DE69636260T2

DE69636260T2 - Implantat mit immunologisch isolierten Bindegewebszellen und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69636260T2
Application number: DE69636260T
Authority: DE
Inventors: J Darwin Philadelphia Prockop; F. Ruth Lansdowne Pereira; B. Dennis Wynnewood Leeper; D. Michael Wyncote O'Hara; Joseph Philadelphia Kulkosky; Donald Maple Glen Phinney; Alexander Laptev; Jose Gladwyn Caro
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2016-03-29
Also published as: EP0871457B1; DE69637185T2; WO1996030031A1; DE69628452D1; EP0871457A1; DE69628452T2; ATE329603T1; HK1055255A1; EP1304112A1; DK0871457T3; ES2266715T3; EP1304113B1; JPH11509171A; CA2215143A1; ES2291588T3; ES2200061T3; ATE367819T1; DE69636260D1; ATE241369T1; EP1304113A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Implantat, das isolierte Stromazellen umfasst, Behälter, die isolierte Stromazellen, die mit exogener DNA transfiziert sind, umfassen, ihre Verwendung für die Behandlung von Individuen, die an Zuständen leiden, die durch das Verabreichen oder das Abgeben von vorteilhaften Proteinen behandelt werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zusätzlich zu hämatopoietischen Stammzellen enthält Knochenmark „Stromazellen", die mesenchymale Vorläuferzellen sind (Frisedenstein, A. J. of al., Exp. Hemat. 4: 267-274 (1976), die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist), die durch ihre Adhärenzeigenschaften charakterisiert sind, wenn Knochenmarkszellen entfernt und auf Plastikschalen gegeben werden. Innerhalb von ca. vier Stunden adhärieren die Stromazellen an das Plastik und können so durch das Entfernen von nicht-adhärierten Zellen von dem Schälchen isoliert werden. Diese Knochenmarkszellen, die fest an Plastik adhäriert sind, wurden umfassend untersucht (Castro-Malaspina, H. et al., Blood 56: 289-301 (1980); Piersma, A. H. et al, Exp. Hematol 13: 237-243 (1985); Simmons, O. J. und Torok-Storb, B., Blood 78: 55-62 (1991); Beresford, J. N. et al., J. Cell. Sci. 102: 341-351 (1992); Liesveld, J. L. et al., Blood 73: 1794-1800 (1989); Liesveld, J. L. et al., Exp. Hematot. 19: 63-70 (1990); und Bennett, J. H. et al., J. Call. Sci. 99: 131-139 (1991)). So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „adhärente Zellen" Stromazellen, und der Begriff „nicht-adhärente Zellen" bedeutet hämatopoietische Vorläuferzellen.
Es wird angenommen, dass Stromazellen in der Bildung der Mikroumgebung mit dem Knochenmark in vivo teilnehmen. Wenn sie isoliert sind, sind Stromazellen anfänglich ruhend, aber sie beginnen schließlich, sich zu teilen, so dass sie in vitro kultiviert werden können. Erweiterte Zahlen von Stromazellen können etabliert und aufrechterhalten werden. Stromazellen wurden verwendet, um Kolonien von fibroblastischen adipozytischen und osteogenen Zellen zu bilden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Wenn die adhärenten Zellen in der Anwesenheit von Hydrocortison oder anderen selektiven Bedingungen kultiviert werden, können Populationen hinsichtlich hämatopoietischen Vorläufern oder osteogenen Zellen erhalten werden (Carter, R. F. et al., Blood 79: 356-364 (1992) und Bienzle, D. of al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 350-354 (1994)).
Es gibt einige Beispiele für die Verwendung von Stromazellen. Das europäische Patent EP 0 381 490 offenbart Gentherapie unter Verwendung von Stromazellen. Insbesondere ist ein Verfahren zur Behandlung von Hämophilie offenbart. Stromazellen wurden verwendet, um fibröses Gewebe, Knochen oder Knorpel, wenn sie in selektive Gewebe in vivo implantiert werden, zu bilden (Ohgushi, H. et al., Acte. Orfhop. Scand. 60: 334-339 (1989); Nakahara, H. et al., J. Orfhop. Res. 9: 465-476 (1991); Niedzwiedski, T. et al., Biomaterials 14: 115-121 (1993); und Wakitani, S. et al., J. Bone & Surg. 76A: 579-592 (1994)). In einigen Berichten wurden Stromazellen verwendet, um Knochen oder Knorpel in vivo zu bilden, wenn sie subkutan zusammen mit einer porösen Keramik (Ohgushi, H. et al. Acta. Orthop. Scand. 60: 334-339 (1989)), intraperitoneal in eine Diffusionskammer (Nakahara, H. et al., J. Orfhop. Res. 9: 465-476 (1991)), perkutan in einem chirurgisch induzierten Knochendefekt (Niedzwiedski, T. et al., Biomaterials. 14: 115-121 (1993)), oder innerhalb eines Kollagen-Gels transplantiert wurden, um einen chirurgischen Defekt in einem Gelenkknorpel zu reparieren (Wakitani, S. et al., J. Bone & Surg. 76A: 579-592 (1994)). Piersma, A. H. et al., Brit. J. Hematol. 54: 285-290 (1983) offenbaren, dass sich nach intravenöser Knochenmarkstransplantation die Fibroblasten koloniebildenden Zellen, die das hämatopoietische Stroma ausmachen, festsetzen und in dem Knochenmark des Wirts verbleiben. Stewart et al. (Blood 81: 2566-2571 (1993)) beobachteten kürzlich, dass ungewöhnlich große und wiederholte Verabreichungen von Gesamtknochenmarkszellen zur Langzeit-Verpflanzung von hämatopoietischen Vorläufern in Mäusen führen, die noch keine Markablation bzw. Markablösung durchgemacht haben. Außerdem verwendeten Bienzle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 350-354 (1994)) erfolgreich Langzeitknochenmarkskulturen als Spenderzellen, um dauerhaft hämatopoietische Zellen in Hunden ohne Marksablation zu besiedeln. In einigen Berichten wurden Stromazellen entweder als Zellen verwendet, die eine Mikroumgebung für die Kultur von hämatopoietischen Vorläufern etablieren (Ankelsaria, PNAS USA 84: 7681-7685 (1987)) oder als eine Quelle einer angereicherten Population von hämatopoietischen Stammzellen (Kiefer, Blood 78(10): 2577-2582 (1991)).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Implantat-Vorrichtung, umfassend einen Behälter mit mindestens einer Membranoberfläche, wobei der Behälter darin enthaltene Knochenmarks Bindegewebszellen, die ein Genkonstrukt umfassen, immunologisch isoliert, wobei das Genkonstrukt eine Nukleotidsequenz, die ein vorteilhaftes Protein kodiert, operativ mit regulatorischen Elementen verbunden, die in der Bindegewebszelle wirksam sind, umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUR
1 zeigt schematisch die retroviralen Konstrukte pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ und pCOL2-lacZ. Die Kassetten der Genkonstrukte sind: LTR-Neo-Promotor-LacZ-LTR.
2 ist eine schematische Darstellung einer Diffusionskammer.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
So wie hier verwendet, werden „Stromazellen", „koloniebildende Fibroblasten", „Markstromazellen", „adhärente Zellen" und „MSCs" austauschbar verwendet und betreffen die kleine Fraktion von Zellen im Knochenmark, die als Stammzellähnliche Vorläufer von Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten dienen können, und die aus Knochenmark durch ihre Fähigkeit, an Plastikschalen zu adhärieren, isoliert werden können. Stromazellen können von irgendeinem Tier abgeleitet sein. In einigen Ausführungsformen sind die Stromazellen von Primaten, vorzugsweise Menschen, abgeleitet.
So wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind" Krankheiten, Störungen und Zustände, in denen defekte Gene und/oder unzureichende Genexpression ursächlich mit der Erkrankung oder den Symptomen verknüpft ist. Individuen, die irgendeine/n von mehreren gut bekannten Erkrankungen, Störungen oder Zuständen aufweisen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, können vom Fachmann identifiziert werden. Beispiele von Erkrankungen, Störungen und Zuständen, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Wachstumshormonmangel, Diabetes, Adenindesaminasemangel, Hämophilie A und Hämophilie B. Die Verfahren und Mittel zum Diagnostizieren jedes der Zustände sind gut bekannt.
So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Erkrankung, Störung oder Zustand, gekennzeichnet durch einen Knochen-, Knorpel- oder Lungendefekt" Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch eine genetische Mutation in einem Gen verursacht werden, das von Knochenzellen, Zellen, die Knorpel bilden, oder Lungenzellen exprimiert werden, so dass eine der Wirkungen einer solchen Mutation durch eine abnormale Struktur und/oder Funktion jeweils des Knochens, des Knorpels und der Lungen manifestiert wird.
So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Erkrankung, Störung oder Zustand, gekennzeichnet durch einen Defekt in der Dermis, den Blutgefäßen, dem Herzen und der Niere" Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch eine genetische Mutation in einem Gen verursacht werden, das durch Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Niere exprimiert wird, so dass sich eine der Wirkungen einer solchen Mutation in einer abnormalen Struktur und/oder Funktion jeweils der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Niere manifestiert. Beispiele von Erkrankungen, Störungen und Zuständen, die durch einen Defekt in der Dermis gekennzeichnet sind, schließen Verbrennungen, Wundliegen und diabetische Geschwülste ein.
So wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch einen Gendefekt eines Gens gekennzeichnet sind, das ein segregiertes Protein kodiert" Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, in dem das Gen, welches ein defektes Gen ist oder unzureichend exprimiert wird, ein Protein kodiert, das normalerweise segregiert wird.
So wie hier verwendet, bedeutet „Erkrankungen, Störungen und Zustände, die mit vorteilhaften Proteinen behandelt werden können" Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch die Anwesenheit eines Proteins, das die Ursachen und/oder Symptome, welche die Erkrankung, die Störung oder den Zustand kennzeichnen, gelindert, verringert, verhindert werden oder die Linderung, die Verringerung oder die Verhinderung verursacht, behandelt oder verhindert werden können. Erkrankungen, Störungen und Zustände, die durch solche Proteine behandelt werden können, schließen Erkrankungen, Störungen und Zustände ebenso ein, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, wie jene, die nicht durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, aber die dennoch durch die Anwesenheit eines Proteins, das die Ursachen und/oder Symptome, welche die Erkrankung, die Störung oder den Zustand kennzeichnen, lindert, verringert, verhindert oder die Linderung, die Verringerung oder die Verhinderung verursacht, behandelt oder verhindert werden können.
So wie hier verwendet, bedeutet „immunologisch isoliert", „immunologisch geschützt", „immunologisch neutralisiert" und „eine Weise, die sie physikalisch aus dem Immunsystem des Empfängers isoliert" die Verkapselung, die Eingrenzung und andere physikalische Trennung einer implantierten Zelle aus dem Körper, in den sie implantiert ist, so dass die Zelle nicht gegenüber dem Immunsystem des Körpers ausgesetzt ist und nicht durch das Immunsystem des Körpers isoliert werden kann, so dass Zellen, die immunologisch isoliert sind, in einer Weise verabreicht werden, die sie physikalisch von dem Immunsystem des Empfängers isoliert. Beispiele von immunologischer Isolierung schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, gut bekannte Techniken und Vorrichtungen, wie Mikroverkapselung, bioverträgliche Matrizes, Diffusionskammern, implantierbare Kartuschen bzw. Kassetten, Implantat-Vorrichtungen mit Membrananordnungen und andere Behälter mit Membranen. Es ist bevorzugt, dass Zellen immunologisch durch ihre Aufrechterhaltung in Implantat-Vorrichtungen isoliert sind.
So wie hier verwendet, werden „vorteilhaftes Protein" und „heterologes Protein" austauschbar verwendet und bedeuten 1) Proteine, die das Protein kompensieren können, das von defekten Genen kodiert und/oder durch unzureichende Genexpression gebildet wird, die ursächlich mit der Erkrankung oder den Symptomen der Erkrankung, den Störungen und Zuständen verbunden sind, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, und 2) Proteine, deren Anwesenheit die Ursachen und/oder Symptome, welche die Erkrankungen, Störungen und Zustände kennzeichnen, die mit den vorteilhaften Proteinen behandelt werden können, lindern, verringern oder verhindern, oder die Linderung, die Verringerung oder die Verhinderung bewirken.
So wie hier verwendet, bedeutet „Genkonstrukt" fremde rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die kodierende Sequenzen einschließen, die vorteilhafte Proteine funktional verknüpft mit regulatorischen Elementen kodieren, die für die Expression der kodierenden Sequenz in Stromazellen ausreichend sind.
So wie hier verwendet, bedeutet „fremde rekombinante Nukleinsäuremoleküle" rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die entweder nicht in Stromazellen anwesend sind oder die nicht als Proteine in ausreichend hohen Mengen in Stromazellen exprimiert werden, bis sie in die Zelle durch Mittel, wie, aber nicht beschränkt auf, klassische Transfektion (CaPO₄ oder DEAE-Dextran), Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem Transfer, chemisch vermitteltem Transfer, Liganden-vermitteltem Transfer oder rekombinantem viralen Vektortransfer eingeführt werden.
So wie hier verwendet, bedeutet „heterologes Gen" die kodierende Sequenz des Genkonstrukts.
So wie hier verwendet, werden die Begriffe „exogenes genetisches Material" und „exogenes Gen" austauschbar verwendet und betreffen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und RNA, mRNA und Antisense-DNA und -RNA, die in die Stromazelle eingeführt werden. Das exogene genetische Material kann heterolog sein oder eine zusätzliche Kopie oder Kopien von genetischem Material, das normalerweise in dem Individuum oder dem Tier gefunden wird, darstellen. Wenn die Zellen als ein Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung in einem Verfahren zur Behandlung von humanen Erkrankungen, Zuständen oder Störungen verwendet werden, dann kann das exogene genetische Material, das verwendet wird, um die Zellen zu transformieren, Proteine kodieren, die als Therapeutika ausgewählt werden, um das Individuum zu behandeln, und/oder um die Zellen geeigneter für die Transplantation zu machen.
So wie hier verwendet, bedeuten „transfizierte Stromazellen" Stromazellen, an die ein Genkonstrukt durch irgendeine Technologie bereitgestellt wurde, die verwendet wird, um fremde Nukleinsäuremoleküle in Zellen einzuführen, wie, aber nicht beschränkt auf, klassische Transfektion (CaPO₄ oder DEAE Dextran), Elektropora tion, Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem Transfer, chemisch vermitteltem Transfer, Liganden-vermitteltem Transfer oder rekombinantem viralen Vektortransfer.
Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung stammen von der Entdeckung, dass einige Stromazellen, die in einen Patienten eingeführt werden, einen Knochen, einen Knorpel und eine Lunge entwickeln, während andere Vorläuferzellen bleiben, die Tochterzellen bilden, die sich zu einem Knochen, einem Knorpel und einer Lunge entwickeln. Diese Entdeckung erlaubt die erfolgreiche Behandlung von Individuen, die an Erkrankungen, Zuständen und Störungen leiden, die mit Defekten in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen assoziiert sind, entweder durch das Bereitstellen von Stromazellen von einem normalen, passenden synergistischen Spender an die Individuen oder durch Isolieren von Stromazellen aus dem Patienten, ihr Kultivieren und ihr genetisches Modifizieren, um den genetischen Defekt zu korrigieren, der für die Erkrankungen, Zustände oder Störungen verantwortlich ist, die mit den Defekten in den Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen assoziiert sind. Genauso wird angenommen, dass Stromazellen sich zu Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Nieren entwickelt werden, oder dass sie Tochterzellen hervorbringen, die dies tun.
Die Entdeckung, dass isolierte, kultivierte Stromazellen, insbesondere Knochen-, Knorpel- und Lungengewebe erneut bevölkern, wenn sie an die Blutbahn eines Individuums verabreicht werden, macht sie geeignet für die Behandlung von Individuen, die an Erkrankungen, Zuständen und Störungen leiden, die mit Defekten in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen assoziiert sind. Die Entdeckung, dass einige isolierte, kultiviert Stromazellen, wenn sie in die Blutbahn eines Individuums verabreicht werden, als Vorläuferzellen wirken, die Tochterzellen hervorbringen, die anschließend zu differenzierten Zellen reifen, macht die Erfindung insbesondere nützlich, weil sie die Langzeit- und kontinuierliche Anwesenheit von gespendeten normalen und genetisch modifizierten Zellen ohne die Notwendigkeit für konti nuierliche erneute Verabreichung der Zellen erlaubt. Genauso erlaubt die Entwicklung von Stromazellen in Zellen der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Nieren, oder das Hervorbringen von Tochterzellen die Behandlung von Erkrankungen durch ähnliche Mittel, die diese Gewebe betreffen.
Folglich können Stromazellen von einem passenden Spender intravenös an Individuen verabreicht werden, die an Erkrankungen leiden, welche Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen betreffen, um die Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen eines Individuums zu erhöhen oder auszutauschen. Die Stromazellen eines passenden Spenders können intravenös an Individuen verabreicht werden, die an Erkrankungen leiden, die mit einer defekten Genexpression in Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen assoziiert sind, um die Knochen-, Knorpel- oder Lungenzellen, oder Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen des Individuums auszutauschen, die ein normales Gen nicht exprimieren oder unterexprimieren und/oder ein mutiertes Gen exprimieren. Die Stromazellen können auch mit heterologen Genen in Gentherapieprotokollen transfiziert werden. Passende Spender-Stromazellen oder Stromazellen aus einem Individuum können entfernt und genetisch vor dem erneuten Einführen der Zellen in das Individuum verändert werden. Die Zellen können genetisch verändert werden, um ein Gen einzuführen, dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist. Stromazellen von einem Individuum können genetisch modifiziert sein, um ein defektes Gen auszutauschen und/oder um ein Gen einzuführen, dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist.
Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, die Knochen beeinflussen und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, können durch das Bereitstellen, Erhöhen und/oder Austauschen von Defekten oder defekten Knochenzellen gegen Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren, behandelt werden. Die Zellen können von Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder Stromazellen von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die Zellen genetisch modifiziert sein, um den Defekt zu korrigieren. Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die Knochen betrifft, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist gestörte Knochenbildung (imperfekte Osteogenese). Ein anderes Beispiel einer Erkrankung oder Störung, die den Knochen betrifft, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist Osteoporose. Osteoporose wird häufig als eine auf vielen Faktoren beruhende Erkrankung erachtet, zu denen Umweltfaktoren, wie Ernährung und Bewegung, beitragen. Jedoch zeigen Untersuchungen der Erkrankung in Zwillingen, großen Familien und großen Populationen, dass viele Individuen die Erkrankung primär aufgrund eines genetischen Defekts entwickeln (siehe Morrison et al., Nature 367: 284-287 (1994)). Individuen, die an gestörter Knochenbildung leiden, können Stromazellen aus einem normalen passenden Spender verabreicht werden, welche die Knochenzellen des Individuums, die ein mutiertes Kollagen-Gen aufweisen, austauschen. In solchen Ausführungsformen werden die normalen Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einigen Ausführungsformen können die normalen Zellen aus den eigenen Stromazellen des Individuums hergestellt werden, weil Zellen mit einem mutierten Kollagendefekt einen Wachstumsnachteil im Vergleich zu normalen Zellen aufweisen, wenn sie in Kultur angezogen werden: Wenn deshalb Stromazellen aus einem Individuum mit defekter Knochenbildung in Kultur angezogen werden, werden schrittweise normale Zellen angereichert. Diese Ausführungsform ist insbesondere wirksam, wenn das Individuum ein Mosaik bezüglich des mutierten Kollagens ist, so dass einige seiner oder ihrer Zellen das mutierte Kollagen-Gen enthalten, und andere nicht. In einer alternativen Ausführungsform werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an gestörter Knochenbildung leidet, und ein normales Gen für Kollagen I wird in die isolierten Stromazellen eingebaut. Die transfizierten Zellen werden anschließend in das Individuum erneut eingeführt. Einige wenige Individuen, die an Osteoporose leiden, weisen auch Mutationen in einem der zwei Gene für Kollagen I auf, und dieselben Ausführungsformen werden die defekten Zellen kompensieren. In den meisten Individuen mit Osteoporose sind die fehlerhaften Gene immer noch unbekannt, aber es ist wahrscheinlich, dass sie bald identifiziert werden. In solchen Individuen werden normale Zellen den Defekt kompensieren. Auch wenn die fehlerhaften Gene identifiziert und isoliert werden, werden in einer alternativen Ausführungsform die Stromazellen aus dem Individuum isoliert, eine normale Kopie oder Kopien des mutierten Gens wird/werden eingebaut, und die Zellen werden in das Individuum erneut eingeführt.
Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, die den Knorpel beeinflussen, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, können durch Ergänzen, Erhöhen und/oder Austauschen von defekten Zellen, gegen Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren, behandelt werden. Die Zellen können von Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder von Stromazellen von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die Zellen genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren. Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die den Knorpel beeinflusst, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist Chondrodysplasie, die schweren Zwergenwuchs, schwere Probleme mit den Gelenken und verwandte Probleme verursacht. Individuen, die an Chondrodysplasie leiden, können Stromazellen von einem normalen passenden Spender verabreicht werden, welche die Zellen ersetzen, die Knorpel in dem Individuum bilden, die/der ein mutiertes Kollagen-Gen aufweist/en. In solchen Ausführungsformen werden normale Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer alternativen Ausführungsform werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an Chondrodysplasie leidet, und ein normales Gen für Kollagen II wird in die isolierten Stromazellen eingebaut. Die transfizierten Zellen werden anschließend erneut in das Individuum eingeführt. Die Ausführungsform mit dem Kollagen II-Gen wird für 20 % bis 90 % der Individuen mit verschiedenen Arten von schwerer Chondrodysplasie nützlich sein. Die verbleibenden Individuen mit Chondrodysplasie weisen Mutationen in anderen Kollagen-Genen (Kollagen X und XI), in anderen Genen (Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor 3) und in noch nicht identifizierten Genen auf. In solchen Individuen werden normale Zellen die defekten Zellen kompensieren. Es wird auch eine alternative Ausführungsform sein, die Stromazellen aus dem Individuum zu isolieren, eine normale Kopie oder Kopien des mutierten Gens einzuführen und die Zellen erneut in das Individuum einzuführen. Ein anderes Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, die den Knorpel beeinflusst, ist Osteoarthritis. Osteoarthritis ist eine heterogene Erkrankung, sowohl hinsichtlich der Ätiologie als auch der Manifestationen. Einige Individuen entwickeln die Degeneration von Knorpel in den Gelenken, die Osteoarthritis kennzeichnen, aufgrund von Schmerzen oder dem späten Auftreten von Folgeerkrankungen von Infektionen. Einige wenige Individuen entwickeln Osteoarthritis aufgrund von Mutationen in dem Gen für Kollagen II in vielen Gelenken, ähnlich zu den Mutationen in dem Gen, das Chondrodysplasie verursacht. Solche Individuen können Zeichen einer milden Chondrodysplasie zeigen, oder auch nicht. Die Ursache von Osteoarthritis in anderen Individuen ist unbekannt, aber Studien in größeren Familien legen nahe, dass die Erkrankung vererbt wird und deshalb Mutationen in noch nicht identifizierten Genen ursächlich sind. Deshalb werden dieselben Ausführungsformen, die nützlich sind, um mutierte Gene in Individuen mit Chondrodysplasie zu kompensieren, auch für viele Individuen mit Osteoarthritis nützlich sein.
Individuen, die an Erkrankungen und Störungen leiden, welche die Lungen beeinflussen, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet sind, können durch Ergänzen, Erhöhen und/oder Austauschen defekter Zellen gegen Zellen, die ein normales Gen korrekt exprimieren, behandelt werden. Die Zellen können von Stromazellen eines normalen passenden Spenders oder Stromazellen von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sein. Wenn sie von dem zu behandelnden Individuum abgeleitet sind, können die Zellen genetisch modifiziert werden, um den Defekt zu korrigieren. Ein Beispiel einer Erkrankung oder einer Störung, welche die Lungen beeinflusst, und die durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist zystische Fibrose. Ein anderes Beispiel für eine Erkrankung oder eine Störung, welche die Lungen beeinflusst und durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist, ist der Mangel an α1-Antitrypsin. Individuen, die an zystischer Fibrose leiden, können Stromazellen aus einem normalen passenden Spender, die eine normale zystische Fibrose aufweisen, verabreicht werden, um die Lungenzellen in dem Individuum, die ein mutiertes zystisches Fibrose-Gen aufweisen, auszutauschen oder zu ergänzen. In solchen Ausführungsformen werden die normalen Zellen die defekten Zellen kompensieren. In einer alternativen Ausführungsform werden Stromazellen aus einem Individuum isoliert, das an zystischer Fibrose leidet, und ein normales zystisches Fibrose-Gen wird in die isolierten Stromazellen eingeführt. Die transfizierten Zellen werden anschließend erneut in das Individuum eingeführt.
In einigen Aspekten können Individuen, die an Erkrankungen des Knochens, des Knorpels und der Lungen leiden, ebenso wie jene, die an Erkrankungen der Dermis, der Blutgefäße, des Herzens und der Nieren leiden, durch isolierte Stromazellen behandelt werden, die ihre Zahl vergrößern und die systematisch an die vermehrten, erneuerten Stromazellen verabreicht werden. Einige der erneuerten Stromazellen werden sich zu normale Knochen-, Knorpel-, Lungen-, Dermis-, Blutgefäß-, Herz- oder Nierenzellen entwickeln. Normale Stromazellen vermehren sich schneller als defekte, und die vermehrte, erneuerte Population wird eine größere Population von normalen Zellen reflektieren. Tabelle 1 beschreibt Medien, die nützlich sind, um vermehrte, erneuerte Kulturen von isolierten Stromazellen zu kultivieren.
Zusätzlich zu dem Austauschen von defekten Zellen gegen reparierte Zellen oder normale Zellen von passenden Spendern, können diese Zellen auch verwendet werden, um gewünschte Proteine zu exprimieren, die segregiert werden. Dies bedeutet, dass Stromazellen isoliert, mit einem Gen für ein gewünschtes Protein ausgestattet und in ein Individuum eingeführt werden können, in dem das gewünschte Protein gebildet wird und eine therapeutische Wirkung ausübt oder auf andere Weise zeigt. Dieser Aspekt betrifft die Gentherapie, in der therapeutische Proteine an ein Individuum verabreicht werden.
Gemäß einigen hier offenbarten Aspekten können immunologisch isolierte, transfizierte Stromazellen als Zelltherapeutika verwendet werden, um Erkrankungen, Störungen und Zustände zu behandeln, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, und/oder Erkrankungen, Störungen und Zustände, die mit Proteinen behandelt werden können. Insbesondere werden Genkonstrukte, die heterologe Gene umfassen, die vorteilhafte Proteine kodieren, in Stromazellen eingeführt. Die transfizierten Stromazellen werden anschließend immunologisch isoliert und in ein Individuum implantiert, das den Vorteil genießen wird, wenn das Protein exprimiert und durch die Zelle in den Körper segregiert wird.
Immunologisch isolierte Stromazellen sind besonders nützlich in zelltherapeutischen Zusammensetzungen, weil zusätzlich zu der Tatsache, dass sie geeignete Wirte für die Vermehrung von heterologen Genen und die Bildung heterologer Proteine sind, Stromazellen sich gut entwickeln, wenn sie immunologisch isoliert sind. Immunologisch isolierte Stromazellen weisen eine sehr große Vitalität auf, wenn sie an Orte implantiert werden, die keine vaskuläre Blutversorgung aufweisen. Darüber hinaus können Stromazellen einfach und unmittelbar erhalten werden, sie vermehren sich rasch in Kultur, was sie zu einer guten Quelle einer adäquaten Ergänzung von nützlichen Zellen für immunologisch isolierte Zelltherapeutika macht.
Genkonstrukte, die Nukleotidsequenzen umfassen, die heterologe Proteine kodieren, können in Stromazellen eingeführt werden. Dies bedeutet, dass die Zellen genetisch verändert werden, um ein Gen einzuführen, dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist. Gemäß einigen hier beschriebenen Aspekten können Stromazellen von einem Individuum oder von einem anderen Individuum oder von einem nicht-humanen Tier genetisch verändert werden, um ein defektes Gen auszutauschen und/oder um ein Gen einzuführen, dessen Expression eine therapeutische Wirkung auf das Individuum aufweist.
Stromazellen sind nützlich, um transfizierte Zellen herzustellen, die immunologisch isoliert werden können und die heterologe vorteilhafte Gene exprimieren, was das Mittel liefert, genetische Defekte zu korrigieren und/oder therapeutische Proteine zu bilden. Stromazellen können relativ einfach isoliert werden, und isolierte Stromazellen können kultiviert werden, um die Zahl der verfügbaren Zellen zu erhöhen. Stromazellen können transfiziert, immunologisch isoliert und mit einem hohen Grad an Vitalität an Orten implantiert werden, die keine direkte Blutversorgung aufweisen, wie subkutane Orte. In einigen Ausführungsformen können Stromazellen immortalisiert werden, wie durch SV40-Virus oder Proteine mit transformierenden Eigenschaften.
Individuen, die an genetischen Erkrankungen und Störungen leiden, können durch Ergänzen, Erhöhen und/oder Austauschen von defekten oder defizienten Genen behandelt werden, indem immunologisch isolierte Stromazellen mit Genkonstrukten bereitgestellt werden, die normale, funktionelle Kopien des defizienten Gens einschließen. Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Gentherapie, in der das Individuum mit Genen versorgt wird, hinsichtlich denen es bezüglich der Anwesenheit und/oder Funktion defizient ist. Diese Gene, die in dem Zelltherapeutikum bereitgestellt werden, kompensieren das defekte Gen des Individuums. Solche Gene kodieren vorzugsweise Proteine, die segregiert werden.
Die Stromazellen werden transfiziert und immunologisch isoliert. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen mit Genen transfiziert, hinsichtlich denen das zu behandelnde Individuum an einer vollständigen Abwesenheit einer nicht- mutierten Kopie des Gens leidet, oder an der Abwesenheit oder unzureichenden Expression einer nicht-mutierten Form des Proteins leidet. Stromazellen werden mit einer nicht-mutierten Kopie des Gens in einer exprimierbaren Form transfiziert. Dies bedeutet, dass das Protein, das durch das transfizierte Gen kodiert wird, durch die Stromazellen exprimiert wird, vorzugsweise als ein segregiertes Protein. Beispiele von Erkrankungen, Zuständen oder Störungen, in denen defekte Gene oder unzureichende Genexpression ursächlich mit der Erkrankung oder den Symptomen verbunden ist, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindesaminasedefizienz, Hämophilie A und Hämophilie B. Andere genetische Erkrankungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden können, schließen ein: α1-Antitrypsin-Defizienz, Fabray-Erkrankung, familiäre Hypercholesterolämie, Gaucher'sche Erkrankung, Lesch-Nyhan-Syndrom, Ahornsirup-Harnerkrankung. Ornithintranscarbamylase-Defizienz, Phenylketonurie, Sandhoff-Erkrankung, Tay-Sachs-Erkrankung und von-Willebrand-Erkrankung. Durch das Einführen normaler Gene in exprimierbarer Form, die Wachstumshormon, Insulin, Adenindesaminase oder einen geeigneten Blutgerinnungsfaktor kodieren, können an die Individuen, die an Wachstumshormon-Defizienz, Diabetes, Adenindesaminase-Defizienz und Hämophilie leiden, jeweils die Mittel bereitgestellt werden, um die genetischen Defekte zu kompensieren und einige und alle der Symptome, die mit solchen Erkrankungen assoziiert sind, zu eliminieren, zu lindern oder zu verringern. Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen von Erkrankungen, Zuständen und Störungen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Zusätzlich zu dem Austauschen von defekten Genen gegen funktionelle Gene können gewünschte segregierte Proteine ebenfalls exprimiert werden, die eine biologisch aktive therapeutische oder prophylaktische Wirkung ausüben. Solche Proteine werden vorzugsweise von den Zellen segregiert. Dies bedeutet, dass Stromazellen isoliert, mit einem Gen für ein gewünschtes Protein ausgestattet, immunologisch isoliert und in ein Individuum eingeführt werden können, innerhalb dem das gewünschte Protein gebildet wird und eine therapeutische Wirkung zeigt oder auf andere Weise ausführt. Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Gentherapie, in der therapeutische Proteine an ein Individuum verabreicht werden. Gemäß diesen Aspekten der Erfindung sind die isolierten Stromazellen Vektoren für das Einführen therapeutischer Gene in das Individuum, ebenso wie Wirte für solche Gene, wenn die Zellen an ein Individuum verabreicht werden.
In solchen Ausführungsformen werden die Stromazellen mit Genen transfiziert, die Proteine kodieren, die eine therapeutische Wirkung aufweisen, wenn sie in dem zu behandelnden Individuum exprimiert werden. Anstelle das therapeutische Protein direkt und in einer Reihe von zeitlichen Intervallen zu verabreichen, stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zum kontinuierlichen Verabreichen eines therapeutischen Proteins durch Verabreichen von Zellen, die das Protein bilden, bereit. Stromazellen werden mit einem Gen transfiziert, das ein Protein in exprimierbarer Form kodiert. Dies bedeutet, dass das Protein, das durch das transfizierte Gen kodiert wird, von den Stromazellen exprimiert wird, vorzugsweise als ein segregiertes Protein. Beispiele von therapeutischen Proteinen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Fettleibigkeitsfaktor (Considine, R. V. et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 2986-2988; Arner, P., N. Engl. J. Med., 1995, 333, 382; Emorine, L. et al., Trends Pharmacol. Sci., 1994, 15, 3; Flier, J. S., Cell, 1995, 80, 15; Lowell, B. B. et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 923; und Rink, T. J. et al., Nature, 1994, 372, 406), Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor, Granulozyten Kolonie-stimulierenden Faktor, Erythropoietin, Interleukin-2- und Interleukin-1-Rezeptorantagonistprotein. Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen von Erkrankungen, Zuständen und Störungen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, und sie enthalten die Namen der Proteine, die über ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt verabreicht werden können.
In allen Fällen, in denen ein Genkonstrukt in eine Stromazelle transfiziert wird, ist das heterologe Gen funktionell mit regulatorischen Sequenzen verbunden, die benötigt werden, um Expression des Gens in der Stromazelle zu erreichen. Solche regulatorischen Sequenzen schließen einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal ein.
Das Genkonstrukt wird vorzugsweise als ein Expressionsvektor bereitgestellt, der eine kodierende Sequenz für das heterologe Protein, funktionell verknüpft mit essentiellen regulatorischen Sequenzen aufweist, so dass, wenn der Vektor in die Zelle transfiziert wird, die kodierende Sequenz von der Zelle exprimiert wird. Die kodierende Sequenz ist funktionell mit den regulatorischen Elementen verbunden, die für die Expression dieser Sequenz in den Zellen notwendig sind. Die Nukleotidsequenz, die das Protein kodiert, kann cDNA, genomische DNA, synthetische DNA oder ein Hybrid davon oder ein RNA-Molekül, wie mRNA, sein.
Das Genkonstrukt, das die Nukleotidsequenz einschließt, die für das vorteilhafte Protein, funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden, kodiert, kann in der Zelle als ein funktionelles zytoplasmatisches Molekül, ein funktionelles episomales Molekül verbleiben, oder es kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Exogenes genetisches Material kann in Zellen eingeführt werden, wo es als getrenntes genetisches Material in der Form eines Plasmids verbleibt. Alternativ dazu kann lineare DNA, die in das Chromosom integrieren kann, in die Zelle eingeführt werden. Wenn DNA in die Zelle eingeführt wird, können Reagenzien, welche die DNA-Integration in Chromosomen fördern, zugegeben werden. DNA-Sequenzen, die nützlich sind, um die Integration zu fördern, können in das DNA-Molekül ebenfalls eingeschlossen sein. Alternativ kann RNA in die Zelle eingeführt werden.
Die regulatorischen Elemente, die für die Genexpression notwendig sind, schließen ein: einen Promotor, ein Startkodon, ein Stoppkodon und ein Polyadenylie rungssignal. Es ist notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in den Zellen, die von den Stromazellen nach Infusion in ein Individuum abstammen, funktionell sind. Darüber hinaus ist es notwendig, dass diese Elemente funktionell mit der Nukleotidsequenz verbunden sind, die das Protein kodiert, so dass die Nukleotidsequenz in den Stromazellen exprimiert werden und somit das Protein gebildet werden kann. Startkodons und Stoppkodon werden für gewöhnlich als Teil einer Nukleotidsequenz erachtet, die das Protein kodiert. Jedoch ist es notwendig, dass diese Elemente in den Stromazellen oder in den Zellen, die von den Stromazellen abgeleitet sind, funktionell sind. Genauso müssen die verwendeten Promotoren und Polyadenylierungssignale innerhalb der Stromazellen oder innerhalb der Zellen, die von den Stromazellen abgeleitet sind, funktionell sein. Beispiele für Promotoren, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Promotoren, die aktiv in vielen Zellen sind, wie der Zytomegalievirus-Promotor, SV40-Promotoren und retrovirale Promotoren. Andere Beispiele von Promotoren, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, gewebespezifische Promotoren, d. h. Promotoren, die in einigen Geweben funktionell sind, aber nicht in anderen; ebenso Promotoren von jenen, die normalerweise in Stromazellen exprimiert werden, mit oder ohne spezifische oder allgemeine Enhancersequenzen. In einigen Ausführungsformen werden Promotoren verwendet, die konstitutiv Gene in Stromazellen exprimieren, mit oder ohne Enhancersequenzen. Enhancersequenzen werden in solchen Ausführungsformen bereitgestellt, wenn sie geeignet oder gewünscht sind.
Gemäß einigen Ausführungsformen sind gewünschte Gene für die Transfektion in Stromazellen funktionell mit dem humanen Prokollagen-I-Promotor, dem humanen Prokollagen-II-Promotor und dem humanen Prokollagen-III-Promotor verbunden. In einigen Ausführungsformen sind die Gene mit relativ kurzen 5'-Fragmenten des entweder COL1A1- oder COL2A1-Gens verbunden, die den Promotor zusammen mit einigen der 5'-translatierten und/oder -untranslatierten Sequenzen des Gens umfassen. In einigen Ausführungsformen ist das zu transfizierende Gen funktionell mit einer Sequenz verbunden, die ein 1,9 kb SphI-HindIII-Fragment von dem 5'-Ende des humanen COL1A1 enthält. Das Fragment enthält von –476 bp bis –1440 bp des COL1A1-Gens und schließt deshalb den Promotor (476 bp), Exon 1 (222 bp) und das meiste des Introns 1 (1223 bp von insgesamt 1453 bp) ein. In einigen Ausführungsformen ist das zu transfizierende Gen funktionell mit einer Sequenz verbunden, die ein Fragment aus dem 5'-Ende des humanen COL2A1 enthält. In einigen Ausführungsformen enthält das Fragment –4,0 kb des COL2A1-Promotors und das vollständige COL2A1-Gen, das eine oder andere Exon und Introns in der Reihenfolge von Exon1 bis Exon 15 und Intron 1 bis Intron 14. Einige Konstrukte können gestaltet werden, wie in der gleichzeitig anhängigen US-Seriennummer 08/184,260, eingereicht am 18. Januar 1994, mit dem Titel „Methods of targeting DNA insertion into genome", die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, gelehrt wird.
Beispiele von Polyadenylierungssignalen, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf das humane Kollagen-II-Polyadenylierungssignal, das humane Kollagen-II-Polyadenylierungssignal und das SV40-Polyadenylierungssignal.
Damit exogenes genetisches Material in einem Expressionsvektor exprimiert wird, müssen die regulatorischen Elemente funktionell mit der Nukleotidsequenz verbunden sein, die das Protein kodiert. Um die Proteinherstellung zu maximieren, können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die für Genexpression in den gewünschten Zellen gut geeignet sind. Darüber hinaus können Kodons ausgewählt werden, die in der Zelle am wirksamsten transkribiert werden. Der Fachmann kann exogenes genetisches Material als Expressionsvektoren herstellen, die in den gewünschten Zellen funktionell sind.
Es ist auch vorgesehen, dass regulatorische Elemente ausgewählt werden können, um eine gewebespezifische Expression des Proteins bereitzustellen. So können z. B. spezifische Promotoren bereitgestellt werden, so dass das heterologe Gen nicht nur in dem Gewebe exprimiert wird, in welches die immunologisch isolierten Stromazellen implantiert werden.
Das heterologe Protein schließt vorzugsweise eine Signalsequenz ein, die den Transport und die Sekretion des heterologen Proteins in der Stromazelle steuert. Die Signalsequenzen werden allgemein verarbeitet und nach Sekretion des reifen Proteins aus der Zelle entfernt.
Zusätzlich zu dem Bereitstellen von Zellen mit genetischem Material, das entweder 1) genetische Defekte in den Zellen korrigiert, 2) Proteine kodiert, die sonst nicht in ausreichenden Mengen und/oder einem funktionellen Zustand anwesend sind, so dass das genetische Material genetische Defekte in dem Individuum korrigiert und/oder 3) Proteine kodiert, die als Therapeutika in der Behandlung oder Verhinderung eines bestimmten Erkrankungszustands oder einer bestimmten Erkrankungsstörung oder Symptomen nützlich ist, die damit assoziiert sind, kann genetisches Material auch in die Stromazellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingeführt werden, um ein Mittel für das selektive Beenden solcher Zellen bereitzustellen, sollte ein solches Beenden wünschenswert werden. Solche Mittel zum Abzielen auf Zellen für die Zerstörung können in Stromazellen eingeführt werden, die auf andere Weise modifiziert werden, ebenso wie in jene, in welche kein anderes exogenes genetisches Material eingeführt wird.
Isolierte Stromazellen werden mit genetischem Material ausgestattet, was sie insbesondere empfänglich für die Zerstörung macht. Zum Beispiel können Stromazellen mit Genen ausgestattet werden, die einen Rezeptor kodieren, auf den mit einem zytotoxischen Mittel spezifisch abgezielt werden kann. Eine exprimierbare Form eines Gens, die verwendet werden kann, um selektiven Zelltod zu induzieren, kann in die Zellen eingeführt werden. In einem solchen System sind die Zellen, die das Protein exprimieren, das durch das Gen kodiert wird, empfänglich für gezieltes Abtöten unter spezifischen Bedingungen oder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen Agentien. Zum Beispiel kann eine exprimierbare Form eines Herpesvirus Thymidinkinase-(Herpes Tk)-Gens in die Zellen eingeführt werden und verwendet werden, um selektiven Zelltod zu induzieren. Wenn das exogene genetische Material, welches das (Herpes Tk)-Gen einschließt, in das Individuum eingeführt wird, wird Herpes Tk gebildet. Wenn es wünschenswert oder notwendig ist, die implantierten Zellen abzutöten, kann das Arzneimittel Gancyclovir an das Individuum verabreicht werden, und das Arzneimittel wird das selektive Abtöten jeder Zelle bewirken, die Herpes Tk bildet. Somit kann ein System bereitgestellt werden, das die selektive Zerstörung von implantierten Zellen erlaubt.
Der Fachmann kann Individuen identifizieren, die an genetischen Erkrankungen leiden, wie jene, die in den Tabellen IV und V aufgelistet sind, einschließlich Wachstumshormondefizienz, Diabetes, Adenindesaminase-Defizienz und Hämophilie, wobei er standarddiagnostische Verfahren routinemäßig verwendet.
Stromazellen können erhalten werden, indem Knochenmarkszellen aus einem Spender entfernt werden und die Zellen in einen sterilen Behälter mit einer Plastikoberfläche oder einer anderen geeigneten Oberfläche gegeben werden, so dass die Zellen damit in Kontakt kommen. Die Stromazellen werden an die Plastikoberfläche innerhalb von 30 Minuten bis ungefähr 3 Tagen anheften. Nach mindestens 30 Minuten, vorzugsweise ungefähr 4 Stunden werden die nicht-angehefteten Zellen entfernt und verworfen. Die angehefteten Zellen sind Stromazellen, die anfänglich nicht-teilend sind. Nach ungefähr 2-4 Tagen beginnen die Zellen jedoch zu proliferieren und können unter Verwendung von Standardzellkulturtechniken kultiviert werden, um ihre Zahl zu steigern.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen in Medium kultiviert, das mit 2-20 % fötalem Kälberserum ergänzt ist, oder in serumfreiem Medium mit oder ohne zusätzlichen Ergänzungen.
Isolierte Stromazellen können unter Verwendung von gut bekannten Techniken, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, transfiziert werden. Fremdgene können in Stromazellen durch Standardverfahren eingeführt werden, die für das Einführen von Genkonstrukten in die Zelle verwendet werden, so dass sie die Proteine exprimieren, die von den Genen kodiert werden. In einigen Ausführungsformen werden die Zellen durch Calciumphosphat-Präzipitationstransfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomen-vermitteltem Transfer, chemisch vermitteltem Transfer, Liganden-vermitteltem Transfer oder rekombinantem viralen Vektortransfer transfiziert.
In einigen Ausführungsformen werden rekombinante Adenovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden rekombinante Retrovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden Standard-CaPO₄, DEAE-Dextran oder Lipidträgervermittelte Transfektionstechniken eingesetzt, um gewünschte DNA in teilende Zellen einzuführen. Standard-Antibiotika-Resistenz-Selektionstechniken können verwendet werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektieren. In einigen Ausführungsformen wird DNA direkt in Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. Genauso können gut bekannte Elektroporations- oder Partikelbeschuss-Techniken verwendet werden, um Fremd-DNA in isolierte Stromazellen einzuführen. Ein zweites Gen wird für gewöhnlich ko-transfiziert oder mit dem therapeutischen Gen verbunden. Das zweite Gen ist häufig ein selektierbares Antibiotika-Resistenz-Gen. Transfizierte Zellen können durch Anziehen der Zellen in einem Antibiotikum selektiert werden, das Zellen abtöten wird, die das selektierbare Gen nicht aufgenommen haben. In den meisten Fällen, in denen die zwei Gene nicht miteinander verbunden und ko-transfiziert werden, weisen die Zellen, welche die Antibiotikum-Behandlung überleben, beide Gene in sich auf und exprimieren sie beide.
Nach dem Isolieren der Stromazellen können die Zellen nach der Isolierung oder nachdem sie kultiviert wurden, verabreicht werden. Isolierte Stromazellen, die nach der Isolierung verabreicht werden, werden innerhalb einer Stunde nach der Isolierung verabreicht. Im Allgemeinen können Stromazellen unmittelbar nach der Isolierung verabreicht werden, in Situationen, in denen der Spender erwachsen und der Empfänger ein Kind ist. Es ist bevorzugt, dass Stromazellen vor der Verabreichung kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 1 Stunde bis über ein Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden, die isolierten Stromazellen vor der Verabreichung für einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, damit sie sich von nicht-teilenden zu replizierenden Zellen umwandeln. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 3-30 Tage, vorzugsweise 5-14 Tage, weiter bevorzugt 7-10 Tage kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate, weiter bevorzugt 3-6 Monate kultiviert.
Wenn die Zellen transfiziert werden, werden entweder 1) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst transfiziert und anschließend als nicht-teilende Zellen verabreicht, 2) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst transfiziert, anschließend für einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln und anschließend verabreicht, 3) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst für einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend transfiziert und anschließend verabreicht, oder 4) isolierte, nicht-teilende Stromazellen zuerst für einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend transfiziert, anschließend kultiviert und anschließend verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden Stromazellen isoliert, transfiziert und sofort verabreicht. Es ist bevorzugt, dass Stromazellen vor der Transfektion und/oder den Verabreichungen kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen können für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden.
Isolierte Stromazellen können für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Transfektion und nach der Transfektion zusätzlich für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Transfektion kultiviert. Transfizierte Stromazellen können für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen können isolierte Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungformen 3-6 Monate vor der Transfektion und nach der Transfektion weiterhin für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungformen 6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Verabreichung kultiviert werden.
Isolierte Stromazellen können unter Verwendung von gut bekannten Techniken, die dem Fachmann einfach zur Verfügung stehen, transfiziert werden. In einigen Ausführungformen werden rekombinante Adenovirus-Vektoren verwendet, um DNA mit gewünschten Sequenzen in die Stromazelle einzuführen. In einigen Ausführungsformen werden Standard-CaPO₄, DEAE-Dextran oder Flüssigträger- vermittelte Transfektionstechniken eingesetzt, um gewünschte DNA in teilende Zellen einzuführen. Standard-Antibiotika-Resistenz-Selektionstechniken können verwendet werden, um transfizierte Zellen zu identifizieren und zu selektieren. In einigen Ausführungsformen wird DNA direkt in Zellen durch Mikroinjektion eingeführt. Ebenso können gut bekannte Elektroporations- oder Partikelbeschuss-Techniken verwendet werden, um Fremd-DNA in isolierte Stromazellen einzuführen.
Für die Verabreichung von Stromazellen werden die isolierten Stromazellen aus den Kulturschalen entfernt, mit Salzlösung gewaschen, zu einem Pellet zentrifugiert und in einer Glucoselösung resuspendiert, die in den Patienten infundiert wird. In einigen Ausführungsformen wird Knochenmarksablation vor der Infusion durchgeführt, um Raum in dem Knochen für die eingeführten Zellen zu schaffen. Knochenmarksablation kann unter Verwendung von Röntgenbehandlung des zu behandelnden Individuums, dem Verabreichung von Arzneimitteln, wie Cyclophosphamid oder durch eine Kombination von Röntgenbehandlung und Arzneimittelverabreichung erreicht werden. In einigen Ausführungsformen wird Knochenmarksablation durch Verabreichen von Radioisotopen erreicht, von denen bekannt ist, dass sie metastatische Knochenzellen abtöten, wie z. B. radioaktives Strontium, ¹³⁵Samarium oder ¹⁶⁶Holmium (siehe Applebaum, F. R. et al., 1992, Blood 80(6): 1608-1613, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist).
Wenn Knochenmarksablation der Verabreichung von Stromazellen vorhergeht, muss die Verabreichung von Stromazellen durch die Verabreichung von nicht-adhärenten Zellen begleitet werden, die Blutzellvorläufer enthalten, die für das Überleben notwendig sind. Solche nicht-adhärenten Zellen können aus der gleichen Probe gewonnen werden, die als Ausgangsmaterialien in der Isolierung von Stromazellen verwendet werden, und sie können gelagert werden, oder sie sind von einer anderen Probe abgeleitet. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die nicht-adhärenten Zellen von dem Empfänger/Patienten bereitgestellt.
Vor den Verfahren, die Knochenmarksablation bilden, wird eine Probe des Knochenmarks des Patienten/Empfängers erhalten und gelagert. Die gesamte Probe kann verwendet werden, oder die nicht-adhärenten Zellen können isoliert und verwendet werden, um zusammen mit isolierten Stromazellen verabreicht zu werden. Nicht-adhärente Zellen, die zusammen mit der Verabreichung von Stromazellen verabreicht werden, können getrennt davon vorher oder nach der Stromazellverabreichung verabreicht werden, oder sie können mit den isolierten Stromazellen vor der Verabreichung gemischt werden.
Die Knochenmarksablation ist optional. In einigen Ausführungsformen wird eine teilweise, aber nicht vollständige Knochenmarksablation vor der Verabreichung von Stromazellen durchgeführt. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen ohne irgendeine Knochenmarksablation verabreicht.
Zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person werden pro Infusion verabreicht. In einigen Ausführungsformen zwischen ungefähr 1-5 × 10⁶ und 1-5 × 10¹² Zellen intravenös pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert. In einigen Ausführungsformen werden zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen intravenös pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert. In einigen Ausführungsformen werden 4 × 10⁵ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert. In einigen Ausführungsformen werden 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person infundiert.
In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von Zellen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrere Verabreichungen über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 3-7 Verabreichungen über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1-5 × 10⁸ und 1-5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1-5 × 10⁸ und 1-5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 3-5 × 10⁹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabrei chungen von 1-3 × 10¹¹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
Stromazellen in Diffusionskammern sind beschrieben in Benayahu, D. et al. (1989) J. Cell Physiol. 140: 1-7 und Mardon, H. J. et al. (1987) Cell Tissue Res. 250: 157-165.
Nach dem Einführen des Genkonstrukts in die Stromazellen können die Zellen sofort immunologisch, oder nachdem sie kultiviert wurden, isoliert werden. Stromazellen können, nachdem sie immunologisch isoliert wurden, implantiert werden. Stromazellen können immunologisch durch irgendeine der Vielzahl von bekannten Verfahren isoliert werden, unter Verwendung von einfach zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterialien und/oder Vorrichtungen. Stromazellen können unter Verwendung von vielen Mikroverkapselungsprotokollen mikroverkapselt werden, einschließlich jenen, die z. B. in dem US-Patent Nr. 4,391,009, dem US-Patent Nr. 4,806,355, dem US-Patent Nr. 4,942,129 und dem US-Patent Nr. 5,334,640 offenbart sind.
Stromazellen können in Kammern mit diffundierbaren Membranen oder verkapselt in Mikrokügelchen verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform sind die Stromazellen in Hohlfasern enthalten, wie jenen, die von Amicon, Inc. (Beverly MA) erhalten werden können. Diese Fasern werden z. B. verwendet, um Kartuschen bzw. Kassetten für die Dialyse zu erhalten. Ein Ende kann von unterhalb der Haut herausgezogen werden und in der Größe verringert werden, wenn die Dosierung des Proteins, das von den Zellen gebildet wird, verringert werden soll. Der Oberflächenbereich der Fasern ist sehr groß. Weiterhin können die Zellen in der Faser herausgespült und periodisch ausgetauscht werden. Hohlfasern sind auf den Seiten 50/51 der Amicon, Inc. Veröffentlichung Nr. 323 beschrieben.
Genauso wird der Einbau von transfizierten Stromazellen in bioverträgliche Matrizes, die Sekretion von vorteilhaften Protein an ein Individuum erlauben, während die Zellen in einem immunologisch isolierten Zustand gehalten werden. Beispiele von bioverträglichen Matrizes sind z. B. in dem US-Patent Nr. 4,902,295 und dem US-Patent Nr. 4,997,443 offenbart. In einigen Ausführungsformen sind transfizierte Stromazellen durch ihre Einlagerung innerhalb von Gewebeimplantat-Systemen, die Membranzusammensetzungen sind, immunologisch isoliert. Dies bedeutet, dass Zellen in Behältern aufrechterhalten werden, die mindestens eine poröse Membran einschließen. Die Zellen innerhalb der Membranzusammensetzung sind immunologisch isoliert, während vorteilhafte Proteine an die Individuen bereitgestellt werden können, indem sie durch die Membran passagieren. Implantat-Vorrichtungen, die Membranzusammensetzungen sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, jene, die in dem US-Patent Nr. 5,314,471 und dem US-Patent Nr. 5,344,454 beschrieben sind. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Implantat-Vorrichtung bereitgestellt, die zwei Ringzusammensetzungen umfasst. Jede Ringzusammensetzung umfasst einen zirkulären Plastikring und eine 0,3 Mikron Millipor-Membran, welche den Bereich des Rings abdeckt. Transfizierte Stromazellen werden zwischen die zwei Ringzusammensetzungen angeordnet, die miteinander am Umfang in Verbindung stehen. Die hergestellte Implantat-Vorrichtung wird vorzugsweise subkutan implantiert.
In einigen bevorzugten Implantat-Vorrichtungen werden 10⁴ bis 10¹¹ Zellen bereitgestellt.
Immunologisch isolierte Zellen können subkutan oder intraperitoneal implantiert werden. Alternativ können sie angeheftet oder auf andere Weise benachbart zu Organen und Geweben implantiert werden, an die das vorteilhafte Protein vorzugsweise verabreicht wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Implantat-Vorrichtungen subkutan oder intraperitoneal implantiert.
Die Erfindung ist insbesondere nützlich, um jene Erkrankungen, Störungen oder Zustände zu behandeln, die relativ kleine Proteinmengen benötigten, am meisten bevorzugt segregiertes Protein. Beispiele schließen den Wachstumsfaktor, den Fettsucht-Faktor und Faktor IX ein, die alle sehr kleine Proteinmengen für die Funktion benötigen. Die Tabellen IV und V enthalten teilweise Listen von Erkrankungen, Zuständen und Störungen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Es ist bevorzugt, dass die Stromazellen vor der immunologischen Isolierung kultiviert werden. Stromazellen können von 1 Stunde bis über ein Jahr kultiviert werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die Stromazellen für einen Zeitraum kultiviert, der ausreichend ist, um ihnen zu erlauben, dass sie sich von nicht-teilenden zu replizierenden Zellen umwandeln. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen für 3-30 Tage, vorzugsweise 5-14 Tage, weiter bevorzugt 7-10 Tage kultiviert. In einigen Ausführungsformen werden die Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, vorzugsweise 6 Wochen bis 10 Monate, weiter bevorzugt 3-6 Monate kultiviert.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen entweder 1) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst transfiziert und anschließend immunologisch isoliert, anschließend als nicht-teilende Zellen implantiert werden, 2) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst transfiziert, anschließend für einen Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend werden sie immunologisch isoliert und anschließend implantiert, 3) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst für einen Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, anschließend werden sie transfiziert, anschließend immunologisch isoliert und anschließend implantiert, oder 4) isolierte, nicht-teilende Stromazellen, die zuerst für einen Zeitraum kultiviert werden, der ausreichend ist, um sie von nicht-teilenden in replizierende Zellen umzuwandeln, an schließend werden sie transfiziert, anschließend kultiviert, anschließend immunologisch isoliert und anschließend implantiert. In einigen Ausführungsformen werden Stromazellen isoliert, transfiziert, immunologisch isoliert und implantiert. Es ist bevorzugt, dass die Stromazellen vor und nach der Transfektion kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können aus kultivierten für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen können aus kultivierten für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. Isolierte Stromazellen können aus kultivierten für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Transfektion und nach der Transfektion kultiviert werden, zusätzlich können sie für 3-30 Tage, in einigen Ausführungsformen 5-14 Tage, in einigen Ausführungsformen 7-10 Tage vor der Verabreichung kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen können die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Transfektion kultiviert werden. Transfizierte Stromazellen können für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis zu 10 Monaten, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Implantation kultiviert werden. In einigen Ausführungsformen können die isolierten Stromazellen für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Transfektion und nach der Transfektion kultiviert werden, weiterhin können sie für 4 Wochen bis zu einem Jahr, in einigen Ausführungsformen 6 Wochen bis 10 Monate, in einigen Ausführungsformen 3-6 Monate vor der Implantation kultiviert werden.
Wie oben erwähnt, kann die Knochenmarksprobe für die Transplantation von einem passenden Spender abgeleitet sein. Der Fachmann kann einfach passende Spender unter Verwendung von Standardtechniken und -kriterien identifizieren.
Knochenmarksproben für die Transplantation können von passenden Spendern durch Standardtechniken erhalten werden. In einigen Ausführungsformen wird eine Knochenmarksablation vor der Infusion unternommen, um in dem Knochen Platz für eingeführte Zellen zu schaffen. Die Knochenmarksablation kann durch Röntgenbestrahlung des zu behandelnden Individuums, dem Verabreichen von Arzneimitteln, wie Cyclophosphamid oder durch eine Kombination von Röntgenbestrahlung und Arzneimittelverabreichung erreicht werden. In einigen Ausführungsformen wird die Knochenmarksablation durch Verabreichen von Radioisotopen, von denen bekannt ist, dass sie metastatische Knochenzellen abtöten, wie z. B. radioaktives Strontium, ¹³⁵Samarium oder ¹⁶⁶Holmium (siehe Applebaum, F. R. et al., 1992, Blood 80(6): 1608-1613), durchgeführt werden.
Knochenmarksablation ist optional. In einigen Ausführungsformen wird eine teilweise, aber nicht vollständige Knochenmarksablation vor der Knochenmarkstransplantation durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird das Knochenmark ohne eine Knochenmarksablation verabreicht.
Es ist bevorzugt, dass die Zahl der Zellen, die in der Knochenmarkstransplantation für die Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankung jene übersteigt, die normalerweise für andere Behandlungen verwendet wird. Zwischen 3- und 10-fach der normalen Knochenmarksdosis pro 100 kg Körpergewicht der Person werden pro Infusion verabreicht.
In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von Zellen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrere Verabreichungen über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 3-7 Verabreichungen über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1-5 × 10⁸ und 1-5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine einzelne Verabreichung von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen 10⁷ und 10¹³ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1-5 × 10⁸ und 1-5 × 10¹² Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von zwischen ungefähr 1 × 10⁹ und 5 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden mehrfache Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen pro 100 kg Körpergewicht der Person über den Verlauf von 3-7 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 3-5 × 10⁹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 4 × 10⁹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabrei chungen von 1-3 × 10¹¹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden 5 Verabreichungen von 2 × 10¹¹ Zellen über den Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Tagen bereitgestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1 – nicht Teil der Erfindung
Zellen aus einer transgenen Mauslinie, die ein humanes Minigen für Kollagen I in einer gewebespezifischen Weise exprimiert, wurden verwendet, um zu untersuchen, ob Vorläufer-mesenchymale Zellen aus Knochenmark, die in Kultur vermehrt wurden, als Langzeitvorläufer von Knochen und anderen Bindegeweben nach der intravenösen Infusion in bestrahlte Mäuse dienen können. Das Markergen bestand aus einem inneren deletierten Minigen für die humane Pro-α1(I)Kette von Prokollagen I, welches die Synthese von verkürzten Pro-α1(I)Ketten bewirkte (Khillan, J. S. et al., J. Biol. Chem. 266: 23373-23379 (1991); Pereira, R. et al., J. Clin. Invest. 91: 709-716 (1983); und Sokolov, B. P. et al., Biochemistry 32: 9242-9249 (1993)). Zellen, die das Gen exprimierten, wurden aus einer Linie von transgenen Mäusen erhalten, in denen die Kopienzahl des humanen Minigens relativ zu dem endogenen Mausgen ungefähr 100:1 betrug, und die Fließgleichgewichtmengen von mRNA des humanen Minigens relativ zu mRNA aus dem endogenen Mausgen ungefähr 0,5:1 in den meisten Geweben betrugen.
Spenderzellen aus Mark, das teilweise hinsichtlich mesenchymaler Vorläufer angereichert war, wurde durch Standardprotokolle hergestellt (Friedenstein, A. J. of al., Exp. Hemat. 4: 267-274 (1976); Castro-Malaspina, H. et al., Blood 56: 289-301 (1980); Piersma, A. H. et al., Exp. Hematol. 13: 237-243 (1985); Simmons, P. J. und Torok-Storb, B., Blood 78: 55-62 (1991); Beresford, J. N. et al., J. Cell. Sci. 102: 341-351 (1992); Liesveld, J. L. et al., Blood 73: 1794-1800 (1989); Liesveld, J. L. et al., Exp. Hematot 19: 63-70 (1990); und Bennett, J. H. et al., J. Call. Sci. 99: 131-139 (1991)). Kurz gesagt, wurden die Enden von langen Knochen der transgenen Mäuse geschnitten, und das Mark wurde mit einer unter Druck stehenden Spritze, die mit α-MEM (Sigma) mit 10 % fötalem Rinderserum (Atlanta Biologicals) gefüllt war, extrahiert. Ungefähr 10⁷ kernhaltige Zellen wurden auf 175 cm² Plastikkulturflaschen in 25 ml α-MEM mit 10 % fötalem Rinderserum ausplattiert. Nach 4 h wurden nicht-adhärente Zellen verworfen, indem das Medium ausgetauscht wurde. Foci, die zwei bis vier Fibroblasten-ähnliche Zellen enthielten, erschienen in 2 bis 3 Tagen, und die Foci wuchsen zu nahezu konfluenten Kolonien in ungefähr 1 Woche. Die Ausbeute betrug ungefähr 10⁷ Zellen pro Flasche nach Trypsin-Spaltung. In der Phasenkontrastmikroskopie waren die meisten der Zellen Fibroblasten-ähnlich, aber einige wenige Makrophagen und Adipozyten wurden auch beobachtet.
Ungefähr 10⁵ der kultivierten adhärenten Zellen wurden mit 6 × 10⁵ nicht-adhärenten Zellen gemischt, die durch Inkubation von Mark aus normalen Mäusen für 4 h auf 175 cm² Flaschen unter denselben Bedingungen erhalten wurden, die für die anfängliche Isolierung der adhärenten Zellen verwendet wurden. Das Gemisch aus ungefähr 7 × 10⁵ Zellen in 0,2 bis 0,4 ml α-MEM und 10 % fötalem Rinderserum wurde in die Schwanzvene jeder Empfängermaus injiziert.
Acht Wochen alte Mäuse aus derselben Inzucht FVB/N-Linie wurden hergestellt, um die Spenderzellen durch Bestrahlung mit einem ¹³⁷Cu-Bestrahler (Atomic Energy of Canada, Ltd.) zu erhalten. Die Einheit wies eine Dosisrate von 116 cG/min mit einer parallel entgegengesetzten Bestrahlungskonfiguration auf. Jedes Tier erhielt 9,0 Gy in zwei Fraktionen mit einem 4 h Intervall (4,5 Gy + 4,5 Gy) (O'Hara, M. D. et al., Exp. Hemat. 19: 878-881 (1991)). Eine bis 2 Stunden nach der zweiten Bestrahlungsfraktion wurde das Gemisch von markierten adhärenten Zellen und normalen nicht-adhärenten Zellen intravenös injiziert. Die zur Kontrolle bestrahlten Mäuse, die keine Zellinfusion erhielten, starben nach 10 bis 13 Tagen aufgrund von Markversagen.
Um das Schicksal der Spenderzellen zu verfolgen, wurden zwei PCR-Assays aus dem humanen COL1A1-Minigen und dem Maus-endogenen COL1A1-Gen entwickelt. Mit einem Zwei-Primer-Assay waren die Werte für das Verhältnis des humanen und des Mausgens linear über einem Bereich von 10^–4 bis ungefähr 10⁺¹ und deshalb von ungefähr 10^–6 bis 10^–1 Spenderzellen pro Empfängerzelle. Mit dem Drei-Primer-Assay waren die Werte linear über einem Bereich von ungefähr 10³ bis 10⁺² und deshalb ungefähr 10^–5 bis 1 Spenderzelle pro Empfängerzelle.
Assays von bestrahlten Mäusen nach einem Tag zeigten nur Spuren von Mengen der Spenderzellen im Mark, der Milz, dem Knochen, der Lunge oder dem Gehirn (Tabelle 1). Geringfügig höhere Mengen wurden nach sieben Tagen beobachtet. Nach 30 Tagen und 150 Tagen machten Nachkommen der Spenderzellen 2,0 bis 12 % der Zellen im Mark, der Milz, dem Knochen und der Lunge aus (Tabelle 1). Nach 150 Tagen machten sie außerdem 1,5 bis 5 % der Zellen im Xiphoid-Knorpel aus, der frei von irgendwelchem mineralisierten oder fibrösen Gewebe unter einem Mikroskop präpariert wurde. Obwohl es schien, dass die durchschnittlichen Werte einen Abfall zwischen dem 1. und dem 5. Monat zeigten, gab es keinen statisch signifikanten Abfall in den kombinierten Werten für Mark, Milz, Knochen und Lunge zwischen diesen zwei Zeiträumen (Tabelle 1). Assays von nicht-bestrahlten Mäusen zeigten nur sehr geringe Mengen der Spenderzellen an denselben Zeitpunkten (< 0,0001 bis 0,05 %). PCR in situ Assays von Gewebeschnitten der Lunge zeigten, dass die Nachkommen der Spenderzellen gleichmäßig in dem Parenchym von sowohl der Lunge als auch den Bronchien verteilt waren.
Um zu bestätigen, dass Nachkommen der Spenderzellen im Knorpel anwesend waren, wurden Chondrozyten aus dem Xiphoid und artikulären Knorpel durch Spalten bei 37°C über Nacht mit 0,5 mg/ml bakterieller Kollagenase (Sigma) in DMEM isoliert. PCR-Assays zeigten, dass Nachkommen der Spenderzellen 2,5 % der isolierten Chondrozyten ausmachten.
Um zu bestimmen, ob die Spenderzellen funktionelle mesenchymale Zellen in den Geweben geworden waren, die sie bevölkerten, wurden die Gewebe der Empfängermäuse durch RT-PCR hinsichtlich der Expression des humanen Minigens für Kollagen I, das in den Spenderzellen enthalten ist, untersucht. In drei Mäusen, die nach 150 Tagen untersucht wurden, wurde das Minigen im Knochen exprimiert, einem Gewebe, in dem über die Hälfte des synthetisierten Proteins Kollagen I ist. Die Expression im Knochen wurde durch einen ähnlichen Assay an Knochenzellen bestätigt, die vom Oberschenkel isoliert und für 1 Woche kultiviert wurden. Die Expression des Minigens für Kollagen I war variabler im Mark, der Milz und der Lunge; Geweben, in denen die Rate von Kollagen I-Synthese geringer ist als im Knochen. Wie erwartet, wurde das Minigen nicht im Knorpel exprimiert; einem Gewebe, in dem die Hälfte des synthetisierten Proteins Kollagen II ist, aber in dem es keine Synthese von Kollagen I gibt. Das Minigen für Kollagen I wurde ebenfalls nicht in Kulturen von Chondrozyten von den Empfängermäusen exprimiert, die das Markergen enthielten und die Kollagen II, aber kein Kollagen I synthetisierten.
Frühere Berichte haben gezeigt, dass Assays von Zellen mit zytochemischen Markern oder für mRNAs zeigten, dass die Zellen Kollagen I, Kollagen III, Fibronectin, alkalische Phosphatase und Osteopontin synthetisierten, aber sie wiesen keine charakteristischen Merkmale von Makrophagen, Granulozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten oder endothelialen Zellen auf. Diese Ergebnisse hier zeigen, dass nach intravenöser Injektion in bestrahlte Mäuse, die vermehrten Kulturen von adhärenten Zellen wirksam verschiedene Bindegewebe besiedeln. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Zellen als wahre Vorläuferzellen für diese Gewebe dienen, weil sie das Markergen für Kollagen I in gewebespezifischer Weise exprimierten, und weil sie diffus in das mesenchymale Parenchym der Lunge eingebaut wurden.
Beispiel 2
Bedingungen für die Isolierung und Kultur von MSCs.
Es wurden Kulturbedingungen von MSCs untersucht, so dass sie sich vermehrten, aber den Stammzell-ähnlichen Phänotyp beibehielten. Tabelle I zeigt, dass eine Ko-Kultur von MSCs mit Stücken von Knochen die Zellzahl steigerte, die nach einer Woche erhalten wurde. Gleichzeitig verringerte das Ko-Kultivieren mit Knochen die alkalische Phosphatase-(APase)-Mengen in den Zellen, eine Beobachtung, die nahelegt, dass die Zellen nicht zu Osteoblasten differenzierten. Es gab auch einen Abfall in den Mengen der Tartrat-resistenten Säurephosphatase (TRAP), eine Beobachtung, die nahelegt, dass die Zellen nicht zu Osteoklasten differenzierten. Ähnliche Wirkungen wurden mit sekundären Kulturen der MSCs beobachtet. Deshalb legen die Ergebnisse nahe, dass Ko-Kultivieren mit Knochenstücken verbesserte Bedingungen für die Vermehrung von MSCs bereitstellen kann. Auch das Medium der kultivierten Knochenstücke kann eine wichtige Quelle von Zytokinen und Wachstumsfaktoren für die Vermehrung von MSCs in Kultur sein.
In ähnlichen Experimenten wurde gefunden, dass sekundäre Kulturen von MSCs für lange Zeiträume aufrechterhalten werden können. MSCs können in Kultur für über 4 Monate durch Trypsinierung und erneutes Ausplattieren passagiert werden. Die Zellen sind in Kulturen der stationären Phasen bemerkenswert stabil. In einem Experiment bleiben Kulturen in der stationären Phase über 4 Monate mit erneutem Füttern ungefähr einmal wöchentlich lebensfähig. In einem anderen Experiment blieben die Zellen lebensfähig, wenn sie, unter Aufsicht in einem Inkubator ohne erneutes Füttern für 1 Monat belassen wurden.
Stabile Transfektion von MSCs mit einem Retrovirus-Vektor
Um Virus für die Infektion von MSCs zu erhalten, wurde LNCZ retroviraler Vektor (Miller, A. D. und Rosman, G. J. (1989) BioTechniques 7, 980-990, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist) modifiziert, so dass der Promotor für Zytomegalovirus (pCMV) die Expression des lacZ-Gens (1) steuerte. Der Vektor wurde stabil in eine amphotrophe murine Verpackungszelllinie (PA317) transfiziert. Konstitutive Virus-bildende Klone wurden durch G418-Selektion isoliert, und der Überstand von den Klonen wurde für die Infektion von MSCs verwendet. Primäre Kulturen von MSCs (3 Tage alt) wurden für drei aufeinanderfolgende Tage mit frischem Überstand von der Herstellerlinie mit dem höchsten Titer infiziert. Die Färbung der Zellen 5 Tage später zeigte, dass ungefähr 15-20 % der Zellen typischerweise das lacZ-Gen exprimierten. Einige Kulturen der infizierten Zellen wurden unter Selektion mit G418 (0,4-4 μg/ml aktive Konzentration) für 5 Tage gegeben. Die meisten der gewonnenen Zellen exprimierten das lacZ-Gen kontinuierlich. Es wurden auch Modifikationen von LNCZ konstruiert, so dass die Expression des lacZ-Gens durch den Promotor des COL1 A1-Gens und des Promotors des COL2 A1-Gens (pCOL2A1) gesteuert wurde. Eine Expression des lacZ-Gens wurde erfolgreich in primären Kulturen von MSCs mit beiden Konstrukten erhalten.
Austausch von Knochenzellen in transgenen Mäusen gegen normale MSCs.
MSCs aus normalen Mäusen wurden in die transgenen Mäuse infundiert, die hohe Mengen des mutierten COL1 A1-Gens (Tabelle II und III) exprimierten. Ein Monat nach der Infusion von normalen MSCs in die Osteo-Imperfecta-(OI)-Mäuse (Tabelle II) machten die Nachkommen der Spenderzellen 10 bis 45 % der Knochenzellen in den Empfängermäusen aus, die mit einer maximal tolerierten Dosis an Röntgenstrahlung (700 centi-Gray oder cGy) bestrahlt wurden. Ähnliche Werte wurden mit Mäusen erhalten, die mit der Hälfte der maximal tolerierten Dosis an Röntgenstrahlung (350 cGy) bestrahlt wurden. Jedoch verringerte eine Verringerung der Dosis auf ein Viertel (175 cGy) die Werte in vier Mäusen auf 0 %, 5 %, 10 % und 40 %. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn OI-transgene Mäuse mit gro ßen Zahlen von Gesamtknochenmarkszellen infundiert wurden, aus denen MSCs nicht entfernt wurden (Tabelle III).
In fünf Empfängermäusen, in denen die Synthese von proα1(1)-Ketten untersucht wurde (Tabellen II und III), wurde der Austausch der Knochenzellen des Empfängers gegen normale Spender-MSCs durch einen Anstieg gegenüber dem Verhältnis von normalem proα1(1)-Ketten gegenüber mutierten proα1(1)-Ketten im Knochen begleitet. Somit war der Austausch durch normale Zellen von der erwarteten Veränderung auf der Proteinebene begleitet.
Beispiel 3
Langzeitexpression der humanen Gene für hGH, Faktor IX oder Ob in stabil transfizierten MSCs.
MSCs wurden aus Mäusen isoliert und unter Bedingungen kultiviert, die beschrieben sind in Pereira, R. F. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4857-4861. MSCs wurden mit retroviralen Vektoren infiziert oder mit nackter DNA transfiziert, um Klone zu erhalten, die Gene für humanes Wachstumshormon (hGH), das humane Fettsuchtprotein (Ob) oder das Gen für humanen Faktor IX exprimieren. Weil ein lacZ-Gen erfolgreich in Maus-MSCs mit einem retroviralen Vektor eingeführt wurde, wurden Varianten desselben Vektors verwendet. Gleichzeitig werden MSCs stabil mit Elektroporation transfiziert (Andreason, G. L und Evans, G. A. (1988) BioTechniques 6, 650-660 und Toneguzzo, F. et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6, 703-706), Lipofektamin und Kerninjektion (Mercer, W. E., et al. (1992) In: Antisense Strategies, Ann. N. Y. Acad. Sci. Biol. 660, 209-218, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist), so dass größere endogene Gene verwendet werden können. Darüber hinaus werden einige der potentiellen Nachteile von Retroviren unter Verwendung von alternativen Verfahren zur Einführung vermieden.
Standardbedingungen für die Isolierung und Kultur sind: Gesamtmark wird aus den Unterschenkeln und Oberschenkeln von 6-10 Wochen alten FVB/N-Mäusen durch Zerschneiden der Knochenenden und Extrudieren des Marks mit einer Spritze, die 1 bis 2 ml eiskaltes α-MEM und 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, erhalten. Die vereinigten Markzellen werden durch vorsichtiges Schütteln verteilt und in einem automatisierten Zählgerät (Coulter Modell ZM) gezählt. Von 5 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ kernhaltige Zellen in 25 ml α-MEM und 10 % FBS wurden auf 75 cm² Kulturflaschen ausplattiert. Nach 4 h oder 3 Tagen werden die nicht-adhärenten Zellen durch Austauschen des Mediums entfernt. Die adhärenten Zellen werden als primäre Kulturen für 10 bis 12 Tage mit einem erneuten Füttern ungefähr alle 4 Tage vermehrt. Die Zellen werden durch Spalten mit 0,25 % Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für 5 min bei 37°C nach vorsichtigem Abschaben gewonnen. Die Zellen werden mit α-MEM mit 10 % FBS verdünnt und erneut bei einer Dichte von 3 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ pro 9,5 cm² in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert. Unter diesen Bedingungen beträgt die Verdopplungszeit der Zellen 19 bis 22 Stunden. Die sekundären Kulturen werden erneut ungefähr alle 4 Tage gefüttert und durch Trypsinierung und erneutes Ausplattieren unter denselben Bedingungen passagiert.
Herstellung von Genkonstrukten.
Der Retrovirus-Vektor LNCX wird als das Ausgangskonstrukt verwendet. Es werden geeignete Klonierungsstellen in dem Konstrukt verwendet, um die modifizierten Konstrukte pRSV-lacZ, pCMV-lacZ, pCOL1-lacZ und pCOL2-lacZ (1) herzustellen. Der pCOL1-Promotor ist ein 1,4 kb Fragment, das 476 bp des Promotors, das erste Exon und den größten Teil des ersten Introns des humanen COL1A1-Gens enthält. Von dem Promotor wurde gezeigt, dass er in transgenen Mäusen eine promotorlose Form des COL2A1-Gens in einer stark gewebespezifischen und entwicklungsspezifischen Weise exprimiert (Sokolov, B. P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 9622-9629). Der COL2A1-Promotor ist ein 1 kb Fragment aus dem humanen COL2A1-Gen (Ala-Kokko, L. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14175-14178), das der Expression Gewebespezifität verleiht (Bradham, D. M. et al. (1994) J. Cell Physiol. 158, 61-68). Das lacZ-Gen wird gegen das hGH-Gen (Nichols Laboratories); das OB-Gen (Considine, R. V. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95, 2986-2988), oder das humane Faktor IX Gen (Genetic Therapy, Inc.) ausgetauscht.
Verwendung des Retrovirus-Vektors.
Retrovirus-Herstellungszellinien.
Um Herstellungszelllinien zu etablieren, wurden amophotrophe Retrovirus verpackende murine Zellen PA317 verwendet. Die Zellen wurden bei 20 % Konfluenz in 100 mm-Schälchen durch das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren (Promega) unter Verwendung von 15 μg Plasmid-DNA, die durch Spalten mit Scal linearisiert wurde, das in der pBR322-Region des Retrovirus-Vektors spaltet, transfiziert. Ein Tag nach der Transfektion wurde G418 (GIBCO/BRL) zu dem Medium in einer aktiven Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Neomycin-resistente Kolonien traten nach 7 bis 10 Tagen der Selektion auf und wurden durch Klonieren mit mechanischen Ringen isoliert. Die Kolonien wurden vermehrt, und einzelne Kolonien wurden hinsichtlich der Fähigkeit, lacZ zu exprimieren, durch direktes Färben in doppelten Vertiefungen getestet. Der Virustiter, der von den positiven Zellen gebildet wurde, wurde durch eine einzelne Zugabe von 50 μl des Mediums zu HT-1080 humanen Tumorzellen, die bis zu 20 % Konfluenz in Mikroplatten mit 6 Vertiefungen mit 3 ml Medium pro Vertiefung und in der Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren angezogen wurden, untersucht. Der Titer wurde durch Bestimmen der Zahl von HT-1080-Zellen, die sich positiv hinsichtlich der Expression des lacZ-Gens färbten, untersucht. Typischerweise betrug der Titer 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁶.
Retrovirus-Infektion von Maus-MSCs.
Primäre Kulturen von Maus-MSCs wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach 3 Tagen wurden die nicht-adhärenten Markzellen verworfen, und frisches Medium wurde zugegeben. Die Zellen wurden anschließend mit dem Retrovirus in der Anwesenheit von 4 μg/ml Polybren durch Zugabe von 1/4 Volumen von frischem Überstandmedium aus stabil transfizierten Herstellungszellen infiziert, welche den höchsten Titer der Virusbildung aufwiesen. Die Infektion wurde an zwei zusätzlichen aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Die Zellen wurden anschließen entweder direkt hinsichtlich lacZ-Expression gefärbt oder in größere Schälchen geteilt und unter Selektion mit 0,4 mg/ml G418 (aktive Konzentration) gegeben. Ungefähr 15 bis 20 % der Primärkulturen waren positiv hinsichtlich lacZ, und die meisten Zellen, welche die G418-Selektion überlebten, waren positiv hinsichtlich lacZ.
Lipofektamin-Transfektion.
Primäre MSCs-Kulturen wurden für 10 Tage in α-MEM mit 10 % FBS angezogen. Nach der Trypsinierung und leichtem Abschaben wurden die Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen zu einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Vertiefung ausgesät. Die Zellen wurden für zwei Tage angezogen, anschließend zweimal mit PBS gewaschen und mit einem DNA-Lipofektamin-Komplex inkubiert. Der DNA-Lipofektamin-Komplex wurde wie folgt hergestellt: 6 μl Lipofektamin (GIBCO/BRL) wurden mit 1 μg LINCZ-DNA in 200 μl α-MEM gemischt, bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert und zu einer Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen mit MSCs in 800 μl α-MEM zugegeben. Nach 6 h Inkubation bei 37°C wurde der DNA-Lipofektamin-Komplex gegen 2 ml α-MEM mit 10 % FBS ausgetauscht. Die Zellen wurden hinsichtlich lacZ gefärbt oder unter G418-Selektion nach 18 h Inkubation in FBS-enthaltendem Medium gegeben. Es wurden positive Klone erhalten, aber sie wuchsen nur langsam, offensichtlich weil die Zelldichte nach der G418-Selektion zu gering war. Um diese Situation zu umgehen, wurden drei verschiede ne Strategien verwendet: (a) Die Zellen wurden mit höheren Dichten ausplattiert; (b) ko-kultivierte Zellkultur-Inserts werden über die überlebenden Klone früh im Selektionsverfahren gegeben und frische MSCs oder Knochenstücke in den Inserts (siehe Tabelle 1) werden auf einer täglichen Basis zugegeben, um die notwendigen Zellfaktoren, um das Wachstum zu stimulieren, bereitzustellen; (c) zu dem Zeitpunkt, zu dem die Selektion mit G418 viele der nicht-transfizierten Zellen abgetötet hat, werden die Kulturen erneut mit MSCs ausgesät, die mit einer Variante des Retrovirus LNCX (2) infiziert wurden, in denen das lacZ-Gen gegen ein selektierbares Gen für Thymidinkinase ausgetauscht wurde. Deshalb werden die MSCs, die stabil mit Retrovirus transfiziert sind, verwendet, um die notwendigen Zytokine, Wachstumsfaktoren und Zellinteraktionen bereitzustellen, die für das anfängliche Wachstum der transfizierten MSCs während der Selektion in G418 benötigt werden. Wir können anschließend die Zellen, die mit dem Retrovirus infiziert sind, durch negative Selektion mit Gancyclovir entfernen.
Verabreichungsverfahren
Kerninjektionen.
Kerninjektionen sind hoch wirksam als ein Mittel zum Transfizieren einiger Zellen. Die Zellen wurden in 60 mm-Schälchen mit einem 22 × 22 mm Deckel (Coverslip), der mit einem Kreis markiert war, um den Bereich für die Mikroinjektion zu kennzeichnen, ausplattiert. Die Zellen wurden in Medium mit 0,1 % FCS für 5 Tage inkubiert, um den Wachstumsarrest vor der Mikroinjektion zu induzieren. Unter diesen Bedingungen bauten zwischen 8 und 15 % der Zellen [³H]Thymidin während der kontinuierlichen Markierung für 24 h zwischen 5 und 6 Tagen ein. Die Mikroinjektion wurde unter Verwendung eines Zeiss Axiovert invertierten Mikroskops, das mit einer Eppendorf Mikroinjektion und einem Mikromanipulator ausgestattet war, unter Verwendung kommerziell erworbener Glaskapillar-Femtotips (Eppendorf), durchgeführt. Alle Zellen innerhalb eines gekennzeichneten Bereichs auf dem Deckel (für gewöhnlich 150-200) wurden in den Kern mit DNA bei Konzentrationen im Bereich von 0,01-10 μg/ml in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,6) mikroinjiziert. Die injizierten Zellen werden vermehrt und wie oben beschrieben untersucht.
Elektroporation
MSCs werden mit 0,25 % Trypsin und 1 bis 5 mM EDTA für 5 min bei Raumtemperatur behandelt und anschließend durch Abschaben geerntet. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 4000 × g für 10 min pelletiert, und anschließend werden sie zweimal durch Resuspendieren des Pellets in eiskaltem PBS (pH 7,4) gewaschen. Die MSCs werden bei 2 × 10⁶ Zellen pro 0,8 ml resuspendiert und in eine Elektroporationscuvette (0,4 cm Lücke) aliquotiert. Die Zellen werden bei 10 min auf Eis inkubiert, DNA wird zu der Suspension (5-50 μg) zugegeben, und die Zellen werden für weitere 10 min gekühlt. Die Zellsuspension wird anschließend unter Verwendung eines herkömmlichen Instruments (BioRad Gene Pulser, Modell 1652076) bei einer empirisch bestimmten Feldstärke, welche den größten Prozentsatz von Zellen liefert, welche exogen zugegebene DNA zurückhalten, elektroporiert. Um die geeignete Feldstärke für MSCs zu bestimmen, werden Titrationen im Bereich von 0,25-2,5 kv/cm durchgeführt. Die Elektroporationswirksamkeit wurde durch Einführen eines lacZ-Gens (LNCZ-Vektors) und anschließendem Färben der Zellen 48 bis 72 h nach der Elektroporation überwacht.
Assays.
hGH
Die Expression des hGH-Gens wird durch Untersuchen des Mediums hinsichtlich Zellklonen überwacht, die in Mikrotiterplatten mit 6 Vertiefungen angezogen wurden, mit einem Enzym-basierten Immunoabsorbent-Assay mit einem kommerziell erhältlichen Kit (GIBCO/BRL). In diesem Assay werden 0,1 ml 2 × verdünnter Puffer pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte zugegeben. Nach 5 min werden 0,1 ml der Testprobe zugegeben, und die Platte wird bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Vertiefungen werden 5 mal gewaschen, und 0,2 ml primärer Antikörper wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Proben werden bei 37°C für 30 min inkubiert und 5 mal gewaschen. Anschließend werden 0,2 ml Substratpuffer mit O-Phenylendiamin-Substrat zugegeben. Die Proben werden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 2 N Schwefelsäure abgestoppt. Die Absorption der Probe wird bei 490 nm bewertet.
Ob-Protein.
Die Zellen werden hinsichtlich Expression des Ob-Gens mit einem Proteinradioimmunassay des Zellmediums untersucht. Der primäre Antikörper für humanes Ob-Protein wird in Kaninchen gegen rekombinantes Protein gewonnen, das in einem E. coli Expressionssystem synthetisiert und bis zur Homogenität gereinigt wurde. Das humane Protein ist hoch homolog zu der Maus und deshalb sollten anti-humane Antikörper mit dem Mausprotein kreuzreagieren. Wenn sie dies nicht tun, dann wird die kurze Maus-cDNA (619 nt) in E. coli exprimiert, das Protein gereinigt, und die Antikörper werden hergestellt. Alternativ werden synthetische Peptide mit der Maus-Sequenz gekauft, und diese werden verwendet, um Antikörper herzustellen. Für den Assay wird rekombinantes Ob-Protein radioaktiv mit ¹²⁵Iod durch das Bolton-Hunter-Verfahren radioaktiv markiert, gefolgt durch Gelfiltrationsreinigung unter Verwendung von Sephadex G-25. Die erhaltene spezifische Aktivität betrug –30 μCi/μg. Die Assayproben (0,2 ml) wurden mit primärem Antiserum (1:2000 Verdünnung) in Phosphat-gepufterter Salzlösung mit 0,1 % Triton X-100 für 16 h bei 4°C in einem Gesamtvolumen von 0,4 ml präinkubiert. ¹²⁵I-Ob-Protein (30.000 cpm im 100 μl) wurde anschließend zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 24 h fortgesetzt. Das gebundene Ob-Protein (12 ± 1 %; unspezifische Bindung 1,4 ± 0,1 %) wurde durch Zugabe von 0,1 ml Schaf-anti-Kaninchen-IgG-Serum (Antibodies, Inc., Davis, CA), 0,1 ml normalem Kaninchen serum (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) und 0,1 ml 10 % Polyethylenglycol immunpräzipitiert. Die Gefäße wurden für 15 min (2200 rpm) zentrifugiert, und ungebundene Markierung wurde dekantiert und das Pellet in einem Packard 5000 Gamma Zählgerät (Downers Grove, IL) gezählt. Die Konzentration des Ob-Proteins in unbekannten Proben wurde unter Verwendung von Rodbard's ungewichtetem vierparametrischen Logistikmodell berechnet. Die Nachweisgrenze dieses Assays beträgt 0,39 ng/ml. Die Infra-Assay-Varianz beträgt 11,6 % bei 12 ng/ml mit einem Inter-Assay-Varianz von 20,8 % bei 13,1 ng/ml.
Humaner Faktor IX.
Die Expression des Gens für Faktor IX wird mit einem kommerziell erhältlichen ELISA (American Bioproducts Company) unter Bedingungen, die jenen ähnlich sind, die für den hGH-Assay (oben) verwendet wurden, untersucht. Wie von Smith et al. (74) berichtet wurde, erreichte die Standardkurve von 1-50 ng/ml, und die Sensitivitätsgrenze betrug 1 ng/ml. Der Assay zeigte keine Kreuzreaktivität mit Mausfaktor IX.
Beispiel 4 – nicht Teil der Erfindung
Die verzögerte Expression der drei Gene bei physiologisch wichtigen Mengen durch synthetische Infusion von stabil transfizierten MSCs in Mäuse.
Die Experimente mit den OI-transgenen Mäusen (Tabelle II und III) haben gezeigt, dass kultivierte MSCs als Stammzell-ähnliche Vorläufer von Knochen-, Knorpel- und anderen mesenchymalen Geweben nach systemischer Infusion dienen können. Deshalb werden MSCs, die hGH, das Ob-Protein oder Faktor IX exprimieren, in bestrahlte und nicht-bestrahlte Mäuse infundiert, um die verzögerte Expression der Gene in vivo zu bewerten.
Infusion von MSCs.
Anfänglich werden MSCs in Mäuse unter Bedingungen wie jenen, die in Tabelle III beschrieben sind, infundiert (3 Wochen alte Mäuse: 300 oder 700 Gray Bestrahlung; intraperitoneale Injektion; 1 × 10⁶ MSCs; und 2 × 10⁸ Gesamtmarkszellen). Zusätzlich wird die intravenöse Infusion mit intraperitonealer verglichen; und niedrige Mengen von Röntgenbestrahlung werden eingesetzt. Außerdem werden die Zellen in Embryos durch Kaiserschnitt infundiert. In vorläufigen Versuchen wurden 50 μl 5 × 10⁴ ES in das Amnion von sieben 13 Tage alten Embryos injiziert; 6 von 7 wurden als lebendige junge Mäuse geboren. Deshalb ist die intrauterine Injektion von MSCs machbar.
Wachstumskurven.
Die wirksame in vivo Expression von hGH sollte die Wachstumsrate von Mäusen steigern, und das Ob-Protein sollte das Hungern (Starvation) induzieren. Deshalb wird das Gewicht und die Größe der behandelten Mäuse und der Kontrollen überwacht.
Assays für die Genexpression.
Es wurde Blut aus dem retro-orbitalen Plexus der Mäuse nach 1 Woche, 1 Monat, 3 Monaten, 5 Monaten, 10 Monaten und 20 Monaten nach Infusion der MSCs erhalten. hGB und Faktor IX werden durch ELISA untersucht, und das Ob-Protein wird mit einem Radioimmunassay untersucht. Zusätzlich wird, falls messbare Anstiege in humanem Faktor IX mit dem ELISA erhalten werden, das Verfahren, das in Smith, T.A.G., et al. (1993) Nature Genet. 5, 397-402, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben ist, verwendet, um biologisch aktiven humanen Faktor IX zu untersuchen. In diesem Verfahren wird humaner Faktor IX zunächst in einer Mikrotitervertiefung mit einem monoklonalen Antikörper, BGIX1, gefangen und anschließend durch Faktor XIa aktiviert. Der aktive Faktor IX, in Verbindung mit Faktor VIII, wandelte Faktor X in Xa um. Der Faktor Xa spaltete das chromogene Substrat, S-2765, was zu einem gelben Produkt führte. Die BGIX1-beschichteten Mikrotiterplatten und Faktor VIII wurden von Elcatech, Inc. (Winston-Salem, NC) gekauft. Faktor XIa wurde von Enzyme Research Labs, Inc. (South Bend, IN) gekauft. Faktor X, Phospholipid-Lösung, S-2765 und der Thrombin-Inhibitor 1-2581, wurden von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH) gekauft. Vier Puffer wurden hergestellt: A, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BS, pH 7,5; B, 150 mM Tris, 5 mM CaCl₂1 10 mg/ml^–1 Gelatin, pH 7,6; C, 50 mM Tris, 10 mM CaCl₂ pH 7,5; D, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,4. Der Faktor-VIII/X-Reaktionsmix wurde frisch durch Mischen gleicher Mengen der folgenden Stocklösungen hergestellt: Faktor VIII, 5 U ml^–1 in Puffer A, Faktor X, 1 U ml^–1 in Puffern; 1-2581, 34 μg ml^–1 in Puffer A; CaCl₂, 25 mM in Wasser; und Phospholipid. Die Plasmaproben wurden in Puffer A verdünnt, und 100 μl wurden zu jeder Vertiefung in der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Platte wurde für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend fünfmal mit Puffer B gewaschen. 100 μl Faktor XIa (μg ml^–1 in Puffer C) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 30 min bei 37°C wurden 100 μl S2765 (0,5 mM in Puffer D) zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte wurde für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von Essigsäure in einer Endkonzentration von 10 % abgestoppt wurde. Die Absorptionen bei 405 nm wurden mit einem BioRad Mikroplatten-Lesegerät bestimmt. Die Standardkurve, hergestellt mit Verdünnungen von humanem normalen gepoolten Plasma, war von 3-25 ng ml^–1 linear. Der Assay kreuzreagierte nicht mit Mausfaktor IX. Faktor IX, Mengen von 250 ng pro ml oder 5 % des Normalen wurden im Allgemeinen als therapeutisch erachtet, und 100 bis 150 ng/ml wurden als vorteilhaft erachtet.
Beispiel 5
Verzögerte Expression der Gene bei physiologisch wichtigen Mengen, in denen die MSCs in subkutane Diffusionskammern gegeben wurden.
Zellen, die in subkutanen Diffusionskammern implantiert waren, weisen mindestens zwei unterschiedliche Vorteile für die Therapie von Patienten auf: (a) Immunantworten werden umgangen; und (b) wenn sie in Kapseln in Mäuse (Benayahu, D. et al. (1989) J. Cell Physiol. 140, 1-7), in Ratten (Mardon, H. J. et al. (1987) Cell Tissue Res. 250, 157-165) oder Kaninchen (Friedenstein, A. J., et al. (1987) Cell Tissue Kinet. 20, 263-272) implantiert werden, überleben sie für mindestens 6 Wochen (Wakitani, S. et al. (1994) J. Bone and J. T. Surgery 76A, 579-592), offensichtlich, weil sie als Knochen, fibröses Gewebe oder Knorpel persistieren, das keine Vaskularisierung benötigt (Benayahu, D. et al. (1989) supra, Mardon, H. J. et al. (1987) supra, Owen, M. und Friedenstein, A. J. (1988) In: Cell and Molecular Biology of Invertebrate Hard Tissues, Wiley Chicester, CIBA Foundation Symposion, 136, 42-60 und Friedenstein, A. J. et al. (1987) supra).
Herstellung von Kammern.
Die Diffusionskammern wurden aus kommerziell erhältlichen Bestandteilen (Millipore Corp.) zusammengebaut und wie in vorherigen Berichten beschrieben, verwendet (Benayahu, D. et al. (1989) supra, Mardon, H. J. et al. (1987) supra). Kurz gesagt, wurden Membranfilter mit 0,3 μm Porengröße an einer Seite von jeder der zwei Plastikringe mit Acrylkleber verklebt. Die zwei Ringe wurden anschließend zusammengeklebt, um eine Kammer zu bilden, die Dimensionen betragen 9 mm innerer Durchmesser und 9 mm Stärke mit einem Volumen von ungefähr 127 mm³. Von 10⁴ bis 10⁷ MSCs werden in die Kammern durch ein Loch in einem Ring inokuliert, und das Loch wird mit einem kegelförmigen Plastikstopfen, der mit Klebstoff beschichtet ist, versiegelt. Die Kammern werden in Mäuse entweder subkutan im Rücken oder intraperitoneal unter Anästhesie implantiert. Anfänglich wird eine oder werden mehrere Kammern in frisch entwöhnte bzw. abgestillte Mäuse (3 Wochen) eingebaut. Anschließend werden die Kammern in 1-Wochen-alte Mäuse inseriert. Für die Experimente mit den 1-Wochen-alten Mäusen werden kleinere Kammern aus Scheiben (5 mm innerer Durchmesser) hergestellt, die aus Plastikspitzen für Mikropipetten ausgeschnitten wurden.
Assays
Es wurde Blut von dem retro-orbitalen Plexus 1 Woche, 1 Monat, 3 Monate, 5 Monate, 10 Monate und 20 Monate nach der Implantation der Kammern erhalten. Das Plasma wird hinsichtlich hGB, Ob-Protein und Faktor IX, wie oben beschrieben, untersucht.
Beispiel 6
Unter Bezugnahme auf 2 kann die Diffusionskammer (1) ein Kammerfass bzw. eine walzenförmige Kammer (3) mit zwei Enden, einem ersten Ende (5) und einem zweiten Ende (7) aufweisen. Das Fass kann einen oder mehrere Ringe aufweisen, die durch nicht-toxische Mittel miteinander verbunden sind. Die Kammer ist an jedem Ende mit einem Filter, einem ersten Filter (9) und einem zweiten Filter (11) ausgestattet. Die Filter sind porös gegenüber Faktoren, so dass die Faktoren zwischen der Kammer und dem Säugetier passagieren können. Die Filterporengröße kann ungefähr 0,25 μm oder kleiner, vorzugsweise ungefähr 0,1 μm sein. Die Filter sind aus Plastik, Teflon, Polyester oder irgendeinem inerten Material, das stark, flexibel und in der Lage ist, chemischen Behandlungen zu widerstehen, hergestellt. Die Filter können in eine Position mit Gummimanschetten gesichert sein, die auch eine festere Versiegelung bereitstellen. Wahlweise kann der Fass abschnitt der Kammer auch eine Öffnung (13) aufweisen, die mit einer Kappe (nicht gezeigt) bedeckt sein kann. Die Kappe kann aus einer Art selbstversiegelndem Gummi hergestellt sein und in die Öffnung eingepasst sein. Das Einführen von Zellen in den Kammerinnenraum kann somit durchgeführt werden, indem die Öffnung durch Entfernen der Kappe geöffnet wird und die Zellen unter Verwendung einer normalen Nadel und Spritze eingeführt werden. Die Kammer kann aus einer Substanz hergestellt sein, wie, aber nicht beschränkt auf, Plastik, Teflon, Acrylglas bzw. Acrylharz (Lucite^®), Titan oder irgendeinem inerten Material, das nicht toxisch gegenüber und von Säugetieren gut toleriert wird. Zusätzlich sollten die Kammern in der Lage sein, eine Sterilisation zu überleben.
Die Kammer kann auf die folgenden, nicht-beschränkten Weisen implantiert werden: zum Beispiel subkutan oder intraperitoneal. Die Kammer kann nach ungefähr 24 bis ungefähr 30 Stunden nach der Implantation entfernt werden. Alternativ kann eine wiederbefüllbare Kammer eingesetzt werden, so dass die Kammer für Behandlungen wiederverwendet werden und nach Behandlungen geleert werden kann. Tabelle I: Bedingungen für das Wachstum von primären und sekundären MSCs-Kulturen.

^a Gesamtmarkszellen (20 × 10⁶) von 6 Wochen alten Mäusen wurden in einzelnen 9,5 cm² Vertiefungen in 2 ml 10 % FCS und α-MEM kultiviert. Nicht-adhärente Zellen wurden am dritten Tag entfernt und die Inkubation in frischem Medium bis zum 7. Tag fortgesetzt. APase und TRAP wurden wie zuvor in der Referenz 55 beschrieben, untersucht.
^b Ko-kultiviert mit Knochenstücken (1/2 Oberschenkel und 1/2 Unterschenkel) in Zellkultur-Inserts (23 mm; 3 μm Porengröße; Becton Dickinson).
^c Genauso wie ^b, mit Inserts, die mit Matrigel beschichtet sind.
^d Primäre Kulturen am 10. Tag wurden mit 0,25 % Trypsin und 1 % EDTA für 5 min bei 37°C, gefolgt von vorsichtigem Abkratzen abgelöst. Die Zellen aus einer Vertiefung (2 × 10⁵) wurden 1:4 verdünnt und in 9,5 cm² Vertiefungen für 7 Tage mit Austausch des Mediums am 3. und am 6. Tag kultiviert.
^e APase (20, 54) und TRAP (55) Aktivitäten waren pro mg Gesamtprotein.

^a (N), normal; (TG), transgen.
^b MSCs, entfernt aus Gesamtmarkszellen vor der Infusion durch Inkubation auf Plastikkulturschale für 4 h bei 37°C.

^a (N) Gesamtmark von normalen Mäusen ohne irgendeine Behandlung, um MSCs zu entfernen.

Claims

Implantat Vorrichtung umfassend: einen Behälter mit mindestens einer Membranoberfläche, wobei der Behälter darin enthaltene Knochenmarks Bindegewebszellen, die ein Genkonstrukt umfassen, immunologisch isoliert, wobei das Genkonstrukt eine Nukleotidsequenz, die ein vorteilhaftes Protein kodiert, operativ mit regulatorischen Elementen verbunden, die in der Bindegewebszelle wirksam sind, umfasst.
Implantat Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Membran eine Porengröße von 0,3 Mikron aufweist.
Implantat Vorrichtung nach Anspruch 1 mit einem Membranoberflächenbereich von mindestens 100 mm².
Implantat Vorrichtung nach Anspruch 1 umfassend 10⁴ bis 10¹¹ Bindegewebszellen.
Implantat Vorrichtung nach Anspruch 1 umfassend 10⁴ bis 10⁸ Bindegewebszellen.
Implantat Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das vorteilhafte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus menschlichem Wachstumshormon, Fettsucht Faktor und menschlichem Faktor VIII besteht.
Verwendung einer Implantat Vorrichtung umfassend einen Behälter mit mindestens einer Membranoberfläche, wobei der Behälter darin enthaltene Knochenmarks Bindegewebszellen, die ein Genkonstrukt umfassen, immunologisch isoliert, wobei das Genkonstrukt eine Nukleotidsequenz, die ein vorteilhaftes Protein kodiert, operativ mit regulatorischen Elementen verbunden, die in der Bindegewebszelle wirksam sind, umfasst, in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums mit einer Erkrankung, einer Störung oder einem Zustand, die/der mit einem vorteilhaften Protein behandelt werden kann.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Erkrankung, die Störung oder der Zustand, die/der mit einem vorteilhaften Protein behandelt werden kann, eine Erkrankung, eine Störung oder Zustände ist/sind, die durch einen Gendefekt gekennzeichnet ist/sind.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das vorteilhafte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus menschlichem Wachstumshormon und menschlichem Faktor VIII besteht.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Membran der Implantat Vorrichtung eine Porengröße von 0,3 Mikron aufweist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Implantat Vorrichtung einen Membranoberflächenbereich von mindestens 100 mm² aufweist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Implantat Vorrichtung 10⁴ bis 10¹¹ Bindegewebszellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Implantat Vorrichtung 10⁴ bis 10⁸ Bindegewebszellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Implantat Vorrichtung für subkutane Implantation in das Individuum geeignet ist.