JPH11509171A - 単離されたストロマ細胞と当該細胞を使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 骨、軟骨あるいは肺の欠陥に特徴づけられる疾患、障害あるいは症状にかかった患者の治療方法が開示されている。正常の遺伝的に同一なヒトから単離されたストロマ細胞を静脈内投与する工程、あるいは患者から単離され、単離された細胞内の遺伝子的欠陥を改善された後のストロマ細胞を静脈内投与する工程を含む方法が開示されている。少なくとも一つの膜表面と、遺伝子構築物を含む骨髄から単離されたストロマ細胞とを含む容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む、移植装置が開示されている。ストロマ細胞内の遺伝子構築物には、ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能なように連結された、有益なタンパク質をコードする塩基配列が含まれている。遺伝子的欠陥に特徴づけられる疾患、障害あるいは症状を含む、有益なタンパク質で治療されうる疾患、障害あるいは症状の治療方法が開示されている。その方法には、そのような患者に対してレシピエントの免疫系からそれらを物理的に隔離する方法で投与され、そしてストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能なように連結された、有益なタンパク質をコードする塩基配列が含まれる遺伝子構築物を含むストロマ細胞を投与することが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 単離されたストロマ細胞と当該細胞を使用する方法発明の分野 本発明は、単離されたストロマ細胞を含む組成物、外来のＤＮＡをトランスフ ェクトされた単離されたストロマ細胞を含む容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、骨及 び軟骨に関連する疾患をもつ患者を治療する方法、並びに骨、軟骨あるいは肺組 織に関連する疾患をもつ患者を、皮膚、血管、心臓および腎臓組織に関連する疾 患をもつ患者を、遺伝的欠損および／または疾患に関連する疾患をもつ患者を、 あるいは有益なタンパク質を投与あるいは導入することで治療しうる症状にある 患者を治療する際のストロマ細胞の使用方法に関する。発明の背景 造血幹細胞に加えて、骨髄には骨髄細胞を回収しプラスチック培養皿上におい て培養するときにその接着活性により特徴づけられる、間葉性の（ｍｅｓｅｎｃ ｈｙｍａｌ）前駆細胞である「ストロマ細胞」が含まれる（本明細書中で参考文 献として援用されている、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．４：２６７−２７４（１９７６））。およそ４時間のうち に、ストロマ細胞はプラスチックに接着し、その後非接着細胞を培養皿から取り 除くことにより単離されうる。これらのプラスチックにしっかりと接着した骨髄 細胞は、広範囲にわたって研究されてきた（本明細書中で参考文献として援用さ れている、Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ５６：２８９−３０１（１９８０）；Ｐｉｅｒｓｍａ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ． ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：２３７−２４３（１９８５）；Ｓｉｍｍｏｎ ｓ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，Ｂ．，Ｂｌｏｏｄ ７８：５５ −６２（１９９１）；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ ｌ．Ｓｃｉ．１０２：３４１−３５１（１９９２）；Ｌｉｅｓｖｅｌｄ，Ｊ．Ｌ ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：１７９４−１８００（１９８９）；Ｌｉｅ ｓｖ ｅｌｄ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｔ １９：６３−７０（ １９９０）；およびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓ ｃｉ．９９：１３１−１３９（１９９１））。本明細書中で使用されているよう に、「接着細胞」という用語は、ストロマ細胞に言及することを意味しており、 「非接着細胞」という用語は、造血前駆細胞に言及することを意味している。 ストロマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨髄における、ミクロ環境を形成す る際に役割を果たしていると考えられている。単離されたときには、ストロマ細 胞は当初は静止期にあるが、その後分裂しはじめ、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏ において培養することができる。細胞数が増加したストロマ細胞は、樹立されそ して維持されうる。ストロマ細胞は、適切な条件下で培養をされるとき、繊維芽 細胞性の含脂肪細胞および骨形成細胞のコロニーを形成するものとして使用され てきた。接着細胞をヒドロコルチゾンあるいはその他の選択的な条件の存在下で 培養すると、造血前駆細胞あるいは骨形成細胞が増加した細胞集団が得られる（ 本明細書中で参考文献として援用されている、Ｃａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｆ．ｅｔａｌ ．，Ｂｌｏｏｄ ７９：３５６−３６４（１９９２）およびＢｉｅｎｚｌｅ，Ｄ ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５ ０−３５４（１９９４））。 ストロマ細胞の使用に関する実施例はいくつか存在する。本明細書中で参考文 献として援用されている欧州特許ＥＰ第０,３８１,４９０号は、ストロマ細胞を 用いた遺伝子療法を開示している。特に、血友病の治療に関する方法が開示され ている。ストロマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで選択された組織中に移植されるとき に繊維性組織、骨あるいは軟骨を形成するために使用されてきた（Ｏｈｇｕｓｈ ｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｅ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．６０：３３４− ３３９（１９８９）；Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ ．Ｒｅｓ．９：４６５−４７６（１９９１）；Ｎｉｅｄｚｗｉｅｄｓｋｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １４：１１５−１２１（１９９３） ；およびＷａｋｉｔａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ＆ Ｓｕｒｇ． ７６Ａ：５７９−５９２（１９９４））。いくつかの報告では、ストロマ細胞は 多孔性のセラミックと共に皮下に移植された場合に（Ｏｈｇｕｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．６０：３３４−３３９（１９８ ９））、拡散性チャンバーに入れて腹腔内に移植することで（Ｎａｋａｈａｒａ ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：４６５−４７６（１９９ １））、外科的に引き起こされた骨欠損の場合に経皮的に（Ｎｉｅｄｚｗｉｅｄ ｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １４：１１５−１２１ （１９９３））、あるいは関節軟骨における外科的欠損を修復するためにコラー ゲンゲルの中に入れて移植されることで（Ｗａｋｉｔａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｂｏｎｅ ＆ Ｓｕｒｇ．７６Ａ：５７９−５９２（１９９４））、ｉｎ ｖｉｖｏで骨あるいは軟骨を形成するために使用されてきた。Ｐｉｅｒｓｍａ ，Ａ．Ｈ．ら（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５４：２８５−２９０（１９８ ３））は、静脈内の骨髄移植の後、造血ストロマロッジ（ｓｔｒｏｍａ ｌｏｄ ｇｅ）を形成しそして宿主の骨髄中で生き残る、繊維芽細胞コロニー形成細胞に ついて開示している。Ｓｔｅｗａｒｔら（Ｂｌｏｏｄ ８１：２５６６−２５７ １（１９９３））は、全骨髄細胞を非常に大規模に繰り返し投与をすることによ り、骨髄除去を行わなかったマウス体内で、造血前駆細胞の長期間の生着（ｅｎ ｇｒａｆｔｍｅｎｔ）が引き起こされることを最近観察した。同様にＢｉｅｎｚ ｌｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５０−３５ ４（１９９４））は、骨髄除去をしていないイヌにおいて、造血細胞として永久 的に生残する（ｐｏｐｕｌａｔｅ）ためのドナー細胞として長期間にわたって骨 髄培養物を使用することに成功した。いくつかの報告において、ストロマ細胞は 、造血前駆細胞の培養のためのミクロ環境を確立する細胞として（Ａｎｋｌｅｓ ａｒｉａ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：７６８１−７６８５（１９８７））、ある いは造血幹細胞の濃縮された細胞集団の供給源として（Ｋｉｅｆｅｒ，Ｂｌｏｏ ｄ ７８（１０）：２５７７−２５８２（１９９１））、使用された。発明の概要 本発明の１つの側面は、骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴づけられる疾患 、障害あるいは症状、あるいは皮膚、血管、心臓あるいは腎臓における欠陥によ り特徴づけられる疾患、障害あるいは症状にかかった患者を治療する方法に関す る。 その方法は、以下の工程、正常な遺伝子的に適合したドナーから骨髄試料を採取 し、試料から接着細胞を単離し、そして単離された接着細胞を患者へ静脈内点滴 により投与する工程を含む。本発明の別の側面は、結果として患者の骨、軟骨あ るいは肺または皮膚、血管、心臓あるいは腎臓の欠陥が引き起こされる、変異し た、機能していない、あるいは発現が低下した遺伝子により特徴づけられる疾患 、障害あるいは症状にかかった患者を治療する方法に関する。その方法は、患者 あるいは遺伝子的に適合したドナーから骨髄試料を採取し、試料から接着細胞を 単離し、そして前記接着細胞を、機能的な調節要素と機能可能なように連結され た、前記変異した、機能していない、あるいは発現が低下した遺伝子についての 正常なコピーをトランスフェクトし、トランスフェクトされた接着細胞を患者へ 静脈内点滴により投与する工程が含まれる。 本発明は、少なくとも一つの膜表面とストロマ細胞とを有する容器（ｃｏｎｔ ａｉｎｅｒ）を含む、移植装置に関する。ストロマ細胞はストロマ細胞内で機能 する調節要素と機能可能なように連結された有益なタンパク質をコードする塩基 配列が含まれている遺伝子構築物を含む。 本発明は、遺伝子的欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状を含む 、有益なタンパク質で治療されうる疾患、障害あるいは症状にかかった患者を治 療する方法に関する。その方法には、そのような患者の体内に遺伝子構築物を含 む免疫学的に隔離されたストロマ細胞を投与する工程が含まれる。遺伝子構築物 には、ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能なように連結された有益な タンパク質をコードする塩基配列が含まれる。 本発明は、遺伝子構築物を含むストロマ細胞、および宿主の免疫系からそれら の細胞を物理的に隔離する方法により投与されるストロマ細胞に関する。遺伝子 構築物には、ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能なように連結された 有益なタンパク質をコードする塩基配列が含まれる。図面の簡単な説明 図１は、レトロウィルス構築物であるｐＣＭＶ−ｌａｃＺ、ｐＣＯＬ１−ｌａ ｃＺおよびｐＣＯＬ２−ｌａｃＺの概略図を示している。遺伝子構築物のカセッ トは、ＬＴＲ−Ｎｅｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＬａｃＺ−ＬＴＲである。 図２は、拡散性チャンバーの概略図である。発明の詳細な説明 本明細書中で使用されているように、「ストロマ細胞」、「コロニー形成繊維 芽細胞」、「骨髄ストロマ細胞」、「接着細胞」および「ＭＳＣｓ」は、交換可 能で使用されており、そして骨細胞、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）お よび含脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）の幹細胞様前駆細胞として機能しうる 、そしてプラスチック培養皿に接着するそれらの細胞の能力により骨髄から単離 されうる、骨髄中の細胞の小画分のことに言及することを意味している。、スト ロマ細胞は、どんな動物種からも採取しうる。いくつかの態様においては、スト ロマ細胞は霊長類、好ましくはヒトから採取している。 本明細書中で使用されているように、「遺伝子欠損により特徴づけられる疾患 、障害および症状」とは、欠損した遺伝子および／または不十分は遺伝子発現が 疾患あるいは症候に原因となって（ｃａｕｓａｌｌｙ）結びついている疾患、障 害および症状を意味している。遺伝子欠損に特徴づけられるいくつかのよく知ら れた疾患、障害および症状のどれかにかかった患者は、当該技術分野の通常の知 識を有する者により、特定されうる。遺伝子欠損により特徴づけられる疾患、障 害および症状の例には、成長ホルモン欠損症、糖尿病、アデニンデアミナーゼ欠 損症、血友病Ａおよび血友病Ｂが含まれるが、それらだけに限られない。それら それぞれの症状の診断方法および手段はよく知られている。 本明細書中で使用されているように、「骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴 づけられる疾患、障害あるいは症状」という用語は、骨細胞、軟骨や肺の細胞を 形成する細胞により発現されている遺伝子中における、遺伝子変異により引き起 こされる疾患、障害および症状に言及することを意味しており、そのような変異 の結果の一つは、骨、軟骨および肺それぞれの異常な形態および／または機能に より明らかにされる。 本明細書中で使用されているように、「皮膚、血管、心臓および腎臓における 欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状」という用語は、皮膚、血管 、 心臓および腎臓の細胞により発現されている遺伝子における、遺伝子変異により 引き起こされる疾患、障害および症状に言及することを意味しており、そのよう な変異の結果の一つは、皮膚、血管、心臓および腎臓それぞれの異常な形態およ び／または機能により明らかにされる。皮膚における欠陥により特徴づけられる 疾患、障害および症状の例には、火傷、床ずれおよび糖尿病性潰瘍が含まれる。 本明細書中で使用されているように、「分泌タンパク質をコードする遺伝子の 遺伝子的欠陥により特徴づけられる疾患、障害および症状」という用語は、通常 は分泌されているタンパク質をコードしている欠損した遺伝子あるいは不十分に しか発現されていない遺伝子のおける遺伝子の欠陥により特徴づけられる疾患、 障害および症状に言及することを意味している。 本明細書中で使用されているように、「有益なタンパク質により治療可能であ る疾患、障害および症状」は、疾患、障害あるいは症状に特徴的な原因および／ または症候を緩和し、減少し、予防し、あるいは緩和された、減少されたあるい は予防された状態を引き起こすタンパク質の存在により、治療あるいは予防され うる疾患、障害および症状に言及することを意味している。タンパク質を用いる ことで治療可能な疾患、障害および症状には、遺伝子欠損と同様に遺伝子欠損に より特徴づけられないしかしそれにもかかわらず疾患、障害あるいは症状に特徴 的な原因および／または症候を緩和し、減少し、予防し、あるいは緩和された、 減少されたあるいは予防された状態を引き起こすタンパク質の存在により、治療 あるいは予防されうる疾患、障害および症状が含まれる。 本明細書中で使用されているように、「免疫学的に隔離された（ｉｓｏｌａｔ ｅｄ）」「免疫学的に防御された」「免疫学的に中和された」および「レシピエ ントの免疫系からそれらを物理的に隔離する方法」は、移植される細胞をカプセ ルに入れ包み込むこと、あるいは移植される細胞を移植される体内から隔離する その他の物理的な分離について言及することを意味しており、それにより細胞は 身体の免疫系に晒されずそして排除され得ず、それにより免疫学的に隔離されて いる細胞がレシピエントの免疫系からそれらが物理的に隔離される方法により投 与される。免疫学的な隔離の手段の例として、よく知られた技術および装置、た とえばマイクロカプセル化（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）、生物親 和性基質（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）、拡散性チャンバ ー（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）、移植可能なカートリッジ、膜集成 材としての移植装置およびその他の膜を伴うコンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）が 含まれるが、これらだけには限定されない。好ましくは、細胞はそれらを移植装 置を用いて維持することにより免疫学的に隔離される。 本明細書中で使用されているように、「有益なタンパク質」および「異種（ｈ ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質」は、互いに交換可能であり、そして１） 遺伝子の欠損により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状における、疾患ある いは症候の原因となって結びついている、欠損した遺伝子および／または不十分 な発現の遺伝子によりコードされたタンパク質を補いうるタンパク質、および２ ）その存在により、有益なタンパク質により治療されうる疾患、障害および症状 に特徴的な原因および／または症候を緩和し、減少し、予防し、あるいは緩和さ れた、減少されたもしくは予防された状態を引き起こすタンパク質について言及 することを意味している。 本明細書中で使用されているように、「遺伝子構築物」は、ストロマ細胞にお いてコード配列の発現に対して十分な働きをする調節要素と機能可能に連結され た有益なタンパク質をコードする、外来の組換え核酸分子について言及すること を意味する。 本明細書中で使用されているように、「外来の組換え核酸分子」は、伝統的な トランスフェクション法（ＣａＰＯ₄あるいはＤＥＡＥデキストラン）、エレク トロポレーション法、微量注入法（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リポソー ム媒介導入法、化学物質媒介導入法、リガンド媒介導入法あるいは組換えウィル スベクター導入法などの、しかしこれらに限定されるものではないが、方法によ り細胞内に導入されるまでは、ストロマ細胞には存在しないかあるいはストロマ 細胞内では十分な高濃度のタンパク質としては発現されていない組換え核酸分子 について言及することを意味する。 本明細書中で使用されているように、「異種遺伝子」は遺伝子構築物のコード 配列について言及することを意味している。 本明細書中で使用されているように、「外来性の遺伝子物質」および「外来性 の遺伝子」という用語は、互いに交換可能なものとして使用されており、ストロ マ細胞に導入されるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ、ｍＲＮ ＡおよびアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡについて言及することを意味している 。外来性の遺伝子物質は、ヒトあるいは動物において正常に見いだされる遺伝子 物質の異種のあるいは付加的なコピー（もしくは複数のコピー）であり得る。細 胞がヒトの疾患、障害あるいは症状を治療する方法において薬剤組成物の要素と して使用されるときには、細胞を形質転換するために使用される外来性の遺伝子 物質は、患者を治療するためおよび／または移植に対してより敏感に反応する細 胞を作成するために使用される、治療剤として選択されたタンパク質をコードし うる。 本明細書中で使用されているように、「トランスフェクトされたストロマ細胞 」は、外来性の遺伝子物質を細胞に導入するために使用されるあらゆる技術を、 たとえば伝統的なトランスフェクション法（ＣａＰＯ₄あるいはＤＥＡＥデキス トラン）、エレクトロポレーション法、微量注入法（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉ ｏｎ）、リポソーム媒介導入法、化学物質媒介導入法、リガンド媒介導入法ある いは組換えウィルスベクター導入法を、しかしこれらに限定されるものではない が、通じて遺伝子構築物が導入されたストロマ細胞について言及することを意味 している。 本発明のいくつかの側面は、患者に投与されるストロマ細胞のあるものは骨、 軟骨および肺に分化するが、一方で別の細胞は骨、軟骨および肺に分化する娘細 胞を発生する前駆細胞のまま存在しているという発見に起因している。この発見 により、このような患者に正常な遺伝子的に適合したドナーから得られたストロ マ細胞を投与することにより、あるいは患者からストロマ細胞を単離し、培養し そしてそれらの細胞に骨、軟骨あるいは肺の細胞における欠陥と関連する疾患、 障害および症状の原因となるどんな遺伝子的欠損でも訂正するという遺伝子的な 改変をすることにより、骨、軟骨あるいは肺の細胞の欠陥と関連する疾患、障害 および症状にかかった患者をうまく治療することができる。同様に、ストロマ細 胞は皮膚、血管、心臓および腎臓の細胞にも分化するかあるいはそうなりうる娘 細胞を発生するであろうと信じられている。 単離され、培養されたストロマ細胞が、患者の血流中に投与されたときに、再 び組織を形成する、特に骨、軟骨および肺の組織を形成するという発見により、 ストロマ細胞が骨、軟骨あるいは肺の細胞における欠陥と関連する疾患、障害お よび症状にかかった患者の治療に適したものとなっている。いくらかの単離され 、培養されたストロマ細胞が、患者の血流中に投与されたときに、その後に成熟 して分化した細胞となる娘細胞を産生する前駆細胞として機能するという発見に より、本発明は特に有用なものとなる。なぜなら、その発見により細胞の継続的 な再投与をする必要なく関与する正常なあるいは遺伝子的に改変された細胞を、 長期間にわたってそして継続的に維持することができるからである。同様に、ス トロマ細胞から皮膚、血管、心臓および腎臓の細胞が発生することにより、ある いは娘細胞を産生することにより、同様な手段によるそれらの組織に効果的であ る疾患の治療が可能になる。 したがって、遺伝子的に適合したドナーから得られたストロマ細胞は、患者の 骨、軟骨あるいは肺の細胞、または皮膚、血管、心臓あるいは腎臓の細胞を増加 させるかあるいはそれらと置換するために、骨、軟骨あるいは肺の細胞、または 皮膚、血管、心臓あるいは腎臓の細胞に関する疾患にかかった患者に、静脈点滴 により投与されうる。遺伝子的に適合したドナーから得られたストロマ細胞は、 正常な遺伝子を発現していないか発現抑制されているおよび／または変異した遺 伝子を発現している患者の骨、軟骨あるいは肺の細胞、または皮膚、血管、心臓 あるいは腎臓の細胞と置換するために、骨、軟骨あるいは肺の細胞、または皮膚 、血管、心臓あるいは腎臓の細胞における遺伝子発現の欠損と関連する疾患にか かった患者に、静脈点滴により投与されうる。ストロマ細胞はまた、遺伝子療法 のプロトコルにおいて異種遺伝子としてトランスフェクトされてもよい。本発明 のそのような側面によれば、遺伝子的に適合したドナーのストロマ細胞あるいは 患者から回収したストロマ細胞は、患者に細胞を再び投与するのに先立って、回 収され、そして遺伝子的に改変されうる。細胞は、その発現が患者に対して療法 として効果的である遺伝子を導入するために遺伝子的に改変されうる。本発明の いくつかの側面によれば、患者から得られたストロマ細胞は欠損した遺伝子と置 換するためにおよび／またはその発現が患者に対して療法として効果的である遺 伝 子を導入するために遺伝子的に改変されうる。 本発明のいくつかの側面において、骨に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損によ り特徴づけられる疾患および障害を持つ患者は、正常な遺伝子を正しく発現する 細胞を添加し、増加させおよび／またはそれらで欠陥のあるあるいは不完全な骨 細胞を置換することにより治療されうる。細胞は、正常な遺伝子的に適合したド ナーのストロマ細胞あるいは治療されるべき患者から得られたストロマ細胞から 採取しうる。もし治療されるべき患者から採取される場合には、細胞は欠陥を直 すために遺伝的に改変されうる。骨に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損により特 徴づけられる疾患あるいは障害の一例は、骨形成不全症である。骨に影響を及ぼ しそして遺伝子的欠損により特徴づけられる疾患あるいは障害の別の一例は、骨 粗鬆症である。骨粗鬆症はしばしば、たとえば食餌や運動などの環境的因子が関 与する、多因性の疾患と考えられている。しかしながら、双子、大家族および大 人数での疾患の研究により、多くのヒトで主として遺伝子的欠損により疾患が発 生しているということが示されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ ｔｕｒｅ ３６７：２８４−２８７（１９９４）を参照）。骨形成不全症にかか った患者は、変異したコラーゲン遺伝子をもった患者において骨細胞と置換され る、正常な遺伝子的に適合したドナーから得られたストロマ細胞を投与されうる 。このような態様において、正常な細胞は、欠陥のある細胞を埋め合わせうる。 いくつかの態様において、変異したコラーゲンの欠陥をもつ細胞は正常な細胞と 比較して培養において成長させたときにその成長において不利益を有するため、 正常な細胞が患者本人のストロマ細胞から調製されうる。そのため、もし骨形成 不全症の患者から得られたストロマ細胞が培養物として増殖するのであれば、そ れらの細胞は正常細胞の代わりに徐々に濃縮されていくであろう。変異したコラ ーゲンについてモザイクでありそのために患者の細胞のあるものは変異したコラ ーゲンを含み、別の細胞は含まないと言う場合には、この態様は特に効果的にな りうる。別の態様において、ストロマ細胞は骨形成不全症の患者から単離されそ してタイプＩコラーゲンの正常な遺伝子が単離されたストロマ細胞中に挿入され る。トランスフェクトされた細胞は、その後患者に再び投与される。骨粗鬆症で ある数人の患者もまた、２つのタイプＩコラーゲン遺伝子のうち１つに変異を有 して おり、同一の態様においては、欠陥のある細胞が置換されうる。骨粗鬆症の患者 のほとんどでは、欠陥をもった遺伝子はまだ知られていないが、しかし近いうち に同定されるであろう。このような患者においては、正常な細胞は欠陥をもった 細胞と置換されうる。同様に、欠陥をもった遺伝子が同定され単離されたときに は、患者からストロマ細胞を単離し、変異した遺伝子の代わりに正常なコピーあ るいは複数のコピーを挿入し、そして患者に細胞を再び投与するという、別の態 様になりうる。 本発明のいくつかの側面において、軟骨に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損に より特徴づけられる疾患および障害を持つ患者は、正常な遺伝子を正しく発現す る細胞を添加し、増加させおよび／またはそれらで欠陥のある細胞を置換するこ とにより治療されうる。細胞は、正常な遺伝子的に適合したドナーのストロマ細 胞あるいは治療されるべき患者から得られたストロマ細胞から採取されうる。も し治療されるべき患者から採取される場合には、細胞は欠陥を直すために遺伝的 に改変されうる。軟骨に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損により特徴づけられる 疾患あるいは障害の一例は、重度のこびと症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）、重度の関節 異常そして関連する異常を引き起こす軟骨形成異常症（ｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐ ｌａｓｉａ）である。軟骨形成異常症にかかった患者は、変異したコラーゲン遺 伝子をもつ患者において軟骨を形成する細胞と置換される、正常な遺伝子的に適 合したドナーから得られたストロマ細胞を投与されうる。このような態様におい て、正常な細胞は欠陥のある細胞を埋め合わせうる。別の態様において、ストロ マ細胞は軟骨形成異常症の患者から単離され、そして単離されたストロマ細胞中 にタイプＩＩコラーゲンの正常な遺伝子が挿入される。。トランスフェクトされ た細胞は、その後患者に再び投与される。タイプＩＩコラーゲン遺伝子について の態様は、様々なタイプの軟骨形成異常症の患者の２０％から９０％に対して有 効でありうる。残りの軟骨形成異常症の患者は、他のコラーゲン遺伝子（タイプ ＸおよびタイプＸ１コラーゲン）、他の遺伝子（繊維芽細胞成長因子受容体３型 ）そして未だに同定されていない遺伝子に変異を有している。このような患者に おいて、正常な細胞は欠陥のある細胞を埋め合わせうる。同様に、患者からスト ロマ細胞を単離し、変異した遺伝子の代わりに正常なコピーあるいは複数のコピ ー を挿入し、患者に細胞を再び投与するという、別の態様になりうる。軟骨に影響 を及ぼす疾患あるいは障害の別の例は、骨関節症である。骨関節症は、病因論的 および疾患の症状のどちらから見ても、多因性の疾患である。何人かの患者では 、外傷あるいは感染症の後遺症のために、骨関節症の特徴である関節の軟骨の変 性が発生している。数人の患者では、軟骨形成異常症を引き起こした遺伝子の変 異と同様に、タイプＩＩコラーゲン遺伝子の変異のために複数の関節で骨関節症 が発生している。このような患者は、穏やかな軟骨形成異常症の症状を見せる場 合もあるいは見せない場合もあり得る。その他の患者における骨関節症の原因は 知られていないが、大家族での研究により、疾患は遺伝され、よって引き起こさ れた変異はまだ同定されていない遺伝子であるということが示唆される。従って 、軟骨形成異常症の患者において変異した遺伝子を置換するために有効でありう る同一の態様が、骨関節症の患者の多くに対してもまた有効でありうる。 本発明のいくつかの側面において、肺に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損によ り特徴づけられる疾患および障害を持つ患者は、正常な遺伝子を正しく発現する 細胞を添加し、増加させおよび／またはそれらで欠陥のある細胞を置換すること により治療されうる。細胞は、正常な遺伝子的に適合したドナーのストロマ細胞 あるいは治療されるべき患者から得られたストロマ細胞から採取しうる。もし治 療されるべき患者から採取される場合には、細胞は欠陥を直すために遺伝的に改 変されうる。肺に影響を及ぼしそして遺伝子的欠損により特徴づけられる疾患あ るいは障害の一例は、嚢胞性繊維症である。肺に影響を及ぼしそして遺伝子的欠 損により特徴づけられる疾患あるいは障害の別の例は、α１−抗トリプシンの欠 乏症である。嚢胞性繊維症の患者には、変異した嚢胞性繊維症遺伝子をもつ患者 において肺の細胞と置換あるいはそれに添加するために、正常な嚢胞性繊維症遺 伝子を有する、正常な遺伝子的に適合したドナーから得られたストロマ細胞が投 与されうる。このような態様において、正常な細胞は、欠陥のある細胞を埋め合 わせうる。別の態様において、ストロマ細胞は嚢胞性繊維症の患者から単離され 、そして単離されたストロマ細胞中に正常な嚢胞性繊維症遺伝子が挿入される。 トランスフェクトされた細胞は、その後患者に再び投与される。 いくつかの側面において、骨、軟骨および肺の疾患をもつ患者と同様に皮膚、 血管、心臓および腎臓に疾患をもつ患者も、単離されたストロマ細胞を細胞数を 増加させそして増加し、新生された（ｒｅｊｕｖｉｎａｔｅｄ）ストロマ細胞を 全身的に投与することにより治療されうる。新生されたストロマ細胞のいくらか は、正常な骨、軟骨、肺、皮膚、血管、心臓あるいは腎臓の細胞を発生しうる。 正常なストロマ細胞は欠陥のある細胞より早く増加し、そして増加して新生され た細胞集団は、より数の多い正常細胞の集団を反映しうる。表１は、単離された ストロマ細胞の増加され、新生された培養物を培養するために有用な培地を記載 している。 欠陥のある細胞を修復した細胞あるいは遺伝子的に適合したドナーから得た正 常な細胞で置換することに加えて、本発明はまた分泌される望ましいタンパク質 を発現するために使用されうる。すなわち、ストロマ細胞は単離され、望ましい タンパク質のための遺伝子を与えられ、そして望ましいタンパク質が産生されそ して機能するかあるいは別な方法で療法的効果が得られる患者に投与されうる。 本発明のこの側面は、治療用のタンパク質が患者に投与される遺伝子治療に関す る。 本発明のいくつかの側面によれば、免疫学的に隔離されたトランスフェクトさ れたストロマ細胞は、遺伝子欠損により特徴づけられる疾患、障害および症状お よび／またはタンパク質により治療されうる疾患、障害および症状を治療するた めの細胞療法剤として使用される。特に、有益なタンパク質をコードする異種遺 伝子を含む遺伝子構築物が、ストロマ細胞に導入される。トランスフェクトされ たストロマ細胞はその後免疫学的に隔離され、そしてタンパク質が体内の細胞に より発現されそして分泌されるときに恩恵を受けうる患者の体内に移植される。 ストロマ細胞は、異種遺伝子を発現するためにそして異種タンパク質を産生す るために適した宿主であることに加えて、免疫学的に隔離されるときに有利に機 能するため、免疫学的に隔離されたストロマ細胞は、特に細胞療法剤組成物にお いて有用である。免疫学的に隔離されたストロマ細胞は、直接血管による血液供 給がない場所に移植されたときに、非常に高い生存率を有する。さらに、ストロ マ細胞は簡単にそしてすぐに回収されうるものであり、それらは培養中で急速に 増加し、それにより免疫学的に隔離された細胞療法剤として有用な細胞を適切に 供給するためのよい供給源となる。 本発明によれば、異種タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物が 、ストロマ細胞に導入される。すなわち、その発現が患者に対して療法的に効果 を有する遺伝子を導入するために、細胞は遺伝子的に改変される。本発明のいく つかの側面において、患者から得られたあるいは別の患者から得られたストロマ 細胞、あるいはヒト以外の動物から得られたストロマ細胞は、欠損した遺伝子と 置換するためにおよび／またはその発現が患者に対して療法的に効果を有する遺 伝子を導入するために、遺伝子的に改変されうる。 本発明によれば、免疫学的に隔離可能な、そして遺伝子的欠損を訂正するため のおよび／または療法的なタンパク質を産生するための手段を提供する、異種の 有益な遺伝子を発現しうるトランスフェクトされた細胞を調製するために、スト ロマ細胞は有用である。ストロマ細胞は比較的容易に単離されうるもので、そし て単離されたストロマ細胞は利用可能な細胞の数を増加するために培養されうる 。ストロマ細胞は、トランスフェクトされ、免疫学的に隔離されそして直接の血 液供給がない場所、たとえば皮下において、高い生存率で移植されうる。いくつ かの態様において、ストロマ細胞はたとえばＳＶ４０ウィルスあるいは形質転換 をする特徴を持つタンパク質により不死化されうる。 本発明のいくつかの側面において、遺伝子的な疾患および障害を持つ患者は、 不完全な遺伝子の正常で機能的なコピーを含む免疫学的に隔離されたストロマ細 胞を提供することにより、細胞を添加し、増加させおよび／またはそれらで欠陥 のあるまたは不完全な遺伝子を置換することで治療されうる。本発明のこの側面 は、遺伝子の存在自体および／または機能が不完全である様な遺伝子を患者に提 供する遺伝子療法に関する。細胞治療剤の形で提供される遺伝子は、患者の欠損 した遺伝子と置換される。このような遺伝子は分泌されるタンパク質をコードす ることが好ましい。 ストロマ細胞はトランスフェクトされそして免疫学的に隔離される。いくつか の態様において、ストロマ細胞には、治療すべき患者がその遺伝子の変異してい ないコピーを完全に欠損しているか、あるいは変異していない型のタンパク質を 欠損しているかあるいは不完全にしか発現していないような遺伝子がトランスフ ェクトされる。ストロマ細胞は、発現可能な型の遺伝子の変異をしていないコピ ーをトランスフェクトされる。すなわち、トランスフェクトされた遺伝子により コードされるタンパク質がストロマ細胞により、好ましくは分泌タンパク質とし て発現されうる。遺伝子が欠損していることあるいは遺伝子発現が不完全である ことが原因として疾患あるいは症候と関連づけられる疾患、障害あるいは症状の 例としては、成長ホルモン欠損症、糖尿病、アデニンデアミナーゼ欠損症、血友 病Ａおよび血友病Ｂが含まれるが、これらだけに限定されない。本発明の方法を 使用して治療されうるその他の遺伝子疾患には、以下のものが含まれる：α１− 抗トリプシン欠損症、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病 、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、オルニチン トランスカ ルバミラーゼ欠損症、フェニルケトン尿症、サンドホフ病、テイ・サックス病お よびフォンビルブラント病が含まれる。成長ホルモン、インシュリン、アデニン デアミナーゼあるいは適切な血液凝固因子をコードする発現可能な型の正常な遺 伝子を導入することにより、それぞれ成長ホルモン欠損症、糖尿病、アデニンデ アミナーゼ欠損症および血友病の患者は、遺伝子的欠損を置換し、これらの疾患 に関連する症候のいくつかあるいはすべてを除去、緩和あるいは減少するための 手段を提供されうる。表ＩＶおよびＶには、本発明を利用して治療されうる疾患 、障害および症状の一部のリストが含まれる。 欠損している遺伝子を機能的な遺伝子により置換することに加えて、本発明は また、生物学的に活性のある療法的なあるいは予防的な効果を高める、望ましい 、分泌されたタンパク質を発現するためにも使用されうる。このようなタンパク 質は好ましくは細胞により分泌される。すなわち、ストロマ細胞は単離され、望 ましいタンパク質に対する遺伝子を与えられ、免疫学的に隔離されそして望まし いタンパク質が産生されそして機能するかあるいはそうでなければ療法的効果が 得られる患者に投与されうる。本発明のこの側面は、患者に対して療法的なタン パク質を投与する遺伝子療法に関する。本発明のこれらの側面によれば、単離さ れたストロマ細胞は、細胞が患者に対して投与されるときには、患者に対して療 法的な遺伝子を導入するためのベクターであり、同時にそのような遺伝子の宿主 である。 このような態様において、ストロマ細胞は治療されるべき患者の体内で発現さ れるときに療法的な効果を持ちうるタンパク質をコードする遺伝子をトランスフ ェクトされる。療法的なタンパク質を直接そして時間間隔をあけて一連のものと して投与するよりもむしろ、本発明はタンパク質を産生する細胞を投与すること により持続的に療法的なタンパク質を投与する方法を提供する。ストロマ細胞は 、発現可能な型のタンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトされる。す なわち、トランスフェクトされた遺伝子によりコードされるタンパク質は、スト ロマ細胞により好ましくは分泌タンパク質として発現されうる。療法的なタンパ ク質の例としては、肥満因子（Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅ，Ｒ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５，９５，２９８６−２９８８；Ａｒｎｅ ｒ，Ｐ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９５，３３３，３８２；Ｅｍｏｒ ｉｎｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１ ９９４，１５，３；Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８０，１５； Ｌｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１ ９９５，９５，９２３；およびＲｉｎｋ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ，１９９４，３７２，４０６）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、顆 粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン−２およびインタ ーロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質が含まれるが、これらだけに限 定されない。表ＩＶおよびＶには、本発明により遺伝子構築物を介して投与され うるタンパク質の名前を含む、本発明を利用して治療されうる疾患、障害および 症状の一部のリストが含まれる。 遺伝子構築物がストロマ細胞にトランスフェクトされるすべての場合において 、異種構造の遺伝子はストロマ細胞内で遺伝子の発現を達成するのに必要な調節 配列と機能可能に連結している。このような調節配列には、プロモーターやポリ アデニル化シグナルが含まれる。 遺伝子構築物は、好ましくは、欠くことのできない調節配列と機能可能に連結 した異種構造のタンパク質をコードする配列を含む、発現ベクターとして提供さ れ、それによりベクターが細胞にトランスフェクトされたときにはコード配列が 細胞により発現されうる。コード配列は細胞内でその配列を発現するために必要 な調節要素と機能可能に連結している。タンパク質をコードする核酸配列は、ｃ ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、あるいはこれらの混成物、あるいはｍＲＮ ＡなどのＲＮＡ分子であり得る。 調節要素と機能可能に連結した有益なタンパク質をコードする核酸配列を含む 遺伝子構築物は、機能的な細胞質分子として、機能的なエピソームの分子として 細胞内に存在し続けるか、あるいは細胞の染色体ＤＮＡ中に融合しうる。外来性 の遺伝子物質は、プラスミドという形態で別個の遺伝子物質のままであるように 細胞中に導入されうる。別の方法では、染色体中に融合しうる線形ＤＮＡが細胞 中に導入されうる。ＤＮＡを細胞中に導入するとき、染色体へのＤＮＡの融合を 促進する試薬を添加してもよい。融合を促進するのに有効であるＤＮＡ配列もま た、ＤＮＡ分子中に含めてもよい。別の方法では、ＲＮＡが細胞に導入されうる 。 遺伝子発現に必要な調節要素には以下のものが含まれる：すなわち、プロモー ター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。こ れらの要素は、ストロマ細胞中であるいは患者に対して点滴した後ストロマ細胞 から発生する細胞中で、機能可能であることが必要である。さらにこれらの要素 は、タンパク質をコードする核酸配列と機能可能に連結されていることが必要で あり、それにより核酸配列はストロマ細胞中で発現されうるものでありそしてそ の結果タンパク質が産生されうる。開始コドンおよび終止コドンは一般的にはタ ンパク質をコードする核酸配列の一部として考えられている。しかしながら、こ れらの要素はストロマ細胞あるいはストロマ細胞から発生する細胞中で機能的で あることが必要である。同様に、使用されるプロモーターやポリアデニル化シグ ナルもストロマ細胞あるいはストロマ細胞から発生する細胞中で機能的でなけれ ばいけない。本発明を実施するために有用なプロモーターの例としては、多くの 細胞で活性を持つ、たとえばサイトメガロウィルスプロモーター、ＳＶ４０プロ モーターおよびレトロウィルスプロモーターなどのプロモーターが含まれるが、 これらだけに限定されるものではない。本発明を実施するために有用なプロモー ターのその他の例としては、組織特異的プロモーター、たとえばある組織では機 能するが他の組織では機能しないプロモーター、これと同様に特異的あるいは一 般的なエンハンサー配列とともにあるいはこれらなしでストロマ細胞中で通常は 発現されるプロモーターが含まれるが、これらだけに限定されるものではない。 いくつかの態様においては、エンハンサー配列とともにあるいはこれらなしでス トロマ細胞中で持続的に遺伝子を発現するプロモーターが使用される。エンハン サー配列は、このような態様において、適切なあるいは望ましいときに提供され る。 いくつかの態様によれば、ストロマ細胞にトランスフェクトするための望まし い遺伝子は、ヒトプロコラーゲンＩプロモーター、ヒトプロコラーゲンＩＩプロ モーターおよびヒトプロコラーゲンＩＩＩプロモーターと機能可能に連結されて いる。いくつかの態様においては、遺伝子はプロモーターと共に遺伝子のいくつ かの５’翻訳配列および／またはあるいは非翻訳配列を含むＣＯＬ１Ａ１あるい はＣＯＬ２Ａ１遺伝子のどちらかから得られた比較的短い５’断片と連結されて いる。いくつかの態様において、トランスフェクトされるべき遺伝子は、ヒトＣ ＯＬ１Ａ１の５’末端から得られた１．９ｋｂのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片 を含む配列と機能可能に連結されている。その断片には、−４７６ｂｐから＋１ ４４０ｂｐのＣＯＬ１Ａ１遺伝子が含まれ、そしてそのため、プロモーター（４ ７６ｂｐ）、第１エクソン（２２２ｂｐ）および第１イントロンのほとんど（１ ４５３ｂｐのうち１２２３ｂｐ）が含まれる。いくつかの態様においては、トラ ンスフェクトされるべき遺伝子は、ヒトＣＯＬ２Ａ１の５’末端から得られた断 片を含む配列と機能可能に連結されている。いくつかの態様においては、断片に はＣＯＬ２Ａ１プロモーターの−４．０ｋｂｐが含まれ、そして一つあるいはそ れより多いエクソンおよびイントロンを連続的に第１エクソンから第１５エクソ ンまでおよび第１イントロンから第１４イントロンまでを含む完全長のＣＯＬ２ Ａ１遺伝子が含まれる。いくつかの構築物は共に係属中の１９９４年１月１８日 に出願され、「ゲノム中に目的とするＤＮＡを挿入する方法」（”Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｇｅ ｎｏｍｅ”）と題され、本明細書中でも参考文献として援用されている、米国特 許出願第０８／１８４,２６０号において開示されたように構築されうる。 本発明を実施するために有用なポリアデニル化シグナルの例には、ヒトタイプ Ｉコラーゲンポリアデニル化シグナル、ヒトタイプＩＩコラーゲンポリアデニル 化シグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定 されるものではない。 発現ベクター中の外来性遺伝子物質が発現されるために、調節要素がタンパク 質をコードする核酸配列と機能可能に連結されていることが必要である。タンパ ク質産生を最大にするために、望ましい細胞において遺伝子発現によく適してい る調節要素が選択されうる。さらに細胞中で最も効率よく転写されるコドンが選 択される。当該技術分野の通常の知識を有するものは、望ましい細胞内で機能的 である発現ベクターとして外来性の遺伝子物質を調製しうる。 調節要素は、タンパク質の組織特異的発現を提供するために選択しうることも また企図されている。従ってたとえば特異的プロモーターが提供されうるもので あり、それにより異種遺伝子は、免疫学的に隔離されたストロマ細胞が移植され た組織内でのみ発現されうる。 異種タンパク質は、好ましくはストロマ細胞内で異種タンパク質の輸送や分泌 を方向づけるシグナル配列を含む。シグナル配列は、一般的には細胞から成熟タ ンパク質が分泌されるときに切断され取り除かれる。 １）細胞における遺伝子的欠損を訂正する遺伝子物質、２）それがなければ十 分な量および／または十分な機能を持った状況では存在しないタンパク質をコー ドする遺伝子物質であり、それにより患者の遺伝子欠損を訂正する遺伝子物質お よび／または３）特定の疾患、障害あるいはこれらに関連する異常あるいは症候 を治療しあるいは予防する際に治療剤として有用なタンパク質をコードする遺伝 子物質のいずれかを細胞に供することに加えて、細胞死が好ましいものであるべ き細胞に選択的に細胞死を起こすための手段を提供するための遺伝子物質もまた 本発明で使用されるストロマ細胞内に導入されうる。細胞を破壊することを目標 とするこのような手段は、他のどんな外来性遺伝子物質も導入されていないスト ロマ細胞に対してと同様に、そうでなければ遺伝子を改変されたストロマ細胞に も導入しうる。 本発明によれば、単離されたストロマ細胞は、それらの細胞を細胞死に対して 特異的に感受性にする遺伝子物質により改変される。たとえば、ストロマ細胞は 細胞傷害性の試薬により特異的に標的となりうる受容体をコードする遺伝子を提 供されうる。選択的細胞死を誘起するために使用されうる遺伝子の発現可能な型 が、細胞に導入されうる。このようなシステムでは、遺伝子によりコードされて いるタンパク質を発現している細胞は、特定の条件下であるいは特定の試薬の存 在下あるいは非存在下において標的とされた細胞障害に感受性である。たとえば 、ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（ヘルペスｔｋ）遺伝子の発現可能な型 は、細胞に導入可能であり、そして選択的細胞死を誘起するために使用すること ができる。ヘルペスｔｋ遺伝子を含む外来性の遺伝子物質を患者に導入する場合 には、ヘルペスｔｋが産生されるだろう。もし移植された細胞を細胞死させるこ とが好ましいあるいは必要である場合には、薬物ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒが患 者に投与可能であり、そしてその薬物によりヘルペスｔｋを産生しているあらゆ る細胞に選択的な細胞死が引き起こされる。このように、移植された細胞の選択 的な破壊が可能であるシステムを提供することができる。 当該技術分野の通常の知識を有するものは、たとえば成長ホルモン欠損症、糖 尿病、アデニンデアミナーゼ欠損症および血友病を含む表ＩＶおよびＶに記載さ れたような遺伝子疾患の患者を、標準的な診断手順を用いて日常的に同定するこ とができる。 ストロマ細胞は骨髄細胞をドナーから回収しそして細胞を滅菌したプラスチッ クの表面あるいは細胞が接触するその他の適切な表面がある容器中に静置するこ とにより回収されうる。ストロマ細胞はプラスチックの表面に３０分以内からお よそ３日間接着しうる。少なくとも３０分後には、好ましくは約４時間後には、 非接着細胞は除去され廃棄されうる。接着した細胞は当初は分裂していないスト ロマ細胞である。しかしながらおよそ２−４日後には、細胞は増殖しはじめそし て標準的な細胞培養技術を用いて細胞数を増加するために培養可能になる。 好ましい態様によれば、ストロマ細胞は２−２０％のウシ胎仔血清を添加した 培養液、あるいは追加的な添加物とともにあるいはそれらなしで、血清を含まな い培養液中で培養される。 単離されたストロマ細胞は、当該技術分野の通常の技術を有するものには容易 に利用可能なよく知られた技術を用いてトランスフェクトされる。外来性の遺伝 子は、遺伝子によりコードされるタンパク質を発現しうる細胞中に遺伝子構築物 を導入するために使用されうる標準的な方法によりストロマ細胞に導入されうる 。いくつかの態様において、細胞は、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクショ ン法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法、エレクトロポレーション 法、微量注入法（マイクロインジェクション法）、リポソーム媒介導入法、化学 物質媒介導入法、リガンド媒介導入法あるいは組換えウィルスベクター導入法に よりトランスフェクトされる。 いくつかの態様においては、組換えアデノウィルスベクターが望ましい配列を 持つＤＮＡをストロマ細胞に導入するために使用される。いくつかの態様におい ては、組換えレトロウィルスベクターが望ましい配列を持つＤＮＡをストロマ細 胞に導入するために使用される。いくつかの態様においては、標準的なＣａＰＯ₄ 、ＤＥＡＥデキストランあるいは脂質担体に媒介されるトランスフェクション 技術が、分裂している細胞に望ましいＤＮＡを導入するために使用される。標準 的な抗生物質耐性を用いた選別技術が、トランスフェクトされた細胞を同定し、 選別するために使用されうる。いくつかの態様においては、ＤＮＡが微量注入法 により細胞に直接導入される。同様に、単離されたストロマ細胞に外来性のＤＮ Ａを導入するために、よく知られたエレクトロポレーション法あるいは小片衝撃 技術（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を 使用することができる。２つめの遺伝子は、通常は共感染（コトランスフェクト ）されるかあるいは治療用遺伝子と連結される。２つめの遺伝子は、しばしば選 択的な抗生物質耐性遺伝子である。トランスフェクトされた細胞は、選択的な遺 伝子が存在しない細胞を殺しうる抗生物質中で細胞が成長することにより選択さ れうる。２つの遺伝子が連結されずコトランスフェクトされたほとんどの場合に 、抗生物質処理を生き延びる細胞は、細胞内に両方の遺伝子を持っていて両方の 遺伝子を発現している。 ストロマ細胞を単離したのち、細胞は単離したときに、あるいは培養した後に 、投与されうる。単離の際に投与される単離されたストロマ細胞は、単離された 後およそ１時間以内に投与される。一般的には、ストロマ細胞はドナーが成人で レシピエントが幼児である状況では、単離したときにすぐに投与されうる。投与 に先立ってストロマ細胞は培養されるのが望ましい。単離されたストロマ細胞は 、 １時間から１年以上の間培養可能である。いくつかの好ましい態様においては、 投与に先立って単離されたストロマ細胞が静止期の細胞から増殖期の細胞に転換 することができるだけの十分な期間培養される。いくつかの態様において、単離 されたストロマ細胞は、３−３０日間、好ましくは５−１４日間、より好ましく は７−１０日間培養される。いくつかの態様においては、単離されたストロマ細 胞は４週間から１年、好ましくは６週間から１０カ月、より好ましくは３−６カ 月培養される。 細胞がトランスフェクトされる場合、１）単離され静止期にあるストロマ細胞 は、最初にトランスフェクトされ、その後静止期の細胞として投与されるか、２ ）単離され静止期にあるストロマ細胞は、最初にトランスフェクトされ、その後 静止期の細胞から増殖期の細胞に転換することができるだけの十分な期間培養さ れ、その後投与されるか、３）単離され静止期にあるストロマ細胞は、最初に静 止期の細胞から増殖期の細胞に転換することができるだけの十分な期間培養され 、その後トランスフェクトされ、その後投与されるか、あるいは４）単離され静 止期にあるストロマ細胞は、最初に静止期の細胞から増殖期の細胞に転換するこ とができるだけの十分な期間培養され、その後トランスフェクトされ、その後培 養され、そしてその後投与されるかのいずれかである。いくつかの態様において 、ストロマ細胞は単離されトランスフェクトされそしてすぐに投与される。スト ロマ細胞はトランスフェクションおよび／または投与に先立って培養されるのが 好ましい。単離されたストロマ細胞は、トランスフェクションに先立って３−３ ０日間、いくつかの態様においては５−１４日間、いくつかの態様においては７ −１０日間培養された細胞から培養されうる。トランスフェクトされたストロマ 細胞は、投与に先立って３−３０日間、いくつかの態様においては５−１４日間 、いくつかの態様においては７−１０日間培養された細胞から培養されうる。単 離されたストロマ細胞は、トランスフェクションに先立って３−３０日間、いく つかの態様においては５−１４日間、いくつかの態様においては７−１０日間培 養された細胞から培養され、そしてトランスフェクションのときにさらに投与に 先立って３−３０日間、いくつかの態様においては５−１４日間、いくつかの態 様においては７−１０日間培養された細胞から培養されうる。いくつかの態様 においては、単離されたストロマ細胞は、トランスフェクションに先立って４週 間から１年間、いくつかの態様においては６週間から１０カ月間、いくつかの態 様においては３−６カ月間培養された細胞から培養される。トランスフェクトさ れたストロマ細胞は、投与に先立って４週間から１年間、いくつかの態様におい ては６週間から１０カ月間、いくつかの態様においては３−６カ月間培養されう る。いくつかの態様においては、単離されたストロマ細胞は、トランスフェクシ ョンに先立って４週間から１年間、いくつかの態様においては６週間から１０カ 月間、いくつかの態様においては３−６カ月間培養された細胞から培養され、そ してトランスフェクションのときにさらに投与に先立って４週間から１年間、い くつかの態様においては６週間から１０カ月間、いくつかの態様においては３− ６カ月間培養された細胞から培養されうる。 単離されたストロマ細胞は、当該技術分野の通常の知識を有するものが容易に 利用可能であるよく知られた技術を用いてトランスフェクトされうる。いくつか の態様においては、望ましい配列を持つＤＮＡをストロマ細胞に導入するために 組換えアデノウィルスベクターが使用される。いくつかの態様においては、標準 的なＣａＰＯ₄、ＤＥＡＥデキストランあるいは脂質担体に媒介されるトランス フェクション技術が分裂している細胞に望まれるＤＮＡを導入するために使用さ れる。標準的な抗生物質耐性による選択技術が、トランスフェクトされた細胞の 同定および選択に使用可能である。いくつかの態様においては、ＤＮＡは微量注 入法によって細胞に直接導入される。同様に、単離されたストロマ細胞に外来性 のＤＮＡを導入するためによく知られたエレクトロポレーション法あるいは小片 衝撃技術（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ）を使用することができる。 ストロマ細胞の投与のために、単離されたストロマ細胞は、培養皿から回収さ れ、塩類溶液で洗浄され、遠心されてペレットにされそして患者に注入されるグ ルコース溶液中で再懸濁される。いくつかの態様においては、投与された細胞の ために骨中に空間を作るため、点滴に先立って骨髄除去が行われる。骨髄除去は 、治療されるべき患者にＸ線照射することにより、シクロフォスファミドの様な 薬物を投与することによりあるいはＸ線照射と薬物投与とを組み合わせることに よ り達成されうる。いくつかの態様においては、転移した骨細胞を殺すことで知ら れるたとえば放射性活性ストロンチウム、¹³⁵サマリウムあるいは¹⁶⁶ホルミウム のような放射性同位体を投与することにより、骨髄除去は提供される（本明細書 中でも参考文献として援用されている、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ ａ ｌ．，１９９２ Ｂｌｏｏｄ ８０（６）：１６０８−１６１３を参照）。 もしストロマ細胞の投与に先立って骨髄除去が行われた場合には、ストロマ細 胞の投与には生存に必要な血液細胞前駆細胞を含む非接着細胞の投与を伴う必要 がある。このような非接着細胞は、ストロマ細胞を単離する際に最初の材料とし て使用されたものと同一の試料から採取され、貯蔵されうるか、あるいはそれら は別の試料からも回収されうる。いくつかの好ましい態様において、非接着細胞 はレシピエント／患者から提供される。骨髄除去を行う手順に先立って、患者／ レシピエントの骨髄試料が採取され貯蔵される。全試料が使用されうるか、また は非接着細胞が単離されそして単離されたストロマ細胞と共に投与するために単 離されそして使用されうる。ストロマ細胞の投与と共に投与される非接着細胞は 、ストロマ細胞の投与の前あるいは後に別々に投与されうるか、あるいは投与に 先立って単離されたストロマ細胞と混合される。 骨髄除去は選択的なものである。いくつかの態様においては、部分的なしかし 完全ではない骨髄除去がストロマ細胞の投与に先立って提供される。いくつかの 態様においては、骨髄除去をせずにストロマ細胞が投与される。 １００ｋｇのヒトに対して、１０⁷から１０¹³の間の細胞が一回の点滴で投与 される。いくつかの態様においては、およそ１−５ｘ１０⁸から１−５ｘ１０¹² の間の細胞が１００ｋｇのヒトに対して静脈から点滴される。いくつかの態様に おいては、１ｘ１０⁹から５ｘ１０¹¹の間の細胞が１００ｋｇのヒトに対して静 脈から点滴される。いくつかの態様においては、４ｘ１０⁹の細胞が１００ｋｇ のヒトに対して静脈から点滴される。いくつかの態様においては、２ｘ１０¹¹の 間の細胞が１００ｋｇのヒトに対して静脈から点滴される。 いくつかの態様においては、細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様に おいては、複数回投与が提供される。いくつかの態様においては、３−７日間続 けてのコースとして複数回投与が提供される。いくつかの態様においては、３− ７日間続けてのコースとして３−７回の投与が提供される。いくつかの態様にお いては、５日間連続のコースとして５回の投与が提供される。 いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対する１０⁷から１０¹³の間 の細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒト に対するおよそ１−５ｘ１０⁸から１−５ｘ１０¹²の間の細胞の一回投与が提供 される。いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対するおよそ１ｘ１０⁹ から５ｘ１０¹¹の間の細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様において は、１００ｋｇのヒトに対する４ｘ１０⁹の細胞の一回投与が提供される。いく つかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対する２ｘ１０¹¹の間の細胞の一回 投与が提供される。 いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する１０⁷から１０¹³の間の 細胞の複数回の投与が提供される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒト に対するおよそ１−５ｘ１０⁸から１−５ｘ１０¹²の間の細胞の複数回の投与が 提供される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する１ｘ１０⁹か ら５ｘ１０¹¹の間の細胞の複数回の投与が３−７日間続けてのコースとして提供 される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する４ｘ１０⁹の細胞 の複数回の投与が３−７日間続けてのコースとして提供される。いくつかの態様 において、１００ｋｇのヒトに対する２ｘ１０¹¹の細胞の複数回の投与が３−７ 日間続けてのコースとして提供される。いくつかの態様において、５日間連続の コースとして１００ｋｇのヒトに対する３−５ｘ１０９の細胞の５回の投与が提 供される。いくつかの態様において、５日間連続のコースとして１００ｋｇのヒ トに対する４ｘ１０⁹の細胞の５回の投与が提供される。いくつかの態様におい て、５日間連続のコースとして１００ｋｇのヒトに対する１−３ｘ１０¹¹の細胞 の５回の投与が提供される。いくつかの態様において、５日間連続のコースとし て１００ｋｇのヒトに対する２ｘ１０¹¹の細胞の５回の投与が提供される。 拡散性チャンバー中のストロマ細胞は、Ｂｅｎａｙａｈｕ，Ｄら（（１９８９ ）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：１−７）およびＭａｒｄｏｎ，Ｈ． Ｊ．ら（（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２５０：１５７−１６ ５）に記載されており、どちらも本明細書中で参考文献として援用されている。 ストロマ細胞に遺伝子構築物を導入した後、細胞はすぐにあるいは培養をされ た後、免疫学的に隔離されうる。ストロマ細胞は、免疫学的に隔離された後に移 植されうる。ストロマ細胞は、容易に利用可能な開始のための物質および／また は装置を用いるよく知られた方法をいくつでも用いることにより、免疫学的に隔 離されうる。たとえば米国特許第４,３９１,９０９号、米国特許第４,８０６,３ ５５号、米国特許第４,９４２，１２９号および米国特許第５,３３４,６４０号 に開示されているプロトコルを含む、多くのマイクロカプセル化のプロトコルを 用いて、ストロマ細胞はマイクロカプセル化されうる。 ストロマ細胞は、拡散性の膜を持つチャンバーに入れて、あるいはマイクロビ ーズにカプセル化されて投与されうる。もう一つの態様においては、ストロマ細 胞はたとえばＡｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）より入手可能で ある中空の繊維中に含まれる。たとえば、これらの繊維は透析のためのカートリ ッジを作るために使用されている。細胞より産生されるタンパク質の濃度を減少 させる必要がある場合は、片方の末端を皮下から取り出し、サイズを減少させる ことができる。繊維の表面積は非常に大きい。さらに繊維中の細胞は、定期的に 洗浄し交換可能である。中空繊維は、本明細書中で参考文献として援用されてい るＡｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．出版物第３２３号の５０−５１ページに記載されてい る。 同様に、生物親和性基質中にトランスフェクトされたストロマ細胞を混和する ことにより、免疫学的に隔離された条件下に細胞を維持したままずっと、患者に 対して有益なタンパク質を分泌することが可能になる。生物親和性基質の一例は 、たとえば米国特許第４,９０２,２９５号および米国特許第４,９９７,４４３号 に開示されている。いくつかの態様においては、トランスフェクトされたストロ マ細胞は、膜集成材である組織移植システム中にそれら細胞を包み込むことによ り、免疫学的に隔離される。すなわち細胞は、少なくとも一つの多孔性膜を含む 容器中に維持される。有益なタンパク質が膜を透過することにより患者にとって 利用できうるままずっと、膜集成材中の細胞は免疫学的に隔離される。膜集成材 である移植装置には、米国特許第５,３１４,４７１号および米国特許第５,３４ ４,４５４号に記載されている移植装置が含まれるが、しかしこれらに限定され るもの ではない。本発明の一つの態様によれば、二つのリング集成材である移植装置が 提供される。それぞれのリング集成材には円形のプラスチックリングとリングの 円形部分を被う０．３ミクロンの小さな穴の開いた膜とが含まれる。トランスフ ェクトされたストロマ細胞は、円周部で互いに結合される二つのリング集成材の 間に配置される。構築された移植装置は好ましくは皮下に投与される。 いくつかの好ましい移植装置においては、１０⁴から１０¹¹の細胞が提供され る。 免疫学的に隔離された細胞は、皮下にあるいは腹腔内に移植されうる。別の方 法では、有益なタンパク質が送達されることが好ましい器官や組織と付着させて あるいはそうでなければ隣り合わせてそれらは移植されうる。好ましい態様にお いては、移植装置は皮下にあるいは腹腔内に移植されうる。 本発明は、比較的少量のタンパク質、もっとも好ましくは分泌タンパク質を必 要とする疾患、障害および症状を治療するために特に有用である。実施例には、 機能するためにはそれぞれ非常に少量のタンパク質しか必要としない、成長ホル モン、肥満因子および血液凝固ＩＸ因子が含まれる。表ＩＶおよびＶには、本発 明を利用して治療可能である疾患、障害および症状の一部のリストが含まれてい る。 ストロマ細胞は免疫学的に隔離されるのに先立って培養されることが好ましい 。ストロマ細胞は１時間から１年以上培養することができる。いくつかの好まし い態様においては、ストロマ細胞は、静止期の細胞から増殖期の細胞に転換する ことができるだけの十分な期間培養される。いくつかの態様においては、ストロ マ細胞は３−３０日間、好ましくは５−１４日、より好ましくは７−１０日間培 養される。いくつかの態様においては、ストロマ細胞は４週間から１年、好まし くは６週間から１０カ月、より好ましくは３−６カ月培養される。 好ましい態様において、細胞は、１）単離され静止期にあるストロマ細胞は、 最初にトランスフェクトされ、その後免疫学的に隔離され、そしてその後静止期 の細胞として移植されるか、２）単離され静止期にあるストロマ細胞は、最初に トランスフェクトされ、その後静止期の細胞から増殖期の細胞に転換することが できるだけの十分な期間培養され、その後免疫学的に隔離され、そしてその後移 植されるか、３）単離され静止期にあるストロマ細胞は、最初に静止期の細胞か ら増殖期の細胞に転換することができるだけの十分な期間培養され、その後トラ ンスフェクトされ、その後免疫学的に隔離され、そしてその後移植されるか、あ るいは４）単離され静止期にあるストロマ細胞は、最初に静止期の細胞から増殖 期の細胞に転換することができるだけの十分な期間培養され、その後トランスフ ェクトされ、その後培養され、その後免疫学的に隔離され、そしてその後移植さ れるかのいずれかである。いくつかの態様においては、ストロマ細胞は、単離さ れ、トランスフェクトされ、免疫学的に隔離されそして移植される。ストロマ細 胞はトランスフェクションに先立ちそしてその後、培養されることが好ましい。 単離されたストロマ細胞は３−３０日間、いくつかの態様においては５−１４日 間、いくつかの態様においては７−１０日間、トランスフェクションに先立って 、培養された細胞から培養されうる。トランスフェクトされたストロマ細胞は３ −３０日間、いくつかの態様においては５−１４日間、いくつかの態様において は７−１０日間、投与に先立って、培養された細胞から培養されうる。単離され たストロマ細胞は３−３０日間、いくつかの態様においては５−１４日間、いく つかの態様においては７−１０日間、トランスフェクションに先立って培養され た細胞から培養され、そしてトランスフェクションのときにさらに３−３０日間 、いくつかの態様においては５−１４日間、いくつかの態様においては７−１０ 日間、投与に先立って培養されうる。いくつかの態様においては、単離されたス トロマ細胞は４週間から１年、いくつかの態様においては６週間から１０カ月、 いくつかの態様においては３−６カ月、トランスフェクションに先立って培養さ れる。トランスフェクトされたストロマ細胞は４週間から１年、いくつかの態様 においては６週間から１０カ月、いくつかの態様においては３−６カ月、移植に 先立って培養されうる。いくつかの態様においては、単離されたストロマ細胞は ４週間から１年、いくつかの態様においては６週間から１０カ月、いくつかの態 様においては３−６カ月、トランスフェクションに先立って培養され、そしてト ランスフェクションのときにさらに４週間から１年、いくつかの態様においては ６週間から１０カ月、いくつかの態様においては３−６カ月、移植に先立って培 養される。 本発明のもう一つの側面は、骨あるいは軟骨の欠陥により特徴づけられる疾患 、 障害あるいは症状にかかった患者を治療する方法に関する。その方法には、骨あ るいは軟骨に欠陥を持つ患者を同定し、正常で遺伝子的に適合した同系のドナー から骨髄試料を採取し、そして骨髄試料を静脈点滴により患者に投与する工程が 含まれる。 上記に述べたように、移植に用いる骨髄試料は遺伝子的に適合したドナーから 採取される。当該技術分野における通常の知識を有するものは、標準的な技術と 基準を使用することにより遺伝子的に適合したドナーを容易に同定できる。 移植に用いる骨髄試料は、遺伝子的に適合したドナーから標準の技術により採 取される。いくつかの態様においては、導入される細胞のための空間を骨中に作 るために、点滴に先立って骨髄除去が行われる。骨髄除去は、治療されるべき患 者にＸ線照射することで、シクロフォスファミドの様な薬物を投与することであ るいはＸ線照射と薬物投与との組合せにより達成されうる。いくつかの態様にお いては、転移した骨細胞を殺すことで知られるたとえば放射性活性ストロンチウ ム、¹³⁵サマリウムあるいは¹⁶⁶ホルミウムのような放射性同位体を投与すること により、骨髄除去は提供される（本明細書中でも参考文献として援用されている 、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｂｌｏｏｄ ８０（ ６）：１６０８−１６１３を参照）。 骨髄除去は選択的なものである。いくつかの態様においては、部分的なしかし 完全ではない骨髄除去が骨髄移植に先立って提供される。いくつかの態様におい ては、骨髄除去をせずに骨髄が投与される。 骨および軟骨の疾患を治療するための骨髄移植において使用される細胞の数は 、その他の治療のために通常使用される細胞数よりも多いことが好ましい。１０ ０ｋｇのヒトに対して通常の３−１０倍の間の骨髄濃度が、一回の点滴で投与さ れる。 いくつかの態様においては、細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様に おいては、複数回投与が提供される。いくつかの態様においては、３−７日間続 けてのコースとして複数回投与が提供される。いくつかの態様においては、３− ７日間続けてのコースとして３−７回の投与が提供される。いくつかの態様にお いては、５日間連続のコースとして５回の投与が提供される。 いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対する１０⁷から１０¹³の間 の細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒト に対するおよそ１−５ｘ１０⁸から１−５ｘ１０¹²の間の細胞の一回投与が提供 される。いくつかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対するおよそ１ｘ１０⁹ から５ｘ１０¹¹の間の細胞の一回投与が提供される。いくつかの態様において は、１００ｋｇのヒトに対する４ｘ１０⁹の細胞の一回投与が提供される。いく つかの態様においては、１００ｋｇのヒトに対する２ｘ１０¹¹の間の細胞の一回 投与が提供される。 いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する１０⁷から１０¹³の間の 細胞の複数回の投与が提供される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒト に対するおよそ１−５ｘ１０⁸から１−５ｘ１０¹²の間の細胞の複数回の投与が 提供される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する１ｘ１０⁹か ら５ｘ１０¹¹の間の細胞の複数回の投与が３−７日間続けてのコースとして提供 される。いくつかの態様において、１００ｋｇのヒトに対する４ｘ１０⁹の細胞 の複数回の投与が３−７日間続けてのコースとして提供される。いくつかの態様 において、１００ｋｇのヒトに対する２ｘ１０¹¹の細胞の複数回の投与が３−７ 日間続けてのコースとして提供される。いくつかの態様において、５日間連続の コースとして３−５ｘ１０⁹の細胞の５回の投与が提供される。いくつかの態様 において、５日間連続のコースとして４ｘ１０⁹の細胞の５回の投与が提供され る。いくつかの態様において、５日間連続のコースとして１−３ｘ１０¹¹の細胞 の５回の投与が提供される。いくつかの態様において、５日間連続のコースとし て２ｘ１０¹¹の細胞の５回の投与が提供される。実施例 実施例１ タイプＩコラーゲンに対するヒトのミニ遺伝子を、組織特異的な方法により発 現するトランスジェニックマウス系統から得られた細胞を、骨髄から得られ培養 において細胞数が増加された間葉性細胞の前駆細胞が、Ｘ線照射されたマウスに 対して静脈点滴された後、骨およびその他の結合組織の前駆細胞として長期間機 能するかどうかを確かめるために使用した。マーカー遺伝子には、短縮されたプ ロα１（Ｉ）鎖の合成を引き起こすプロコラーゲンＩのヒトプロα１（Ｉ）鎖に 対する、内部を欠失させたミニ遺伝子からなる（本明細書中で参考文献として援 用されている、Ｋｈｉｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６６：２３３７３−２３３７９（１９９１）；Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：７０９−７１６（１９８３）； およびＳｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ ２：９２４２−９２４９（１９９３））。遺伝子を発現している細胞は、ヒトミ ニ遺伝子のコピー数が内在性のマウス遺伝子と比較して約１００：１でありそし てヒトミニ遺伝子の安定した状態のｍＲＮＡ濃度が内在性のマウスｍＲＮＡ濃度 と比較して、ほとんどの組織でおよそ０．５：１であるトランスジェニックマウ スの系統から採取された。 間葉性前駆細胞のために部分的に濃縮された骨髄から得られるドナー細胞は、 標準的なプロトコルにより調製された（本明細書中で参考文献として援用されて いる、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ ．４：２６７−２７４（１９７６）；Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ５６：２８９−３０１（１９８０）；Ｐｉｅｒｓｍ ａ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：２３７−２４３（ １９８５）；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，Ｂ． ，Ｂｌｏｏｄ ７８：５５−６２（１９９１）；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２：３４１−３５１（１９９２）； Ｌｉｅｓｖｅｌｄ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：１７９４−１８ ００（１９８９）；Ｌｉｅｓｖｅｌｄ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ ａｔｏｔ １９：６３−７０（１９９０）；およびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｈ．ｅ ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．９９：１３１−１３９（１９９１））。簡 単に言うと、トランスジェニックマウスから採取した長骨の両端を切断し、そし て骨髄を１０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を含 むα−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で満たされた加圧型シリンジで柚出した。およそ１ ０⁷の有核細胞が１７５ｃｍ²のプラスチック培養フラスコで２５ｍｌの１０％ウ シ胎仔 血清を含むα−ＭＥＭを使用して培養された。４時間後、非接着細胞は培養液を 交換することにより廃棄された。２から４の繊維芽細胞様細胞を含む細胞塊が、 ２−３日で出現し、そして細胞塊はおよそ１週間でコンフルエントに近いコロニ ーに成長した。トリプシン消化の後、フラスコあたりおよそ１０⁷の細胞が回収 された、位相差顕微鏡によると、ほとんどの細胞が繊維芽細胞様であり、しかし 数個のマクロファージや含脂肪細胞もまた観察された。 およそ１０⁵の培養された接着細胞は、最初に接着細胞を単離するために使用 した条件と同一の条件下において正常マウスから得られた骨髄を１７５ｃｍ²フ ラスコで４時間培養したものから得られた、６ｘ１０⁵の非接着細胞と混合され た。０．２から０．４ｍｌのα−ＭＥＭと１０％ウシ胎仔血清中におよそ７ｘ１ ０⁵の細胞が混合されたものが、それぞれのレシピエントマウスの尾静脈から投 与された。 同一の近交系ＦＶＢ／Ｎ系統から得られた８週齢のマウスが、ドナー細胞を受 け入れるために放射性¹³⁷Ｃｕ照射器による（Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏ ｆ Ｃａｎａｄａ，Ｌｔｄ．）照射により作成された。一単位は、平行な対向性 のビーム配置による１１６ｃＧ／ｍｉｎの線量率であった。それぞれの動物は４ 時間の間隔をあけて２回に分けて９．０Ｇｙ（４．５Ｇｙ＋４．５Ｇｙ）を照射 された（Ｏ’Ｈａｒａ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．１９：８ ７８−８８１（１９９１））。２回目の照射の１から２時間後に、標識された接 着細胞と正常な非接着細胞の混合物が静脈から注入された。細胞の注射を受けな かった対照の照射されたマウスは、骨髄除去の１０から１３日後に死んだ。 ドナー細胞の運命を追跡するために、ヒトＣＯＬ１Ａ１ミニ遺伝子とマウス外 来性ＣＯＬ１Ａ１遺伝子に対する２種のＰＣＲアッセイを行った。２プライマー を用いたアッセイでは、ヒト遺伝子対マウス遺伝子の割合の値は、１０^-4からお よそ１０⁺¹の範囲で、それによりレシピエント細胞に対するドナー細胞がおよそ １０^-6から１０^-1の範囲で比例していた。３プライマーを用いたアッセイにより 、値は、１０^-3からおよそ１０^-2の範囲で、それによりレシピエント細胞に対す るドナー細胞がおよそ１０^-5から１の範囲で比例していた。 １日後に照射マウスで行ったアッセイでは、骨髄、脾臓、骨、肺あるいは脳で のみ追跡できる数のドナー細胞が存在したことが示された（表１）。少しだけ高 い濃度の細胞が７日目に見られた。３０日目および１５０日目にはドナー細胞の 子孫細胞が骨髄、脾臓、骨および肺で細胞の２．０から１２％として数えられた 。１５０日目にはそれらはまた、剣状軟骨中に細胞の１．５％から５．０％とし て数えられ、剣状軟骨は顕微鏡下での詳細な観察でどんな石灰化あるいは繊維組 織の存在もなかった。１から５カ月の間に平均値は減少を示しているようであっ たが、骨髄、脾臓、骨および肺について混合した値においてはこれら２時点間で は統計的に顕著な減少はなかった（表１）。非照射マウスでのアッセイでは、同 一の時点においてドナー細胞の濃度は非常に低いものでしかなかった（＜０．０ ００１から０．０５％）。肺の組織切片上でのｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲアッセイ により、ドナー細胞の子孫細胞は、肺胞および気管支の両方の実質に均等に散在 していた。 ドナー細胞の子孫細胞が軟骨中に存在しているかを確かめるため、軟骨細胞が 剣状軟骨および関節軟骨から、ＤＭＥＭ中に溶かした０．５ｍｇ／ｍｌの細菌性 コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で一晩かけて消化することにより単 離された。ＰＣＲアッセイにより、ドナー細胞の子孫細胞が単離された軟骨細胞 の２．５％として測定されることが示された。 ドナー細胞がそれが分布する組織中で機能的な間葉性細胞となっていたかどう かを確かめるため、レシピエントマウスから採取した組織において、ドナー細胞 に含まれているタイプＩコラーゲンのヒトのミニ遺伝子の発現がＲＴ−ＰＣＲに よりアッセイされた。１５０日目の３匹のマウスを用いたアッセイにおいては、 ミニ遺伝子はタンパク質の半分以上がタイプＩコラーゲンとして合成されている 組織である骨において発現されていた。骨における発現は、大腿骨から単離され １週間培養された骨細胞における同様なアッセイによって確認された。タイプＩ コラーゲンにたいするミニ遺伝子の発現は、骨に比べてタイプＩコラーゲンの合 成が少ない組織である骨髄、脾臓および肺ではもっと不定である。期待されたよ うに、タンパク質のおよそ半分がタイプＩＩコラーゲンとして合成される組織で あるがしかしタイプＩコラーゲンの合成がない軟骨では、ミニ遺伝子は発現され ていなかった。マーカー遺伝子を含みそしてタイプＩＩコラーゲンは合成してい るがタイプＩコラーゲンは合成していないレシピエントマウスから得られた軟骨 細胞の培養においては、タイプＩコラーゲンに対するミニ遺伝子もまた発現され なかった。 細胞化学的マーカーを持つ細胞あるいはｍＲＮＡのアッセイにより、細胞がタ イプＩコラーゲン、タイプＩＩＩコラーゲン、フィブロネクチン、アルカリフォ スファターゼおよびオステオポンチンを合成しているが、マクロファージ、顆粒 球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球あるいは内皮細胞の形態の特徴を有していないこと が示されたということが、以前の報告で示されている。本結果では、照射マウス に対する静脈注射の後、長期間培養されて増殖した接着細胞がいくつかの結合組 織に効率よく分布したことが示される。本結果ではまた、それらの細胞が組織特 異的な様式でタイプＩコラーゲンに対するマーカー遺伝子を発現したこと、およ びそれらの細胞が肺の間葉性実質内に拡散するように組み込まれたことから、細 胞はこれらの組織で真正の前駆細胞として機能したことが示される。 実施例２ ＭＳＣｓの単離と培養の条件 ＭＳＣｓが増殖はするが幹細胞様の表現型を維持する様な、ＭＳＣｓの培養条 件が、研究された。表１は、ＭＳＣｓと骨小片との共培養により、１週間後に回 収された細胞数が増加することを示している。同時に、骨との共培養により細胞 内のアルカリフォスファターゼ（ＡＰａｓｅ）濃度が低下し、これは細胞が骨芽 細胞に分化しなかったことを示唆する観察であった。同様に酒石酸耐性酸性フォ スファターゼ（ＴＲＡＰ）の濃度が減少し、これは細胞が骨芽細胞に分化しなか ったことを示唆する観察であった。同様な結果がＭＳＣｓの二次培養においても 観察された。このように結果から、骨小片との共培養により、ＭＳＣｓの増殖の ための改良された条件が提供されうることが示唆される。同様に培養された骨小 片の培養液は、培養中でＭＳＣｓが増殖するためのサイトカインおよび成長因子 の重要な供給源となりうる。 関連する実験においては、ＭＳＣｓの二次培養が長期間にわたって維持されう ることが示された。ＭＳＣｓは、トリプシン消化と再培養により４カ月以上培養 中で継代することができる。細胞は固着培養において特に安定している。ある実 験においては、固着培養により、１週間に１回培養液を交換することで４カ月以 上も細胞が生存した。別の実験においては、うっかりして１カ月間培養液の交換 をしないで培養器の中に放置されていた場合にも、細胞は生存し続けた。 レトロウィルスベクターによるＭＳＣｓの持続性トランスフェクション ＭＳＣｓの感染のためのウィルスを得るために、ＬＮＣＺレトロウィルスベク ター（本明細書中で参考文献として援用されている、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ａ ｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７， ９８０−９９０）が改変され、それによりサイトメガロウィルスのプロモーター （ｐＣＭＶ）がｌａｃＺ遺伝子の発現を促進した（図１）。ベクターは、両栄養 性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）の、マウスのパッケージング細胞系列（ＰＡ３１ ７）に持続的にトランスフェクトされた。持続的ウィルス産生クローン化細胞は Ｇ４１８により単離され、そしてクローンの培養上清はＭＳＣｓの感染のために 使用された。初代培養ＭＳＣｓ（３日齢）を、最高の力価（タイター）を持った 産生細胞系列から得られた新鮮な培養上清で３日間連続して感染させた。５日後 に細胞を染色したところ、およそ１５−２０％の細胞がｌａｃＺ遺伝子を顕著に 発現していたことが示された。感染させた細胞の培養のうちいくつかは、Ｇ４１ ８（活性濃度０．４４μｇ／ｍｌ）による選別下に５日間おかれた。回収された 細胞のほとんどが、ｌａｃＺ遺伝子を発現し続けていた。ＬＮＣＺの改変もまた 構築され、よって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子のプロモーターおよびＣＯＬ２Ａ１遺伝 子のプロモーター（ｐＣＯＬ２Ａ１）により、ｌａｃＺ遺伝子の発現が促進され た。ｌａｃＺ遺伝子の発現は、両構築物を用いて初代培養のＭＳＣｓによりうま く回収された。 トランスジェニックマウスにおける骨細胞の正常ＭＳＣｓへの置換 正常なマウスから得られたＭＳＣｓは、変異したＣＯＬ１Ａ１遺伝子を高濃度 に発現しているトランスジェニックマウスに注射された（表ＩＩおよびＩＩＩ） 。骨形成不全症（ＯＩ）マウスに正常ＭＳＣｓを注射した１カ月後に（表ＩＩ） 、寛容されうる最大の線量のＸ線（７００センチグレイあるいはｃＧｙ）を照射 されたレシピエントマウスにおいて、骨細胞の１０から４５％の細胞がドナー細 胞の子孫細胞であることが計測された。寛容されうる最大の線量の半量のＸ線（ ３ ５０ｃＧｙ）を照射されたマウスにおいて、同様な値が得られた。しかしながら 、１／４量（１７５ｃＧｙ）に線量を減少したところ、４匹のマウスにおいて、 その値がそれぞれ０％、５％、１０％そして４０％に減少した。ＯＩトランスジ ェニックマウスに多数のＭＳＣｓを除去していない全骨髄細胞を点滴した際に、 同様な結果が得られた（表ＩＩＩ）。 プロα１（１）鎖の合成が試験された５匹のレシピエントマウスにおいては（ 表ＩＩおよびＩＩＩ）、レシピエントの骨細胞を正常なドナーＭＳＣｓにより置 換することに付随して、骨中における変異したプロα１（１）鎖に対する正常な プロα１（１）鎖の比率が増加した。したがって、正常細胞により置換されるこ とによりタンパク濃度が期待される変化をした。 実施例３安定的にトランスフェクトされたＭＳＣｓにおけるｈＧＨ、血液凝固ＩＸ因子あ るいはＯｂといったヒト遺伝子の長期的発現 ＭＳＣｓは、マウスから単離され、そして本明細書中で参考文献として援用さ れている、Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．Ｆ．ら（（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，４８５７−４８６１）に記載されている条件下 で培養された。ＭＳＣｓは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト肥満因子タンパ ク質（Ｏｂ）、あるいはヒト血液凝固ＩＸ因子の遺伝子を発現するクローンを得 るために、レトロウィルスベクターに感染されあるいはむき出しのＤＮＡにより トランスフェクトされる。ｌａｃＺ遺伝子がレトロウィルスベクターによりマウ スＭＳＣｓにうまく導入されることにより、同一のベクターの変異体が使用され ている。同時に、ＭＳＣｓはエレクトロポレーションにより（本明細書中で参考 文献として援用されている、Ａｎｄｒｅａｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｖａｎｓ ，Ｇ．Ａ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６，６５０−６６０およ びＴｏｎｅｇｕｚｚｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．６，７０３−７０６）、リポフェクトアミンおよび核注入により（本 明細書中で参考文献として援用されている、Ｍｅｒｃｅｒ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ ａ ｌ．（１９９２）Ｉｎ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．６６０，２０９−２１８）持続的にトランス フェクトされるため、より大きな内在性の遺伝子が使用可能である。さらに、レ トロウィルスの持ついくつかの潜在的な不利益は、別の導入方法を用いれば回避 される。 単離および培養の標準的な条件は以下の通りである：６から１０週齢のＦＶＢ ／Ｎマウスから脛骨（ｔｉｂｉａｓ）と大腿骨（ｆｅｍｕｒｓ）を採取し、骨の 両端を切断し１から２ｍｌの氷冷αＭＥＭと１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含 むシリンジを用いて骨髄を押し出すことにより、全骨髄を採取する。蓄えられた 骨髄細胞は、優しく撹拌することによりバラバラにされ、自動測定器（Ｃｏｕｌ ｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ＺＭ）により細胞数を測定される。５ｘ１０⁵から５ｘ１ ０⁷の有核細胞が２５ｍｌのαＭＥＭと１０％ＦＢＳ中で、７５−ｃｍ²培養フラ スコ上で培養される。４時間後あるいは３日後に、非接着細胞が培養液を交換す ることにより除去される。接着細胞は、初代培養として１０から１２日間、およ そ４日ごとに培養液を交換しながら増殖させる。細胞は、０．２５％トリプシン と１から５ｍＭＥＤＴＡで５分間、３７℃で消化し、その後優しくかき出すこと により（ｓｃｒａｐｉｎｇ）回収される。細胞は１０％ＦＢＳ添加αＭＥＭで、 ６穴培養プレートの９．５ｃｍ²あたりで３ｘ１０⁴から１ｘ１０⁵の細胞に希釈 される。これらの条件下では、細胞分裂時間は１９から２２時間である。二次培 養はおよそ４日ごとに培養液を交換し、同一の条件下におけるトリプシン消化と 再培養により行われる。 遺伝子構築物の調製 レトロウィルスベクターＬＮＣＸが、構築物のもととして使用される。構築物 内部の都合の良いクローニング部位が、改変された構築物であるｐＲＳＶ−ｌａ ｃＺ、ｐＣＭＶ−ｌａｃＺ、ｐＣＯＬ１−ｌａｃＺおよびｐＣＯＬ２−ｌａｃＺ を調製するために使用される（図１）。ｐＣＯＬ１プロモーターは、ヒトＣＯＬ １Ａ１遺伝子のうち４７６ｂｐのプロモーター、第１エクソン、そして第１イン トロンのほとんどを含む、１．４ｋｂの断片である。トランスジェニックマウス においてプロモーターは、高度に組織特異的であり分化特異的な様式で、ＣＯＬ ２Ａ１遺伝子のプロモーターのない型を発現することが示されてきた（本明細書 中で参考文献として援用されている、Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ． ，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９６２２−９６２９）。ＣＯ Ｌ２Ａ１プロモーターは、ヒトＣＯＬ２Ａ１遺伝子から得られた１ｋｂの断片で あり（本明細書中で参考文献として援用されている、Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ，Ｌ． ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１４１７５− １４１７８）、ヒトＣＯＬ２Ａ１プロモーターにより発現の組織特異性を与えら れている（本明細書中で参考文献として援用されている、Ｂｒａｄｈａｍ，Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５８，６ １−６８）。ｌａｃＺ遺伝子は、ｈＧＨ遺伝子（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ）、ＯＢ遺伝子（本明細書中で参考文献として援用されている、Ｃ ｏｎｓｉｄｉｎｅ，Ｒ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ ｖｅｓｔ．９５，２９８６−２９８８）、あるいはヒト血液凝固ＩＸ因子遺伝子 （Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．）と置換される。 レトロウィルスベクターの使用 レトロウィルス産生細胞系列 産生細胞系列を確立するために、両方向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）な、レ トロウィルスパッケージングのマウス細胞系列であるＰＡ３１７が使用された。 細胞は１００ｍｍ培養皿中で２０％コンフルエントの状態のときに、レトロウィ ルスベクターをｐＢＲ３２２領域において切断するＳｃａＩ消化により線状化さ れた、１５μｇのプラスミドＤＮＡを用い、リン酸カルシウム沈殿技術（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）によりトランスフェクトされた。トランスフェクション後１日のとき 、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）が活性濃度１ｍｇ／ｍｌで培養液に添加され た。ネオマイシン耐性コロニーが、選別から７日から１０日で現れ、機械性のリ ングを用いたクローニングにより単離された。クローンは増殖され、それぞれの クローンは複製されたウェルの直接的染色によりｌａｃＺを発現する能力をテス トされた。陽性の細胞により産生されたウィルスの力価は、１穴あたり３ｍｌの 培養液と４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、６穴マイクロリッタープレート 中で２０％コンフルエントの状態に成長させたＨＴ−１０８０ヒト腫瘍細胞に、 ５０μｌの培養液を１回添加することによりアッセイされた。ｌａｃＺ遺伝子の 発現 について陽性に染色されたＨＴ−１０８０細胞の数を測定することにより、力価 はアッセイされた。一般的には力価は、１ｘ１０⁵から１ｘ１０⁶であった。 マウスＭＳＣｓのレトロウィルス感染 マウスＭＳＣｓの初代培養が上記のように調製された。３日後に、非接着骨髄 細胞が廃棄され新鮮な培養液が添加された。細胞はその後、４μｇ／ｍｌのポリ ブレンの存在下で、ウィルス産生について最高の力価を持つ持続的にトランスフ ェクトされた産生細胞から得られた、新鮮な培養上清を１／４量添加することに より、レトロウィルスに感染させた。感染は、さらに２日間連続して繰り返され た。細胞はその後、ｌａｃＺの発現を確かめるため直接的に染色しあるいは大き な培養皿に分け、そして０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（活性濃度）による選別下 におかれる。およそ１５から２０％の初代培養がｌａｃＺに陽性であり、Ｇ４１ ８の選別を生き残った細胞のほとんどがｌａｃＺに陽性であった。 リポフェクトアミントランスフェクション ＭＳＣｓの初代培養は、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ中で１０日間成長させた 。トリプシン消化と穏やかなかき出し（ｓｃｒａｐｉｎｇ）の後、細胞を１穴あ たり１０⁵の細胞の濃度にして６穴培養皿に播種した。細胞を２日間成長させ、 その後ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体と共にイ ンキュベートした。ＤＮＡ−リポフェクトアミン複合体は以下のように調製され た：６μｌのリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を、１μｇのＬＩＮＣ ＺのＤＮＡと２００μｌのα−ＭＥＭ中で混和し、室温で３０分間インキュベー トし、そして８００μｌのα−ＭＥＭ中のＭＳＣｓを含む６穴プレートの１穴に 添加した。３７℃で６時間インキュベートした後、ＤＮＡ−リポフェクトアミン 複合体を２ｍｌの１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで置換した。細胞はｌａｃＺのた めの染色をされ、あるいはＦＢＳ含有培養液中で１８時間培養した後にＧ４１８ 選別下におかれる。陽性クローンは回収されたが、しかし明らかにＧ４１８選別 の後細胞濃度が低すぎるため、成長はゆっくりであった。この状況を回避するた めに、３つの異なる戦略が使用可能である：（ａ）細胞をもっと高濃度で培養す る。（ｂ）共培養される細胞培養挿入物を選別工程の初期に生き残ったクローン 上におき、成長を刺激する必要な細胞因子を提供するために、日々のベースで挿 入物 中に新鮮なＭＳＣｓや骨小片をおく（表１参照）。（ｃ）Ｇ４１８による選別に よりトランスフェクションされていない細胞の多くが死んだときに、ｌａｃＺ遺 伝子がチミジンキナーゼといった選択的な遺伝子と置換されているレトロウィル スＬＮＣＸの変異体を感染させたＭＳＣｓを再び培養中に播種する（図１）。こ のように、レトロウィルスに安定的にトランスフェクトされたＭＳＣｓは、必要 なサイトカイン、成長因子、およびＧ４１８２よる選別の間にトランスフェクト されたＭＳＣｓの初期の成長に必要とされる細胞間相互作用を提供するために使 用される。我々はその後、レトロウィルスに感染した細胞をｇａｎｇｃｙｃｌｏ ｖｉｒによるネガティブ選択により回収することができる。 導入方法 核注入 核注入は、いくつかの細胞をトランスフェクトさせる方法として非常に効率が よい。細胞は微量注入のための領域を線引きする円で印を付けられた、２２ｘ２ ２ｍｍのカバーグラスを含む６０ｍｍ培養皿に培養した。細胞は０．１％のＣＳ を含む培養液中で５日間培養され、微少注入の前の細胞成長停止状態を誘導され る。これらの条件下では、５日目から６日目の２４時間連続的に標識される間に 、８から１５％の細胞に［³Ｈ］チミジンが取り込まれた。微量注入は、Ｅｐｐ ｅｎｄｏｒｆの微量注入器と操縦装置が装備された、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅ ｒｔの倒立顕微鏡を用いて、商業的に購入されたガラスキャピラリーのフェムト チップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して行われた。カバーグラスの印を付けら れた領域内のすべての細胞（通常は１５０−２００）が、核に１０ｍＭのＴｒｉ ｓ緩衝液（ｐＨ７．６）中で０．０１−１．０μｇ／μｌの範囲の濃度のＤＮＡ を微量注入された。注入された細胞は、上記のように増殖されそしてアッセイさ れた。 エレクトロポレーション ＭＳＣｓは、０．２５％トリプシンと１から５ｍＭのＥＤＴＡで５分間室温で 処理され、その後かき出すことにより回収する。細胞は４,０００ｘｇで１０分 間遠心することによりペレットにされ、そしてその後、氷冷したＰＢＳ（ｐＨ７ ．４）でペレットを再懸濁することにより２回洗浄する。ＭＳＣｓは、０．８ｍ ｌにつき２ｘ１０⁶の細胞数に再懸濁され、エレクトロポレーション用のキュベ ット （０．４ｃｍの間隙）中に分配される。細胞は氷上で１０分間インキュベートさ れ、ＤＮＡ（５−５０μｇ）が懸濁液中に添加され、そして細胞はさらに１０分 間冷却される。細胞懸濁液は、その後商業的な機械（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ ＰｕＩｓｅｒ；ｍｏｄｅｌ １６５２０７６）で外来性の添加されたＤＮＡを保 持する細胞の割合がもっとも高く得られる、経験的に決定された場の強さで、エ レクトロポレーションされた。ＭＳＣｓに対する適切な場の強さを決定するため に、０．２５−２．５ｋｖ／ｃｍの範囲で力価が測定された。エレクトロポレー ションの効率は、ｌａｃＺ遺伝子（ＬＮＣＺベクター）が導入されその後エレク トロポレーションの後４８から７２時間に細胞を染色することによりモニターさ れた。 アッセイ ｈＧＨ ｈＧＨ遺伝子の発現は、６穴マイクロリッタープレート中で成長した細胞のク ローンから得られた培養液を、商業的に入手可能なキット（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ ）を用いて酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定することによりモ ニターされた。このアッセイにおいては、２倍希釈された緩衝液の０．１ｍｌが マイクロリッタープレートのウェルごとに添加される。５分後に、テスト試料が ０．１ｍｌ添加され、プレートは３７℃で３０分間インキュベートされる。ウェ ルは５回洗浄され、そして０．２ｍｌの一次抗体がウェルごとに添加される。試 料は３７℃で３０分間インキュベートされ、５回洗浄される。その後Ｏ−フェニ レンジアミン基質を含む基質緩衝液０．２ｍｌが添加される。試料は室温で３０ 分間インキュベートされ、反応は２Ｎの硫酸を０．１ｍｌ添加することで停止さ れる。試料の吸光度は、４９０ｎｍでアッセイする。 Ｏｂタンパク質 細胞は、ＯＢ遺伝子の発現について細胞培養液のタンパク質放射線免疫アッセ イによりアッセイされた。ヒトＯＢタンパク質に対する一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌ ｉ発現系により合成された組換えタンパク質に対してウサギで作られ、均質性に なるまで精製された。ヒトタンパク質は、マウスのタンパク質と相同性が高く、 その結果抗ーヒト抗体はマウスのタンパク質と相互反応する。もしそれらが反応 しなければ、短縮したマウスのｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉに発現させ、タンパク質 を精製し、そして抗体を調製する。別の方法では、マウスの配列を持った合成ペ プチドを購入し、そしてこれらを抗体の調製のために使用する。アッセイのため には、組換えヒトＯｂタンパク質をＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ法で¹²⁵ヨウ素 で放射線標識し、その後ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いたゲルろ過で精製した 。得られた特異的活性は、−３０μＣｉ／μｇであった。アッセイの試料（０． ２ｍｌ）は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝塩類溶液中で 一次抗血清（１：２０００希釈）とあわせて総量０．４ｍｌで、１６時間、４℃ でプレインキュベートされた。¹²⁵Ｉ−Ｏｂタンパク質（１００μｌ中で−３０ ０００ｃｐｍを発生する）がその後添加され、インキュベーションはさらに２４ 時間継続された。結合したＯｂタンパク質（１２±１％；非特異的結合１．４± ０．１％）は、０．１ｍｌのヒツジ抗−ウサギＩｇＧ血清（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ，Ｉｎｃ．，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）、０．１ｍｌ正常ウサギ血清（ＧＩＢＣＯ／ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、そして０．１ｍｌの１０％ポリエ チレングリコールを添加することにより免疫沈降された。遠心管は１５分間遠心 され（２２００ｒｐｍ）、そして結合していない標識はデカントされ、そしてペ レットがＰａｃｋａｒｄ５０００ガンマカウンター（Ｄｏｗｂｅｒｓ Ｇｒｏｖ ｅ，ＩＬ）で測定された。未知試料中のＯｂタンパク質の濃度は、Ｒｏｄｂａｒ ｄの不定量４パラメーター論理モデルを用いて計算された。本アッセイの検出の 限界は０．３９ｎｇ／ｍｌである。アッセイ内分散は、１２ｎｇ／ｍｌで１１． ６％、アッセイ間分散は、１３．１ｎｇ／ｍｌで２０．８％であった。 ヒト血液凝固ＩＸ因子 血液凝固ＩＸ因子の遺伝子の発現は、ｈＧＨのアッセイで使用された条件（上 記）と同一な条件下で、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂ ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）によりアッセイされた。Ｓｍｉｔｈら （７４）により報告されているように、標準曲線は１−５０ｎｇ／ｍｌ−１の範 囲にあり、感度の限界は１ｎｇ／ｍｌ−１であった。アッセイはマウス血液凝固 ＩＸ因子とは相互反応しなかった。 実施例４ 安定的にトランスフェクトされたＭＳＣｓのマウスに対する全身的な投与による 、生理学的に重要な濃度での３遺伝子の持続的発現 ＯＩトランスジェニックマウスを用いた実験（表ＩＩおよびＩＩＩ）により、 培養されたＭＳＣｓは、全身的な投与の後、骨、軟骨およびその他の間葉系組織 の幹細胞様前駆細胞として機能することができることが示された。そのため、ｈ ＧＨ、Ｏｂタンパク質、あるいは血液凝固ＩＸ因子を発現しているＭＳＣｓが、 ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性の遺伝子発現について評価するために、照射および非 照射マウスに投与される。 ＭＳＣｓの投与 はじめに、ＭＳＣｓは表ＩＩに記載されているような条件下で（３週齢マウス 、３００あるいは７００グレイ（Ｇｒａｙ）の照射、腹腔内投与、１ｘ１０⁶Ｍ ＳＣｓ、および２ｘ１０⁸全骨髄細胞）、マウスに投与された。加えて、静脈内 投与が腹腔内投与と比較され、そしてより低いＸ線照射量が使用された。同様に 、細胞は帝王切開により胚にも投与される。予備試験において、５０μｌの５ｘ １０⁴のＥＳ細胞が、７匹の１３日目の胚の羊膜に注射された。７匹のうち６匹 が生存した子どもとして分娩された。よって、ＭＳＣｓの子宮内注射が可能であ る。 成長曲線 ｈＧＨのｉｎ ｖｉｖｏでの有効な発現はマウスの成長率を上昇させるはずで あるし、ｏｂタンパク質の発現により飢餓が誘導されるはずである。そのため、 処置されたマウスおよび対照の同腹子の体重と大きさがモニターされる。 遺伝子発現についてのアッセイ 血液は、ＭＳＣｓの投与後、１週間、１カ月、３カ月、５カ月、１０カ月およ び２０カ月のマウスの後眼窩血管叢（retro−orbital plexus）から採取される 。ｈＧＨおよび血液凝固ＩＸ因子はＥＬＩＳＡによりアッセイされ、Ｏｂタンパ ク質は放射線免疫アッセイでアッセイされる。加えて、ヒト血液凝固ＩＸ因子に おいてもし測定可能な増加がＥＬＩＳＡにより得られるとすると、生物学的に活 性なヒト血液凝固ＩＸ因子をアッセイするため、手順は本明細書中で参考文献と して援用されている、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ａ．Ｇ．ら（（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．５ ３９７−４０２）に記載されている。この手順においては、 ヒ ト血液凝固ＩＸ因子は最初は、マイクロタイタープレートのウェル内でモノクロ ーナル抗体であるＢＧＩＸｌにより捕らえられ、その後血液凝固ＸＩａ因子によ り活性化された。活性化された血液凝固ＩＸ因子は、血液凝固ＶＩＩＩ因子とと もに、血液凝固Ｘ因子を血液凝固Ｘａ因子に変換する。血液凝固Ｘａ因子は、発 色体基質であるＳ２７６５を開裂させ、黄色の産物を生ずる。ＢＧＩＸ１でコー トされたマイクロタイタープレートと血液凝固ＶＩＩＩ因子は、Ｅｌｃａｔｅｃ ｈ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ，ＮＣ）から購入した。血液凝固Ｘ Ｉａ因子は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔ ｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）より購入した。血液凝固Ｘ因子、フォスフォリピド溶液、 Ｓ２７６５、およびトロンビン阻害剤である１−２５８１は、Ｋａｂｉ Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ Ｈｅｐａｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ）より購入した 。以下の４種類の緩衝液が調製された：Ａ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ、１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．５；Ｂ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＣａＣ ｌ₂、１１０ｍｇ／ｍｌ^-1ゼラチン、ｐＨ７．６；Ｃ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ ｍＭ ＣａＣｌ²、ｐＨ７．５；Ｄ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ｐＨ８．４。血液凝固ＶＩＩＩ因子／Ｘ因子反応混合物は、等量の以下のストッ クを混合することにより新しく調製した：緩衝液Ａ中の５Ｕｍｌ^-1の血液凝固Ｖ ＩＩＩ因子、複数の緩衝液中の１Ｕｍｌ^-1の血液凝固Ｘ因子、緩衝液Ａ中の３４ μｇ／ｍｌ^-1の１−２５８１、水中の２５ｍＭのＣａＣｌ₂、およびフォスフォ リピド。血漿試料は緩衝液Ａで希釈され、１００μｌがマイクロタイタープレー トのそれぞれのウェルに添加された。プレートは、室温で９０分間インキュベー トされ、その後緩衝液Ｂで５回洗浄された。１００μｌの血液凝固ＸＩａ因子（ 緩衝液Ｃ中の２μｇ／ｍｌ^-1のもの）がそれぞれのウェルに添加された。３７℃ で３０分間後、１００μｌのＳ２７６５が（緩衝液Ｄの０．５ｍＭのもの）がそ れぞれのウェルに添加され、反応が最終濃度である１０％の酢酸の添加により停 止されるまで、プレートは室温で１０分間インキュベートされた。４０５ｎｍに おける吸光度が、ＢｉｏＲａｄのマイクロプレートリーダーにより測定された。 正常ヒトの貯蔵された血漿を希釈することで作成された標準曲線は、３−２５ｎ ｇ／ｍｌ^-1で直線であった、アッセイはマウス血液凝固ＩＸ因子とは相互反応し なかった。 血液凝固ＩＸ因子は、２５０ｎｇ／ｍｌあるいは正常の５％の濃度で通常は療法 的であり、１００から１５０ｎｇ／ｍｌで有益であると考えられている。 実施例５ ＭＳＣｓを皮下の拡散性チャンバーに入れておくことによる、生理学的に重要な 濃度での遺伝子の持続的発現 皮下の拡散性チャンバー中に移植された細胞は、患者の療法について少なくと も２つの顕著な有利な点を有する。（ａ）免疫反応が回避される。そして（ｂ） マウスで（本明細書中で参考文献として援用されている、Ｂｅｎａｙａｈｕ，Ｄ ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０，１− ７）、ラットで（本明細書中で参考文献として援用されている、Ｍａｒｄｏｎ， Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２５ ０，１５７−１６５）、あるいはウサギで（本明細書中で参考文献として援用さ れている、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ．２０，２６３−２７２）カプセルに入れ て移植されたとき、明らかに血管新生を必要としない骨、繊維組織あるいは軟骨 で生存するために（上述のＢｅｎａｙａｈｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９ ）、上述のＭａｒｄｏｎ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）、本明細書中 で参考文献として援用される、Ｏｗｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉ ｎ，Ａ．Ｊ．（１９８８）Ｉｎ：Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｈａｒｄ Ｔｉｓｓｕｅ（無脊 椎動物の硬組織の細胞および分子生物学），Ｗｉｌｅｙ Ｃｈｉｃｅｓｔｅｒ， ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ＣＩＢＡ財団シンポジ ウム），１３６，４２−６０、上述のＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．，ｅ ｔ ａｌ．，（１９８７））、少なくとも６週間生存する（本明細書中で参考文 献として援用されている、Ｗａｋｉｔａｎｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４ ）Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊ．Ｔ．Ｓｕｒｇｅｒｙ ７６Ａ，５７９−５９２） 。 チャンバーの作成 拡散性チャンバーは、商業的に入手可能な部材（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒ ｐ．）から組み立てられ、そして以前の報告に記載されているように（上述のＢ ｅｎａｙａｈｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、上述のＭａｒｄｏｎ，Ｈ ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８７））使用される。簡単に言うと、０．３μｍ のポアサイズの膜フィルターが２つのプラスチックのリングのそれぞれの片側に 、アクリル系接着剤を用いて接着される。２つのリングはその後チャンバーを形 作るように互いに接着され、寸法は内径が９ｍｍ、厚さが２ｍｍ容量が１２７ｍ ｍ³である。１０⁴から１０⁷のＭＳＣｓが、一つのリングにあけた穴を通じてチ ャンバー内に送り込まれ、その穴は接着剤でコートした先細のプラスチック栓で 閉じられる。チャンバーは、麻酔下でマウスの背中の皮下にあるいは腹腔内に移 植される。最初は１つあるいはそれ以上のチャンバーが離乳直後のマウス（３週 齢）に投与される。それに続き、１週齢のマウスに投与される。１週齢のマウス での実験については、マイクロピペットのプラスチックチップから切り出される ディスク（内径５ｍｍ）から、より小さなチャンバーが調製される。 アッセイ 血液は、チャンバーを移植した後１週間、１カ月、３カ月、５カ月、１０カ月 および２０カ月のマウスの後眼窩血管叢から採取される。血漿は上記のように、 ｈＧＨ、Ｏｂタンパク質および血液凝固ＩＸ因子についてアッセイされる。 実施例６ 図２に関して、拡散性チャンバー（１）は、第１端（５）および第２端（７） という２つの端を持つチャンバー胴（ｂａｒｒｅｌ）（３）を持ちうる。胴には 無毒な手段により固定される１つあるいはそれ以上のリングが含まれうる。チャ ンバーには、第１フィルター（９）と第２フィルター（１１）がそれぞれ固定さ れている。フィルターは要素に対して多孔性であり、それにより要素はチャンバ ーと動物との間を行き来することができる。フィルターのポアサイズは、およそ ０．２５μｍかそれより小さいものであり、好ましくは０．１μｍでありうる。 フィルターは、強度があり、可塑性がありそして化学的処理に耐性である、プラ スチック、テフロン、ポリエステルあるいはその他の不活性な材質で作られうる 。 フィルターは、よりしっかりした封印をも提供しうるゴム製のガスケットの部分 で固定されうる。所望により、チャンバーの胴の部分には、キャップ（示されて いない）で被われうる開口（１３）が存在してもよい。キャップは密閉型のゴム にねじ込み、開口に固定してもよい。そのように細胞は、キャップをはずしそし て通常の針およびシリンジを用いることにより、開口を通じてチャンバー内容に 注入されうる。チャンバーは、動物に対して無毒でありまたよく寛容される、プ ラスチック、テフロン、ルーサイト、チタンあるいは不活性のあらゆる材質など のどんな物質でも作られうるが、これに限られるものではない。加えて、チャン バーは滅菌に耐えることができるはずである。 チャンバーは、以下の限定的ではない方法、たとえば皮下にあるいは腹腔によ り移植されうる。チャンバーは移植からおよそ２４時間からおよそ３０時間後に 取り出しうる。別の方法では、詰め替えが可能なチャンバーが使用され、そのた めチャンバーは治療のために再利用され、次の治療に使用されうる。 ^a６週齢のマウスから得た全骨髄細胞（２０ｘ１０⁶）が、それぞれ９．５ｃｍ² のウェル中で２ｍｌの１０％ＦＣＳ添加α−ＭＥＭで培養した。非付着細胞は ３日目に除去し、培養は新鮮な培養液で７日目まで継続した。ＡＰａｓｅおよび ＴＲＡＰは参考文献５５において記載されているように検定した。 ^b細胞培養挿入物（２３ｍｍ；孔径３μｍ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ ｎ）中の骨の小片（半分は大腿骨、半分は脛骨）と共培養された。 ^cｂと同様で、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートされた培養挿入物と共培養された。 ^d１０日目の初代培養は、０．２５％のトリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡで５分 間３７℃で処理した後穏やかなスクレーピング（引っかくこと）によりはがされ た。１ウェルから回収された細胞（２ｘ１０⁵）は１：４に希釈され９．５ｃｍ² のウェル中で７日間、３日目と６日目に培養液を交換して培養された。 ^eＡＰａｓｅ（２０、５４）およびＴＲＡＰ（５５）活性は比ｍｇ全タンパク 質であった。 ^a（Ｎ）：正常；（ＴＧ）：トランスジェニック ^bプラスチック培養皿上で４時間３７℃で培養することにより点滴前に全骨髄 細胞から回収したＭＳＣｓ ^a（Ｎ）：ＭＳＣｓを回収するためのどんな処置もしていない正常マウスから 得られた全骨髄。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ペリーラ，ルス・エフ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19050, ランズダウン，イースト・ボルチモア・ア ベニュー 101，セカンド・フロアー (72)発明者 リーパー，デニス・ビー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19096, ワインウッド，メアディス・ロード 21 (72)発明者 オハラ，マイケル・ディー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19095, ワインコート，アンダーウッド・ロード ６ (72)発明者 クルコスキー，ジョゼフ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19111, フィラデルフィア，マーティンズ・マル・ ロード 6731 (72)発明者 フィネイ，ドナルド アメリカ合衆国ペンシルバニア州19002, メイプル・グレン，ウエブスター・レーン 1841 (72)発明者 ラプテフ，アレクセイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フイラデルフィア，パイン・ストリート 917，アパートメント １−エフ (72)発明者 カロ，ホセ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19035, グラッドワイン，ラファイエット・ロード 1227

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状 にかかった患者を治療する方法であって、以下の工程 ａ）骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状 にかかっておらず、そして患者と遺伝子的に適合しているドナーから骨髄試料を 採取し； ｂ）試料からストロマ細胞を単離し；そして ｃ）静脈点滴によって単離されたストロマ細胞を患者に対して投与する ことを含む、前記方法。 ２．単離されたストロマ細胞を投与するのに先立って、患者に骨髄除去を施す 、請求項１の方法。 ３．骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状 にかかっておらず、そして患者と遺伝子的に適合しているドナーから採取された 骨髄試料から得られた造血前駆細胞と共に、ストロマ細胞を患者に静脈点滴によ り投与する、請求項２の方法。 ４．ストロマ細胞を造血前駆細胞とは別に患者に静脈点滴により投与する、請 求項２の方法。 ５．ストロマ細胞の投与に先立って、調節配列が機能可能に連結されそしてス トロマ細胞内で発現されるヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を含む、遺伝子構築 物をストロマ細胞にトランスフェクトする、請求項１の方法。 ６．疾患、障害あるいは症状が、患者の骨における欠陥により特徴づけられる 、請求項１の方法。 ７．疾患、障害あるいは症状が、骨形成不全症あるいは骨粗鬆症である、請求 項６の方法。 ８．疾患、障害あるいは症状が、患者の軟骨における欠陥により特徴づけられ る、請求項１の方法。 ９．疾患、障害あるいは症状が、軟骨形成異常症あるいは骨関節症である、請 求項８の方法。 １０．疾患、障害あるいは症状が、患者の肺における欠陥により特徴づけられ る、請求項１の方法。 １１．疾患、障害あるいは症状が、嚢胞性繊維症である、請求項１０の方法。 １２．患者の骨、軟骨あるいは肺に欠陥を引き起こす、変異した、機能してい ないあるいは発現が低下している遺伝子により特徴づけられる疾患、障害あるい は症状にかかった患者を治療する方法であって、以下の工程 ａ）患者から骨髄試料を採取し； ｂ）試料からストロマ細胞を単離し； ｃ）機能的な調節要素と機能可能に連結されている、変異した、機能していな いあるいは発現が低下している遺伝子の正常なコピーをストロマ細胞へトランス フェクトし；そして ｄ）静脈点滴によって、トランスフェクトされたストロマ細胞を患者に対して 投与する ことを含む、前記方法。 １３．ストロマ細胞を投与するのに先立って、患者に骨髄除去を施す、請求項 １２の方法。 １４．試料から得られた造血前駆細胞と共に、ストロマ細胞を患者に静脈点滴 により投与する、請求項１３の方法。 １５．ストロマ細胞の投与に先立って、調節配列が機能可能に連結されそして ストロマ細胞内で発現されるヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を含む、遺伝子構 築物でストロマ細胞をトランスフェクトする、請求項１２の方法。 １６．疾患、障害あるいは症状が、患者の骨における欠陥により特徴づけられ る、請求項１２の方法。 １７．疾患、障害あるいは症状が骨形成不全症であり、遺伝子がタイプＩプロ コラーゲンあるいはタイプＩコラーゲンをコードする、請求項１６の方法。 １８．疾患、障害あるいは症状が、患者の軟骨における欠陥により特徴づけら れる、請求項１２の方法。 １９．疾患、障害あるいは症状が軟骨形成異常症であり、遺伝子がタイプＩＩ プロコラーゲンあるいはタイプＩＩコラーゲンをコードする、請求項１８の方法 。 ２０．疾患、障害あるいは症状が、患者の肺における欠陥により特徴づけられ る、請求項１２の方法。 ２１．特徴づけられる疾患、障害あるいは症状が嚢胞性繊維症であり、遺伝子 が嚢胞性繊維症遺伝子である、請求項２０の方法。 ２２．少なくとも一つの膜表面を持つ容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）；および ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結されている、有益 なタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を含んでいるストロマ細 胞 含む移植装置。 ２３．膜が、０．３ミクロン孔径の孔を有する、請求項２２の移植装置。 ２４．少なくとも１００ｍｍ²の膜の表面積を有する、請求項２２の移植装置 。 ２５．１０⁴から１０¹¹のストロマ細胞を含む、請求項２２の移植装置。 ２６．１０⁴から１０⁸のストロマ細胞を含む、請求項２２の移植装置。 ２７．有益なタンパク質が、ヒト成長ホルモン、肥満因子およびヒト血液凝固 ＶＩＩＩ因子からなる群から選択される、請求項２２の移植装置。 ２８．有益なタンパク質により治療されうる疾患、障害あるいは症状にかかっ た患者の治療方法であって、ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能に連 結されている有益なタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を含む 、免疫学的に隔離されたストロマ細胞を当該患者に対し投与する工程を含む、前 記方法。 ２９．有益なタンパク質を用いて治療可能である疾患、障害あるいは症状が、 遺伝子欠損により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状である、請求項２８の 方法。 ３０．有益なタンパク質が、ヒト成長ホルモンおよびヒト血液凝固ＶＩＩＩ因 子からなる群から選択される、請求項２９の方法。 ３１．免疫学的に隔離されたストロマ細胞が、ストロマ細胞と少なくとも一つ の膜表面を持つ容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む移植装置の中にある、請求項 ２８の方法。 ３２．移植装置の膜が０．３ミクロン孔径である、請求項３１の方法。 ３３．移植装置が少なくとも１００ｍｍ²の膜表面の面積をもつ、請求項３１ の方法。 ３４．移植装置に１０⁴から１０¹¹のストロマ細胞が含まれる、請求項３１の 方法。 ３５．移植装置に１０⁴から１０⁸のストロマ細胞が含まれる、請求項３１の方 法。 ３６．移植装置が患者の皮下に移植される、請求項３１の方法。 ３７．ストロマ細胞内で機能する調節要素と機能可能に連結されている、有益 なタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物が含まれている、免疫学 的に隔離されているストロマ細胞。 ３８．ストロマ細胞がマイクロカプセル化されている、請求項３７の免疫学的 に隔離されているストロマ細胞。 ３９．骨、軟骨あるいは肺の欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症 状にかかった患者を治療する方法であって、以下の工程 ａ）骨あるいは軟骨の欠陥により特徴づけられる疾患、障害あるいは症状にか かっておらず、そして患者と遺伝子的に適合しているドナーから骨髄試料を採取 し；そして ｂ）療法的に効果的な量の前記骨髄を、静脈点滴によって患者へ投与する ことを含む、前記方法。 ４０．単離されたストロマ細胞を投与するのに先立って、患者に骨髄除去を施 す、請求項３９の方法。 ４１．疾患、障害あるいは症状が、患者の骨における欠陥により特徴づけられ る、請求項３９の方法。 ４２．疾患、障害あるいは症状が、骨形成不全症である、請求項４１の方法。 ４３．疾患、障害あるいは症状が、患者の軟骨における欠陥により特徴づけら れる、請求項３９の方法。 ４４．疾患、障害あるいは症状が、軟骨形成異常症である、請求項４３の方法 。 ４５．患者の骨、軟骨あるいは肺において欠陥を引き起こす、変異した、機能 していないあるいは発現が低下している遺伝子により特徴づけられる疾患、障害 あるいは症状にかかった患者を治療する方法であって、以下の工程 ａ）患者から骨髄試料を採取し； ｂ）試料からストロマ細胞を単離し； ｃ）ストロマ細胞の分裂を引き起こし、ストロマ細胞の増殖した培養物を得る ような条件下でストロマ細胞を培養し；そして ｄ）静脈注射によって増殖培養されたストロマ細胞を患者に対して投与する ことを含む、前記方法。 ４６．ストロマ細胞を投与するのに先立って、患者に骨髄除去を施す、請求項 ４５の方法。 ４７．試料から得られた造血前駆細胞と共に、ストロマ細胞を患者に静脈注射 により投与する、請求項４６の方法。 ４８．試料から得られた造血前駆細胞とは別に、ストロマ細胞を患者に静脈点 滴により投与する、請求項４６の方法。 ４９．疾患、障害あるいは症状が、患者の骨における欠陥により特徴づけられ る、請求項４５の方法。 ５０．疾患、障害あるいは症状が、骨形成不全症あるいは骨粗鬆症である、請 求項４９の方法。 ５１．疾患、障害あるいは症状が、患者の軟骨における欠陥により特徴づけら れる、請求項４５の方法。 ５２．疾患、障害あるいは症状が、軟骨形成異常症あるいは骨関節症である、 請求項４６の方法。 ５３．疾患、障害あるいは症状が、患者の肺における欠陥により特徴づけられ る、請求項４５の方法。 ５４．特徴づけられる疾患、障害あるいは症状が、嚢胞性繊維症であり、遺伝 子が嚢胞性繊維症遺伝子である、請求項５３の方法。