-
Die Erfindung betrifft den Einsatz gentechnischer
Methoden zur Behebung genetischer Mangel und insbesondere
Spender-Knochenmark-Stromazellen für den therapeutischen
Einsatz.
-
Hämophilie A, eine durch Mangel oder Mißbildung eines
speziellen Gerinnungsproteins, des Faktors VIII-C,
verursachte Blutungskrankheit tritt bei etwa 10-20 von
100.000 Männern auf. Davon betroffene Individuen leiden
von Zeit zu Zeit unter unstillbaren Blutungen und werden
heutzutage mit Faktor VIII-C-reichen Konzentraten aus
menschlichem Plasma behandelt. Für die Bereitstellung von
aus Zellkulturen extrahiertem Faktor VIII-C als
alternatives Therapeutikum für Hamophile sind
DNS-Rekombinationstechniken vorgeschlagen worden (Toole et
al., 1984, Nature 312, S. 342).
-
Louis et al. (1988, Proc. Nat. Aca. Sci. 85, S. 3150)
pflanzten in Kollagen eingebettete Fibroblasten aus
primärer Haut von Mäusen, die mit einem rekombinanten
Virus infiziert worden waren, welcher cDNS für den
menschlichen Faktor IX enthielt, in die Epidermis von
Mäusen ein und konnten 10-12 Tage lang menschlichen
Faktor IX im Serum nachweisen.
-
Garver et al. (1987, Science 237, S. 762)
transplantierten Mäuse-Fibroblasten, welche rekombinante,
menschliches α&sub1;-Antitrypsin codierende DNS enthielten, in
die Peritonealhöhle nackter Mäuse, und wiesen menschliches
α&sub1;-Antitrvpsin im Serum und in der Epitheloberfläche der
Lunge nach. Garver et al. bemerken, daß "das Niveau der
Genexpression in den Zielzellen, beispielsweise in
Fibroblasten, im allgemeinen höher als bei Knochenmark-
Stammzellen aus Primaten" war.
-
Die vorliegende Erfindung stellt Knochenmark-
Stromazellen bereit, denen mittels Transfektion ein Gen
übertragen wurde, das ein biologisch aktives Enzym
codiert, wobei die Zellen in der Lage sind, an der
Oberfläche einer Knochenkavität eines menschlichen
Patienten zu haften.
-
Solche Zellen können im allgemeinen zum
therapeutischen Einsatz bereitgestellt werden, wobei die
genannten Zellen in einen menschlichen Patienten
eingebracht werden, um die Erzeugung und Sekretion eines
biologisch aktiven Enzyms, an dem der Patient Mangel hat,
in den Blutstrom des Patienten herbeizuführen; das
Verfahren beinhaltet das Einbringen in den menschlichen
Patienten von Spender-Knochenmark-Stromazellen, denen ein
das Enzym codierendes Gen mittels Transfektion übertragen
wurde, so daß die eingebrachten Zellen an der Oberfläche
einer Knochenkavität des Patienten haften und das aktive
Enzym erzeugen und sezernieren können.
-
In bevorzugten Ausführungsbeispielen codiert das
mittels Transfektion übertragene Gen ein Lymphokin, einen
Wachstumsfaktor, einen Blutbildungsfaktor oder ein anderes
defizientes Protein im Blut, wie beispielsweise einen
Blutgerinnungsfaktor, z.B. den menschlichen Faktor VIII-C
oder Antithrombin III. Die Spender-Stromazellen sind
vorzugsweise autolog, d.h. es sind Zellen, die mit den
Empfänger-Zellen genetisch identisch sind, so daß die
Immunabstoßung der eingepflanzten Spender-Zellen minimiert
wird; bei nicht-autologen Spender-Zellen sollten diese
vorzugsweise denen des Empfängers genetisch ausreichend
ähnlich sein, damit eine unerwünschte Immunantwort
vermieden wird; d.h. homologe Zellen, die histokompatibel
sind, können eingesetzt werden. Durch den Einsatz von
autologen oder histokompatiblen Zellen erübrigt sich die
allgemeine Immunsuppression beim Empfänger.
-
Vorzugsweise wird die Wechselwirkung zwischen den
Spender-Stromazellen und dem Knochen des Empfängers zur
Förderung der Adhäsion und der stabilen Einpflanzung durch
Bestrahlung (vorzugsweise Röntgenbestrahlung) des
Empfängerknochens verändert, und zwar an dem Ort, zu dem
die Spender-Stromazellen nach Einbringung in das Tier
wandern sollen. Die eingesetzte Röntgenstrahlungsdosis
reicht zwar zur Abtötung der hämopoetischen Zellen, so daß
die meisten der sich schnell teilenden Zellen an dem Ort
beseitigt werden, und zur Beschädigung der Stromazellen an
dem Ort aus, sie ist jedoch niedrig genug, so daß die
Abtötung jener Stromazellen vermieden wird. Der genannte
Ort ist vorzugweise ein Röhrenknochen, wie etwa ein
Oberschenkelknochen, ein Unterschenkelknochen oder eine
Rippe.
-
Die Erfindung kann zur Behandlung der durch
Faktor VIII-Mangel verursachten Hamophilie eingesetzt
werden, ohne daß eine unerwünschte Immunantwort gegen den
ergänzten Faktor VIII ausgelöst wird, da die Übertragung
des Gens für den Faktor VIII auf den Empfänger mittels der
Methode der autologen Transplantation von Zellen erfolgt,
die zur Expression des Gens für den Faktor VIII in der
Lage sind. Dadurch unterscheidet sich diese Methode von
anderen Methoden zur Behandlung von Hämophilie, welche
gravierende Nachteile aufweisen. Zum Beispiel ist das
menschliche Plasma sowohl eine uneffektive als auch eine
kostspielige Quelle für den Faktor VIII und enthält
lediglich 100-200 ng des Proteins pro Milliliter (Fay et
al., 1982, Proc. Nat. Aca. Sci. 79, S. 7200). Die zur
Verfügung stehende Therapie ist zwar einigermaßen
effektiv, jedoch ist sie außerordentlich aufwendig und mit
einem hohen Infektionsrisiko verbunden. Die zur Zeit
verfügbaren Produkte aus Plasma sind stark verunreinigt
(< 1% von Faktor VIII) und werden gewöhnlich aus Plasma-
Sammelchargen hergestellt, die von Tausend verschiedener
Spender stammen. Diese Produkte sind mit einer Vielzahl
ernsthafter, durch die Proteinpräzipitate hervorgerufener
Komplikationen verbunden und sind häufig mit fremden
Agenzien verunreinigt, wie zum Beispiel mit dem Hepatitis-
Virus oder dem Virus der menschlichen Immunschwäche (HIV),
der für das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS)
ursächlich ist. Der rekombinante Faktor VIII, der von
eukaryontischen Zellen erzeugt wird, denen das menschliche
Gen für den Faktor VIII-C durch Transfektion übertragen
wurde (Wood et al., 1984, Nature 312, S. 330; Toole et
al., s.o.) wurde bisher noch nicht zur Homogenität
gereinigt und könnte immunogen sein, da er sich vom
natürlichen menschlichen Faktor VIII-C durch z.B. das
Glycosylationsmuster unterscheiden kann. Die Erfindung
setzt ebenfalls vorteilhaft Stromazellen ein, die
langlebig sind und sich langsam teilen, und die deshalb in
der Lage sind, nach Einpflanzung das erwünschte Enzym für
einen längeren Zeitraum zu exprimieren und zu sezernieren.
-
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus
der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten
Ausführungsbeispiele ersichtlich.
-
Zunächst werden kurz die Abbildungen beschrieben.
-
Fig. 1 ist eine Abbildung von explantierten adhärenten
Zellen aus einer der Transplantation unterzogenen Spender-
Maus einen Monat nach Einpflanzung (oben) und von einer
bestrahlten, der Transplantation nicht unterzogenen Maus
(unten).
-
Fig. 2 ist ein Diagramm des Wachstums der
hämopoetischen Parentalzellen aus LTBMCs, die aus
S1/S1d-Mäusen angelegt werden.
-
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines
retroviralen Vektors, der das menschliche Gen für den
Faktor VIII enthält.
-
Wie oben erörtert kann ein menschlicher Patient, der
an einer Krankheit wegen eines genetischen Mangels leidet,
welche durch Fehlen eines normal funktionierenden Enzyms
hervorgerufen wurde, z.B. die durch einen Mangel an dem
normalen Faktor VIII-C hervorgerufene Hämophilie, dadurch
behandelt werden, daß autologen menschlichen Stromazellen
mittels Transfektion ein Vektor übertragen wird, der das
Gen für den menschlichen Faktor VIII enthält, und daß dann
diese mittels Transfektion übertragenen Stromazellen in
einen Patienten eingepflanzt werden, der dazu in
geeigneter Weise vorbereitet worden ist, z.B. ein Patient,
bei dem der Zielort in einem Röhrenknochen bestrahlt
worden ist.
-
Bevor das Verfahren zur Behandlung der menschlichen
Hämophilie detailliert beschrieben wird, wird mit dem
Zweck, einige der verwendeten Methoden zu etablieren, ein
Experiment beschrieben, bei dem neomycin-resistente
Stromazellen in Mäuse eingepflanzt wurden; diese Arbeit
ist in der zum Stand der Technik gehörenden
Veröffentlichung Anklesaria et al., (1987) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 84, S. 7681, beschrieben. Anschließend wird
die Transfektion eines den transformierenden
Wachstumsfaktor-α (TGF-α) codierenden Gens in
Mäuse-Stromazellen beschrieben, gefolgt von der
Einpflanzung dieser Stromazellen in Mäuse; es stellte sich
heraus, daß die eingepflanzten Zellen den von dem
eingeschleusten Gen codierten TGF-α exprimieren und
sezernieren. Zuletzt werden die Verfahren beschrieben, mit
denen Hämophilie bei Menschen behandelt wird, ausgehend
mit der anfänglichen Einpflanzung der das Gen für den
Faktor VIII enthaltenden Stromazellen in Mäuse, gefolgt
von der Einpflanzung der autologen menschlichen, das Gen
für den Faktor VIII enthaltenden Zellen in menschliche
Patienten.
Beispiel 1
Die Experimente von Anklesaria et al.
Langzeit-Zellkulturen
-
B6D2F1(C57BL/6J x DBA/2J)-Mäuse (Jackson Laboratories,
Bar Harbor, Maine) wurden zum Anlegen von Langzeit-
Knochenmark-Kulturen ("long-term bone marrow cultures",
LTBMCs) verwendet. Der Zellinhalt eines Oberschenkel- und
eines Unterschenkelknochens wurde in einer 25 cm² breiten
Corning-Flasche in Fischer-Nährlösung (Gibco), ergänzt mit
25% Pferdeserum (Hazelton) und 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison-
Natriumsuccinat, aufgeschwemmt. Das Pferdeserum wurde nach
zwei Wochen durch fetales Kälberserum ersetzt. Es hat sich
gezeigt, daß dieses Verfahren die Lebensdauer der Kultur
steigert (Sakakeeny et al., 1982, J. Nat. Cancer Inst. 68,
S. 305). Die LTBMCs wurden in den drei
aufeinanderfolgenden Wochen und nach jeweils siebentägiger
Kultivierung mit viralen Überständen infiziert, die als
reiner defekter Virus verpackten Virus und 2 ug/ml
Polybrene (Sigma) enthielten.
Etablierung einer Stromazellinie
-
Am 61. Tag nach der Anlage der LTBMCs wurden aus
repräsentativen LTBMC-Flaschen adhärente Zellen mittels
einer Behandlung mit 0,25% Trypsin (GIBCO) herausgelöst
und in 8,0 ml Fisher-Medium (GIBCO), ergänzt mit
25% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS)
(Hazelton) und 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison-Natriumsuccinat, in
einer Dichte von entweder 3 x 10&sup6; oder 1 x 10&sup6; Zellen pro
25 cm²-Flasche (Falcon) wieder ausplattiert. Die Kulturen
wurden bei 33ºC unter 7% CO&sub2; gehalten und jede Woche beim
selben Dichteverhältnis passagiert. Bei der 8. Passage
wurde jede der sich entwickelnden Zellinien bei
limitierender Verdünnung ausplattiert und unter Einsatz
von Penizylindern ("penicylinders") zur Trennung der
jeweils von einer Einzelzelle stammenden Kolonien,
kloniert. Jede der sich daraus ergebenden Zellinien wurde
durch limitierende Verdünnung zweimal subkloniert. Beim
Erreichen der Konfluenz zeigten die Zellinien
Kontakthemmung. Es stellte sich heraus, daß alle
getesteten Stromazellinien sowohl negativ für reverse
Transkriptase als auch frei von Mycoplasmen waren. Die
reverse Transkriptase-Aktivität wurde unter Verwendung von
NIH/3T3-Zellen als negative Kontrolle nach Greenberger,
1984, bei: Golde (Hrsg.) Meth. Hematol. 11, N.Y.:
Churchill Livingston, S. 202 gemessen.
-
Zwei klonische Mäuse-Knochenmark-Stromazellinien,
GBL/6 und GBL/6 neor, wurden aus permanenten Knochenmark-
Kulturen von B6.cast-GPIA-Mäuse[zellen]
(Glu6PI-α, D-Glucose-6-Phosphat-Ketol-Isomerase;
EC 5.3.1.9) entwickelt (Greenberger, 1978, Nature 275,
S. 752). Für diese Studien wurde die GLB/6-Zellinie
aufgrund ihrer endothelähnlichen Eigenschaften und ihrer
Unterstützungsfähigkeit in vitro für pluripotente
hämopoetische Parentalzellen ausgewählt.
-
Die stabile klonische Stromazellinie GBL/6 exprimiert
das α-Isoenzym der Glu6PI. Die Zellinie wurde durch
spezifische Anfärbung von alkalischer Phosphatase,
Peroxidase, α-Naphtyl-Esterase und Lysozym
charakterisiert, wie bei Pearse, 1986, Histochem., I,
Churchill, London, 3. Auflage. Antiseren gegen die
extrazellulären Matrixproteine Laminin, Fibronectin
(Collaborative Research, Waltham, MA), Kollagen Typ I und
IV sowie gegen den Alloenzym-Marker Glu6PI-α (Charles et
al., 1980, Mol. Cell. Biochem. 29, S. 11) wurden zur
Identifizierung des jeweiligen Proteins in der GBL/6-
Zellinie eingesetzt, wobei das jeweilige Antiserum
eingesetzt und die Immunoperoxidase-Methode von Hadji et
al., 1983, Lab. Med. 14, S. 767 angewandt wurde. Die
GBL/6-Zellen waren Fibronectin+, Laminin+ sowie Kollagen-
Typ IV+, jedoch Kollagen-Typ I&supmin;. Für immunhistologische
Studien wurden proximale Unterschenkelknochen entnommen,
in Längsrichtung aufgespalten und 18 Std. lang in
2% Paraformaldehyd/0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4 fixiert.
Die Knochen wurden 4 Tage lang in 0,3 M EDTA/0,1 M
Cacodylatpuffer, pH 7,4 entkalkt. Aus den in Paraffin
eingebetteten Knochen wurden Dünnschnitte von 5 um Dicke
hergestellt, und durch Reaktion mit Kaninchen-Antiserum
gegen Glu6PI-α und mit indirekter Immunoperoxidase-Farbung
angefärbt.
-
Zur Etablierung einer Stromazellinie mit einem
dominanten, selektierbaren Marker wurde das Gen für die
Neomycin-Resistenz, welches einen dominanten,
selektierbaren Marker codiert, der den Säugetierzellen
Resistenz gegen das Antibiotikum G418 (G418r) verleiht,
auf einem retroviralen Vektor zunächst den NHI/3T3-Zellen
und dann der GBL/6-Zellinie mittels Transfektion
übertragen. Die Transfektion wurde durch Präzipitierung
mit Calciumphosphat durchgeführt (Graham et al., 1973,
Virol. 52, S. 456). Zur Transfektion der Mäuse-NIH/3T3-
Zellen wurden 10 ug DNS von dem Vektor pZIP-Neo(SV) (X)
eingesetzt. Dieser Vektor trägt das von dem SV40-Promotor
gesteuerte Gen für die Neomycin-Resistenz. Klone, die
einen hohen viralen Titer aufwiesen, wurden durch
Selektion der transfektierten Zellinie mit 625 ug/ml G418
(Gibco) und Klonierung der einzelnen G418r-Kolonien
isoliert. Unter den 19 getesteten Zellinien, die defekten
Virus produzieren, wurde eine ausgewählt, die gleichmäßig
hohe virale Titer von 3 x 10&sup6; G418r CFU (koloniebildende
Einheiten)/ml aufwies, und die zur Infektion von Langzeit-
Markkulturen eingesetzt wurde. Dieser Überstand wurde
pSVX-neor-Virus genannt. pSVX-neor-Virus wurde zur
Infektion von GBL/6-Zellen eingesetzt. Ein Subklon,
GBLneor, wurde mit 500 ug/ml G418 selektiert und in vitro
vermehrt. Die GBL/6-neor-Zellen wiesen zytochemische
Eigenschaften auf und enthielten extrazelluläre
Matrixproteine, die von denen der GBL/6-Zellen nicht zu
unterscheiden sind.
-
Die GBL/6-Zellen unterstützen das Wachstum in vitro
von hämopoetischen Stammzellen, die koloniebildende
Einheiten aus Milzzellen (CFU-S) sowie aus Granulocyten,
Erythrozyten und Makrophagen/Megakaryozyten (CFU-GEMM) in
Abwesenheit von detektierbaren Wachstumsfaktoren bilden,
wie z.B. von Interleukin-3 (ein
plurikoloniestimulierender Faktor), dem bei Granulozyten und
Makrophagen koloniestimulierenden Faktor und dem bei
Granulozyten koloniestimulierenden Faktor.
-
Die Fähigkeit der GBL/6-Zellen bzw. der
GBL/6-neor-Zellen, die Hämopoese in vitro zu unterstützen,
konnte nicht auf die Synthese von nachweisbaren Mengen
irgendeines bekannten Hämopoetins mit pluri-CSF-Aktivität
zurückgeführt werden.
-
Zur Aufbereitung von Poly(A)&spplus;-mRNS wurde mittels eines
modifizierten Extraktionsverfahrens mit Guaninhydrochlorid
(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Lab. Manual,
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) die
gesamte RNS aus Zellen der GBLneor-Stromazellinie
extrahiert. Die spezifischen Transkripte (mRNS) für
Interleukin-3 (IL-3) (Fung et al., 1984, Nature 307,
S. 233), den bei Granulozyten und Makrophagen
koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) (Gough et al., 1984,
Nature 309, S. 763), den bei Makrophagen
koloniestimulierenden Faktor (M-CSF) (Kawasaki et al.,
1985, Science 230, S. 291), IL-1 (Auron et al., 1984, PNAS
81, S. 7907) und den bei Granulozyten
koloniestimulierenden Faktor (G-CSF) (Isuchiya et al.,
1986, PNAS 83, S. 7633) wurden durch Hybridisierung mit
spezifischen cDNS-Sonden (> 10&sup8; cpm/ug) identifiziert, wie
in Maniatis et al., a.a.O. beschrieben. mRNS aus
GBL/6-neor-Zellen wurde durch RNS-Blothybridisierung auf
Vorkommen von Poly(A)&spplus;-mRNS für bekannte Wachstumsfaktoren
analysiert. Die GBL/6-neor-Zellen enthielten keine
nachweisbare Poly(A)&spplus;-mRNS für IL-3, GM-CSF, G-CSF oder
IL-1, jedoch konnte mRNS für M-CSF nachgewiesen werden.
Der bei Makrophagen koloniestimulierende Faktor wird von
den GBL/6-Zellen konstitutiv synthetisiert. Die
Unterstützungsfähigkeit der GBL/6-Zellinie kann entweder
auf die Fähigkeit des M-CSF, bei akzessorischen Zellen die
Absonderung anderer CSF in vivo und in vitro auszulösen,
oder auf einen anderen Wachstumsfaktor zurückzuführen
sein.
Tests für hämoepoetische Zellen
-
Adhärente und nicht-adhärente Zellen wurden
wöchentlich aus LTBMCs herausgelöst und auf ihre Fähigkeit
zur Koloniebildung CFU-GEMM mit und ohne G418 in vitro
getestet (Johnson et al., 1977, Proc. Nat. Aca. Sci. 74,
S. 3879; Nakahata et al., 1982, Proc. Nat. Aca. Sci. 79,
S. 3843). Die biologische Aktivität jeder Charge von G418
wurde in Kolonietests mit nichtinfizierten Kulturen
getestet und festgestellt. Alle angegebenen G418-
Konzentrationen sind ausgedrückt als tatsächliches Gewicht
pro Milliliter. Tests mit Parentalzellen wurden in einer
Nährlösung durchgeführt, die 10% BSA (Rinderserumalbumin),
30% FBS (fetales Rinderserum), 10&supmin;² M 1-Mercaptoethanol
mit Methylcellulose als halbfeste Basis enthält, und die
mit drei konditionierten Nährlösungen ("conditioned
media", CM) ergänzt wurde: WEHI-3BCM (Ihle et al., 1983,
J. Immunol. 131, S. 282), L-Zellen-CM als Quelle des bei
Makrophagen koloniestimulierenden Faktors (M-CSF) (Stanley
et al., 1977, J. Biol. Chem. 252, S. 4305) oder
10% Pokeweed-Mitogen-stimulierte Milzzellen-CM und 2,0 u
m/ml EPO (Erythropoetin) (Humphries et al., 1979, Blood
53, S. 746).
-
Die CFU-Tests in vivo wurden wie von Till und
McCulloch (1961; Radia. Res. 14, S. 213) beschrieben
durchgeführt. Für jede Gruppe wurden 5-10 Mäuse bei
140 rad/min (Cäsium-Quelle) mit 1000 rad bestrahlt und es
wurden ihnen 5 x 10&sup5; Zellen/Maus injiziert. Die Mäuse, die
keine Parentalzellen bekommen hatten, starben binnen 12
Tagen nach der Bestrahlung und wiesen ≤ 0,1 ± 0,3 endogene
Kolonien pro Milz auf.
Einpflanzung von GBL/6-neor-Zellen in Mäuse
-
Die Fähigkeit der injizierten Stromazellen, in vivo
ihren Platz in den Sinus des Knochenmarks einzunehmen und
sich dort stabil einzunisten, wurde zunächst mittels in
vivo immunhistochemischer Methoden ausgewertet.
Glu6PIα&spplus;-Stromazellen wurden zwei Monate nach der
Transplantation in die Sinus des RHB(rechtes
Hinterbein)-Knochenmarks von Mäusen, denen sie
transplantiert worden waren, in situ identifiziert. Zwei
Monate nach der Transplantation zeigten weder die der
Einpflanzung unterzogenen noch die zur Kontrolle
bestrahlten aber nicht der Einpflanzung unterzogenen Mäuse
nachweisbare, vom Spender stammende Glu6PI-α-Zellen in
Milz, Leber, Lunge oder Peritonealspülungen. Wie in
Tabelle 1 gezeigt, stammten 26,2% der adhärenten
Stromazellen in Mark-Kulturen, die aus den der
Transplantation unterzogenen Mäusen explantiert wurden,
vom Spender. Die Explantate aus adhärenten Stromazellen
wurden als Kulturen angelegt, und die vom Spender
stammenden Stromazellen wurden am 18. Tag unter Verwendung
eines spezifischen Anstiserums gegen den Glu6PI-α-
Alloenzymmarker (Charles et al., 1980, Mol. Cell. Biochem.
29, S. 11), und Anfärbung mit Immunoperoxidase (PAP)
identifiziert. Diese Zellen sind im oberen Bild der Fig. 1
abgebildet, welches die explantierten adhärenten
Markzellen aus dem RHB von der Transplantation
unterzogenen Mäusen einen Monat nach dieser
Transplantation in vitro zeigt. Das untere Bild der Fig. 1
zeigt in vitro explantierte Markzellen aus zur Kontrolle
bestrahlten, der Transplantation nicht unterzogenen Mäusen
nach einem Monat. Vom Empfänger stammende Zellen wurden
unter Verwendung eines spezifischen Kaninchen-Antiserums
gegen das Mäuse-Glu6PI-α- und Immunoperoxidaseanfärbung in
vitro identifiziert. Der Pfeil zeigt eine Zelle, die
angefärbt wurde. Tabelle 1 zeigt ebenfalls, daß 2 bzw. 3
Monate nach der Transplantation der höchste Anteil an vom
Empfänger stammenden Zellen unter den gesamten adhärenten
Zellen in den Markexplantaten 82.5% bzw. 62.5% betrug.
Glu6PI-α-Zellen machten 78% der adhärenten Zellen in
LTBMCs aus, die aus RHB (mit 13 Gy bestrahlt) von der
Transplantation unterzogenen Mäusen angelegt wurden.
Adhärente Stromazellen aus LTMBCs vom 70. Tag wurden mit
Trypsin behandelt, ausgestreift und einer PAP unterzogen.
Der Anteil der vom Empfänger stammenden Glu6PI-α&spplus;-Zellen
betrug < 0.01% bei den nicht-adhärenten Zellen und in
einzelnen CFU-GEMM-Kolonien, die von diesen LTBMCs
stammten. Dagegen enthielten nicht-adhärente hämopoetische
Parentalzellen, die den gleichen LTBMCs entnommen wurden,
keine nachweisbaren Glu6PI-α-Zellen. In situ oder in
LTMBCs aus zur Kontrolle bestrahlten nicht der
Transplantation unterzogenen Mäusen wurden keine
nachweisbaren Glu6PI-α-Stromazellen identifiziert (Fig. 1
unten, Tabelle 1).
-
Die rückgewonnenen, vom Spender stammenden GBLneor-
Zellen in Kulturen, die von zur Kontrolle bestrahlten, der
Transplantation nicht unterzogenen Mäusen und von Mäusen,
denen GBL/6neor-Zellen transplantiert waren, explantiert
worden waren, wurden selektiert, indem man sie in
Anwesenheit von G418 (500 ug/ml) wachsen ließ. Wie oben
beschrieben wurden GBlneor-Zellen in einer Zellzahl von
5 x 10&sup5; GB1neor-Zellen pro Maus in Mäuse transplantiert.
Zwei Monate nach der Transplantation wurden folgende
Gesamtanzahlen von Zellen rückgewonnen: 5,8 x 10&sup6; pro RHB
(13 Gy) und 8,6 x 10&sup6; pro linkes Hinterbein (3 Gy) von zur
Kontrolle bestrahlten, nicht der Transplantation
unterzogenen Mäusen; 6,5 x 10&sup6; pro RHB (13 Gy) und
6,9 x 10&sup6; pro linkes Hinterbein (3 Gy) von der
Transplantation unterzogenen Mäusen. Explantate mit
adhärenten Stromazellen wurden als Zellkulturen mit einer
Zellzahl von 5 x 10&sup6; Zellen pro Platte (16 x 10 mm)
angelegt. Einigen davon wurde zweimal wöchentlich G418
(500 ug/ml) zugeführt. 17 Tage nach Anlage der in vitro-
Kulturen wurde die Anzahl der G418-resistenten Kolonien
bestimmt. Tabelle 2 zeigt, daß Kolonien mit
G418-resistenten Stromazellen in dem explantierten RHB-Mark
von der Transplantation unterzogenen Mäusen, nicht aber in
den zur Kontrolle bestrahlten Mäusen gefunden wurden. Die
Werte in Klammern sind der Prozentsatz an G418-resistenten
Kontroll-Kolonien, der sich wie folgt berechnet: Anzahl der
Kolonien mit G418-resistenten Stromazellen pro 5 x 10&sup6;
Zellen geteilt durch die Gesamtzahl der
Stromazellenkolonien pro 5 x 10&sup6; Zellen multipliziert mit
100.
-
Es wurde die physiologische Funktion der
transplantierten GBL/6-Stromazellen in vitro untersucht.
In monatlichen Abständen wurden dazu einzelne LTBMCs aus
jedem der Hinterbeine von der Transplantation mit
GBL/6-Zellen unterzogenen oder zur Kontrolle bestrahlten
und nicht der Einpflanzung unterzogenen Mäuse angelegt.
Die funktionelle Integrität der adhärenten Stromazellen
wurde durch Messung der Dauer der Hämopoese als kumulative
Anzahl aller nicht-adhärenten Zellen und der pluripotenten
Parentalzellen, die über einen Zeitraum von 70 Tagen in
vitro erzeugt wurden, quantifiziert. Die kumulative Anzahl
der erzeugten lebensfähigen nicht-adhärenten Zellen in
jeder Mark-Kultur, die 1, 2 und 3 Monate nach der
Transplantation mit GBL/6-Zellen aus den RHB der davon
betroffenen Mäuse angelegt wurden, war größer als die von
Kulturen aus zur Kontrolle bestrahlten, nicht der
Transplantation unterzogenen Mäusen erzeugten. Die
kumulative Anzahl der pluripotenten hämopoetischen
Parentalzellen, die unter dem Einsatz der im folgenden
beschriebenen Verfahren gemischte CFU-GEMM-Kolonien
bilden, pro RHB-Kultur (13 Gy), die jeweils nach 1, 2 und
3 Monaten aus der Transplantation unterzogenen Mäusen
angelegt wurde, betrug 30,5 ± 3,7 x 10², 45,6 ± 2,5 x 10²
und 34,7 ± 4,2 x 10², im Vergleich zu 5,13 ± 2,2 x 10²,
7,3 ± 0,9 x 10² und 6,04 ± 0,13 x 10² bei den Markkulturen
aus zur Kontrolle bestrahlten, der Transplantation nicht
unterzogenen Mäusen (P < 0,05).
-
Es wurde die Auswirkung der Anzahl an Spender-
Stromazellen auf die Erholung der Hämopoese bei
bestrahlten Mäusen getestet. Die Mäuse wurden mit 1 x 10&sup6;,
5 x 10&sup5; bzw. 1 x 10&sup5; Zellen beimpft. Zwei Monate nach der
Transplantation mit GBL/6-Zellen wurden Langzeit-
Knochenmark-Kulturen angelegt. Die Anzahl der
lebensfähigen, nicht-adhärenten Zellen pro Flasche, die
über einen Zeitraum von 70 Tagen erzeugt worden waren,
wurde quantifiziert, ebenso wie die CFU-GEMM in jeder RHB
(13 Gy)- bzw. LHB (linkes Hinterbein) (3 Gy)-Kultur. Es
wurde eine nachweisbare chimärische Stromazellen-
Population mit mindestens 1 x 10&sup5; Stromazellen angelegt.
-
Die Erzeugung von hämopoetischen Parentalzellen durch
RHB-Kulturen von der Transplantation unterzogenen Mäusen
erreichte 48% der in Kulturen aus nicht-bestrahlten Mäusen
beobachteten Werte, im Vergleich zu 5% bei Mark-Kulturen
aus bestrahlten, der Transplantation nicht unterzogenen
Mäusen. Eine Röntgendosis von 3 Gy auf das linke
Hinterbein verringerte die Produktion an hämopoetischen
Stammzellen in Mark-Kulturen aus bestrahlten, der
Transplantation nicht unterzogenen Mäusen auf 35% im
Vergleich zu Kulturen aus nicht-bestrahlten Mäusen. Jedoch
wurde in LTMBCs, die aus mit dieser Dosis bestrahlten
Beinen stammen, durch die Einpflanzung der GBL/6-Zellen
keine nachweisbare Erhöhung der Zellproduktion
hervorgerufen.
-
Sodann wurde die Effizienz der Wiederbesiedlung der
Mark-Sinus von RHB (13 Gy) durch endogene CFU-S und die
Erholung des peripheren Blutbildes bei Mäusen, denen
GBL/6-Zellen transplantiert worden waren, sowie bei zur
Kontrolle bestrahlten, der Transplantation nicht
unterzogenen Mäusen gemessen. Verschiedene Gruppen von
C57BL/6J-Mäusen wurden mit 3 bis 7 Gy in 2 Gy-Schritten
bestrahlt, wobei das RHB zwischen 10 und 12,5 Gy erhielt,
wie in Tabelle 3 gezeigt wird. Jede Bestrahlungsgruppe
bestand aus 5-10 Mäusen. Bei allen Mäusen wurde zusätzlich
das RHB mit 10-12,5 Gy bestrahlt. Einer Gruppe wurden
5 x 10&sup5; GB1/6-Stromazellen pro Maus injiziert. Die Werte
in Klammern beziehen sich auf die Gruppe, die zwar keine
Zellen empfing aber zur Kontrolle bestrahlt wurde. Sechs
Wochen nach der Bestrahlung und Transplantation wurde eine
Untergruppe aus jeder Gruppe getötet; aus jedem RHB wurden
Zellen aufgeschwemmt und auf CFU-S getestet. Die
Ergebnisse werden als Durchschnittswert ± SA
(Standardabweichung) von drei bis fünf Mäusen angegeben.
In der Milz von bestrahlten Mäusen ohne Injektion wurde
eine durchschnittliche Anzahl von 4,4 ± 2,9 endogenen
CFU-S-Kolonien beobachtet. Einer Untergruppe aus jeder der
Gruppen mit unterschiedlichen Bestrahlungsdosen wurde eine
Zellzahl von 5 x 10&sup5; GBL/6-Zellen pro Maus injiziert.
Sechs Wochen nach der Bestrahlung und Transplantation
wurde das RHB jedes Tieres in jeder Dosierungsgruppe auf
die Anzahl der CFU-S bildenden pluripotenten Stammzellen
hin untersucht. Die Ergebnisse werden als
Durchschnittswert ± SA von mindestens drei Mäusen pro
Gruppe angegeben. Nicht-bestrahlte Mäuse wiesen eine
Leukozytenzahl ("white blood cell", WBC) von 8,8 ±
1,6 x 10/mm³, eine Thrombozyten(PLT)-Zahl von 173,7 ±
28,7 x 10³/mm³ und eine Erythrozyten(RBC)-Zahl von 7,8 ±
0,05 x 10&sup6;/mm³ auf.
-
Wie in Tabelle 3 gezeigt war die Anzahl der
CFU-S-bildenden plutipotenten Stammzellen pro RHB bei
niedrigeren Ganzkörperbestrahlungs ("total body
irradiation", TBI)-Dosen von 3 und 5 Gy in Mäusen, denen
GBL/6-Zellen transplantiert worden waren, und in zur
Kontrolle bestrahlten, der Transplantation nicht
unterzogenen Mäusen ähnlich. Sublethal bestrahlte (7-Gy
TBI) Mäuse, denen GBL/6-Zellen transplantiert worden
waren, zeigten dagegen eine wesentlich höhe Anzahl an
CFU-S-bildenden Stammzellen in dem RHB im Vergleich zur
Anzahl der aus RHB von zur Kontrolle bestrahlten, der
Transplantation nicht unterzogenen Mäusen rückgewonnenen
Zellen (P < 0,01 im Vergleich zu den Werten bei zur
Kontrolle bestrahlten, der Transplantation nicht
unterzogenen Mäusen).
-
Der Verlauf der Erholung des peripheren Blutbildes in
Mäusen nach TBI-Dosen von 3 bzw. 5 Gy war bei der
Transplantation unterzogenen und bei zur Kontrolle
bestrahlten, der Transplantation nicht unterzogenen Mäusen
ähnlich. Dagegen wurde im peripheren Blut eine erhebliche
Erholung der Leukozytenzahl (6,9 ± 1,0 x 10³) und der
Thrombozytenzahl (112,5 ± 2,5 x 10 pro mm³) in mit 7 Gy
bestrahlten Mäusen, denen GB1/6-Zellen transplantiert
worden waren, im Vergleich zu den bestrahlten, der
Transplantation nicht unterzogenen Kontrollgruppen
(Leukozytenzahl: 4 ± 0,05 x 10³ Zellen pro mm³;
Thrombozytenzahl 50 ± 3 Thrombozyten pro mm³; P < 0,05;
Tabelle 3) beobachtet.
-
Die Werte zeigen, daß eine vorgeschaltete Bestrahlung
die Stromazellen der hämopoetischen Umgebung beschädigt,
und legen die Interpretation nahe, daß durch die höhere
Dosis von endogenen hämopoetischen Stammzellen befreite
Nischen geeignetere Einnistungsorte für die injizierten
Spenderzellen abgeben.
Expression des TGF("transforming growth factor" =
transformierender Wachstumsfaktor)-α-Gens bei Mäusen
Wanderung der hämopoetischen Zellen an die bestrahlte
Stelle
-
Ein defekter retroviraler Vektor, der TGF-α-cDNS
trägt, wurde mittels Elektroporation in die die Hämopoese
unterstützende Knochenmark-Stromazellinie GBL/6 durch
Transfektion übertragen, welche zur Einpflanzung in vivo
an einem mit einer hohen Dosis bestrahlten Ort einer
syngenischen Maus in der Lage ist, wie in Anklesaria et
al., s.o., gezeigt wurde. Es hat sich herausgestellt, daß
die eingepflanzte GBL/6-Zellinie, der das TGF-α-Gen durch
Transfektion übertragen wurde, (Gp-TGFα) viele Monate lang
an den bestrahlten Stellen stabil gebunden bleibt und den
Liganden TGF-α erzeugt, einen Wachstumsfaktor mit
funktioneller Homologie zum epidermalen Wachstumsfaktor
("epidermal growth factor", EGF) und zu demselben
Rezeptor.
-
Die Fähigkeit einer IL-3-abhängigen hämopoetischen
Parental-Zellinie (32DC13) zur Einpflanzung und
Proliferation auf der Gp-TGF-α-Zellinie in vitro wurde
durch Übertragung eines eukaryontischen Expressionsvektors
mittels Transfektion auf 32DC13 gezeigt, welcher sowohl
das selektierbare Gen (E. coli-gpt) als auch das den
EGF-Rezeptor (EGFR) codierende Gen trägt. Die Expression
des EFGR-Gens führte zur Aktivierung eines mitogenischen
Signals als Reaktion auf EGF (siehe Pierce et al.,
Science, 1988, 239, S. 623). Der Transfektion nicht
unterzogene 32DC13-Kontroll-Zellen, die entweder zusammen
mit der Gp-TGFα- oder mit der GBL/6-Zellinie kultiviert
wurden, proliferierten nicht und bildeten keine
pflastersteinartige ("cobblestone") Flächen. Die
32DC13-Zellen, denen das EGFR-Gen mittels Transfektion
übertragen worden war, (32D-EGFR), proliferierten kräftig
in vitro über 7 Wochen auf Gp-TGFα-Zellen, nicht aber auf
GBL/6-Zellen. Dagegen proliferierten die hämopoetischen
Parentalzellen aus LTMBCs und produzierten CFU-GEMM-
Parentalzellen effektiver mit GBL/6 als mit Gp-TGFα
-Zellen. Folglich waren nur Zellen, die eine
Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung bilden könnten, zur
Einpflanzung und kräftigen Proliferation in vitro in der
Lage. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
-
Es wurde die Fähigkeit der 32D-EGFR-Zellen untersucht,
ihren Platz bei den in vivo eingepflanzten Gp-TGFα-
Stromazellen einzunehmen. Bestrahlten C57B1/6-Mäusen
wurden jeweils 5 x 10&sup5; Gp-TGFα-Zellen/Maus transplantiert.
Zwei Monate nach der Transplantation wurden sowohl Mäusen,
denen Gp-TGFα-Zellen transplantiert worden waren, als auch
zur Kontrolle bestrahlten, der Transplantation nicht
unterzogenen Mäusen Mycophenolsäure-resistente
32D-EGFR-Zellen (1,0 x 10&sup7; Zellen/Maus) injiziert. Vom
Spender stammende, TGR-α-erzeugende neor-Kolonien (11,5 ±
2,5 CFU-F/Bein) wurden zwar in Mark-Explantaten aus
bestrahlten Mäusen, denen Gp-TGFα-Zellen implantiert
worden waren, nicht aber in solchen aus zur Kontrolle
bestrahlten, der Transplantation nicht unterzogenen Mäusen
nachgewiesen. 15,2 ± 8,0 x 10&sup5; 32D-EGFR-Zellen/Bein wurden
aus Hinterbein-Explantaten von bestrahlten Mäusen
rückgewonnen, denen Gp-TGF-α-Zellen transplantiert worden
waren, im Vergleich zu 0,55 ± 0,10 x 10&sup5; 32D-EGFR-Zellen
aus Hinterbein-Explantaten von zur Kontrolle bestrahlten,
der Transplantation nicht unterzogenen Mäusen. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, daß sich die Mark-
Stromazellen, die ein durch Transfektion übertragenes,
enzym-codierendes Gen enthalten, in der durch Bestrahlung
vorbereiteten Knochenkavität etabliert und daß sie nach
der Einpflanzung das Enzym exprimiert haben.
Behandlung des Mangels an Faktor VIII beim Menschen
Das menschliche Faktor VIII-C-Gen
-
Das menschliche Gen für den Blutgerinnungsfaktor
VIII-C aus dem cDNA-Klon pSP64-VIII (Toole et al., 1984,
s.o.) kann in irgendeinen für die Expression in
Säugetieren geeigneten Vektor, wie z.B. den pCVSVL-Vektor,
eingefügt und in menschlichen Stromazellen exprimiert
werden (die Genexpression in pCVSVL wird in Kaufmann et
al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2, S. 1304; Clark et al.,
1984, Proc. Nat. Aca. Sci. 81, S. 2541 beschrieben). Die
DNS-Sequenz der codierenden Region des menschlichen Gens
für den Faktor VIII-C wird in Wood et al., 1984, s.o.,
angegeben.
-
Das Gen für den Faktor VIII-C kann dadurch in die
PstI-Stelle von pCVSVL kloniert werden, daß man das Gen
als SalI-Fragment heraus schneidet und SalI-cohäsive Enden
aufweisende Oligonukleotid-Adaptoren einsetzt, wie in
Toole et al., s.o., beschrieben wird. In pCVSVL-FVIII wird
das Gen für den Faktor VIII-C unter der Kontrolle des
Haupt-"späten"-Promotors ("major late promoter") des
Adenovirus stehen, wie in Fig. 3 gezeigt. Dieses Plasmid
enthält außerdem die SV40-Polyadenylierungsstelle
(SV40-PolyA) sowie zwei Kopien des SV40-
Replikationsursprungs (SV40-Ori) und weist eine Deletion
in pBR322 auf, welche die Replikation von solchen
Plasmiden in Tierzellen verstärkt (Lusky et al., 1981,
Nature 293, S. 79). Als selektierbare Gene enthält der
Vektor das Tetracyclin-Resistenz (Tet ) codierende Gen
sowie das die Dihydrofolatreductase (DHFR) codierende Gen
der Maus. Ähnliche Vektoren für die Expression des Faktors
VIII-C in Säugetieren werden in Kaufmann et al.,
WO87/04187, veröff. am 17. Juli 1987 detailliert
beschrieben.
Test auf Faktor VIII-Aktivität
-
Die Aktivität des Faktors VIII-C in Kulturüberständen
kann durch das Kabi Coatest-Verfahren für Faktor VIII-C,
welches zum Erzielen einer Empfindlichkeit besser als
0,05 mU/ml modifiziert wurde, und durch das einstufige
Gerinnungs-Testverfahren für die aktivierte partielle
Thromboplastinzeit (APTT) (Lee et al., 1983, Thromb. Res.
30, S. 511) unter Einsatz von Faktor VIII-C-defizientem
Plasma bestimmt werden. Der Coatest-Test beruht auf der
Aktivierung des natürlichen Faktors X durch den
Faktor IXa; der Faktor IXa ist vom Faktor VIII abhängig.
Der APTT-Test beruht auf der merklichen Erhöhung der
Blutgerinnungsaktivität des Faktors VIII in Anwesenheit
von Thrombin. Zur Aktivierung des Thrombins können die
Proben 1-10 Min. lang mit 0,2 Einheiten/ml Thrombin bei
Raumtemperatur vorbehandelt werden. Alternativ kann der
Faktor VIII mittels eines Radioimmunotests unter Einsatz
eines für den Faktor VIII spezifischen Antikörpers
quantifiziert werden, wie in Wood et al., 1984, s.o.,
beschrieben wird.
Übertragung des Gens für den Faktor VIII-C auf
Mäuse-Zellen durch Transfektion
-
Zur Transfektion von Mäuse-Stromazellen (worunter sich
z.B. GBL/6-Zellen befinden) durch Elektroporation, durch
Übertragung mittels eines retroviralen Vektors oder durch
irgendeine herkömmliche, zur Übertragung von Vektoren
geeignete Methode kann ein Vektor, der das menschliche
Faktor VIII-C-Gen und das neor-Marker-Gen trägt,
eingesetzt werden.
-
Subklonische GBL/6-neor-Zellinien, die nachweisbare
Mengen an menschlichem Faktor VIII-C exprimieren, werden
auf Dauerhaftigkeit der Neonycin-Resistenz selektiert und
auf Erzeugung von mittels Immunoblotting ("Western blot")
oder eines biochemischen Tests nachweisbarem Faktor VIII-C
durch diese Subklone in einer konditionierten, serumfreien
Nährlösung getestet.
Einpflanzung in bestrahlte Mäuse
-
Männliche C56BL/6J-Mäuse werden als Empfänger
eingesetzt. Die Zellen dieser Tiere enthalten drei
"Empfänger"-Marker: das Y-Chromatin, die Beta-Variante der
Glucophosphatisomerase (GPIA) und die Abwesenheit von
nachweisbarer Neomycin-Resistenz-Aktivität. Die
Ausgangszellen vom Spender stammen von der
GBL/6-neor-VIII-C-Klonlinie, und enthalten vier Marker
mit Spender-Ursprung: Abwesenheit von nachweisbarem
Y-Chromatin, nachweisbare Immunoperoxidase-Anfärbung mit
polyklonalem Antiserum gegen GPIA, biologische Neomycin-
Resistenz in vitro und nachweisbare Erzeugung von
menschlichem Faktor VIII-C. Eine Dosis/Antwort-Kurve für
die Einpflanzung dieser Zellen in bestrahlte Mäuse wird
wie folgt erstellt.
-
Die Empfänger-Mäuse werden mit 300 cGy in
Ganzkörperbestrahlung (TBI) und mit 1000 cGy auf das
isolierte rechte Hinterbein (RHB) bestrahlt, wobei die
Strahlung von einer ¹³&sup7;Cs-γ-Strahlungsquelle (Zelle 40)
geliefert wird. Am Tag nach der Bestrahlung werden den
Tieren Einzelzellsuspensionen mit 1 x 10&sup4;, 5 x 10&sup4;,
1 x 10&sup5; bzw. 5 x 10&sup5; Zellen aus einer hochproduktiven
GBL/6-neor-VIII-C-Klonlinie (Zellen von 10 Mäusen waren
pro Gruppe vereinigt) in die Schwanzvene intravenös
injiziert. Die Mäuse werden wieder in ihre Käfige gesperrt
und in wöchentlichen Abständen auf das Vorkommen von
nachweisbarem Faktor VIII-C im Plasma untersucht. Zu
verschiedenen Zeitpunkten werden repräsentativ ausgewählte
Mäuse getötet und über eine Herzpunktion wird Plasma
entnommen, welches mittels Immunoblotting ("Western blot
analysis") auf das Vorkommen von menschlichem
Faktor VIII-C untersucht wird, wobei dieser durch seine
spezifische Reaktion mit monoklonalem Antiserum gegen den
menschlichen Faktor VIII-C (von mehreren öffentlich
zugänglichen Quellen erhältlich) von dem Faktor VIII-C der
Maus unterschieden werden kann.
-
Zum Zeitpunkt der Tötung von Mäusen aus jeder
Dosisgruppe werden kernhaltige Zellen aus dem rechten und
linken Hinterbein jedes Tieres herausgenommen und zur
Anlage permanenter Maus-Knochenmark-Kulturen verwendet,
wie oben beschrieben. Es ist zu erwarten, daß Knochenmark-
Kulturen aus dem rechten Hinterbein einen höheren Anteil
an vom Spender stammenden, neomycin-resistenten
Stromazellen enthalten und daß permanente Mark-Kulturen
aus diesem Bein nachweisbare Mengen an menschlichem
Faktor VIII-C in vitro erzeugen. Als Zeitpunkte zur
Explantation von Mark aus der Einpflanzung unterzogenen
Mäusen werden eine Woche, zwei Monate, vier Monate und
sechs Monate nach der Transplantation der Stromazellen
sowie weitere dazwischenliegende Zeitpunkte gewählt. Es
wird die Menge von menschlichem Faktor VIII-C im Plasma
gemessen und in einem Diagramm die Faktor VIII-C-
Produktion gegen die Zeit aufgetragen. Die optimale Anzahl
an zu transplantierenden Stromazellen wird im Hinblick auf
die Höchstmenge der Faktor VIII-C-Produktion in einem
Hinterbein bestimmt.
Untersuchung der Bestrahlungsdosis
-
Wenn nach Wiederherstellung eines Hinterbeines mit
Spender-Zellen, nachdem dieses mit einer hohen Dosis
bestrahlt wurde, kein menschlicher Faktor VIII-C im Plasma
der Maus nachweisbar ist, kann nach einem Protokoll zur
schrittweisen "Nischen"-Vorbereitung mit Bestrahlung
beider Hinterbeine und Vorbereitung einer größeren Nische
zur Einpflanzung verfahren werden. Diese Verfahrensweise
ist bereits zur nachweisbaren Veränderung der makrozytären
Anämie des S1/S1d-Mäuse-Stammes eingesetzt worden, um zu
erreichen, daß ein höherer Anteil des Gesamtmarkvolumens
durch die Spender-Stromazellen ersetzt wird. Dieser Stamm
weist einen genetischen Defekt der Knochenmark-
Mikroumgebung auf, der einen Mangel bei den reifen
Erythrozytenvorläufern sowie eine verringerte Anzahl an
pluripotenten hämopoetischen Stromazellen mit sich bringt.
-
Ein überwiegender Anteil der Mark-Mikroumgebung in
S1/S1d-Mäusen wurde entweder durch Vorbereitung der Mäuse
mit 2 Gy TBI oder 20 Gy auf beide Hinterbeine (BHB,
einfacher Arbeitsgang) oder durch Transplantation mit
fraktionierter Bestrahlung (mehrere Arbeitsgänge) ersetzt.
Erwachsene S1/S1d-Empfänger-Mäuse wurden mit 1-2 Gy TBI
und 10,0-20,0 Gy auf das rechte Hinterbein (RHB) oder auf
beide Hinterbeine (BHB) bestrahlt, dabei diente ein
Linearbeschleuniger als Strahlungsquelle, wie in
Anklesaria et al., 1987, s.o., beschrieben wird. 1 Gy TBI-
Dosen und Röntgen-Dosen von 10 Gy werden aufgrund der
relativen Empfindlichkeit der S1/S1d-Mäuse gegenüber TBI
bevorzugt. Den bestrahlten Mäusen wurden 5 x 10&sup5;
Stromazellen (GBLneor) durch intravenöse Injektion
(einfacher Arbeitsgang) transplantiert. Zur Untersuchung
von Bestrahlung und Transplantation in
aufeinanderfolgenden Schüben wurden am Tag Null
S1/S1d-Mäuse von einem Linearbeschleuniger mit 1 Gy TBI
und 10 Gy auf das RHB bestrahlt. Eine Einzelzellsuspension
der GBLneor-Zellinie wurde 48 Stunden später i.v.
injiziert. Zwei Monate nach dem ersten
Bestrahlungsarbeitsgang wurde dieselbe Mäuse-Gruppe mit
1 Gy TBI und 10 Gy auf das linke Hinterbein (LHB)
bestrahlt. Eine weitere Injektion mit der GBLneor-Zellinie
wurde 48 Stunden später verabreicht (mehrfacher
Transplantationsarbeitsgang). Zur Kontrolle bestrahlte,
der Transplantation nicht unterzogene Mäuse wurden mit
2 Gy TBI und 10 Gy auf beide Hinterbeine (BHB) bestrahlt.
-
Keine der zur Kontrolle bestrahlten, der
Transplantation nicht unterzogenen Mäuse überlebte.
LTBMCs, die nach 5 Monaten aus Mäusen (2 Gy TBI und
20 Gy BHB) angelegt wurden, denen GBLneor-Zellen
transplantiert worden waren, zeigten sowohl in Kulturen
aus dem rechten (298,8 ± 32,7) als auch aus dem linken
(415,8 ± 36,5) Hinterbein eine erhöhte kumulative Anzahl
an CFU-GEMM bildenden Parentalzellen pro Flasche im
Vergleich zu nicht-bestrahlten S1/S1d-Mäusen (p < 0,05,
Fig. 2). Zwei bzw. vier Monate nach der
Bestrahlung/Transplantation wurden aus 3 Mäusen pro Gruppe
LTBMCs angelegt. Bei voneinander unabhängigen Experimenten
war zwei Monate, nachdem die Mäuse der zweiten
Bestrahlung/Transplantation unterzogen worden waren, die
kumulative Anzahl der pro Flasche erhaltenen CFU-GEMM
bildenden Parentalzellen bei LTBMCs, die aus der
Einpflanzung unterzogenen rechten (136,1 ± 32) und linken
(78,6 ± 15,4) Hinterbeinen von Mäusen angelegt wurden,
denen GBLneor-Zellen transplantiert worden waren, höher
als bei solchen aus zur Kontrolle nicht-bestrahlten
S1/S1d-Mäusen (p < 0,05, Fig. 2). In Fig. 2 werden Zellen
aus zur Kontrolle nicht bestrahlten Mäusen mit offenen
Kreisen; die Zellen aus Mäusen, welche einer
Transplantation mit GBLneor-Zellen und einer
RHB-Bestrahlung mit 20 Gy unterzogen wurden, mit offenen
Vierecken; die Zellen aus Mäusen, welche einer
Transplantation mit GBLneor-Zellen und einer
LHB-Bestrahlung mit 20 Gy unterzogen wurden, mit
geschlossenen Dreiecken; und die Zellen aus Mäusen, welche
einer Transplantation mit GBLneor-Zellen und einer
LHB-Bestrahlung mit 10 Gy unterzogen wurden, mit
geschlossenen Vierecken dargestellt.
-
Folglich kann in S1/S1d-Mäusen eine hohe
Bestrahlungsdosis zur Einrichtung einer "Nische" in der
Mark-Kavität beitragen, so daß die transplantierte
Stromazellen unterstützt werden, und kann ebenfalls
endogene, die Hämopoese unterdrückende Stromazellen
beseitigen.
Quantifizierung der Zellen und der Enzymmengen
-
Die Anzahl der in vivo eingepflanzten Spender-
Stromazellen wird durch den oben beschriebenen Kolonietest
für neomycin-resistente Stromazellen quantifiziert. Dieser
Test wird durchgeführt, indem man die explantierten,
kernhaltigen Mark-Zellen auf Petrischalen in Anwesenheit
von 100 ug/ml G-418 ausplattiert und am 7. Tag Kolonien
mit ≥ 50 Zellen auszählt, gefolgt von Ausplattieren der
Zellen in aufeinanderfolgenden zehnfachen Verdünnungen bis
zu einer Grenzverdünung.
-
Zur Quantifizierung der erzeugten Menge an
menschlichem Faktor VIII-C relativ zur Anzahl der
eingepflanzten Stromazellen wird die Anzahl der
eingepflanzten koloniebildenden Stromazellen wie oben
beschrieben ermittelt und die Mengen an in vivo und in
vitro nachweisbarem menschlichem Faktor VIII-C nach der
Explantation ebenfalls wie oben beschrieben bestimmt.
Diese Experimente zeigen in Mäusen über mehr als 6 Monate
hinweg stabile Konzentrationen in vivo von nachweisbarem
menschlichen Faktor VIII-C.
-
Folgende Verfahren wurden entwickelt, um nachzuweisen,
daß Hämophilie A beim Menschen durch den Einsatz eines
Protokolls zur Einpflanzung von Stromazellen in vivo
behoben werden kann, welches dem für das Mäusesystem oben
beschriebenen ähnelt. Der Empfänger wird durch ein
ähnliches Verfahren mit hoher Bestrahlungsdosis
vorbereitet.
Langzeitkulturen aus menschlichem Knochenmark
-
Kernhaltige Markzellen aus Patienten mit Hämophilie A,
welche sich zuvor mit dem Virus der menschlichen
Immunschwäche aus HIV-kontaminierten Plasmapräparaten
infiziert haben, werden explantiert, nachdem die Patienten
informiert wurden und ihr Einverständnis vorlag. Aus
diesen Markproben werden unter Einsatz einer Methode zur
Herstellung einer geeigneten, mit Hydrocortison-
Natriumhemisuccinat ergänzten Nährlösung permanente
Knochenmark-Kulturen angelegt.
-
Bei den Patienten, die das Transplantat empfangen
sollen, wird Mark aus den Hüftbeinkämmen abgesaugt, wobei
ungefähr 3 x 10&sup8; kernhaltige Zellen herausgelöst wurden.
Die Methode zur Entnahme von Knochenmark entspricht der
Beschreibung von Buchner et al., 1984, Blood 64, S. 630,
deren Offenbarung durch den Verweis hiermit als einbezogen
zu betrachten ist, sowie von Thomas et al., 1970,
Blood 36, S. 507, modifiziert durch Jin et al., 1985, Exp.
Hematol. 13, S. 879.
-
Kurz zusammengefaßt werden Knochenmarksproben, die
unoperativ aus der Hüftechirurgie erhalten wurden, von
Spiculae gereinigt, indem man sie mit einer Schere in
McCoy 5A-Nährlösung zerkleinert; sodann werden
Einzelzellsuspensionen angesetzt, indem man das Mark durch
Nadeln mit absteigend kleinerer Stärke bis zu einer Nadel
Nr. 30 durchzieht. Durch Einimpfen von jeweils 3 x 10&sup7; bis
4 x 10&sup7; kernhaltigen Markzellen in jede 25 ccm-Corning
Kunststofflasche mit McCoy 5A-Nährlösung, ergänzt wie
vorstehend beschrieben (Greenberg et al., Blood 58,
S. 724, 1981), und 12,5% hitzeinaktiviertes fetales
Kälberserum, 12,5% hitzeinaktiviertes Pferdeserum und
10&supmin;&sup6; mol/l Hydrocortison enthaltend, werden Kulturen
angelegt. Die Kulturen werden bei 33ºC inkubiert und
ungestört 7 bis 14 Tage lang ruhen gelassen; diese Zeit
wird zur Erlangung der Adhäsion der hämopoetischen
Stromazellinseln, die mit der Langzeit-Hämopoese
einhergehen, unbedingt benötigt. Nach dieser anfänglichen
Inkubation werden alle nicht-adhärenten Zellen durch
Absaugen herausgelöst und zum Entfernen der roten
Blutkörperchen wird eine Trennung mittels eines Ficoll-
Hypaque-Dichtegradienten durchgeführt. Alle kernhaltigen
Zellen werden dann in frischer Nährlösung wieder in die
jeweiligen Kulturflaschen eingefüllt. In den ersten vier
Wochen werden die Kulturen zweimal, später einmal pro
Woche durch Entfernen der gesamten Nährlösung und der
nicht-adhärenten Zellen und Wiederbefüllung mit 8,0 ml
frischer Nährlösung versorgt. Durch Elektroporation, durch
Übertragung mittels eines retroviralen Vektors oder durch
irgendeine andere geeignete Methode wird dann den
menschlichen Stromazellen, wie vorstehend für die Mäuse-
Zellen beschrieben, ein Vektor mittels Transfektion
übertragen, welcher das menschliche Gen für den
Faktor VIII-C trägt.
-
Die Anzahl der Stromazellen, die mittels Transfektion
übertragen wurden und das Gen für den Faktor VIII-C
exprimieren, wird quantitativ bestimmt, und zwar entweder
durch Kopplung des Gens für den Faktor VIII-C mit einem
Gen für Neomycin-Resistenz und Selektion der
neor-resistenten Kolonien oder durch Kultivierung von
subklonischen Linien und Testen ihrer Überstände auf das
Vorkommen nachweisbarer Mengen an Faktor VIII, wie oben
beschrieben, oder durch Anfärbung der Zellen mittels
Immunoperoxidase unter Einsatz von monoklonalen
Antikörpern gegen den menschlichen Faktor VIII-C zum
Nachweis der Erzeugung von Faktor VIII-C. Es wird ein
System zur Transfektion von Vektoren ausgewählt, bei dem
die Häufigkeit der Expression bei den Stromazellen
maximiert wird, denen das Gen für den Faktor VIII-C
mittels Transfektion übertragen wurde. Wenn der Vektor
pZIP-NeoSV(X), welcher das Gen für Neomycin-Resistenz
trägt, mittels Transfektion in frische menschliche
Stromazellen übertragen wurde, wird von ungefähr 10-15%
der Zellen, die normalerweise gegen das Neomycin-Analog
G418 empfindlich sind, das Gen für die Neomycin-Resistenz
in vitro stabil exprimiert. Auf der Grundlage dieses
neor-Experiments erwartet man, daß mindestens 10% der
menschlichen Stromazellen das Gen für den Faktor VIII-C
stabil exprimieren. Wenn niedrigere Werte beobachtet
werden, können die klonischen menschlichen Knochenmark-
Stromazellinien KM101, KM102, KM103, KM104 und KM105
verwendet werden, die permanent und immortalisiert sind
(Fitzgerald et al., 1988, Int. J. Rad. Oncol. Biol.
Phys. 15, S. 1153), so daß die
Transfektionswahrscheinlichkeit und den Nachweis des Gens
für den Faktor VIII-C in vitro maximiert werden. Die
Faktor VIII-C-Produktion wird in den Klonlinien
quantifiziert und bezogen auf die Zellzahl mit der
Produktion in der Mäuse-GBL/6-neor-Linie verglichen. Die
folgenden Studien über Toxizität und tumorerzeugende
Wirkung werden durchgeführt.
-
Das Wachstum der menschlichen Stromazellinien in vitro
wirft potentiell verschiedene Probleme auf, darunter die
Aktivierung des Epstein-Barr-Virus (Rothstein et al.,
1985, Blood 65, S. 744), die Kontamination der
Stromazellen mit pathogenen Organismen während der in
vitro-Kultivierung, einschließlich Mycoplasma-,
Bakterienoder Pilzinfektion, und die spontane Transformation in
tumorerzeugende Zellinien. Eine eventuelle mikrobielle
Kontamination der Stromakulturen wird durch
bakteriologische und virologische Tests sowie durch
Mycoplasma-Tests des Materials überwacht. Die Zellen
werden auf das Vorkommen des Kern-Antigens des Epstein-
Barr-Virus getestet, wie in Rothstein et al., s.o.,
beschrieben, und mittels Elektronmikroskopie überprüft, um
eventuelle Anzeichen für die Aktivierung des
Epstein-Barr-Virus zu finden. In permanenten in
vitro-Kulturen menschlicher Knochenmark-Zellen wurde
bisher vor der 20.-25. Woche kein EBV (Epstein-Barr-Virus)
nachgewiesen. Der Mechanismus der EBV-Aktivierung ist zwar
nicht bekannt aber sie wird mit geringer Häufigkeit in
menschlichen Mark-Kontroll-Kulturen beobachtet.
-
Um zu untersuchen, ob sich nach Einschleusen des Gens
für den Faktor VIII-C eine spontane tumorerzeugende
Wirkung entwickelt hat, werden 1 x 10&sup7; Zellen aus
Stromazellkulturen, die den Faktor VIII-C exprimieren, in
nackte Mäuse i.p., i.v. oder intrathekal eingepflanzt.
Diese Tiere werden zur Entdeckung eventuell auftretender
Tumoren sechs Monate lang überwacht. Als positive
Kontrolle für diese Experimente mit nackten Mäusen dienen
u.a. die menschlichen Tumor-Zellinien HL60 und U937
(Greenberger et al., 1978, Cancer Res. 38, S. 3340). Unter
Anwendung dieser Kriterien ist es möglich, Anzeichen für
die tumorerzeugende Wirkung der menschlichen Mark-
Stromazellen, die den Faktor VIII-C exprimieren, zu
finden; 10%, möglicherweise sogar 50-60%, der frisch
explantierten menschlichen Stromazellen können das mittels
Transfektion übertragene Gen für den Faktor VIII-C
exprimieren.
Vorbereitung des Patienten
-
Zur autologen Einpflanzung der eigenen Stromazellen,
denen das Gen für den Faktor VIII-C mittels Transfektion
übertragen wurde, wird der jeweilige Patient durch
Bestrahlung eines Hüftbeinkamms vorbereitet. Man wählt
eine radiologische Pforte von höchstens 10 cm Breite und
10 cm Länge, um den Hüftbeinkamm und einen Teil des
Sitzbeines bei einseitiger Abschirmung von Blase und
Rektums einzubeziehen, oder eine winkelförmige
a.p. (antero-posterior)-p.a. (posterior-anterior)-Pforte zur
Minimierung des vom Bestrahlungsfeld erfaßten Volumens von
Darm, Blase und anderer normaler Weichteile. Auf diesen
Knochenmark-Abschnitt wird entweder mit der
a.p.-p.a.- oder mit der schrägen Gegenfeld-Methode eine Einzeldosis
von 1000 Gy appliziert. Zur Vorbereitung einer mit einer
hohen Dosis bestrahlten Nische könnte eine fraktionierte
Strahlentherapie besser geeignet und möglicherweise für
den Menschen besser veträglich sein. Den grundlegenden
Parametern der menschlichen Strahlenbiologie zufolge
sollten 500 cGy täglich zwei Tage lang oder 300 cGy
täglich zehn Tage lang dasselbe Wirkungsäquivalent wie
eine Einzeldosis von 1000 cGy haben (siehe Fletcher,
Hrsg., Textbook of Radiotherapy, 1980, 3. Aufl., Lee und
Febinger, Phila, Kap. 2, S. 180-219). (Eine
Bestrahlungsdosis von 1000 cGy auf einen einzelnen
Hüftbeinkamm läßt keine negativen Wirkungen erwarten; sie
wird häufig zur palliativen Strahlentherapie eines
einzelnen Knochens mit schmerzhaften Metastasen
verwendet.) Am Tag nach der Bestrahlung des Hüftbeinkarnms
mit einer Einzeldosis wird den Patienten eine intravenöse
Infusion mit einer Einzelzellsuspension von autologen
Mark-Stromazellen appliziert, die das Gen für den
menschlichen Faktor VIII-C exprimieren. Das Plasma des
Patienten wird dann wöchentlich auf nachweisbare Mengen an
menschlichem Faktor VIII-C untersucht.
Änderungen im Protokoll
-
Es wird erwartet, daß eine Erzeugung des menschlichen
Faktors VIII-C durch eingepflanzte autologe Stromazellen
nachgewiesen werden kann, wenn die zur Injektion gewählte
Zellzahl von 1 x 10&sup8; zur selektiven Einnistung in die mit
einer hohen Dosis bestrahlte Nische hinreichend ist. Kann
der Faktor VIII-C im Plasma nicht nachgewiesen werden, so
muß überprüft werden, ob eine ausreichende Einnistung an
der bestrahlten Stelle erfolgt ist.
-
Durch Markieren der Spender-Stromazellen mit
Indiumoxin vor der Einpflanzung wird bei den Patienten die
Einnistung in vivo überwacht. 24 Stunden nach der
Einpflanzung wird eine Ganzkörperaufnahme mit einer
gamma-Kammera durchgeführt, um festzustellen, ob sich die Zellen
vorzugsweise in dem mit einer hohen Dosis bestrahlten
Knochen eingenistet haben. Die im Mäusemodell
durchgeführten Tests haben bereits gezeigt, daß das mit
einer hohen Dosis bestrahlte Bein die injizierten
Stromazellen bevorzugt aufnimmt und daß die Indium-
Markierung 48 Stunden lang stabil bleibt. Es werden
ähnliche Indiumoxin-Dosen verwendet wie bei
nuklearmedizinischen lymphoszintillatographischen
Aufnahmemethoden der Wanderung der Leukozyten bei der
Hodgkin-Krankheit und in Studien über die
Erythrozytensequestrierung bei Patienten mit myeloischer
Metaplasie und Myelofibrose.
-
Wenn zwar anfänglich gewisse Mengen an Faktor VIII-C
im Plasma nachgewiesen werden, die sich aber dann schnell
verringern, muß festgestellt werden, ob eine Instabilität
der Zelleinpflanzung oder der Vektor-Expression für das
Mißlingen ursächlich ist. Die Vektor-Instabilität kann
durch Standard-Methoden behoben werden, d.h. durch Ersatz
oder Abänderung des Vektors für die Expression in vitro
des Gens für den Faktor VIII-C; etwaige Modifikationen
nutzen Ergebnisse aus Arbeiten mit frisch explantierten
menschlichen Mark-Zellinien oder klonischen menschlichen
Mark-Stromazellinien. Die Instabilität der Einpflanzung
wird durch in vivo-Versuche unter Verwendung von mit S³&sup5;
markierten menschlichen Mark-Stromazellen festgestellt,
die in vivo eingepflanzt und 100 Tage lang beobachtet
worden sind, wobei diese Zeitspanne der Halbwertzeit des
S³&sup5; entspricht. Dem anfänglichen Nachweis von S³&sup5; in dem
mit einer hohen Dosis bestrahlten Knochen sollte der
100 Tage lang aufrechterhaltene Nachweis in diesem mit
hoher Dosis bestrahlten Bereich folgen; eine Abnahme des
durch Aufnahme nachweisbaren S³&sup5; würde auf die Instabilität
der Zellen am Einpflanzungsort hindeuten. In diesem Fall
können andere Verfahren zur Vorbereitung der Nische
angewandt werden, obwohl erwartet wird, daß nach einer
Bestrahlung mit 1000 cGy die Einpflanzung hinreichend
eingenistet und stabil ist.
-
Werden trotz hinreichender Einpflanzung der
Stromazellen in den mit einer hohen Dosis bestrahlten
Knochen und stabiler Vektor-Expression keine ausreichenden
Mengen an Faktor VIII-C gemessen, so kann dies mit einer
unzureichenden relativen Anzahl an Stromazellen
zusammenhängen. Dieses Problem kann durch Vorbereitung
mehrerer Nischen gelöst werden, wie sie bei dem S1/S1d-
Mausmutant-Modell benötigt wurden. Nach diesem Verfahren
werden beide Hüftbeinkamme oder ein Hüftbeinkamm und ein
Oberschenkelknochen unter Verwendung desselben
Bestrahlungsplans mit hoher Dosis, eines fraktionierten
Bestrahlungsplans wie oben beschrieben, als große Nischen
vorbereitet. Sodann werden einzelne oder mehrfache
Einimpfungen mit Spender-Stromazellen aus menschlichen
Mark-Kulturen, welchen das Gen für den Faktor VIII-C durch
Transfektion übertragen worden war und die dieses
exprimieren, durchgeführt.
Andere Verfahren zum Einschleusen des Gens für den
Faktor VIII-C in menschliche Stromazellen
-
Virale Vektoren, die das Gen für den Faktor VIII-C
tragen, können entweder durch Infektion oder durch
Transfektion in die menschlichen Stromazellen
eingeschleust werden. Die rekombinante virale DNS kann in
Anwesenheit eines bereitgestellten Helfervirus repliziert
und in infektiöse Viruspartikel verpackt werden, oder sie
kann in einem virusvermehrenden Stamm repliziert werden,
der einen Defekt bei der Verpackung aufweist. Infektiöse
Viren können z.B. in einer Mäuse-NIH/3T3- oder einer
Mäuse-Ψ&sub2;-Zellinie vermehrt werden, in die eine
rekombinante virale DNS durch Transfektion übertragen
wurde. Die Zellen können wie in Cepko et al., 1984,
Cell 37, S. 1057 beschrieben vermehrt werden und die
Infektionen werden in Anwesenheit von 8 ug/ml Polybrene
(Sigma) durchgeführt.
-
Einzelsträngige RNS-Moleküle enthaltende Retroviren
können zur viralen Infektion eingesetzt werden; ihre RNS
wird intrazellulär in doppelsträngige provirale DNS
umgewandelt, die nach der Verdoppelung einer der
terminalen Regionen der viralen Sequenz zwecks Erzeugung
der LTR-Regionen ("long terminal repeats") in das Genom
der Wirtszelle integriert wird. Helfer-freie
Stammsuspensionen der rekombinanten Retroviren werden in
Helfer-Zellinien nach Transfektion mit dem rekombinanten
retroviralen Vektor erhalten. Die Helfer-Zellinien
enthalten eine Kopie des retroviralen Genoms in
integrierter Form. Das Provirus stellt zwar alle
Funktionen bereit, die für die Durchführung der
Replikation und der Verpackung eines rekombinanten Genoms
benötigt werden, weist aber einen Defekt bei der Fähigkeit
auf, die eigene RNS zu verpacken.
-
Plasmidvektoren, die aus SV40 abgeleitet sind, können
in COS-Zellen von Affen extrachromosomal replizieren
(Gluzman, 1981, Cell 23, S. 175). Vektoren, die in einer
Vielzahl eukaryontischer Zellen (z.B. in menschlichen
Zellen, in Zellen vom Affen, vom Hund) autonom replizieren
können, werden in Pouwels et al., Hrsgg., "Cloning
vectors", 1985, Elsevier Sci. Pub., B.V. beschrieben.
-
Vektoren ohne Replikon für tierische Zellen haben in
der Regel einen Replikon für E. coli. Solche Vektoren,
ebenfalls in Pouwels et al. beschrieben, können in
tierischen Zellen nicht extrachromosomal replizieren; nur
bei Integration in das Genom der Wirtszelle und Expression
eines selektierbaren Markers können Transformanten
isoliert werden. Eine detaillierte Beschreibung der
Vektoren für tierischen Zellen findet sich in Rigby, 1983,
J. Gen. Virol. 64, S. 255; und Subramani et al., 1983,
Anal. Biochem. 135, S. 1.
-
Bei der Selektion stabiler Transformanten können
verschiedene genetische Marker verwendet werden, z.B. das
Resistenz gegen Mycophenolsäure codierende gpt-Gen aus
E. coli, das Resistenz gegen das Antibiotikum G418
codierende neo-Gen aus TN5, die dhfr-Sequenz aus
Mäusezellen oder aus E. coli, welche den Phenotyp der
DHFR&supmin;-Zellen in DHFR&spplus;-Zellen umwandelt, und das tk-Gen aus
dem Herpes-simplex-Virus, welches aus TK&supmin;-Zellen
phenotypische TK&spplus;-Zellen macht.
-
Es können stabile menschliche Stromazellinien
konstruiert werden, die das in Frage kommende Gen in
effizienter Weise exprimieren können, indem das Gen unter
die Kontrolle eines starken Promotors gestellt wird, z.B.
des "frühen"- bzw. "späten"-Promotors aus SV40 (pSV40E,
pSV40L), des Haupt-"späten"-Promotors von Adenoviren
(pAdml), des Promotors eines ein 7,5 KD-Protein codierenden
Vakzinia-Gens (p7,5) und des Promotors des Metallothionein-
Gens der Maus (pMT).
-
Ein weiterer Vektor, der zur Transfektion eines
erwünschten Gens in Frage kommt, ist der retrovirale
Vektor pN2-FAT (Garver et al., 1987, s.o.), welcher den
die Transkription des eingeführten Gens steuernden
"frühen"-Promotor aus SV40 trägt; in diesem Fall des
menschliches α&sub1;-Antitrypsin codierenden Gens. Das Gen für
α&sub1;-Antitrypsin kann entfernt und durch ein erwünschtes Gen
ersetzt werden, indem man den Vektor mit den
Restriktionsenzymen HindIII und XhoI (partiell) spaltet
und bei Bedarf diese Enden oder die Enden des eingeführten
Gens nach herkömmlichen Methoden modifiziert.
-
Gentransfer mittels Retroviren kann durch ein
beliebiges geeignetes Verfahren durchgeführt werden, z.B.
wie es Wilson et al., 1988, Proc. Nat. Aca. Sci. 85,
S. 3014 zum Einschleusen eines Gens in die Hepatozyten
erwachsener Ratten unter Verwendung eines bei der
Replikation defekten Retrovirus beschrieben haben.
Tabelle 1
Tabelle 1 Identifizierung der vom Spender stammenden
Stromazellen im Knochenmark, das aus einer
Transplantation unterzogenen Mäusen explantiert wurde
Vom Spender stammende Glu6PI-a&spplus;-Zellen, %
Explantate* aus adhärenten Stromazellen pro Bein, %
Zeit, Monate
injizierte GB1/6-Zellen pro Maus
Rechtes
Linkes
Adhärente&spplus; Stromazellen aus LMBCs des rechten Beins
nicht getestet
Tabelle 2
Tabelle 2 Rückgewinnung der vom Spender stammenden
GB1neor-Zellen in Kulturen, die aus einer Transplantation
unterzogenen Mäusen explantiert wurden
Stromakolonien pro Hinterbein*, Anzahl
G418-resistente Stromakolonien pro Hinterbein&spplus;, Anzahl
Gruppe
Rechtes
Linkes
zur Kontrollebestrahlt
einer Transplantation unterzogen
Tabelle 3
Tabelle 3 Hämopoetische Erholung bei C57BL/6J-Mäusen, denen
eine GB1/6-Stromazellenlinie transplantiert wurde
Peripheres Blutbild am. 42 Tag nach der Bestrahlung&spplus;&spplus;
Ganzkörperdosis*, Gy
CFU-S pro rechtes Hinterbein+, Anzahl
WBC: white blood cells = Leukozytenzahl
PLT: platelets = Thrombozytenzahl
RBC: red blood cells = Erythrocytenzahl
Tabelle 4
kumulativ (7 Wochen)
Stroma-Zell-linien
Parentalzellen
"Pflasterstein-Inseln" / Flasche
nicht-adhärente Zellen / Flasche
Parentalzellen / Flasche x 10³
nicht getestet