalten
wurde. Gleichzeitig verringerte das Ko-Kultivieren mit Knochen die
alkalische Phosphatase-(APase)-Mengen in den Zellen, eine Beobachtung,
die nahelegt, dass die Zellen nicht zu Osteoblasten differenzierten.
Es gab auch einen Abfall in den Mengen der Tartrat-resistenten Säurephosphatase
(TRAP), eine Beobachtung, die nahelegt, dass die Zellen nicht zu
Osteoklasten differenzierten. Ähnliche
Wirkungen wurden mit sekundären
Kulturen der MSCs beobachtet. Deshalb legen die Ergebnisse nahe,
dass Ko-Kultivieren mit Knochenstücken verbesserte Bedingungen
für die
Vermehrung von MSCs bereitstellen kann. Auch das Medium der kultivierten
Knochenstücke
kann eine wichtige Quelle von Zytokinen und Wachstumsfaktoren für die Vermehrung
von MSCs in Kultur sein.
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In ähnlichen
Experimenten wurde gefunden, dass sekundäre Kulturen von MSCs für lange
Zeiträume aufrechterhalten
werden können.
MSCs können
in Kultur für über 4 Monate
durch Trypsinierung und erneutes Ausplattieren passagiert werden.
Die Zellen sind in Kulturen der stationären Phasen bemerkenswert stabil.
In einem Experiment bleiben Kulturen in der stationären Phase über 4 Monate
mit erneutem Füttern
ungefähr
einmal wöchentlich
lebensfähig.
In einem anderen Experiment blieben die Zellen lebensfähig, wenn
sie, unter Aufsicht in einem Inkubator ohne erneutes Füttern für 1 Monat
belassen wurden.
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Stabile Transfektion von
MSCs mit einem Retrovirus-Vektor
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Um
Virus für
die Infektion von MSCs zu erhalten, wurde LNCZ retroviraler Vektor
(Miller, A. D. und Rosman, G. J. (1989) BioTechniques 7, 980-990,
das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist) modifiziert, so dass
der Promotor für
Zytomegalovirus (pCMV) die Expression des lacZ-Gens (1)
steuerte. Der Vektor wurde stabil in eine amphotrophe murine Verpackungszelllinie
(PA317) transfiziert. Konstitutive Virus-bildende Klone wurden durch
G418-Selektion isoliert, und der Überstand von den Klonen wurde
für die
Infektion von MSCs verwendet. Primäre Kulturen von MSCs (3 Tage
alt) wurden für
drei aufeinanderfolgende Tage mit frischem Überstand von der Herstellerlinie
mit dem höchsten
Titer infiziert. Die Färbung
der Zellen 5 Tage später zeigte,
dass ungefähr
15-20 % der Zellen typischerweise das lacZ-Gen exprimierten. Einige
Kulturen der infizierten Zellen wurden unter Selektion mit G418
(0,4-4 μg/ml
aktive Konzentration) für
5 Tage gegeben. Die meisten der gewonnenen Zellen exprimierten das
lacZ-Gen kontinuierlich. Es wurden auch Modifikationen von LNCZ
konstruiert, so dass die Expression des lacZ-Gens durch den Promotor
des COL1 A1-Gens und des Promotors des COL2 A1-Gens (pCOL2A1) gesteuert
wurde. Eine Expression des lacZ-Gens wurde erfolgreich in primären Kulturen
von MSCs mit beiden Konstrukten erhalten.
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Austausch von Knochenzellen
in transgenen Mäusen
gegen normale MSCs.
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MSCs
aus normalen Mäusen
wurden in die transgenen Mäuse
infundiert, die hohe Mengen des mutierten COL1 A1-Gens (Tabelle
II und III) exprimierten. Ein Monat nach der Infusion von normalen
MSCs in die Osteo-Imperfecta-(OI)-Mäuse (Tabelle II) machten die
Nachkommen der Spenderzellen 10 bis 45 % der Knochenzellen in den
Empfängermäusen aus,
die mit einer maximal tolerierten Dosis an Röntgenstrahlung (700 centi-Gray
oder cGy) bestrahlt wurden. Ähnliche
Werte wurden mit Mäusen
erhalten, die mit der Hälfte
der maximal tolerierten Dosis an Röntgenstrahlung (350 cGy) bestrahlt
wurden. Jedoch verringerte eine Verringerung der Dosis auf ein Viertel
(175 cGy) die Werte in vier Mäusen
auf 0 %, 5 %, 10 % und 40 %. Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten, wenn OI-transgene Mäuse mit gro ßen Zahlen von Gesamtknochenmarkszellen
infundiert wurden, aus denen MSCs nicht entfernt wurden (Tabelle
III).
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In
fünf Empfängermäusen, in
denen die Synthese von proα1(1)-Ketten
untersucht wurde (Tabellen II und III), wurde der Austausch der
Knochenzellen des Empfängers
gegen normale Spender-MSCs durch einen Anstieg gegenüber dem
Verhältnis
von normalem proα1(1)-Ketten
gegenüber
mutierten proα1(1)-Ketten
im Knochen begleitet. Somit war der Austausch durch normale Zellen
von der erwarteten Veränderung
auf der Proteinebene begleitet.
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Beispiel 3
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Langzeitexpression der
humanen Gene für
hGH, Faktor IX oder Ob in stabil transfizierten MSCs.
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MSCs
wurden aus Mäusen
isoliert und unter Bedingungen kultiviert, die beschrieben sind
in Pereira, R. F. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4857-4861.
MSCs wurden mit retroviralen Vektoren infiziert oder mit nackter
DNA transfiziert, um Klone zu erhalten, die Gene für humanes
Wachstumshormon (hGH), das humane Fettsuchtprotein (Ob) oder das
Gen für
humanen Faktor IX exprimieren. Weil ein lacZ-Gen erfolgreich in
Maus-MSCs mit einem retroviralen Vektor eingeführt wurde, wurden Varianten
desselben Vektors verwendet. Gleichzeitig werden MSCs stabil mit
Elektroporation transfiziert (Andreason, G. L und Evans, G. A. (1988) BioTechniques
6, 650-660 und Toneguzzo, F. et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6, 703-706),
Lipofektamin und Kerninjektion (Mercer, W. E., et al. (1992) In:
Antisense Strategies, Ann. N. Y. Acad. Sci. Biol. 660, 209-218,
das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist), so dass größere endogene
Gene verwendet werden können.
Darüber hinaus
werden einige der potentiellen Nachteile von Retroviren unter Verwendung
von alternativen Verfahren zur Einführung vermieden.
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Standardbedingungen
für die
Isolierung und Kultur sind: Gesamtmark wird aus den Unterschenkeln und
Oberschenkeln von 6-10 Wochen alten FVB/N-Mäusen durch Zerschneiden der
Knochenenden und Extrudieren des Marks mit einer Spritze, die 1
bis 2 ml eiskaltes α-MEM
und 10 % fötales
Rinderserum (FBS) enthält,
erhalten. Die vereinigten Markzellen werden durch vorsichtiges Schütteln verteilt
und in einem automatisierten Zählgerät (Coulter
Modell ZM) gezählt.
Von 5 × 106 bis 5 × 107 kernhaltige Zellen in 25 ml α-MEM und
10 % FBS wurden auf 75 cm2 Kulturflaschen
ausplattiert. Nach 4 h oder 3 Tagen werden die nicht-adhärenten Zellen
durch Austauschen des Mediums entfernt. Die adhärenten Zellen werden als primäre Kulturen für 10 bis
12 Tage mit einem erneuten Füttern
ungefähr
alle 4 Tage vermehrt. Die Zellen werden durch Spalten mit 0,25 %
Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für
5 min bei 37°C
nach vorsichtigem Abschaben gewonnen. Die Zellen werden mit α-MEM mit
10 % FBS verdünnt
und erneut bei einer Dichte von 3 × 104 bis
1 × 105 pro 9,5 cm2 in
Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert. Unter diesen Bedingungen
beträgt
die Verdopplungszeit der Zellen 19 bis 22 Stunden. Die sekundären Kulturen
werden erneut ungefähr
alle 4 Tage gefüttert
und durch Trypsinierung und erneutes Ausplattieren unter denselben
Bedingungen passagiert.
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Herstellung von Genkonstrukten.
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Der
Retrovirus-Vektor LNCX wird als das Ausgangskonstrukt verwendet.
Es werden geeignete Klonierungsstellen in dem Konstrukt verwendet,
um die modifizierten Konstrukte pRSV-lacZ, pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ
und pCOL2-lacZ (1) herzustellen. Der pCOL1-Promotor
ist ein 1,4 kb Fragment, das 476 bp des Promotors, das erste Exon
und den größten Teil
des ersten Introns des humanen COL1A1-Gens enthält. Von dem Promotor wurde
gezeigt, dass er in transgenen Mäusen
eine promotorlose Form des COL2A1-Gens in einer stark gewebespezifischen
und entwicklungsspezifischen Weise exprimiert (Sokolov, B. P. et
al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 9622-9629). Der COL2A1-Promotor ist
ein 1 kb Fragment aus dem humanen COL2A1-Gen (Ala-Kokko, L. et al.
(1991) J. Biol. Chem. 266, 14175-14178), das der Expression Gewebespezifität verleiht (Bradham,
D. M. et al. (1994) J. Cell Physiol. 158, 61-68). Das lacZ-Gen wird
gegen das hGH-Gen (Nichols Laboratories); das OB-Gen (Considine,
R. V. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95, 2986-2988), oder das humane Faktor
IX Gen (Genetic Therapy, Inc.) ausgetauscht.
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Verwendung des Retrovirus-Vektors.
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Retrovirus-Herstellungszellinien.
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Um
Herstellungszelllinien zu etablieren, wurden amophotrophe Retrovirus
verpackende murine Zellen PA317 verwendet. Die Zellen wurden bei
20 % Konfluenz in 100 mm-Schälchen
durch das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
(Promega) unter Verwendung von 15 μg Plasmid-DNA, die durch Spalten
mit Scal linearisiert wurde, das in der pBR322-Region des Retrovirus-Vektors
spaltet, transfiziert. Ein Tag nach der Transfektion wurde G418
(GIBCO/BRL) zu dem Medium in einer aktiven Konzentration von 1 mg/ml
zugegeben. Neomycin-resistente Kolonien traten nach 7 bis 10 Tagen
der Selektion auf und wurden durch Klonieren mit mechanischen Ringen
isoliert. Die Kolonien wurden vermehrt, und einzelne Kolonien wurden
hinsichtlich der Fähigkeit,
lacZ zu exprimieren, durch direktes Färben in doppelten Vertiefungen
getestet. Der Virustiter, der von den positiven Zellen gebildet
wurde, wurde durch eine einzelne Zugabe von 50 μl des Mediums zu HT-1080 humanen Tumorzellen,
die bis zu 20 % Konfluenz in Mikroplatten mit 6 Vertiefungen mit
3 ml Medium pro Vertiefung und in der Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren
angezogen wurden, untersucht. Der Titer wurde durch Bestimmen der
Zahl von HT-1080-Zellen, die sich positiv hinsichtlich der Expression
des lacZ-Gens färbten, untersucht.
Typischerweise betrug der Titer 1 × 105 bis
1 × 106.
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Retrovirus-Infektion von
Maus-MSCs.
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Primäre Kulturen
von Maus-MSCs wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach 3 Tagen
wurden die nicht-adhärenten
Markzellen verworfen, und frisches Medium wurde zugegeben. Die Zellen
wurden anschließend
mit dem Retrovirus in der Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren durch Zugabe von
1/4 Volumen von frischem Überstandmedium
aus stabil transfizierten Herstellungszellen infiziert, welche den
höchsten
Titer der Virusbildung aufwiesen. Die Infektion wurde an zwei zusätzlichen
aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Die Zellen wurden anschließen entweder
direkt hinsichtlich lacZ-Expression gefärbt oder in größere Schälchen geteilt
und unter Selektion mit 0,4 mg/ml G418 (aktive Konzentration) gegeben.
Ungefähr
15 bis 20 % der Primärkulturen
waren positiv hinsichtlich lacZ, und die meisten Zellen, welche
die G418-Selektion überlebten,
waren positiv hinsichtlich lacZ.
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Lipofektamin-Transfektion.
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Primäre MSCs-Kulturen
wurden für
10 Tage in α-MEM
mit 10 % FBS angezogen. Nach der Trypsinierung und leichtem Abschaben
wurden die Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen zu einer Dichte
von 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Die Zellen
wurden für
zwei Tage angezogen, anschließend
zweimal mit PBS gewaschen und mit einem DNA-Lipofektamin-Komplex
inkubiert. Der DNA-Lipofektamin-Komplex
wurde wie folgt hergestellt: 6 μl
Lipofektamin (GIBCO/BRL) wurden mit 1 μg LINCZ-DNA in 200 μl α-MEM gemischt,
bei Raumtemperatur für
30 min inkubiert und zu einer Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen
mit MSCs in 800 μl α-MEM zugegeben.
Nach 6 h Inkubation bei 37°C
wurde der DNA-Lipofektamin-Komplex
gegen 2 ml α-MEM
mit 10 % FBS ausgetauscht. Die Zellen wurden hinsichtlich lacZ gefärbt oder
unter G418-Selektion nach 18 h Inkubation in FBS-enthaltendem Medium
gegeben. Es wurden positive Klone erhalten, aber sie wuchsen nur
langsam, offensichtlich weil die Zelldichte nach der G418-Selektion zu gering
war. Um diese Situation zu umgehen, wurden drei verschiede ne Strategien
verwendet: (a) Die Zellen wurden mit höheren Dichten ausplattiert;
(b) ko-kultivierte Zellkultur-Inserts werden über die überlebenden Klone früh im Selektionsverfahren
gegeben und frische MSCs oder Knochenstücke in den Inserts (siehe Tabelle
1) werden auf einer täglichen
Basis zugegeben, um die notwendigen Zellfaktoren, um das Wachstum
zu stimulieren, bereitzustellen; (c) zu dem Zeitpunkt, zu dem die
Selektion mit G418 viele der nicht-transfizierten Zellen abgetötet hat,
werden die Kulturen erneut mit MSCs ausgesät, die mit einer Variante des
Retrovirus LNCX (2) infiziert wurden, in denen
das lacZ-Gen gegen ein selektierbares Gen für Thymidinkinase ausgetauscht
wurde. Deshalb werden die MSCs, die stabil mit Retrovirus transfiziert
sind, verwendet, um die notwendigen Zytokine, Wachstumsfaktoren
und Zellinteraktionen bereitzustellen, die für das anfängliche Wachstum der transfizierten
MSCs während
der Selektion in G418 benötigt
werden. Wir können
anschließend
die Zellen, die mit dem Retrovirus infiziert sind, durch negative
Selektion mit Gancyclovir entfernen.
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Verabreichungsverfahren
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Kerninjektionen.
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Kerninjektionen
sind hoch wirksam als ein Mittel zum Transfizieren einiger Zellen.
Die Zellen wurden in 60 mm-Schälchen
mit einem 22 × 22
mm Deckel (Coverslip), der mit einem Kreis markiert war, um den
Bereich für
die Mikroinjektion zu kennzeichnen, ausplattiert. Die Zellen wurden
in Medium mit 0,1 % FCS für
5 Tage inkubiert, um den Wachstumsarrest vor der Mikroinjektion
zu induzieren. Unter diesen Bedingungen bauten zwischen 8 und 15
% der Zellen [3H]Thymidin während der
kontinuierlichen Markierung für
24 h zwischen 5 und 6 Tagen ein. Die Mikroinjektion wurde unter
Verwendung eines Zeiss Axiovert invertierten Mikroskops, das mit
einer Eppendorf Mikroinjektion und einem Mikromanipulator ausgestattet
war, unter Verwendung kommerziell erworbener Glaskapillar-Femtotips
(Eppendorf), durchgeführt.
Alle Zellen innerhalb eines gekennzeichneten Bereichs auf dem Deckel
(für gewöhnlich 150-200)
wurden in den Kern mit DNA bei Konzentrationen im Bereich von 0,01-10 μg/ml in 10
mM Tris-Puffer (pH 7,6) mikroinjiziert. Die injizierten Zellen werden
vermehrt und wie oben beschrieben untersucht.
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Elektroporation
-
MSCs
werden mit 0,25 % Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für 5 min bei Raumtemperatur
behandelt und anschließend
durch Abschaben geerntet. Die Zellen werden durch Zentrifugation
bei 4000 × g
für 10
min pelletiert, und anschließend
werden sie zweimal durch Resuspendieren des Pellets in eiskaltem
PBS (pH 7,4) gewaschen. Die MSCs werden bei 2 × 106 Zellen
pro 0,8 ml resuspendiert und in eine Elektroporationscuvette (0,4
cm Lücke)
aliquotiert. Die Zellen werden bei 10 min auf Eis inkubiert, DNA
wird zu der Suspension (5-50 μg)
zugegeben, und die Zellen werden für weitere 10 min gekühlt. Die
Zellsuspension wird anschließend
unter Verwendung eines herkömmlichen
Instruments (BioRad Gene Pulser, Modell 1652076) bei einer empirisch
bestimmten Feldstärke,
welche den größten Prozentsatz
von Zellen liefert, welche exogen zugegebene DNA zurückhalten,
elektroporiert. Um die geeignete Feldstärke für MSCs zu bestimmen, werden
Titrationen im Bereich von 0,25-2,5 kv/cm durchgeführt. Die
Elektroporationswirksamkeit wurde durch Einführen eines lacZ-Gens (LNCZ-Vektors)
und anschließendem
Färben
der Zellen 48 bis 72 h nach der Elektroporation überwacht.
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Assays.
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hGH
-
Die
Expression des hGH-Gens wird durch Untersuchen des Mediums hinsichtlich
Zellklonen überwacht,
die in Mikrotiterplatten mit 6 Vertiefungen angezogen wurden, mit
einem Enzym-basierten Immunoabsorbent-Assay mit einem kommerziell
erhältlichen
Kit (GIBCO/BRL). In diesem Assay werden 0,1 ml 2 × verdünnter Puffer
pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte zugegeben. Nach 5 min werden
0,1 ml der Testprobe zugegeben, und die Platte wird bei 37°C für 30 min
inkubiert. Die Vertiefungen werden 5 mal gewaschen, und 0,2 ml primärer Antikörper wird
zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Proben werden bei 37°C für 30 min
inkubiert und 5 mal gewaschen. Anschließend werden 0,2 ml Substratpuffer
mit O-Phenylendiamin-Substrat zugegeben. Die Proben werden bei Raumtemperatur
für 30
min inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 2 N
Schwefelsäure
abgestoppt. Die Absorption der Probe wird bei 490 nm bewertet.
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Ob-Protein.
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Die
Zellen werden hinsichtlich Expression des Ob-Gens mit einem Proteinradioimmunassay
des Zellmediums untersucht. Der primäre Antikörper für humanes Ob-Protein wird in
Kaninchen gegen rekombinantes Protein gewonnen, das in einem E.
coli Expressionssystem synthetisiert und bis zur Homogenität gereinigt wurde.
Das humane Protein ist hoch homolog zu der Maus und deshalb sollten
anti-humane Antikörper
mit dem Mausprotein kreuzreagieren. Wenn sie dies nicht tun, dann
wird die kurze Maus-cDNA (619 nt) in E. coli exprimiert, das Protein
gereinigt, und die Antikörper
werden hergestellt. Alternativ werden synthetische Peptide mit der
Maus-Sequenz gekauft, und diese werden verwendet, um Antikörper herzustellen.
Für den
Assay wird rekombinantes Ob-Protein radioaktiv mit 125Iod
durch das Bolton-Hunter-Verfahren radioaktiv markiert, gefolgt durch
Gelfiltrationsreinigung unter Verwendung von Sephadex G-25. Die
erhaltene spezifische Aktivität
betrug –30 μCi/μg. Die Assayproben
(0,2 ml) wurden mit primärem
Antiserum (1:2000 Verdünnung)
in Phosphat-gepufterter Salzlösung
mit 0,1 % Triton X-100 für
16 h bei 4°C
in einem Gesamtvolumen von 0,4 ml präinkubiert. 125I-Ob-Protein
(30.000 cpm im 100 μl)
wurde anschließend
zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 24 h fortgesetzt.
Das gebundene Ob-Protein (12 ± 1
%; unspezifische Bindung 1,4 ± 0,1
%) wurde durch Zugabe von 0,1 ml Schaf-anti-Kaninchen-IgG-Serum (Antibodies, Inc.,
Davis, CA), 0,1 ml normalem Kaninchen serum (GIBCO/BRL, Gaithersburg,
MD) und 0,1 ml 10 % Polyethylenglycol immunpräzipitiert. Die Gefäße wurden
für 15
min (2200 rpm) zentrifugiert, und ungebundene Markierung wurde dekantiert
und das Pellet in einem Packard 5000 Gamma Zählgerät (Downers Grove, IL) gezählt. Die
Konzentration des Ob-Proteins
in unbekannten Proben wurde unter Verwendung von Rodbard's ungewichtetem vierparametrischen
Logistikmodell berechnet. Die Nachweisgrenze dieses Assays beträgt 0,39
ng/ml. Die Infra-Assay-Varianz beträgt 11,6 % bei 12 ng/ml mit
einem Inter-Assay-Varianz von 20,8 % bei 13,1 ng/ml.
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Humaner Faktor IX.
-
Die
Expression des Gens für
Faktor IX wird mit einem kommerziell erhältlichen ELISA (American Bioproducts
Company) unter Bedingungen, die jenen ähnlich sind, die für den hGH-Assay
(oben) verwendet wurden, untersucht. Wie von Smith et al. (74) berichtet
wurde, erreichte die Standardkurve von 1-50 ng/ml, und die Sensitivitätsgrenze
betrug 1 ng/ml. Der Assay zeigte keine Kreuzreaktivität mit Mausfaktor
IX.
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Beispiel 4 – nicht
Teil der Erfindung
-
Die
verzögerte
Expression der drei Gene bei physiologisch wichtigen Mengen durch
synthetische Infusion von stabil transfizierten MSCs in Mäuse.
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Die
Experimente mit den OI-transgenen Mäusen (Tabelle II und III) haben
gezeigt, dass kultivierte MSCs als Stammzell-ähnliche Vorläufer von
Knochen-, Knorpel- und
anderen mesenchymalen Geweben nach systemischer Infusion dienen
können.
Deshalb werden MSCs, die hGH, das Ob-Protein oder Faktor IX exprimieren,
in bestrahlte und nicht-bestrahlte Mäuse infundiert, um die verzögerte Expression
der Gene in vivo zu bewerten.
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Infusion von MSCs.
-
Anfänglich werden
MSCs in Mäuse
unter Bedingungen wie jenen, die in Tabelle III beschrieben sind, infundiert
(3 Wochen alte Mäuse:
300 oder 700 Gray Bestrahlung; intraperitoneale Injektion; 1 × 106 MSCs; und 2 × 108 Gesamtmarkszellen).
Zusätzlich
wird die intravenöse
Infusion mit intraperitonealer verglichen; und niedrige Mengen von
Röntgenbestrahlung
werden eingesetzt. Außerdem
werden die Zellen in Embryos durch Kaiserschnitt infundiert. In
vorläufigen
Versuchen wurden 50 μl
5 × 104 ES in das Amnion von sieben 13 Tage alten
Embryos injiziert; 6 von 7 wurden als lebendige junge Mäuse geboren.
Deshalb ist die intrauterine Injektion von MSCs machbar.
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Wachstumskurven.
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Die
wirksame in vivo Expression von hGH sollte die Wachstumsrate von
Mäusen
steigern, und das Ob-Protein sollte das Hungern (Starvation) induzieren.
Deshalb wird das Gewicht und die Größe der behandelten Mäuse und
der Kontrollen überwacht.
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Assays für die Genexpression.
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Es
wurde Blut aus dem retro-orbitalen Plexus der Mäuse nach 1 Woche, 1 Monat,
3 Monaten, 5 Monaten, 10 Monaten und 20 Monaten nach Infusion der
MSCs erhalten. hGB und Faktor IX werden durch ELISA untersucht,
und das Ob-Protein wird mit einem Radioimmunassay untersucht. Zusätzlich wird,
falls messbare Anstiege in humanem Faktor IX mit dem ELISA erhalten
werden, das Verfahren, das in Smith, T.A.G., et al. (1993) Nature
Genet. 5, 397-402, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist,
beschrieben ist, verwendet, um biologisch aktiven humanen Faktor
IX zu untersuchen. In diesem Verfahren wird humaner Faktor IX zunächst in
einer Mikrotitervertiefung mit einem monoklonalen Antikörper, BGIX1, gefangen
und anschließend durch
Faktor XIa aktiviert. Der aktive Faktor IX, in Verbindung mit Faktor
VIII, wandelte Faktor X in Xa um. Der Faktor Xa spaltete das chromogene
Substrat, S-2765, was zu einem gelben Produkt führte. Die BGIX1-beschichteten
Mikrotiterplatten und Faktor VIII wurden von Elcatech, Inc. (Winston-Salem,
NC) gekauft. Faktor XIa wurde von Enzyme Research Labs, Inc. (South
Bend, IN) gekauft. Faktor X, Phospholipid-Lösung, S-2765 und der Thrombin-Inhibitor
1-2581, wurden von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH) gekauft.
Vier Puffer wurden hergestellt: A, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 %
BS, pH 7,5; B, 150 mM Tris, 5 mM CaCl21
10 mg/ml–1 Gelatin,
pH 7,6; C, 50 mM Tris, 10 mM CaCl2 pH 7,5;
D, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,4. Der Faktor-VIII/X-Reaktionsmix wurde
frisch durch Mischen gleicher Mengen der folgenden Stocklösungen hergestellt:
Faktor VIII, 5 U ml–1 in Puffer A, Faktor
X, 1 U ml–1 in
Puffern; 1-2581, 34 μg
ml–1 in
Puffer A; CaCl2, 25 mM in Wasser; und Phospholipid.
Die Plasmaproben wurden in Puffer A verdünnt, und 100 μl wurden
zu jeder Vertiefung in der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Platte
wurde für
90 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend fünfmal mit Puffer B gewaschen.
100 μl Faktor
XIa (μg
ml–1 in
Puffer C) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 30 min bei
37°C wurden
100 μl S2765
(0,5 mM in Puffer D) zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte wurde
für 10
min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe
von Essigsäure
in einer Endkonzentration von 10 % abgestoppt wurde. Die Absorptionen
bei 405 nm wurden mit einem BioRad Mikroplatten-Lesegerät bestimmt.
Die Standardkurve, hergestellt mit Verdünnungen von humanem normalen
gepoolten Plasma, war von 3-25 ng ml–1 linear.
Der Assay kreuzreagierte nicht mit Mausfaktor IX. Faktor IX, Mengen
von 250 ng pro ml oder 5 % des Normalen wurden im Allgemeinen als
therapeutisch erachtet, und 100 bis 150 ng/ml wurden als vorteilhaft
erachtet.
-
Beispiel 5
-
Verzögerte Expression
der Gene bei physiologisch wichtigen Mengen, in denen die MSCs in
subkutane Diffusionskammern gegeben wurden.
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Zellen,
die in subkutanen Diffusionskammern implantiert waren, weisen mindestens
zwei unterschiedliche Vorteile für
die Therapie von Patienten auf: (a) Immunantworten werden umgangen;
und (b) wenn sie in Kapseln in Mäuse
(Benayahu, D. et al. (1989) J. Cell Physiol. 140, 1-7), in Ratten
(Mardon, H. J. et al. (1987) Cell Tissue Res. 250, 157-165) oder
Kaninchen (Friedenstein, A. J., et al. (1987) Cell Tissue Kinet.
20, 263-272) implantiert werden, überleben sie für mindestens
6 Wochen (Wakitani, S. et al. (1994) J. Bone and J. T. Surgery 76A,
579-592), offensichtlich, weil sie als Knochen, fibröses Gewebe
oder Knorpel persistieren, das keine Vaskularisierung benötigt (Benayahu,
D. et al. (1989) supra, Mardon, H. J. et al. (1987) supra, Owen, M.
und Friedenstein, A. J. (1988) In: Cell and Molecular Biology of
Invertebrate Hard Tissues, Wiley Chicester, CIBA Foundation Symposion,
136, 42-60 und Friedenstein, A. J. et al. (1987) supra).
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Herstellung von Kammern.
-
Die
Diffusionskammern wurden aus kommerziell erhältlichen Bestandteilen (Millipore
Corp.) zusammengebaut und wie in vorherigen Berichten beschrieben,
verwendet (Benayahu, D. et al. (1989) supra, Mardon, H. J. et al.
(1987) supra). Kurz gesagt, wurden Membranfilter mit 0,3 μm Porengröße an einer
Seite von jeder der zwei Plastikringe mit Acrylkleber verklebt.
Die zwei Ringe wurden anschließend
zusammengeklebt, um eine Kammer zu bilden, die Dimensionen betragen
9 mm innerer Durchmesser und 9 mm Stärke mit einem Volumen von ungefähr 127 mm3. Von 104 bis 107 MSCs werden in die Kammern durch ein Loch
in einem Ring inokuliert, und das Loch wird mit einem kegelförmigen Plastikstopfen,
der mit Klebstoff beschichtet ist, versiegelt. Die Kammern werden
in Mäuse
entweder subkutan im Rücken
oder intraperitoneal unter Anästhesie
implantiert. Anfänglich
wird eine oder werden mehrere Kammern in frisch entwöhnte bzw.
abgestillte Mäuse
(3 Wochen) eingebaut. Anschließend
werden die Kammern in 1-Wochen-alte Mäuse inseriert. Für die Experimente
mit den 1-Wochen-alten Mäusen
werden kleinere Kammern aus Scheiben (5 mm innerer Durchmesser)
hergestellt, die aus Plastikspitzen für Mikropipetten ausgeschnitten
wurden.
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Assays
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Es
wurde Blut von dem retro-orbitalen Plexus 1 Woche, 1 Monat, 3 Monate,
5 Monate, 10 Monate und 20 Monate nach der Implantation der Kammern
erhalten. Das Plasma wird hinsichtlich hGB, Ob-Protein und Faktor
IX, wie oben beschrieben, untersucht.
-
Beispiel 6
-
Unter
Bezugnahme auf 2 kann die Diffusionskammer
(1) ein Kammerfass bzw. eine walzenförmige Kammer (3) mit
zwei Enden, einem ersten Ende (5) und einem zweiten Ende
(7) aufweisen. Das Fass kann einen oder mehrere Ringe aufweisen,
die durch nicht-toxische Mittel miteinander verbunden sind. Die
Kammer ist an jedem Ende mit einem Filter, einem ersten Filter (9)
und einem zweiten Filter (11) ausgestattet. Die Filter sind
porös gegenüber Faktoren,
so dass die Faktoren zwischen der Kammer und dem Säugetier
passagieren können.
Die Filterporengröße kann
ungefähr
0,25 μm
oder kleiner, vorzugsweise ungefähr
0,1 μm sein.
Die Filter sind aus Plastik, Teflon, Polyester oder irgendeinem
inerten Material, das stark, flexibel und in der Lage ist, chemischen
Behandlungen zu widerstehen, hergestellt. Die Filter können in
eine Position mit Gummimanschetten gesichert sein, die auch eine
festere Versiegelung bereitstellen. Wahlweise kann der Fass abschnitt der
Kammer auch eine Öffnung
(13) aufweisen, die mit einer Kappe (nicht gezeigt) bedeckt
sein kann. Die Kappe kann aus einer Art selbstversiegelndem Gummi
hergestellt sein und in die Öffnung
eingepasst sein. Das Einführen
von Zellen in den Kammerinnenraum kann somit durchgeführt werden, indem
die Öffnung
durch Entfernen der Kappe geöffnet
wird und die Zellen unter Verwendung einer normalen Nadel und Spritze
eingeführt werden.
Die Kammer kann aus einer Substanz hergestellt sein, wie, aber nicht
beschränkt
auf, Plastik, Teflon, Acrylglas bzw. Acrylharz (Lucite®),
Titan oder irgendeinem inerten Material, das nicht toxisch gegenüber und von
Säugetieren
gut toleriert wird. Zusätzlich
sollten die Kammern in der Lage sein, eine Sterilisation zu überleben.
-
Die
Kammer kann auf die folgenden, nicht-beschränkten Weisen implantiert werden:
zum Beispiel subkutan oder intraperitoneal. Die Kammer kann nach
ungefähr
24 bis ungefähr
30 Stunden nach der Implantation entfernt werden. Alternativ kann
eine wiederbefüllbare
Kammer eingesetzt werden, so dass die Kammer für Behandlungen wiederverwendet
werden und nach Behandlungen geleert werden kann. Tabelle
I: Bedingungen für
das Wachstum von primären
und sekundären
MSCs-Kulturen.
- a Gesamtmarkszellen
(20 × 106) von 6 Wochen alten Mäusen wurden in einzelnen 9,5
cm2 Vertiefungen in 2 ml 10 % FCS und α-MEM kultiviert.
Nicht-adhärente
Zellen wurden am dritten Tag entfernt und die Inkubation in frischem
Medium bis zum 7. Tag fortgesetzt. APase und TRAP wurden wie zuvor
in der Referenz 55 beschrieben, untersucht.
- b Ko-kultiviert mit Knochenstücken (1/2
Oberschenkel und 1/2 Unterschenkel) in Zellkultur-Inserts (23 mm;
3 μm Porengröße; Becton
Dickinson).
- c Genauso wie b,
mit Inserts, die mit Matrigel beschichtet sind.
- d Primäre Kulturen am 10. Tag wurden
mit 0,25 % Trypsin und 1 % EDTA für 5 min bei 37°C, gefolgt
von vorsichtigem Abkratzen abgelöst.
Die Zellen aus einer Vertiefung (2 × 105)
wurden 1:4 verdünnt
und in 9,5 cm2 Vertiefungen für 7 Tage
mit Austausch des Mediums am 3. und am 6. Tag kultiviert.
- e APase (20, 54) und TRAP (55) Aktivitäten waren
pro mg Gesamtprotein.
Tabelle
II. Experimente mit (a) tansgenen Mäusen als Empfänger; (b)
normale MSCs als Spenderzellen; und (c) abfallenden Röntgenstrahldosierungen. ![Figure 00540001](https://patentimages.storage.googleapis.com/de/81/e9/7e54fe537f9f48/00540001.png)
- a (N), normal;
(TG), transgen.
- b MSCs, entfernt aus Gesamtmarkszellen
vor der Infusion durch Inkubation auf Plastikkulturschale für 4 h bei 37°C.
Tabelle
III: Experimente mit (a) transgenen Mäusen als Empfängern; (b)
10 fachem Anstieg in Gesamtmarkszellen als Spenderzellen; und (c)
abfallende Röntgenstrahldosierung. - a (N) Gesamtmark
von normalen Mäusen
ohne irgendeine Behandlung, um MSCs zu entfernen.
Tabelle
IV: Komplexe genetische oder angenommene Erkrankungen, die durch
verkapselte Stromazellen behandelt werden können (teilweise Liste) Tabelle
V: Definierte monogene Erkrankungen, die durch verkapselte Stromazellen
behandelt werden können (teilweise
Liste)