JP2865354B2 - 基質細胞を用いた遺伝子治療 - Google Patents
基質細胞を用いた遺伝子治療Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、遺伝的欠陥を正すための組換え技術の使
用に関するものである。
用に関するものである。
（従来の技術） Ａ型血友病は、特定の凝固タンパク質、VIII-C因子の
欠陥または異常によつておこる出血異常であり、100,00
0人男性中10-20人の割合でおこる。これに苦しむ人々は
コントロールされていない出血症状の発現に悩んでお
り、今のところヒト血漿由来のVIII-C因子濃縮液によつ
て治療されている。組換えDNA技術が、培養細胞から精
製されたヒトVIII-C因子の供給に有効であり、血友病の
他に採りうる治療法として提案された（トール（Tool
e）ら、1984、ネイチアー（Nature）312:342）。
欠陥または異常によつておこる出血異常であり、100,00
0人男性中10-20人の割合でおこる。これに苦しむ人々は
コントロールされていない出血症状の発現に悩んでお
り、今のところヒト血漿由来のVIII-C因子濃縮液によつ
て治療されている。組換えDNA技術が、培養細胞から精
製されたヒトVIII-C因子の供給に有効であり、血友病の
他に採りうる治療法として提案された（トール（Tool
e）ら、1984、ネイチアー（Nature）312:342）。
ルイス（Louis）ら（1988、Proc.Nat.Aca.Sci.85:315
0）は、ヒトIX因子cDNAを含む組換えレトロウイルスに
感染した、ネズミ初代培養皮膚線維芽細胞をコラーゲン
中に包埋してネズミの表皮に植えつけ、血清中のヒトIX
因子を10-12日間検出した。
0）は、ヒトIX因子cDNAを含む組換えレトロウイルスに
感染した、ネズミ初代培養皮膚線維芽細胞をコラーゲン
中に包埋してネズミの表皮に植えつけ、血清中のヒトIX
因子を10-12日間検出した。
ガーバー（Garver）ら（1987、サイエンス（Scienc
e）237:762）は、ヒトα１−抗トリプシンをコードする
組換えDNAを含む、ハツカネズミ線維芽細胞をヌードマ
ウスの腹腔内に移植し、血清と肺の上皮表面にヒトα
１−抗トリプシンを検出した。ガーバー（Garver）ら
は、“線維芽細胞のような標的細胞中での遺伝子発現の
レベルは一般に霊長類の骨髄幹細胞より良い”ことを観
察した。
e）237:762）は、ヒトα１−抗トリプシンをコードする
組換えDNAを含む、ハツカネズミ線維芽細胞をヌードマ
ウスの腹腔内に移植し、血清と肺の上皮表面にヒトα
１−抗トリプシンを検出した。ガーバー（Garver）ら
は、“線維芽細胞のような標的細胞中での遺伝子発現の
レベルは一般に霊長類の骨髄幹細胞より良い”ことを観
察した。
（発明が解決しようとする課題） 概して本発明は、欠陥に苦しむ患者のために、生物学
的に活性のある酵素を産生させ、患者の血流内に分泌す
る方法を特色とする；この方法は、その酵素をコードす
る遺伝子でトランスフエクトされた、供給骨髄基質細胞
を、患者の骨腔表面に付着して活性のある酵素を産生、
分泌できるよう患者に導入することを含んでいる。
的に活性のある酵素を産生させ、患者の血流内に分泌す
る方法を特色とする；この方法は、その酵素をコードす
る遺伝子でトランスフエクトされた、供給骨髄基質細胞
を、患者の骨腔表面に付着して活性のある酵素を産生、
分泌できるよう患者に導入することを含んでいる。
（課題を解決するための手段） 好ましい態様において、トランスフエクトされる遺伝
子はリンフオカイン、成長因子、造血因子、あるいは凝
血因子のような他の血液関連タンパク質、例えばヒトVI
II-C因子や抗トロンビンIIIなどをコードする。植えら
れた供給細胞の免疫的拒絶を最小にするため、供給基質
細胞は、好ましくは自己由来細胞、即ち受容細胞と遺伝
的に同一であるような細胞である；もし供給細胞が自己
由来でない場合は、不要な免疫反応を避けるため、好ま
しくは受容者に充分遺伝的に相似であるような細胞；即
ち組織適合性の（histo-compatible）細胞が使われてよ
い。自己性の、あるいは組織適合性の細胞の使用は、受
容者の一般的な免疫抑制を不必要にする。
子はリンフオカイン、成長因子、造血因子、あるいは凝
血因子のような他の血液関連タンパク質、例えばヒトVI
II-C因子や抗トロンビンIIIなどをコードする。植えら
れた供給細胞の免疫的拒絶を最小にするため、供給基質
細胞は、好ましくは自己由来細胞、即ち受容細胞と遺伝
的に同一であるような細胞である；もし供給細胞が自己
由来でない場合は、不要な免疫反応を避けるため、好ま
しくは受容者に充分遺伝的に相似であるような細胞；即
ち組織適合性の（histo-compatible）細胞が使われてよ
い。自己性の、あるいは組織適合性の細胞の使用は、受
容者の一般的な免疫抑制を不必要にする。
好ましは、供給基質細胞が動物内に導入されるとただ
ちに、それらの細胞が移動する受容骨地点を照射（好ま
しくはＸ線照射）することによつて、供給基質細胞と受
容骨の間の相互作用は、付着と安定な移植が容易となる
よう変化をうける。使われるＸ線照射の線量は、急速に
分裂する細胞の大多数がその部分から一掃されるよう
に、造血細胞を殺すのには充分高く、しかしそれら基質
細胞の死は避ける程度には低い。その部分は、好ましく
は大腿骨、脛骨、あるいは肋骨のような長骨である。
ちに、それらの細胞が移動する受容骨地点を照射（好ま
しくはＸ線照射）することによつて、供給基質細胞と受
容骨の間の相互作用は、付着と安定な移植が容易となる
よう変化をうける。使われるＸ線照射の線量は、急速に
分裂する細胞の大多数がその部分から一掃されるよう
に、造血細胞を殺すのには充分高く、しかしそれら基質
細胞の死は避ける程度には低い。その部分は、好ましく
は大腿骨、脛骨、あるいは肋骨のような長骨である。
本発明は、VIII因子遺伝子の受容者への移植方法が、
VIII因子遺伝子を発現できる細胞の自己移植によるもの
であるが故に、再補充されたVIII因子に対する不要な免
疫反応をひきおこすことなしに、VIII因子欠陥血友病の
治療に用いられることが可能である。これは深刻な不利
益をもたらす他の血友病治療法と好対照を示す。例えば
ヒト血漿は、非効率的かつ高価なVIII因子源で、わずか
100-200ng/mlのタンパク質を含んでいるにすぎない（フ
エイ（Fay）ら、1982、Proc.Nat.Aca.Sci.79:7200）。
利用できる療法は、それなりに有効ではあるが、非常に
高価であり、高い感染の危険が伴う。現在入手できる血
漿由来製品はひどく不純で（＜１％VIII因子）、たいて
い数千人の供血者に由来するプールされた血漿ロツトか
らつくられる。これらの製品はタンパクの沈降によつて
生ずるあらゆる深刻な合併症を伴つており、しばしば肝
炎ウイルスやヒト免疫不全ウイルス、後天性免疫不全症
候群（エイズ）などの不定要因で汚染されている。組換
え体VIII因子は、ヒトVIII-C遺伝子でトランスフエクト
された真核細胞によつて産生されたが（ウツド（Wood）
ら、1984、ネイチアー（Nature）312:330;トール（Tool
e）ら、同上）、均質にまで精製されてなく、それはお
そらく自然のヒトVIII因子とは例えば免疫原性（immuno
genic）であるかもしれないグリコシル化のパターンな
どにおいて異なるせいであろう。
VIII因子遺伝子を発現できる細胞の自己移植によるもの
であるが故に、再補充されたVIII因子に対する不要な免
疫反応をひきおこすことなしに、VIII因子欠陥血友病の
治療に用いられることが可能である。これは深刻な不利
益をもたらす他の血友病治療法と好対照を示す。例えば
ヒト血漿は、非効率的かつ高価なVIII因子源で、わずか
100-200ng/mlのタンパク質を含んでいるにすぎない（フ
エイ（Fay）ら、1982、Proc.Nat.Aca.Sci.79:7200）。
利用できる療法は、それなりに有効ではあるが、非常に
高価であり、高い感染の危険が伴う。現在入手できる血
漿由来製品はひどく不純で（＜１％VIII因子）、たいて
い数千人の供血者に由来するプールされた血漿ロツトか
らつくられる。これらの製品はタンパクの沈降によつて
生ずるあらゆる深刻な合併症を伴つており、しばしば肝
炎ウイルスやヒト免疫不全ウイルス、後天性免疫不全症
候群（エイズ）などの不定要因で汚染されている。組換
え体VIII因子は、ヒトVIII-C遺伝子でトランスフエクト
された真核細胞によつて産生されたが（ウツド（Wood）
ら、1984、ネイチアー（Nature）312:330;トール（Tool
e）ら、同上）、均質にまで精製されてなく、それはお
そらく自然のヒトVIII因子とは例えば免疫原性（immuno
genic）であるかもしれないグリコシル化のパターンな
どにおいて異なるせいであろう。
本発明はさらに、寿命が長く、急速に分裂しない、そ
してそれ故移植後に長い期間望む酵素を発現、分泌させ
ることができる、基質細胞を有効的に使用している。
してそれ故移植後に長い期間望む酵素を発現、分泌させ
ることができる、基質細胞を有効的に使用している。
本発明の他の特色と有効性は、以下の好ましい態様の
記述と請求とから明らかになるだろう。
記述と請求とから明らかになるだろう。
まず簡単に図を説明する。
図１は、植えつけ後１カ月で移植された供給マウスか
ら（上）、又は非移植・照射マウスから（下）、外植
（explanted）された付着細胞の図である。
ら（上）、又は非移植・照射マウスから（下）、外植
（explanted）された付着細胞の図である。
図２はS1/S1dマウスから確立されたLTBMCからの造血
原細胞の成長の図式である。
原細胞の成長の図式である。
図３は、ヒトVIII因子を含むレトロウイルスベクター
の図式的表示である。
の図式的表示である。
上で述べられているように、ヒトVIII-C因子遺伝子を
含むベクターで自己性ヒト基質細胞をトランスフエクト
し、その後それらのトランス−フエクトされた基質細胞
を適切に準備された患者、例えば長骨の標的部位の照射
を行つた患者に植えつける、本発明に従えば、例えば正
常VIII-C因子の欠陥によつて生ずる血友病のような、正
常に機能する酵素の欠陥によつておこる遺伝的欠陥疾患
で苦しむ患者は、治療可能である。
含むベクターで自己性ヒト基質細胞をトランスフエクト
し、その後それらのトランス−フエクトされた基質細胞
を適切に準備された患者、例えば長骨の標的部位の照射
を行つた患者に植えつける、本発明に従えば、例えば正
常VIII-C因子の欠陥によつて生ずる血友病のような、正
常に機能する酵素の欠陥によつておこる遺伝的欠陥疾患
で苦しむ患者は、治療可能である。
本発明に従つたヒト血友病の治療過程を詳細にわたつ
て記述する前に、用いられる技術のいくつかを可能にす
る目的で、ネオマイシン耐性基質細胞がマウスに植えつ
けられた実験について述べる；この仕事はアンクレサリ
ア（Anklesaria）ら（1987）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
4、7681による、以前の発表内に記載されている。その
後形質転換成長因子−α（Transforming Growth Factor
-α、TGF-α）をコードする遺伝子によるネズミ（murin
e）基質細胞のトランスフエクシヨンと、それに続く、
それら基質細胞の植えつけが述べられる；植えつけられ
た細胞は、導入された遺伝子にコードされているTGF-α
を発現・分泌することが見い出された。最後に、まずVI
I因子遺伝子を含む基質細胞をマウスに植えつけて始ま
り、続いてVIII因子を含む自己ヒト細胞をヒト患者に植
えつける。本発明に従つたヒト血友病の治療過程で記述
される。
て記述する前に、用いられる技術のいくつかを可能にす
る目的で、ネオマイシン耐性基質細胞がマウスに植えつ
けられた実験について述べる；この仕事はアンクレサリ
ア（Anklesaria）ら（1987）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
4、7681による、以前の発表内に記載されている。その
後形質転換成長因子−α（Transforming Growth Factor
-α、TGF-α）をコードする遺伝子によるネズミ（murin
e）基質細胞のトランスフエクシヨンと、それに続く、
それら基質細胞の植えつけが述べられる；植えつけられ
た細胞は、導入された遺伝子にコードされているTGF-α
を発現・分泌することが見い出された。最後に、まずVI
I因子遺伝子を含む基質細胞をマウスに植えつけて始ま
り、続いてVIII因子を含む自己ヒト細胞をヒト患者に植
えつける。本発明に従つたヒト血友病の治療過程で記述
される。
実施例１ アンクレサリア（Anklesaria）らの実験 長期性細胞培養 B6D2F1（C57BL/6J×DBA/2J）マウス（ジヤクソン ラ
ボラトリー（Jackson Laboratories）バーハーバー（Ba
r Harbor）、メイン（Maine））が長期性骨髄培養（lon
g term bone marrow cutures（LTBMC））に使われた。
フイツシヤー培地（ギブコ Gibco）の入つた25cmコー
ニングフラスコ内に大腿骨と脛骨の細胞内容物が入れら
れ、25％ウマ血清（ハゼルトン Hazelton）と10-6Ｍの
ハイドロコルチゾンコハク酸ナトリウムが加えられた。
２週間後ウマ血清に代わつて胎児性コウシ血清が用いら
れた。この方法は、培地の寿命を延ばすものとして示さ
れた（サカキーニ Sakakeenyら、1982、J.Nat.Cancer
Inst.68:305）。LTBMCは培養７日後から連続して３週
間、純粋欠陥ウイルスとしてパツケージされたウイルス
と２μg/mlのポリブレン（polybrene）（シグマ Sigm
a）を含んだウイルス上澄で感染させられた。
ボラトリー（Jackson Laboratories）バーハーバー（Ba
r Harbor）、メイン（Maine））が長期性骨髄培養（lon
g term bone marrow cutures（LTBMC））に使われた。
フイツシヤー培地（ギブコ Gibco）の入つた25cmコー
ニングフラスコ内に大腿骨と脛骨の細胞内容物が入れら
れ、25％ウマ血清（ハゼルトン Hazelton）と10-6Ｍの
ハイドロコルチゾンコハク酸ナトリウムが加えられた。
２週間後ウマ血清に代わつて胎児性コウシ血清が用いら
れた。この方法は、培地の寿命を延ばすものとして示さ
れた（サカキーニ Sakakeenyら、1982、J.Nat.Cancer
Inst.68:305）。LTBMCは培養７日後から連続して３週
間、純粋欠陥ウイルスとしてパツケージされたウイルス
と２μg/mlのポリブレン（polybrene）（シグマ Sigm
a）を含んだウイルス上澄で感染させられた。
LTBMCの確立後61日目に、0.25％トリプシン（ギブコ
GIBCO）処理によつて代表的なLTBMCフラスコから付着
細胞がはずされて8mlのフイツシヤー培地（ギブコ）の
入つた25cm2フラスコ（フアルコン Falcon）に３×106
又は１×106細胞のいずれかの割合で入れられ、熱で非
活性化した胎児性コウシ血清（FCS）（ハゼントン Haz
elton）25％と、10-6Ｍのハイドロコルチゾンコハク酸
ナトリウムが追加された。培養細胞は33％Ｃ、７％CO2
で保持され週毎に同じ密度で継代（passage）される。
８継代目（passage 8）に各々の発育した細胞株は特定
の希釈培数でプレートされ、ペニシリンダーを用いてク
ローン化され、コロニー由来の単細胞が分離される。そ
の後の細胞株はそれぞれ更に特定の希釈で２回サブクロ
ーンされる。細胞株はそれらが密集状態に達すると接触
が禁じられた。テストされた基質細胞株はすべてマイコ
プラズマも、逆転写酵素も持たないことが判明した。逆
転写酵素活性はグリーンバーガー（Green berger）の、
1984、ゴルデ（Golde）（編集）Meth.Hemotol.11、N.
Y.;チヤーチルリビングストン（Churchill Livingsto
n）、P.202、に記載されている方法に従つてNIH/3T3細
胞を負のコントロールとして用いて測定された。
GIBCO）処理によつて代表的なLTBMCフラスコから付着
細胞がはずされて8mlのフイツシヤー培地（ギブコ）の
入つた25cm2フラスコ（フアルコン Falcon）に３×106
又は１×106細胞のいずれかの割合で入れられ、熱で非
活性化した胎児性コウシ血清（FCS）（ハゼントン Haz
elton）25％と、10-6Ｍのハイドロコルチゾンコハク酸
ナトリウムが追加された。培養細胞は33％Ｃ、７％CO2
で保持され週毎に同じ密度で継代（passage）される。
８継代目（passage 8）に各々の発育した細胞株は特定
の希釈培数でプレートされ、ペニシリンダーを用いてク
ローン化され、コロニー由来の単細胞が分離される。そ
の後の細胞株はそれぞれ更に特定の希釈で２回サブクロ
ーンされる。細胞株はそれらが密集状態に達すると接触
が禁じられた。テストされた基質細胞株はすべてマイコ
プラズマも、逆転写酵素も持たないことが判明した。逆
転写酵素活性はグリーンバーガー（Green berger）の、
1984、ゴルデ（Golde）（編集）Meth.Hemotol.11、N.
Y.;チヤーチルリビングストン（Churchill Livingsto
n）、P.202、に記載されている方法に従つてNIH/3T3細
胞を負のコントロールとして用いて測定された。
２つのクローナル ネズミ（murine）骨髄基質細胞
株、GBL/6とGBL/6neorが、B6.型（GPIA（Glu 6PI-α、
Ｄ−グルコース−６−ケトリン酸−イソメラーゼD-gluc
ose-6-phosphate ketol-isomerase EC5.3.1.9）ネズミ
（グリーンバーガー（Green berger）、1978、ネイチヤ
ーNature 275:752）の連続した骨髄培養組織から発育さ
れた。内皮様特徴と、インビトロで多型潜在性の（mult
ipotential）造形原細胞を維持できることから、GBL/6
細胞株がこれらの研究用に選択された。
株、GBL/6とGBL/6neorが、B6.型（GPIA（Glu 6PI-α、
Ｄ−グルコース−６−ケトリン酸−イソメラーゼD-gluc
ose-6-phosphate ketol-isomerase EC5.3.1.9）ネズミ
（グリーンバーガー（Green berger）、1978、ネイチヤ
ーNature 275:752）の連続した骨髄培養組織から発育さ
れた。内皮様特徴と、インビトロで多型潜在性の（mult
ipotential）造形原細胞を維持できることから、GBL/6
細胞株がこれらの研究用に選択された。
安定したクローナル基質細胞株GBL/6はGlu 6PIのαイ
ソメラーゼを発現する。
ソメラーゼを発現する。
パース（Peares）、1986、Histochem.,I、チヤーチル
（Churchill）、ロンドン（London）、3rd ed.に記述さ
れているように、この細胞株はアルカリフオスフアター
ゼ、酸フオスフアターゼ、ペルオキシターゼ、α−ナフ
チルエステラーゼ、そしてライソザイムを染色して特徴
づけられた。細胞外殻マトリツクスタンパク質であるラ
ミニン（laminin）、フイブロネクチン（fibronectin）
（コラボレーテイブ・リサーチ Collaborative Resear
ch,ワルサム Walthum,マサチユーセツツMA）、コラー
ゲンＩ型とIV型、そしてアロ酵素マーカーのGlu 6 PI-
α（チヤールズ Charlesら、1980、Mol.Cell.Biochem.
28:11）などに対する抗血清がGBL/6細胞株内の各タンパ
ク質を同定するため、それぞれの特異的抗血清とハジ
（Hadji）ら、1983、Lab.Med.14:767の免疫ペルオキシ
ダーゼ（immune peroxidase）法を用いて使用された。G
BL/6細胞はフイブロネクチン＋、ラミニン＋、そしてコ
ラーゲンIV型＋、コラーゲンＩ型−であつた。免疫血液
学的研究用に脛骨近位端が集められ、縦に割られて、２
％パラフオルムアルデヒド/0.1Mカコデイレート（cacod
ylate）バツフアー、pH7.4中で18時間固定された。骨は
0.3M EDTA/0.1Mカコデイレートバツフアー、pH7.4中で
４日間脱カルシウムが行われた。パラフインに埋められ
た骨は５μｍの厚さに切断されて、マウスGlu 6 PI-α
に対するウサギ抗血清との反応性と、間接性免疫ペルオ
キシダーゼ染色性を調べるため染色された。
（Churchill）、ロンドン（London）、3rd ed.に記述さ
れているように、この細胞株はアルカリフオスフアター
ゼ、酸フオスフアターゼ、ペルオキシターゼ、α−ナフ
チルエステラーゼ、そしてライソザイムを染色して特徴
づけられた。細胞外殻マトリツクスタンパク質であるラ
ミニン（laminin）、フイブロネクチン（fibronectin）
（コラボレーテイブ・リサーチ Collaborative Resear
ch,ワルサム Walthum,マサチユーセツツMA）、コラー
ゲンＩ型とIV型、そしてアロ酵素マーカーのGlu 6 PI-
α（チヤールズ Charlesら、1980、Mol.Cell.Biochem.
28:11）などに対する抗血清がGBL/6細胞株内の各タンパ
ク質を同定するため、それぞれの特異的抗血清とハジ
（Hadji）ら、1983、Lab.Med.14:767の免疫ペルオキシ
ダーゼ（immune peroxidase）法を用いて使用された。G
BL/6細胞はフイブロネクチン＋、ラミニン＋、そしてコ
ラーゲンIV型＋、コラーゲンＩ型−であつた。免疫血液
学的研究用に脛骨近位端が集められ、縦に割られて、２
％パラフオルムアルデヒド/0.1Mカコデイレート（cacod
ylate）バツフアー、pH7.4中で18時間固定された。骨は
0.3M EDTA/0.1Mカコデイレートバツフアー、pH7.4中で
４日間脱カルシウムが行われた。パラフインに埋められ
た骨は５μｍの厚さに切断されて、マウスGlu 6 PI-α
に対するウサギ抗血清との反応性と、間接性免疫ペルオ
キシダーゼ染色性を調べるため染色された。
優性（dominant）選択マーカーを持つ基質細胞株を確
立するため、ホ乳動物細胞に抗生物質、G418耐性（G418
ｒ）を与える優性選択マーカーをコードするネオマイシ
ン耐性遺伝子が、レトロウイルスのベクターを用いて最
初はNIH/3T3細胞に、その後細胞株GBL/6にトランスフエ
クトされた。トランスフエクシヨンはリン酸カルシウム
沈降法によつた（グラハム Grahamら、1973、Virol.5
2:456）。
立するため、ホ乳動物細胞に抗生物質、G418耐性（G418
ｒ）を与える優性選択マーカーをコードするネオマイシ
ン耐性遺伝子が、レトロウイルスのベクターを用いて最
初はNIH/3T3細胞に、その後細胞株GBL/6にトランスフエ
クトされた。トランスフエクシヨンはリン酸カルシウム
沈降法によつた（グラハム Grahamら、1973、Virol.5
2:456）。
ベクターpZIP-Neo（SV）（Ｘ）DNA（下参照）10μｇ
がマウスNIH/3T3細胞をトランスフエクトするのに用い
られた。このベクターはSV40プロモーターのコントロー
ル下にネオマイシン耐性遺伝子を持つている。トランス
フエクトされた細胞株は625μg/mlのG418（ギブコ）で
選択され、個々のG418ｒコロニーをクローニングして、
ウイルスを高いタイマー値で産生するクローンが分離さ
れた。欠陥ウイルスを産生する細胞株で、テストされた
19コから常に３×106 G418r CFU/mlの高いウイルスタ
イター値を示す１コが選択され、長期間骨髄培養の感染
に使用された。この上澄はpSVX-neorウイルスと命名さ
れた。pSVX-neorウイルスはGBL/6細胞の感染に用いられ
た。サブクローンのGBL neorは500μg/mlG418中で選択
され、インビトロで増殖された。GBL/6 neor細胞はGBL/
6細胞と判別不能な細胞化学的（cytochemical）特徴と
細胞外殻マトリツクスタンパクを持つていた。
がマウスNIH/3T3細胞をトランスフエクトするのに用い
られた。このベクターはSV40プロモーターのコントロー
ル下にネオマイシン耐性遺伝子を持つている。トランス
フエクトされた細胞株は625μg/mlのG418（ギブコ）で
選択され、個々のG418ｒコロニーをクローニングして、
ウイルスを高いタイマー値で産生するクローンが分離さ
れた。欠陥ウイルスを産生する細胞株で、テストされた
19コから常に３×106 G418r CFU/mlの高いウイルスタ
イター値を示す１コが選択され、長期間骨髄培養の感染
に使用された。この上澄はpSVX-neorウイルスと命名さ
れた。pSVX-neorウイルスはGBL/6細胞の感染に用いられ
た。サブクローンのGBL neorは500μg/mlG418中で選択
され、インビトロで増殖された。GBL/6 neor細胞はGBL/
6細胞と判別不能な細胞化学的（cytochemical）特徴と
細胞外殻マトリツクスタンパクを持つていた。
GBL/6細胞は、脾臓細胞と（CFU-S）、顆粒球、赤血
球、そしてマクロフアージ／巨核球（CFU-GEMM）のコロ
ニー形成単位（Colony-forming unit,CFU）を形成する
造形性基質細胞の成長を、インビトロで、検出可能な量
の成長因子、例えばインターロイキン３（マルチコロニ
ーステイミユレーテイングフアクター）、顆粒球マクロ
フアージコロニーステイミユレーテイングフアクター、
顆粒球ステイミュレーテイングフアクターなど、欠除し
た状態で維持する。
球、そしてマクロフアージ／巨核球（CFU-GEMM）のコロ
ニー形成単位（Colony-forming unit,CFU）を形成する
造形性基質細胞の成長を、インビトロで、検出可能な量
の成長因子、例えばインターロイキン３（マルチコロニ
ーステイミユレーテイングフアクター）、顆粒球マクロ
フアージコロニーステイミユレーテイングフアクター、
顆粒球ステイミュレーテイングフアクターなど、欠除し
た状態で維持する。
GBL/6細胞あるいはGBL/6-neor細胞の、インビトロに
おける造血細胞維持能力は、マルチ−CSF活性を持つい
かなる既知のヘマトポエチン（hematopoietin）の検出
可能量までの合成によるものではあり得ない。
おける造血細胞維持能力は、マルチ−CSF活性を持つい
かなる既知のヘマトポエチン（hematopoietin）の検出
可能量までの合成によるものではあり得ない。
GBL neor基質細胞から分離された全細胞性RNAを用い
て、塩酸グアニジン抽出法の変法によつてpoly(A)+のmR
NAが精製された（マニアテイス Maniatisら、1982、モ
レキユラークローニング Molecular Cloning:ラボマニ
ユアル A Lab.Manual,コールドスプリング ハーバー
ラボ Cold Spring Harbor Lab.、コールド スプリ
ング ハーバー、ニユーヨークNY）。インターロイキン
３（IL-3）（フアング Fungら、1984、ネイチアー Na
ture 307:233）、顆粒球／マクロフアージコロニーステ
イミユレーテイングフアクター（GM-CSF）（ガフ Goug
hら、1984、ネイチアー309:763）、マクロフアージコロ
ニーステイミユレーテイングフアクター（M-CSF）（カ
ワサキ Kawasakiら、1985、サイエンス Science 230:
291）、IL-1（アウロン Auronら、1984、PNAS 81:790
7）、そして顆粒球コロニーステイミユレーテイングフ
アクター（G-CSF）（イスチヤ Isuchiyaら、1986、PNA
S 83:7633）の特異的メツセージが、マニアテイスら、
同上、に記述されているような、特異的cDNAプローブ
（＞108cpm/μｇ）とのハイブリダイゼーシヨンによつ
て同定された。
て、塩酸グアニジン抽出法の変法によつてpoly(A)+のmR
NAが精製された（マニアテイス Maniatisら、1982、モ
レキユラークローニング Molecular Cloning:ラボマニ
ユアル A Lab.Manual,コールドスプリング ハーバー
ラボ Cold Spring Harbor Lab.、コールド スプリ
ング ハーバー、ニユーヨークNY）。インターロイキン
３（IL-3）（フアング Fungら、1984、ネイチアー Na
ture 307:233）、顆粒球／マクロフアージコロニーステ
イミユレーテイングフアクター（GM-CSF）（ガフ Goug
hら、1984、ネイチアー309:763）、マクロフアージコロ
ニーステイミユレーテイングフアクター（M-CSF）（カ
ワサキ Kawasakiら、1985、サイエンス Science 230:
291）、IL-1（アウロン Auronら、1984、PNAS 81:790
7）、そして顆粒球コロニーステイミユレーテイングフ
アクター（G-CSF）（イスチヤ Isuchiyaら、1986、PNA
S 83:7633）の特異的メツセージが、マニアテイスら、
同上、に記述されているような、特異的cDNAプローブ
（＞108cpm/μｇ）とのハイブリダイゼーシヨンによつ
て同定された。
GBL/6-neor細胞由来のmRNAは、既知の成長因子のpoly
（A+）mRNAについてRNAブロツトハイブリダイゼーシヨ
ンによつて分析された。GBL/6-neor細胞はIL-3、GM-CS
F、G-CSF、又はIL-1の検出可能なpoly（A+）mRNAを持た
ず、M-CSFの検出可能なmRNAを持つていた。GBL/6細胞は
構成的に（constitutively）マクロフアージ コロニー
ステイミユレーテイングフアクターを産生していた。
GBL/6細胞株の維持能力は、M-CSFがインビボとインビト
ロにおいて付属（accessary）細胞から他のCSFを放出さ
せる引きがねになることができることに起因するか、あ
るいは他の成長フアクターに起因するのかのどちらかで
あるかもしれない。
（A+）mRNAについてRNAブロツトハイブリダイゼーシヨ
ンによつて分析された。GBL/6-neor細胞はIL-3、GM-CS
F、G-CSF、又はIL-1の検出可能なpoly（A+）mRNAを持た
ず、M-CSFの検出可能なmRNAを持つていた。GBL/6細胞は
構成的に（constitutively）マクロフアージ コロニー
ステイミユレーテイングフアクターを産生していた。
GBL/6細胞株の維持能力は、M-CSFがインビボとインビト
ロにおいて付属（accessary）細胞から他のCSFを放出さ
せる引きがねになることができることに起因するか、あ
るいは他の成長フアクターに起因するのかのどちらかで
あるかもしれない。
付着性と非付着性の細胞がLTBMCから毎週とり除かれ
て、インビトロにおける、G418存在下、非存在下のCFU-
GEMMコロニー形成能がアツセイされた（ジヨンソン Jo
hnsonら、1977、Proc.Nat.Aca.Sci.74:3879;ナカハタ
Nakahataら、1982、Proc.Nat.Aca.Sci.79:3843）。G418
の各ロツトの生物学的活性が、非感染性培養細胞上のコ
ロニーアツセイで測定された。すべてのG418濃度はmlあ
たりの実際の重さで報告されたものである。原細胞アツ
セイは10％BSA（コウシ血清アルブミン bovine serum
albumin）、30％FBS（胎児性コウシ血清 fetal bovine
serum）、メチルセルロースを半固体ベースとして含ん
だ10-2M1−メルカプトエタノールの培地中で、３種類の
条件別培地:WEHI-3BCM（イーレ（Ihle）ら、1983、J.Im
munol.131:282）、Ｌ−細胞CMをマクロフアージコロニ
ーステイミユレーテイングフアクター（M-CSF）源とし
て（スタンレー Stanleyら、1977、J.Biol.Chem.252:4
305）、又は10％ポークウイード（pokeweed）マイトジ
エン誘発脾臓細胞CMと2.0μm/ml EPO（ハンフイリーズ
Humphriesら、1979、ブラツド Blood 53:746）が更
に加えられて行われた。
て、インビトロにおける、G418存在下、非存在下のCFU-
GEMMコロニー形成能がアツセイされた（ジヨンソン Jo
hnsonら、1977、Proc.Nat.Aca.Sci.74:3879;ナカハタ
Nakahataら、1982、Proc.Nat.Aca.Sci.79:3843）。G418
の各ロツトの生物学的活性が、非感染性培養細胞上のコ
ロニーアツセイで測定された。すべてのG418濃度はmlあ
たりの実際の重さで報告されたものである。原細胞アツ
セイは10％BSA（コウシ血清アルブミン bovine serum
albumin）、30％FBS（胎児性コウシ血清 fetal bovine
serum）、メチルセルロースを半固体ベースとして含ん
だ10-2M1−メルカプトエタノールの培地中で、３種類の
条件別培地:WEHI-3BCM（イーレ（Ihle）ら、1983、J.Im
munol.131:282）、Ｌ−細胞CMをマクロフアージコロニ
ーステイミユレーテイングフアクター（M-CSF）源とし
て（スタンレー Stanleyら、1977、J.Biol.Chem.252:4
305）、又は10％ポークウイード（pokeweed）マイトジ
エン誘発脾臓細胞CMと2.0μm/ml EPO（ハンフイリーズ
Humphriesら、1979、ブラツド Blood 53:746）が更
に加えられて行われた。
インビボにおけるCFU-Sアツセイがテイルとマツクロ
ツシユ（Till ＆ Mc Culloch）（1961;Radia.Res.14:21
3）によつて記述されたように行われた。各グループに
ついて、5-10匹のマウスが1000rad、140rad/min（セシ
ウム源）照射され、５×105細胞／マウスが注射され
た。原細胞を受けなかつたマウスは照射後12日以内に死
亡し、脾臓あたり≦0.1±0.3の内在性コロニーを持つて
いた。
ツシユ（Till ＆ Mc Culloch）（1961;Radia.Res.14:21
3）によつて記述されたように行われた。各グループに
ついて、5-10匹のマウスが1000rad、140rad/min（セシ
ウム源）照射され、５×105細胞／マウスが注射され
た。原細胞を受けなかつたマウスは照射後12日以内に死
亡し、脾臓あたり≦0.1±0.3の内在性コロニーを持つて
いた。
インビボにおいて、注入された基質細胞が髄腔内に安
定に根づく能力は、最初インビボ免疫血液化学技術によ
つて判定された。Glu 6 PIα＋基質細胞は、マウスのRH
L髄腔に移植されて２カ月後に、インサイツにおいて確
認された。移植２カ月後に、植えつけられたマウスも、
あるいは照射された植えつけられていない対照マウス
も、どちらも脾臓、肝臓、肺、あるいは腹膜洗滌液中
に、検出し得る量の供給由来Glu 6 PI-α細胞は見い出
せないことを示した。表１に示されているように、移植
１カ月では移植されたマウスから外植された骨髄培養細
胞中、付着性基質細胞の26％が基準由来であつた。付着
性基質細胞外植が確立され、18日目にGlu 6 PI-αアロ
酵素マーカーに対する特異的抗血清（チヤールズ Char
lesら、1980、Mol.Cell.Biochem.28、11）と、免疫ペル
オキシダーゼ染色（PAP）を用いて供給由来の基質細胞
が確認された。これらの細胞は図１の上方パネルに図示
されており、移植後１カ月に移植を受けたマウスのRNA
からインビトロで外植された付着性骨髄細胞を示してい
る。図１の下方パネルは、照射はされているが移植を受
けていない対照マウスから１カ月後にインビトロで外植
された骨髄細胞を示している。供給由来の細胞はインビ
トロにおいて抗ネズミGlu 6 PI-α特異的ウサギ抗血清
と免疫ペルオキシダーゼ染色を用いて確認された。矢印
は染色性陽性細胞を示す。表１はまた移植後２カ月と３
カ月の骨髄外植において供給由来細胞の最も高い割合
は、それぞれ総付着性細胞の82.5％と62.5％であつたこ
とを示す。Glu 6 PI-α細胞は、移植を受けたマウスのR
HL（13-Gy照射）から確立されたLTBMC中の付着性細胞78
％を構成していた。70日目のLTBMCからとれた付着性基
質細胞はトリプシンで処理され、カバースリツプ上に置
かれてPAP用の過程を受けた。供給由来のGlu 6 PI-α＋
細胞の割合は、非付着性細胞と、これらのLTBMCに由来
する個々のCFU-GEMMコロニーにおいて0.01％以下であつ
た。一方これらの同じLTBMCからとれた非付着性造血原
細胞中に検出し得るGlu 6 PI-α細胞はなかつた。照
射、非移植の対照マウスからインサイツ、又はLTBMCに
おいて検出し得るGlu 6 PIα‐基質細胞は確認されなか
つた（図１、下、表１）。
定に根づく能力は、最初インビボ免疫血液化学技術によ
つて判定された。Glu 6 PIα＋基質細胞は、マウスのRH
L髄腔に移植されて２カ月後に、インサイツにおいて確
認された。移植２カ月後に、植えつけられたマウスも、
あるいは照射された植えつけられていない対照マウス
も、どちらも脾臓、肝臓、肺、あるいは腹膜洗滌液中
に、検出し得る量の供給由来Glu 6 PI-α細胞は見い出
せないことを示した。表１に示されているように、移植
１カ月では移植されたマウスから外植された骨髄培養細
胞中、付着性基質細胞の26％が基準由来であつた。付着
性基質細胞外植が確立され、18日目にGlu 6 PI-αアロ
酵素マーカーに対する特異的抗血清（チヤールズ Char
lesら、1980、Mol.Cell.Biochem.28、11）と、免疫ペル
オキシダーゼ染色（PAP）を用いて供給由来の基質細胞
が確認された。これらの細胞は図１の上方パネルに図示
されており、移植後１カ月に移植を受けたマウスのRNA
からインビトロで外植された付着性骨髄細胞を示してい
る。図１の下方パネルは、照射はされているが移植を受
けていない対照マウスから１カ月後にインビトロで外植
された骨髄細胞を示している。供給由来の細胞はインビ
トロにおいて抗ネズミGlu 6 PI-α特異的ウサギ抗血清
と免疫ペルオキシダーゼ染色を用いて確認された。矢印
は染色性陽性細胞を示す。表１はまた移植後２カ月と３
カ月の骨髄外植において供給由来細胞の最も高い割合
は、それぞれ総付着性細胞の82.5％と62.5％であつたこ
とを示す。Glu 6 PI-α細胞は、移植を受けたマウスのR
HL（13-Gy照射）から確立されたLTBMC中の付着性細胞78
％を構成していた。70日目のLTBMCからとれた付着性基
質細胞はトリプシンで処理され、カバースリツプ上に置
かれてPAP用の過程を受けた。供給由来のGlu 6 PI-α＋
細胞の割合は、非付着性細胞と、これらのLTBMCに由来
する個々のCFU-GEMMコロニーにおいて0.01％以下であつ
た。一方これらの同じLTBMCからとれた非付着性造血原
細胞中に検出し得るGlu 6 PI-α細胞はなかつた。照
射、非移植の対照マウスからインサイツ、又はLTBMCに
おいて検出し得るGlu 6 PIα‐基質細胞は確認されなか
つた（図１、下、表１）。
照射、非移植の対照マウスとGBL/6neor細胞を移植さ
れたマウスから外植された培養細胞中、供給由来のGBLn
eor細胞の回復はG418（500μg/ml）存在下での成長で選
択される。マウスは下に記述されているように、マウス
あたり５×105 GBLneor細胞の移植を受ける。移植後２
カ月で回復した細胞総数は以下の通りであつた：照射、
非移植対照マウスではRHL（13Gy）あたり5.8×106と左
後肢（3Gy）あたり8.6×106；移植を受けたマウスではR
HL（13Gy）あたり6.5×106と左後肢（3Gy）あたり6.9×
106。付着性基質細胞の外植体がデイツシユ（60×10m
m）あたり５×106細胞の割で確立された。いくつかはG4
18（500μg/ml）が隔週おきに与えられた。インビトロ
で培養細胞が確立してから17日間、G418抵抗性コロニー
の数が数えられた。表２は、移植を受けたマウスではG4
18耐性基質細胞コロニーが外植されたRHL骨髄中に見い
出され、照射された対照マウスでは見い出されなかつた
ことを示している。カツコの中の値は、５×106細胞あ
たりのG418耐性基質細胞コロニーの数を、５×106細胞
あたりの基質細胞コロニーの総数で割つて100をかけ
た、G418耐性コロニーのパーセントコントロールを表わ
している。
れたマウスから外植された培養細胞中、供給由来のGBLn
eor細胞の回復はG418（500μg/ml）存在下での成長で選
択される。マウスは下に記述されているように、マウス
あたり５×105 GBLneor細胞の移植を受ける。移植後２
カ月で回復した細胞総数は以下の通りであつた：照射、
非移植対照マウスではRHL（13Gy）あたり5.8×106と左
後肢（3Gy）あたり8.6×106；移植を受けたマウスではR
HL（13Gy）あたり6.5×106と左後肢（3Gy）あたり6.9×
106。付着性基質細胞の外植体がデイツシユ（60×10m
m）あたり５×106細胞の割で確立された。いくつかはG4
18（500μg/ml）が隔週おきに与えられた。インビトロ
で培養細胞が確立してから17日間、G418抵抗性コロニー
の数が数えられた。表２は、移植を受けたマウスではG4
18耐性基質細胞コロニーが外植されたRHL骨髄中に見い
出され、照射された対照マウスでは見い出されなかつた
ことを示している。カツコの中の値は、５×106細胞あ
たりのG418耐性基質細胞コロニーの数を、５×106細胞
あたりの基質細胞コロニーの総数で割つて100をかけ
た、G418耐性コロニーのパーセントコントロールを表わ
している。
移植されたGBL/6基質細胞の、インビトロにおける生
理学的機能が判定された。月毎の間隔をおいて、GBL/6
移植マウス、又は照射、非移植の対照マウスのそれぞれ
の後肢からLTBMCが個々に確立された。付着性基質細胞
の機能的統合性は、インビトロにおいて70日以上産生さ
れた非付着性細胞と多型潜在性原細胞の加算総数で造血
作用の寿命を測り、定量化された。GBL/6細胞を移植さ
れたマウスのRHLから外植した後、１、２、３カ月後、
確立された骨髄培養あたりの産生される有効非付着生細
胞の加算総数は、照射、非移植の対照マウスからの培養
細胞によつて産生されたものより高かつた。移植された
マウスから１、２、３カ月後に確立された、下に記述さ
れている過程を用いて混在したCFU-GEMMコロニーを形成
する、多型潜在性造血原細胞のRHL（13Gy）あたりの加
算総数はそれぞれ30.5＋／−3.7×102、45.6＋／−2.5
×102、34.7＋／−4.2×102であり、照射、非移植対照
マウスの骨髄培養の5.13＋／−2.2×102、7.3＋／−0.9
×102、6.04＋／−0.13×102と比較された（Ｐ＜0.0
5）。
理学的機能が判定された。月毎の間隔をおいて、GBL/6
移植マウス、又は照射、非移植の対照マウスのそれぞれ
の後肢からLTBMCが個々に確立された。付着性基質細胞
の機能的統合性は、インビトロにおいて70日以上産生さ
れた非付着性細胞と多型潜在性原細胞の加算総数で造血
作用の寿命を測り、定量化された。GBL/6細胞を移植さ
れたマウスのRHLから外植した後、１、２、３カ月後、
確立された骨髄培養あたりの産生される有効非付着生細
胞の加算総数は、照射、非移植の対照マウスからの培養
細胞によつて産生されたものより高かつた。移植された
マウスから１、２、３カ月後に確立された、下に記述さ
れている過程を用いて混在したCFU-GEMMコロニーを形成
する、多型潜在性造血原細胞のRHL（13Gy）あたりの加
算総数はそれぞれ30.5＋／−3.7×102、45.6＋／−2.5
×102、34.7＋／−4.2×102であり、照射、非移植対照
マウスの骨髄培養の5.13＋／−2.2×102、7.3＋／−0.9
×102、6.04＋／−0.13×102と比較された（Ｐ＜0.0
5）。
供給基質細胞数の効果が照射マウスにおける造血作用
の回復でテストされた。マウスは１×106、５×105、又
は１×105の細胞を植えられた。GBL/6細胞移植後２カ月
で、長期性骨髄培養が確立された。70日間にわたつてフ
ラスコあたりの産生される生存非付着性細胞が、それぞ
れRHL（13Gy）又はLHL（3Gy）培養でCFU-GEMMについて
行つたように定量化された。検出可能な、キメラの基質
細胞母集団が最底１×105基質細胞で確立された。
の回復でテストされた。マウスは１×106、５×105、又
は１×105の細胞を植えられた。GBL/6細胞移植後２カ月
で、長期性骨髄培養が確立された。70日間にわたつてフ
ラスコあたりの産生される生存非付着性細胞が、それぞ
れRHL（13Gy）又はLHL（3Gy）培養でCFU-GEMMについて
行つたように定量化された。検出可能な、キメラの基質
細胞母集団が最底１×105基質細胞で確立された。
移植を受けたマウスのRHL培養による造血原細胞の産
生は、照射、非移植マウスの骨髄培養で５％であつたの
に比べ、非照射マウスの培養で48％のレベルに達した。
左後肢に対する3GyのＸ線線量は、照射、非移植マウス
の骨髄培養における造血幹細胞産生を、非照射マウスの
培養の35％にまで減少させた。しかしながら、GBL/6細
胞の植えつけは、この線量で照射された肢のLTBMCにお
ける細胞産生を検出し得る程には増加させなかつた。
生は、照射、非移植マウスの骨髄培養で５％であつたの
に比べ、非照射マウスの培養で48％のレベルに達した。
左後肢に対する3GyのＸ線線量は、照射、非移植マウス
の骨髄培養における造血幹細胞産生を、非照射マウスの
培養の35％にまで減少させた。しかしながら、GBL/6細
胞の植えつけは、この線量で照射された肢のLTBMCにお
ける細胞産生を検出し得る程には増加させなかつた。
次に内在性CFU-SによるRHL（13Gy）の髄腔内回復の効
率と、末梢血球数の回復がGBL/6細胞移植マウスと照
射、非移植の対照マウスとにおいて測定された。表３に
示されるように、C57BL/6Jマウスのグループが3Gyから7
Gyまで2Gyずつ増加させて、かつRHLは10から12.5Gy受け
るように照射された。各照射グループは、１グループに
つき5-10匹のマウスを含む。すべてのマウスは更に10-1
2.5GyをRHLに受けた。１グループはマウスあたり５×10
5 GBL/6の基質細胞が注射された。カツコ内の値は、細
胞を受けず、対照照射されたグループのものである。照
射と移植後６週間で、各グループのサブグループが犠牲
となつた；各RHLから細胞が採取されCFU-Sについてアツ
セイされた。結果は３から５匹のマウスの平均±SDで表
現されている。平均4.4±2.9の内在性CFU-Sコロニー
が、照射、非移植マウスの脾臓で見られた。それぞれの
照射線量グループのサブグループは、マウスあたり５×
105 GBL/6細胞を注射された。照射と移植後６週間で、
各線量グループのそれぞれの動物からのRHLは、CFU-Sを
形成する多型潜在性幹細胞の数についてアツセイされ
た。結果は、１グループにつき少なくとも３匹のマウス
の平均±SDで表わされている。非照射マウスは白血球
（WBC）数8.8±1.6×10/mm3、血小板（PLT）数173.7±2
8.7×103／mm3、赤血球（RBC）数7.8±0.05×106／mm3
であつた。
率と、末梢血球数の回復がGBL/6細胞移植マウスと照
射、非移植の対照マウスとにおいて測定された。表３に
示されるように、C57BL/6Jマウスのグループが3Gyから7
Gyまで2Gyずつ増加させて、かつRHLは10から12.5Gy受け
るように照射された。各照射グループは、１グループに
つき5-10匹のマウスを含む。すべてのマウスは更に10-1
2.5GyをRHLに受けた。１グループはマウスあたり５×10
5 GBL/6の基質細胞が注射された。カツコ内の値は、細
胞を受けず、対照照射されたグループのものである。照
射と移植後６週間で、各グループのサブグループが犠牲
となつた；各RHLから細胞が採取されCFU-Sについてアツ
セイされた。結果は３から５匹のマウスの平均±SDで表
現されている。平均4.4±2.9の内在性CFU-Sコロニー
が、照射、非移植マウスの脾臓で見られた。それぞれの
照射線量グループのサブグループは、マウスあたり５×
105 GBL/6細胞を注射された。照射と移植後６週間で、
各線量グループのそれぞれの動物からのRHLは、CFU-Sを
形成する多型潜在性幹細胞の数についてアツセイされ
た。結果は、１グループにつき少なくとも３匹のマウス
の平均±SDで表わされている。非照射マウスは白血球
（WBC）数8.8±1.6×10/mm3、血小板（PLT）数173.7±2
8.7×103／mm3、赤血球（RBC）数7.8±0.05×106／mm3
であつた。
表３に示されているように、３から5Gyの低いTBI線量
では、GBL/6移植マウスと照射、非移植マウスにおいてR
HLあたりのCFU-S形成性多型潜在幹細胞の数は似てい
た。ところが一方、GBL/6細胞を移植されて致命的に近
いまでに照射された（7-Gy TBI）マウスは、照射、非移
植対照マウスのRHLから回復したCFU-S形成幹細胞の数と
比較して顕著に高いCFU-S形成性幹細胞数を示した（Ｐ
＜0.01照射、非移植の対照マウスの値と比較して）。
では、GBL/6移植マウスと照射、非移植マウスにおいてR
HLあたりのCFU-S形成性多型潜在幹細胞の数は似てい
た。ところが一方、GBL/6細胞を移植されて致命的に近
いまでに照射された（7-Gy TBI）マウスは、照射、非移
植対照マウスのRHLから回復したCFU-S形成幹細胞の数と
比較して顕著に高いCFU-S形成性幹細胞数を示した（Ｐ
＜0.01照射、非移植の対照マウスの値と比較して）。
３から5GyのTBI線量の後、マウスの末梢血球数回復の
キネテイクスは、移植を受けたマウスと照射、非移植対
照マウスとで類似であつた。対照的に、照射、非移植対
照と比べて（白血球数４±0.05×103細胞／mm3；血小板
数50±３血小板／mm3;P＜0.05;表３）、末梢血白血球数
（6.9±1.0×103）と血小板数（112.5±2.5×103／m
m3）の著しい回復が、7Gy照射GBL/6移植マウスにおいて
見られた。
キネテイクスは、移植を受けたマウスと照射、非移植対
照マウスとで類似であつた。対照的に、照射、非移植対
照と比べて（白血球数４±0.05×103細胞／mm3；血小板
数50±３血小板／mm3;P＜0.05;表３）、末梢血白血球数
（6.9±1.0×103）と血小板数（112.5±2.5×103／m
m3）の著しい回復が、7Gy照射GBL/6移植マウスにおいて
見られた。
このデータは、先行する照射が造血環境にある基質細
胞に損傷を与えることを示し、高い線量によつて内在性
造血幹細胞がなくなつた部位（niche）は、注入された
供給細胞により効果的な接種部位を提供することを示唆
している。
胞に損傷を与えることを示し、高い線量によつて内在性
造血幹細胞がなくなつた部位（niche）は、注入された
供給細胞により効果的な接種部位を提供することを示唆
している。
TGF-α cDNAを含む欠陥レトロウイルスベクターは、
アンクルサリア Anklesariaら、同上、に示されてい
る、同系マウスにおいてインビボで高線量照射部位に植
えつけが可能である、造血作用を支える骨髄基質細胞株
GBL/6に、エレクトロポレーシヨン（electroporation）
によつてトランスフウエクトされた。植えつけられた、
TGF-dによつてトランスフエクトされたGBL/6細胞株（Gp
-TGFα）は、照射部位に何カ月もの間安定して維持さ
れ、表皮性成長因子（epidermal growth factor EFG）
と、そして同じレセプターとに機能的に相同である成長
因子のTGF-αリガンドを産生することが見い出された。
アンクルサリア Anklesariaら、同上、に示されてい
る、同系マウスにおいてインビボで高線量照射部位に植
えつけが可能である、造血作用を支える骨髄基質細胞株
GBL/6に、エレクトロポレーシヨン（electroporation）
によつてトランスフウエクトされた。植えつけられた、
TGF-dによつてトランスフエクトされたGBL/6細胞株（Gp
-TGFα）は、照射部位に何カ月もの間安定して維持さ
れ、表皮性成長因子（epidermal growth factor EFG）
と、そして同じレセプターとに機能的に相同である成長
因子のTGF-αリガンドを産生することが見い出された。
IL-3依存性造血原細胞株（32DC13）が、インビトロで
Gp-TGFα細胞上に植えつけられ、増殖する能力を持つこ
とが選択遺伝子（大腸菌gpt）とEGFレセプター（EGFR）
をコードする遺伝子の両方を含む真核細胞用発現ベクタ
ーに32D13をのせてトランスフエクトすることによつて
示された。EGFR遺伝子の発現は、EGFへの反応において
細胞分裂促進性シグナルの活性化が結果として見られた
（ピアスPierceら参照、サイエンスScience、1988、23
9:623）。トランスフエクトされない対照32DC13細胞
は、Gp-TGFα細胞株か又はGBL/6のいずれかと共培養さ
れているのだが、増殖せずあるいはコブレストーン（co
bblestone）領域も形成しなかつた。EGFRがトランスフ
エクトしている32D13細胞（32DEGFR）は、インビトロで
７週間以上Gp-TGFα細胞上で大量に増殖するが、GBL/6
上では増殖しない。対照的に、LTBMC由来の造血原細胞
は、Gp-TGFα細胞よりGBL/6細胞上でより効果的に増殖
しCFU-GEMM原細胞を産生した。このように、レセプター
／リガンド相互作用を確立することのできる細胞のみ
が、インビトロで植えつけと大量増殖が可能であつた。
これらの結果は表４に示されている。
Gp-TGFα細胞上に植えつけられ、増殖する能力を持つこ
とが選択遺伝子（大腸菌gpt）とEGFレセプター（EGFR）
をコードする遺伝子の両方を含む真核細胞用発現ベクタ
ーに32D13をのせてトランスフエクトすることによつて
示された。EGFR遺伝子の発現は、EGFへの反応において
細胞分裂促進性シグナルの活性化が結果として見られた
（ピアスPierceら参照、サイエンスScience、1988、23
9:623）。トランスフエクトされない対照32DC13細胞
は、Gp-TGFα細胞株か又はGBL/6のいずれかと共培養さ
れているのだが、増殖せずあるいはコブレストーン（co
bblestone）領域も形成しなかつた。EGFRがトランスフ
エクトしている32D13細胞（32DEGFR）は、インビトロで
７週間以上Gp-TGFα細胞上で大量に増殖するが、GBL/6
上では増殖しない。対照的に、LTBMC由来の造血原細胞
は、Gp-TGFα細胞よりGBL/6細胞上でより効果的に増殖
しCFU-GEMM原細胞を産生した。このように、レセプター
／リガンド相互作用を確立することのできる細胞のみ
が、インビトロで植えつけと大量増殖が可能であつた。
これらの結果は表４に示されている。
32D-EGFRの、インビボで植えついたGp-TGFα基質細胞
に着床する能力がテストされた。照射済みC57B1/6マウ
スが５×105コのGp-TGFα細胞／マウスの割で移植を受
けた。移植２カ月後にマイコフエノリン酸（mycophenol
ic acid）耐性の32D-EGFR細胞（1.0×107細胞／マウ
ス）がGp-TGFα移植されたマウスと、照射、非移植の対
照マウスに注射された。供給由来であるneor TGR-α産
生性コロニー（11.5±2.5CFU-F/肢）が照射、Gp-TGFα
移植マウスの骨髄外植体中に検出されたが、照射、非移
植の対照マウスでは検出されなかつた。32D-EGFR15.2±
8.0×105細胞／肢が、照射、Gp-TGFα移植マウスの後肢
外植体から回復し、照射、非移植の対照マウスの後肢外
植体からの0.55±0.10×105 32D-EGFR細胞と比較され
た。これらのデータは、トランスフエクトされた酵素を
コードする遺伝子を含む骨髄基質細胞が、照射済み骨腔
内で確立され始め、着床後その酵素が発現され始めたこ
とを示唆する。
に着床する能力がテストされた。照射済みC57B1/6マウ
スが５×105コのGp-TGFα細胞／マウスの割で移植を受
けた。移植２カ月後にマイコフエノリン酸（mycophenol
ic acid）耐性の32D-EGFR細胞（1.0×107細胞／マウ
ス）がGp-TGFα移植されたマウスと、照射、非移植の対
照マウスに注射された。供給由来であるneor TGR-α産
生性コロニー（11.5±2.5CFU-F/肢）が照射、Gp-TGFα
移植マウスの骨髄外植体中に検出されたが、照射、非移
植の対照マウスでは検出されなかつた。32D-EGFR15.2±
8.0×105細胞／肢が、照射、Gp-TGFα移植マウスの後肢
外植体から回復し、照射、非移植の対照マウスの後肢外
植体からの0.55±0.10×105 32D-EGFR細胞と比較され
た。これらのデータは、トランスフエクトされた酵素を
コードする遺伝子を含む骨髄基質細胞が、照射済み骨腔
内で確立され始め、着床後その酵素が発現され始めたこ
とを示唆する。
cDNAクローンpSP64-VIII（トールTooleら、1984、同
上）由来のヒト凝固因子VIII-C遺伝子はあらゆる適切な
ホ乳類発現ベクター、例えばベクターpCVSVL、内に導入
し、ヒト基質細胞内で発現させることができる（pCVSVL
での遺伝子発現はカウフマン Kaufmannら、1982、Mol.
Cell.Biol.2:1304;とクラーク Clarkら、1984、Proc.N
at.Aca.Sci.81:2541によつて記述されている）。ヒトVI
II-C因子遺伝子のコーデイング領域のDNA配列がウツドW
oodら、1984、同上、によつて与えられており、ここで
参考文献中に付記されている。トール Tooleら、同
上、によつて記述されているように、因子VIII-C遺伝子
は、遺伝子をSal I断片としてとり出してSal I接着末端
を含む合成オリゴヌクレオチドを用いてpVCSVLのPst I
部位内にクローン化することができる。図３に示されて
いるように、pVCSVL-F VIII内のVIII-C因子遺伝子はア
デノウイルス・メジヤー後期プロモーターの調制下にお
かれる。このプラスミドはまたSV40ポリアデニレーシヨ
ン部位（SV40 poly A）、二つのSV40複製オリジン（SV4
0 Ori）、そして動物細胞においてこのようなプラスミ
ドの複製を促進する、pBR322の欠失（ラスキー Lusky
ら、1981、ネイチヤー Nature 293:79）を含む。この
ベクター内の選択遺伝子は、テトラサイクリン耐性（Te
tR）とマウスダイハイドロフオレート還元酵素（DHFR）
をコードする。同様なVIII-C因子ホ乳類細胞発現ベクタ
ーがカウフマンKaufmanらによつてWO87/04187、pub.7月
17日、1987、で詳細にわたつて記述されており、ここで
参考文献中に付記されている。
上）由来のヒト凝固因子VIII-C遺伝子はあらゆる適切な
ホ乳類発現ベクター、例えばベクターpCVSVL、内に導入
し、ヒト基質細胞内で発現させることができる（pCVSVL
での遺伝子発現はカウフマン Kaufmannら、1982、Mol.
Cell.Biol.2:1304;とクラーク Clarkら、1984、Proc.N
at.Aca.Sci.81:2541によつて記述されている）。ヒトVI
II-C因子遺伝子のコーデイング領域のDNA配列がウツドW
oodら、1984、同上、によつて与えられており、ここで
参考文献中に付記されている。トール Tooleら、同
上、によつて記述されているように、因子VIII-C遺伝子
は、遺伝子をSal I断片としてとり出してSal I接着末端
を含む合成オリゴヌクレオチドを用いてpVCSVLのPst I
部位内にクローン化することができる。図３に示されて
いるように、pVCSVL-F VIII内のVIII-C因子遺伝子はア
デノウイルス・メジヤー後期プロモーターの調制下にお
かれる。このプラスミドはまたSV40ポリアデニレーシヨ
ン部位（SV40 poly A）、二つのSV40複製オリジン（SV4
0 Ori）、そして動物細胞においてこのようなプラスミ
ドの複製を促進する、pBR322の欠失（ラスキー Lusky
ら、1981、ネイチヤー Nature 293:79）を含む。この
ベクター内の選択遺伝子は、テトラサイクリン耐性（Te
tR）とマウスダイハイドロフオレート還元酵素（DHFR）
をコードする。同様なVIII-C因子ホ乳類細胞発現ベクタ
ーがカウフマンKaufmanらによつてWO87/04187、pub.7月
17日、1987、で詳細にわたつて記述されており、ここで
参考文献中に付記されている。
培養体上澄中のVIII-C因子活性は、感度が0.05mU/ml
以上になるよう改良されたカビ・コーテスト Kabi Coa
test）VIII-C因子法と、VIII-C因子欠損血漿を用いた、
一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（one-stage
activated partial thromboplastin time）（APTT）凝
固アツセイ（リーLeeら、1983、Thromb.Res.30:511）に
よつて決定可能である。コーテストアツセイはIXα因子
による自然因子Ｘ（natural Factor X）の活性に基づい
ている;IXa因子はVIII因子依存性である。APTTアツセイ
は、トロンビン存在下でVIII因子の凝固活性が著明に増
加することに基づいている。トロンビン活性化のため
に、試料は0.2単位/mlのトロンビンで1-10分間室温で前
処理される。この代わりとしてVIII因子は、ウツドWood
ら、1984、同上、によつて記述されているように、VIII
因子に特異的抗体を用いたラジオイムノアツセイによつ
て定量化することもできる。
以上になるよう改良されたカビ・コーテスト Kabi Coa
test）VIII-C因子法と、VIII-C因子欠損血漿を用いた、
一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（one-stage
activated partial thromboplastin time）（APTT）凝
固アツセイ（リーLeeら、1983、Thromb.Res.30:511）に
よつて決定可能である。コーテストアツセイはIXα因子
による自然因子Ｘ（natural Factor X）の活性に基づい
ている;IXa因子はVIII因子依存性である。APTTアツセイ
は、トロンビン存在下でVIII因子の凝固活性が著明に増
加することに基づいている。トロンビン活性化のため
に、試料は0.2単位/mlのトロンビンで1-10分間室温で前
処理される。この代わりとしてVIII因子は、ウツドWood
ら、1984、同上、によつて記述されているように、VIII
因子に特異的抗体を用いたラジオイムノアツセイによつ
て定量化することもできる。
ヒトVIII-C因子遺伝子とneorマーカー遺伝子を含むベ
クターを、エレクトロポレーシヨン、レトロウイルスベ
クタートランスフアー、あるいは他の適当な常套のベク
タートランスフアー技術によつてネズミ基質細胞（例え
ばGBL/6細胞を含む）をトランスフエクトするのに使う
ことができる。
クターを、エレクトロポレーシヨン、レトロウイルスベ
クタートランスフアー、あるいは他の適当な常套のベク
タートランスフアー技術によつてネズミ基質細胞（例え
ばGBL/6細胞を含む）をトランスフエクトするのに使う
ことができる。
検出可能なレベルのヒトVIII-C因子を発現する、GBL/
6 neor細胞のサブクローナル株はインビトロで、一貫し
たネオマイシン耐性と、これらサブクローンの非血清に
条件づけられた培地中でウエスタンブロツト分析あるい
は生化学的アツセイによつて検出し得るヒトVIII-C因子
産生によつて選択される。
6 neor細胞のサブクローナル株はインビトロで、一貫し
たネオマイシン耐性と、これらサブクローンの非血清に
条件づけられた培地中でウエスタンブロツト分析あるい
は生化学的アツセイによつて検出し得るヒトVIII-C因子
産生によつて選択される。
C56BL/6Jオスマウスが受容者として使用される。これ
らの動物の細胞は、Ｙ染色体、リン酸化グルコースイソ
メラーゼ（GPIA）のβ型、そして検出し得るネオマイシ
ン耐性活性の欠除の３種類の“受容者”マーカーを持
つ。供給者由来細胞はGBL/6 neor VII-C−１クローナル
株からとられて、検出し得るＹ染色体の欠除、GPIAに対
するヘテロ抗血清による検出可能な免疫ペルオキシダー
ゼ染色、インビトロでの生物学的ネオマイシン耐性、そ
してヒトVIII-C因子の検出可能な産生、の４種類の供給
者由来マーカーを持つ。これらの細胞の照射済みマウス
への植え付けのための投与量反応曲線（dose response
curve）は以下のように作られた。
らの動物の細胞は、Ｙ染色体、リン酸化グルコースイソ
メラーゼ（GPIA）のβ型、そして検出し得るネオマイシ
ン耐性活性の欠除の３種類の“受容者”マーカーを持
つ。供給者由来細胞はGBL/6 neor VII-C−１クローナル
株からとられて、検出し得るＹ染色体の欠除、GPIAに対
するヘテロ抗血清による検出可能な免疫ペルオキシダー
ゼ染色、インビトロでの生物学的ネオマイシン耐性、そ
してヒトVIII-C因子の検出可能な産生、の４種類の供給
者由来マーカーを持つ。これらの細胞の照射済みマウス
への植え付けのための投与量反応曲線（dose response
curve）は以下のように作られた。
受容者マウスは、137Csγ細胞40照射体による300cGy
の全体照射（TBI）と右後肢（RHL）のみへの1000cGyの
照射を受ける。照射の翌日動物たちは、１×104、５×1
04、１×105、あるいは５×105の高産生性GBL/6 neor V
III Cクローナル株の単一細胞浮遊液を、尾の血管から
静脈注射される（１グループにつき10匹のマウスのプー
ルされた細胞）。マウスはその後カゴに帰され、血漿中
の検出し得るVIII-C因子について毎週モニターされる。
代表的なマウスが異なる時間点で犠牲にされ、心臓穿刺
によつて血漿が取り除かれてウエスタンブロツト分析に
よるヒトVIII-C因子アツセイが行われる。ヒトVIII-C因
子は、モノクローナル抗ヒトVIII-C抗血清（いくつかの
公供施設から手に入る）に対する特異的反応性の違いに
よつてマウスVIII-C因子と判別可能である。
の全体照射（TBI）と右後肢（RHL）のみへの1000cGyの
照射を受ける。照射の翌日動物たちは、１×104、５×1
04、１×105、あるいは５×105の高産生性GBL/6 neor V
III Cクローナル株の単一細胞浮遊液を、尾の血管から
静脈注射される（１グループにつき10匹のマウスのプー
ルされた細胞）。マウスはその後カゴに帰され、血漿中
の検出し得るVIII-C因子について毎週モニターされる。
代表的なマウスが異なる時間点で犠牲にされ、心臓穿刺
によつて血漿が取り除かれてウエスタンブロツト分析に
よるヒトVIII-C因子アツセイが行われる。ヒトVIII-C因
子は、モノクローナル抗ヒトVIII-C抗血清（いくつかの
公供施設から手に入る）に対する特異的反応性の違いに
よつてマウスVIII-C因子と判別可能である。
各投与量グループのマウスを殺す時に、核を持つ細胞
がそれぞれの動物の右と左の後肢から取り除かれ、上に
記述されているように、断続的なネズミ骨髄培養を作り
上げるのに用いられる。右後肢からの骨髄培養は、供給
者由来のネオマイシン耐性基質細胞が高い割合で含まれ
ていることが期待され、この肢の断続性骨髄培養はイン
ビトロで検出可能なヒトVIII-C因子を産生することが期
待されるだろう。植え付けられたネズミの骨髄を外植す
る時点は、他の中間時点と同様に基質細胞移植後１週
間、２カ月、４カ月、６カ月が選ばれる。ヒトVIII-C因
子の血漿レベルが測定され、期間中産生されるVIII-C因
子のレベルがグラフで示される。移植される基質細胞の
至適数は１後肢のVIII-C因子産生の最高レベルとの関連
で決定される。
がそれぞれの動物の右と左の後肢から取り除かれ、上に
記述されているように、断続的なネズミ骨髄培養を作り
上げるのに用いられる。右後肢からの骨髄培養は、供給
者由来のネオマイシン耐性基質細胞が高い割合で含まれ
ていることが期待され、この肢の断続性骨髄培養はイン
ビトロで検出可能なヒトVIII-C因子を産生することが期
待されるだろう。植え付けられたネズミの骨髄を外植す
る時点は、他の中間時点と同様に基質細胞移植後１週
間、２カ月、４カ月、６カ月が選ばれる。ヒトVIII-C因
子の血漿レベルが測定され、期間中産生されるVIII-C因
子のレベルがグラフで示される。移植される基質細胞の
至適数は１後肢のVIII-C因子産生の最高レベルとの関連
で決定される。
もし、１後肢の高線量照射後に供給細胞でその肢を再
構築した後、マウス血漿中のヒトVIII-C因子が検出でき
ないようならば、両後肢を照射して植え付けのためのよ
り大きなニツチを調製するための連続的な“ニツチ（ni
che）”調製プロトコールを使うことができる。この試
みは、総骨髄容量中のおきかわつた供給基質細胞の割合
をより大きくする目的で、マウスのS1/S1dの大赤血球性
貧血を検出可能レベルで変化させるために使われた。こ
の株は骨髄微環境に遺伝的欠陥を持ち、成熟赤血球前駆
体の欠除と多型潜在性造血幹細胞数の減少が結果として
見られる。
構築した後、マウス血漿中のヒトVIII-C因子が検出でき
ないようならば、両後肢を照射して植え付けのためのよ
り大きなニツチを調製するための連続的な“ニツチ（ni
che）”調製プロトコールを使うことができる。この試
みは、総骨髄容量中のおきかわつた供給基質細胞の割合
をより大きくする目的で、マウスのS1/S1dの大赤血球性
貧血を検出可能レベルで変化させるために使われた。こ
の株は骨髄微環境に遺伝的欠陥を持ち、成熟赤血球前駆
体の欠除と多型潜在性造血幹細胞数の減少が結果として
見られる。
S1/S1dマウスの骨髄微環境の優勢なフラクシヨンは、
2GyTBIと両後肢（BHL、１回）への20Gyか、あるいは連
続した照射移植（複数回数）で調製したマウスでおきか
えられた。成人受容者のS1/S1dマウスは1-2GyTBIと10.0
-230.0Gyを右後肢（RHL）又は両後肢（BHL）に、アンク
レサリア Anklesariaら、1987、同上、によつて記述さ
れたように直線的な増量を伴う照射を受けた。1Gy TBI
と10Gy X線線両が、S1/S1dマウスのTBIに対する相対的
感受性の故に、望ましい。照射されたマウスに静脈注射
によつて５×105基質細胞（GBL neor）が移植された
（１回）。S1/S1dマウスを用いた。連続した照射量増加
と移植実験のため1Gy TBIとRHLへの10Gyが０日目に直線
的増量を伴つて供給された。GBL neor細胞株の単一細胞
浮遊液が48時間後静脈注射された。最初の照射から２カ
月後、同じグループのマウスが1Gy TBIと左後肢（LHL）
に10Gyを受けた。GBL neor細胞株の再度の注射が48時間
後に予定された（複数移植）。照射、非移植の対照マウ
スは2Gy TBIと10Gyを両後肢（BHL）に受けた。
2GyTBIと両後肢（BHL、１回）への20Gyか、あるいは連
続した照射移植（複数回数）で調製したマウスでおきか
えられた。成人受容者のS1/S1dマウスは1-2GyTBIと10.0
-230.0Gyを右後肢（RHL）又は両後肢（BHL）に、アンク
レサリア Anklesariaら、1987、同上、によつて記述さ
れたように直線的な増量を伴う照射を受けた。1Gy TBI
と10Gy X線線両が、S1/S1dマウスのTBIに対する相対的
感受性の故に、望ましい。照射されたマウスに静脈注射
によつて５×105基質細胞（GBL neor）が移植された
（１回）。S1/S1dマウスを用いた。連続した照射量増加
と移植実験のため1Gy TBIとRHLへの10Gyが０日目に直線
的増量を伴つて供給された。GBL neor細胞株の単一細胞
浮遊液が48時間後静脈注射された。最初の照射から２カ
月後、同じグループのマウスが1Gy TBIと左後肢（LHL）
に10Gyを受けた。GBL neor細胞株の再度の注射が48時間
後に予定された（複数移植）。照射、非移植の対照マウ
スは2Gy TBIと10Gyを両後肢（BHL）に受けた。
照射、非移植の対照マウスのうち生き残つたものは皆
無であつた。GBL neor移植マウス（2Gy TBIと20Gy BH
L）の５カ月目から確立されたLTBMCは、右（298.8±32.
7）と左415.8±36.5）後肢培養両者とも非照射S1/S1dマ
ウスと比較して増加した加算CFU-GEMM形成原細胞数／フ
ラスコを示した（Ｐ＜0.05、図２）。照射と移植後２カ
月、又は４カ月に３匹のマウス／グループからLTBMCが
確立された。別の実験で、マウスが２回目の照射と移植
を受けてから２カ月後に、GBL neor移植されたマウスの
植えつけられた右（136.1±32）と左（78.6±15.4）後
肢から確立されたLTBMCにおいてフラスコあたり得られ
たCFU-GEMM形成原細胞の加算数は非照射の対照、S1/S1d
マウスからのものに比べて高かつた。図２においてそれ
ぞれの細胞を、非照射対照マウスは白丸で、GBL neor移
植されたRHL-20Gyマウスは白四角で、GBL neor移植され
たLHL-20Gyマウスは黒三角で、そしてGBL neor移植され
たLHL-10Gyは黒四角で表わしてある。
無であつた。GBL neor移植マウス（2Gy TBIと20Gy BH
L）の５カ月目から確立されたLTBMCは、右（298.8±32.
7）と左415.8±36.5）後肢培養両者とも非照射S1/S1dマ
ウスと比較して増加した加算CFU-GEMM形成原細胞数／フ
ラスコを示した（Ｐ＜0.05、図２）。照射と移植後２カ
月、又は４カ月に３匹のマウス／グループからLTBMCが
確立された。別の実験で、マウスが２回目の照射と移植
を受けてから２カ月後に、GBL neor移植されたマウスの
植えつけられた右（136.1±32）と左（78.6±15.4）後
肢から確立されたLTBMCにおいてフラスコあたり得られ
たCFU-GEMM形成原細胞の加算数は非照射の対照、S1/S1d
マウスからのものに比べて高かつた。図２においてそれ
ぞれの細胞を、非照射対照マウスは白丸で、GBL neor移
植されたRHL-20Gyマウスは白四角で、GBL neor移植され
たLHL-20Gyマウスは黒三角で、そしてGBL neor移植され
たLHL-10Gyは黒四角で表わしてある。
このように、S1/S1dマウスにおいて高線量の照射は、
移植された基質細胞を支持する髄腔内“ニツチ”を作る
のを助けるかもしれなく、また造血作用を抑制する内在
性基質細胞を除くのかもしれない。
移植された基質細胞を支持する髄腔内“ニツチ”を作る
のを助けるかもしれなく、また造血作用を抑制する内在
性基質細胞を除くのかもしれない。
インビボにおいて植えつけられた供給基質細胞数は上
で記述されたようにネオマイシン耐性基質細胞のコロニ
ーアツセイによつて定量される。このアツセイは、外植
された有核骨髄細胞について一連の10倍希釈をある一定
希釈数まで行い、100μg/mlのG418濃度下でペトリ皿ヘ
プレートし、50細胞以上のコロニーを７日目に数えて行
われる。
で記述されたようにネオマイシン耐性基質細胞のコロニ
ーアツセイによつて定量される。このアツセイは、外植
された有核骨髄細胞について一連の10倍希釈をある一定
希釈数まで行い、100μg/mlのG418濃度下でペトリ皿ヘ
プレートし、50細胞以上のコロニーを７日目に数えて行
われる。
ヒトVIII-C因子産生レベルを植えつけられた基質細胞
数に相関させて定量化するために、植えつけられたコロ
ニー形成性基質細胞数が上記のように決定され、外植に
続いて、インビボとインビトロで検出できるヒトVIII-C
因子のレベルが、同じく上記のように決定される。これ
らの実験は、インビボのマウスにおいてVIII-C因子が６
カ月にもわたつて安定したレベルで検出できることを示
している。
数に相関させて定量化するために、植えつけられたコロ
ニー形成性基質細胞数が上記のように決定され、外植に
続いて、インビボとインビトロで検出できるヒトVIII-C
因子のレベルが、同じく上記のように決定される。これ
らの実験は、インビボのマウスにおいてVIII-C因子が６
カ月にもわたつて安定したレベルで検出できることを示
している。
次の過程は、上で述べられたネズミ組織のためのプロ
トコールと同様な基質細胞着床プロトコールを用いて、
ヒトにおけるＡ型血友病がインビボで是正されることを
示すためにデザインされた。受容者は同じような高線量
照射技法で調製される。
トコールと同様な基質細胞着床プロトコールを用いて、
ヒトにおけるＡ型血友病がインビボで是正されることを
示すためにデザインされた。受容者は同じような高線量
照射技法で調製される。
以前にHIV汚染血漿誘導品からヒト免疫不全ウイルス
に感染したＡ型血友病患者からの有核骨髄細胞が、同意
を得た後外植される。これらの骨髄は、適当な培地にハ
イドロコルチゾン・ヘミコハク酸ナトリウムを加えた調
製技術でヒト継続性骨髄培地に確立される。
に感染したＡ型血友病患者からの有核骨髄細胞が、同意
を得た後外植される。これらの骨髄は、適当な培地にハ
イドロコルチゾン・ヘミコハク酸ナトリウムを加えた調
製技術でヒト継続性骨髄培地に確立される。
移植を受ける患者の骨髄が腸骨稜から約３×108の有
核細胞を含んで吸い上げられる。骨髄細胞収集技術はこ
こに参考文献として記載されているバツハナー Buchne
rら、1984、ブラツドBlood 64:630、とトーマス Thoma
sら、1970、ブラツド36:507、が、ジン Jinらによる変
法、1985、Exp.Hematol.13:879として記述されており、
ここに参考文献として記載されている。
核細胞を含んで吸い上げられる。骨髄細胞収集技術はこ
こに参考文献として記載されているバツハナー Buchne
rら、1984、ブラツドBlood 64:630、とトーマス Thoma
sら、1970、ブラツド36:507、が、ジン Jinらによる変
法、1985、Exp.Hematol.13:879として記述されており、
ここに参考文献として記載されている。
簡単に述べると、腰部の施術によつて切開手術なしで
得られた骨髄標本はマツコイ（Mc Coy）の5A培地中では
さみできざまれて骨片なしに精製され、髄は30ゲージま
での漸次的に小さなゲージ針を通過させて単一細胞の浮
遊液が調製される。３×107から４×107の有核骨髄細胞
を、すでに記述されたように（グリーンバークGreenber
gら、ブラツドBlood 58:724、1981）、マツコイの5A培
地に12.5％の熱非活性化された胎児性コウシ血清、12.5
％の熱非活性化されたウマ血清、10-6mol/Lのハイドロ
コルチゾンを追加してコーニング Corningの25c.c.プ
ラスチツクフラスコ各々に接種し、培養体が確立され
る。培養細胞は33℃でインキユベートされ７から14日間
静置しておかれる；この時間は、長期造血作用に伴う造
血基質細胞島の付着に絶対的に要求される。この初期イ
ンキユベーシヨンの後、すべての非付着性細胞はアスピ
レーシヨンで移動させられ、赤血球を除くためにフアイ
コール・ハイパーク Ficoll-Hypaque比重分離が行われ
る。すべての有核細胞はそのあと新鮮な培地の入つた個
々の培養フラスコに戻される。培養細胞はそれから最初
の４週間は週に２回、その後は週に１回、毎回すべての
培地と非付着性細胞がとり除かれ、8.0mlの新鮮な培地
が入れられて給餌される。それからヒト基質細胞が、ネ
ズミ細胞について上で記述されたように、ヒトVIII-C因
子遺伝子を含むベクターで、エレクトロ ポレーシヨ
ン、レトロウイルスベクタートランスフアー、あるいは
他の適当な技術によつてトランスフエクトされる。
得られた骨髄標本はマツコイ（Mc Coy）の5A培地中では
さみできざまれて骨片なしに精製され、髄は30ゲージま
での漸次的に小さなゲージ針を通過させて単一細胞の浮
遊液が調製される。３×107から４×107の有核骨髄細胞
を、すでに記述されたように（グリーンバークGreenber
gら、ブラツドBlood 58:724、1981）、マツコイの5A培
地に12.5％の熱非活性化された胎児性コウシ血清、12.5
％の熱非活性化されたウマ血清、10-6mol/Lのハイドロ
コルチゾンを追加してコーニング Corningの25c.c.プ
ラスチツクフラスコ各々に接種し、培養体が確立され
る。培養細胞は33℃でインキユベートされ７から14日間
静置しておかれる；この時間は、長期造血作用に伴う造
血基質細胞島の付着に絶対的に要求される。この初期イ
ンキユベーシヨンの後、すべての非付着性細胞はアスピ
レーシヨンで移動させられ、赤血球を除くためにフアイ
コール・ハイパーク Ficoll-Hypaque比重分離が行われ
る。すべての有核細胞はそのあと新鮮な培地の入つた個
々の培養フラスコに戻される。培養細胞はそれから最初
の４週間は週に２回、その後は週に１回、毎回すべての
培地と非付着性細胞がとり除かれ、8.0mlの新鮮な培地
が入れられて給餌される。それからヒト基質細胞が、ネ
ズミ細胞について上で記述されたように、ヒトVIII-C因
子遺伝子を含むベクターで、エレクトロ ポレーシヨ
ン、レトロウイルスベクタートランスフアー、あるいは
他の適当な技術によつてトランスフエクトされる。
トランスフエクトされてVIII-C因子を発現している基
質細胞の数は、上に記述されているように、VIII-C因子
遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子につないでneo耐性コ
ロニーを選択するか、あるいは株を培養細胞にサブクロ
ーニングしてその上澄中の検出可能なレベルのVIII因子
についてアツセイするかのいずれかか、あるいはまた抗
ヒトVIII-C因子のモノクローナル抗体を使つて、検出可
能なVIII C因子を産生する細胞を免疫ペルオキシダーゼ
技法で染色して、定量化が行われる。ベクターのトラン
スフエクシヨン系は、トランスフエクトされた基質細胞
のVIII-C遺伝子発現の頻度が最大になるような方法が選
択される。ネオマイシン耐性遺伝子を持つベクターpZIP
-Neo SV（Ｘ）が新鮮ヒト基質細胞にトランスフエクト
された時、ネオマイシン耐性は、通常ネオマイシン類似
体のG418に感受性を持つ細胞の約10-15％においてイン
ビトロで安定に発現された。このneor実験に基づいて、
ヒト基質細胞の少なくとも10％は安定にVIII-C因子を発
現することが期待される。もしこれより低い数字が検出
されたなら、クローン化された永続ヒト骨髄基質株、KM
101、KM 102、KM 103、KM 104、KM 105がトランスフエ
クシヨンと、インビトロでのVIII-C因子遺伝子の検出の
見込みを最大にするため使用される（フイツツジエラル
ド Fitzgeraldら、1988、Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.
15:1153）。VIII-C因子の産生はクローナル株で定量さ
れ、GBL/6 neorマウス株で検出されるVIII C因子と細胞
あたりで比較される。毒物性と発癌性の実験が下記のよ
うに行われる。
質細胞の数は、上に記述されているように、VIII-C因子
遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子につないでneo耐性コ
ロニーを選択するか、あるいは株を培養細胞にサブクロ
ーニングしてその上澄中の検出可能なレベルのVIII因子
についてアツセイするかのいずれかか、あるいはまた抗
ヒトVIII-C因子のモノクローナル抗体を使つて、検出可
能なVIII C因子を産生する細胞を免疫ペルオキシダーゼ
技法で染色して、定量化が行われる。ベクターのトラン
スフエクシヨン系は、トランスフエクトされた基質細胞
のVIII-C遺伝子発現の頻度が最大になるような方法が選
択される。ネオマイシン耐性遺伝子を持つベクターpZIP
-Neo SV（Ｘ）が新鮮ヒト基質細胞にトランスフエクト
された時、ネオマイシン耐性は、通常ネオマイシン類似
体のG418に感受性を持つ細胞の約10-15％においてイン
ビトロで安定に発現された。このneor実験に基づいて、
ヒト基質細胞の少なくとも10％は安定にVIII-C因子を発
現することが期待される。もしこれより低い数字が検出
されたなら、クローン化された永続ヒト骨髄基質株、KM
101、KM 102、KM 103、KM 104、KM 105がトランスフエ
クシヨンと、インビトロでのVIII-C因子遺伝子の検出の
見込みを最大にするため使用される（フイツツジエラル
ド Fitzgeraldら、1988、Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.
15:1153）。VIII-C因子の産生はクローナル株で定量さ
れ、GBL/6 neorマウス株で検出されるVIII C因子と細胞
あたりで比較される。毒物性と発癌性の実験が下記のよ
うに行われる。
ヒト基質細胞株のインビトロでの成長は、エプスタイ
ン・バーウイルス（Epstein-Barr）（ロースタイン Ro
thsteinら、1985、ブラツド Blood 65:744）の活性化
や、マイコプラズマ、細菌、あるいは真菌の感染を含む
病原体によるインビトロ培養中の基質細胞の汚染、また
腫瘍誘発性株への自然発生的形質転換などを含む潜在的
問題を伴つている。基質細胞の微生物による汚染は、材
料を微生物、ウイルス、そしてマイコプラズマについて
アツセイすることでモニターされる。細胞はエプスタイ
ンバーウイルス核抗原について、ロースタイン Rothst
einら、同上、によつて記述されているようにテストさ
れ、さらに電子顕微鏡によつてエプスタイン・バーウイ
ルス活性化の証拠のあるなしを決定してスクリーンされ
る。EBVはヒト骨髄基質細胞では、継続性のインビトロ
培養の20-25週以前には全く検出されていない。EBV活性
の機序は知られていないが、対照ヒト骨髄培養中に低い
頻度で検出される。
ン・バーウイルス（Epstein-Barr）（ロースタイン Ro
thsteinら、1985、ブラツド Blood 65:744）の活性化
や、マイコプラズマ、細菌、あるいは真菌の感染を含む
病原体によるインビトロ培養中の基質細胞の汚染、また
腫瘍誘発性株への自然発生的形質転換などを含む潜在的
問題を伴つている。基質細胞の微生物による汚染は、材
料を微生物、ウイルス、そしてマイコプラズマについて
アツセイすることでモニターされる。細胞はエプスタイ
ンバーウイルス核抗原について、ロースタイン Rothst
einら、同上、によつて記述されているようにテストさ
れ、さらに電子顕微鏡によつてエプスタイン・バーウイ
ルス活性化の証拠のあるなしを決定してスクリーンされ
る。EBVはヒト骨髄基質細胞では、継続性のインビトロ
培養の20-25週以前には全く検出されていない。EBV活性
の機序は知られていないが、対照ヒト骨髄培養中に低い
頻度で検出される。
自然発生的な腫瘍形成性がVIII-C因子遺伝子の挿入に
続いてひきおこされるものであるかどうかを決定するた
めVIII-C因子を発現している基質細胞培養体をヌードマ
ウスに１×107細胞膜、静脈、あるいはカテーテルから
植えつける。これらの動物は６カ月間腫瘍が検出される
かどうかモニターされる。ヌードマウスでのこれらの実
験の陽性対照は、ヒト腫瘍細胞株HL60とU937（グリーン
バーガー Greenbergerら、1978、Cancer Res.38:334
0）を含む。これらの基準を用いて、VIII-C因子を発現
しているヒト骨髄基質細胞の腫瘍形成性の証拠を検出す
ることが可能になる；新しく外植されたヒト基質細胞の
10％が、そしておそらく50-60％に及んでトランスフエ
クトされたVIII-C因子遺伝子を発現させるためであろ
う。
続いてひきおこされるものであるかどうかを決定するた
めVIII-C因子を発現している基質細胞培養体をヌードマ
ウスに１×107細胞膜、静脈、あるいはカテーテルから
植えつける。これらの動物は６カ月間腫瘍が検出される
かどうかモニターされる。ヌードマウスでのこれらの実
験の陽性対照は、ヒト腫瘍細胞株HL60とU937（グリーン
バーガー Greenbergerら、1978、Cancer Res.38:334
0）を含む。これらの基準を用いて、VIII-C因子を発現
しているヒト骨髄基質細胞の腫瘍形成性の証拠を検出す
ることが可能になる；新しく外植されたヒト基質細胞の
10％が、そしておそらく50-60％に及んでトランスフエ
クトされたVIII-C因子遺伝子を発現させるためであろ
う。
各患者は、自分自身のVIII-C因子トランスフエクトさ
れた基質細胞の自家移植のため１つの腸骨稜を照射して
調製される。照射療法部位は10cm幅×10cm長さを超えな
い範囲で腸骨稜と坐骨の一部を合わせて選択されて膀胱
と直腸は片側だけ遮蔽されるか、あるいはそこの領域の
腸、膀胱、他の通常柔い組織の容積を最小限にするた
め、角度をつけたAP-PA範囲が選ばれる。1000cGyの１回
分の画分量（fraction size）が、AP-PA又は反対の斜角
法によつて骨髄のこの部分に与えられる。何回かに分け
られた（fractionated）放射療法はより適切であり、お
そらくヒトが高線量照射ニツチを調製するのにより容易
に耐えられる。基本的なヒト放射線生物学的パラメータ
は、１日500cGy2日間か、あるいは１日300cGyを10日間
は、1000cGyを１回と等しい同位効果（isoefect）を産
むはずである、と示唆している（フレツチヤーFletche
r,ed.,テキストブツク オブ ラジオセラピー Textbo
ok of Radiotherapy,1980、3 rded.,リーとフエビンジ
ヤー Lee and Febinger,Phila,Chp.2、pp.180-219参
照）。（腸骨稜１カ所に与えられる100cGyは不都合な効
果を生まないと期待され、一般に苦痛を伴う転移を持つ
単独の骨に軽減放射療法として用いられる。）腸骨稜の
１回分照射の翌日、患者はヒトVIII-C因子を発現してい
る自己骨髄基質細胞の単一浮遊液の静脈注入を受ける。
それから患者の血漿は毎週検出できるヒトVIII-C因子レ
ベルについてモニターされる。
れた基質細胞の自家移植のため１つの腸骨稜を照射して
調製される。照射療法部位は10cm幅×10cm長さを超えな
い範囲で腸骨稜と坐骨の一部を合わせて選択されて膀胱
と直腸は片側だけ遮蔽されるか、あるいはそこの領域の
腸、膀胱、他の通常柔い組織の容積を最小限にするた
め、角度をつけたAP-PA範囲が選ばれる。1000cGyの１回
分の画分量（fraction size）が、AP-PA又は反対の斜角
法によつて骨髄のこの部分に与えられる。何回かに分け
られた（fractionated）放射療法はより適切であり、お
そらくヒトが高線量照射ニツチを調製するのにより容易
に耐えられる。基本的なヒト放射線生物学的パラメータ
は、１日500cGy2日間か、あるいは１日300cGyを10日間
は、1000cGyを１回と等しい同位効果（isoefect）を産
むはずである、と示唆している（フレツチヤーFletche
r,ed.,テキストブツク オブ ラジオセラピー Textbo
ok of Radiotherapy,1980、3 rded.,リーとフエビンジ
ヤー Lee and Febinger,Phila,Chp.2、pp.180-219参
照）。（腸骨稜１カ所に与えられる100cGyは不都合な効
果を生まないと期待され、一般に苦痛を伴う転移を持つ
単独の骨に軽減放射療法として用いられる。）腸骨稜の
１回分照射の翌日、患者はヒトVIII-C因子を発現してい
る自己骨髄基質細胞の単一浮遊液の静脈注入を受ける。
それから患者の血漿は毎週検出できるヒトVIII-C因子レ
ベルについてモニターされる。
もし選択された、１×108の注入細胞数が高線量照射
ニツチに選択的に接種するのに適切であるならば植えら
れた自己基質細胞によるヒトVIII-C因子産生が検出され
ることが期待される。もし血漿中にVIII-C因子が検出さ
れなければ、照射された部位への適切な接種が行われた
かどうか決定することが必要になる。
ニツチに選択的に接種するのに適切であるならば植えら
れた自己基質細胞によるヒトVIII-C因子産生が検出され
ることが期待される。もし血漿中にVIII-C因子が検出さ
れなければ、照射された部位への適切な接種が行われた
かどうか決定することが必要になる。
患者は植えつけに先がけてインビボ接種を供給基質細
胞のインジウムオキシン（indium oxine）ラベルによつ
てモニターされる。ガンマカメラの全身スキヤンが、植
えつけ後24時間行われ、細胞が優先的に高線量照射骨に
接種するかどうかが決定される。ネズミのモデルで行わ
れたアツセイはすでに高線量照射肢が優先的に注入基質
細胞を取りこみ、インジウムのラベルは48時間安定であ
ることを示した。インジウムオキシンの線量はホジキン
病 Hodgkin′s diseaseでリンパ球の定着のための核医
学のリンフオシントグラム lymphoscinto-gram スキ
ヤンニング技術で、また、脊髄の変質形成や骨髄繊維症
の患者のための赤血球腐骨形成実験で使われるものと同
程度の量が使用される。
胞のインジウムオキシン（indium oxine）ラベルによつ
てモニターされる。ガンマカメラの全身スキヤンが、植
えつけ後24時間行われ、細胞が優先的に高線量照射骨に
接種するかどうかが決定される。ネズミのモデルで行わ
れたアツセイはすでに高線量照射肢が優先的に注入基質
細胞を取りこみ、インジウムのラベルは48時間安定であ
ることを示した。インジウムオキシンの線量はホジキン
病 Hodgkin′s diseaseでリンパ球の定着のための核医
学のリンフオシントグラム lymphoscinto-gram スキ
ヤンニング技術で、また、脊髄の変質形成や骨髄繊維症
の患者のための赤血球腐骨形成実験で使われるものと同
程度の量が使用される。
もしVIII-C因子レベルが当初血漿中に検出されて、そ
れから急速に減少するなら、その原因が細胞接着の不安
定性のせいなのかあるいはベクターの発現不安定がこの
失敗の原因であるのかが決定される。ベクター不安定性
は標準的方法で、即ちインビトロでのVIII-C因子遺伝子
の発現ベクターの変形あるいは入れ換えで正すことがで
きる；いかなる変形も新しく外植されたヒト骨髄又はク
ローナルヒト骨髄基質細胞株によつて行われる作業に由
来するデータを使用する。接着の不安定性は、インビボ
で植えつけられて35Sの半減期と同じ期間の100日間観察
されたS35標識されたヒト骨髄基質細胞を用いてインビ
ボにおける実験によつて決定される。最初に高線量照射
骨で検出されるS35は、その高線量領域で100日間継続し
て検出されるはずである；スキヤンによつて検出できる
S35の減少は、接着部位での細胞の不安定性を示唆す
る。1000cGy後接着は適切に行われ、安定であることが
期待されるのだが、もしこのことがおこるなら、ニツチ
を調製する他の方法を使うことができる。
れから急速に減少するなら、その原因が細胞接着の不安
定性のせいなのかあるいはベクターの発現不安定がこの
失敗の原因であるのかが決定される。ベクター不安定性
は標準的方法で、即ちインビトロでのVIII-C因子遺伝子
の発現ベクターの変形あるいは入れ換えで正すことがで
きる；いかなる変形も新しく外植されたヒト骨髄又はク
ローナルヒト骨髄基質細胞株によつて行われる作業に由
来するデータを使用する。接着の不安定性は、インビボ
で植えつけられて35Sの半減期と同じ期間の100日間観察
されたS35標識されたヒト骨髄基質細胞を用いてインビ
ボにおける実験によつて決定される。最初に高線量照射
骨で検出されるS35は、その高線量領域で100日間継続し
て検出されるはずである；スキヤンによつて検出できる
S35の減少は、接着部位での細胞の不安定性を示唆す
る。1000cGy後接着は適切に行われ、安定であることが
期待されるのだが、もしこのことがおこるなら、ニツチ
を調製する他の方法を使うことができる。
基質細胞の高線量照射骨への適切な着床と安定なベク
ター発現にもかかわらず、適切なレベルのVIII-C因子検
出の失敗は、相対的基質細胞数の不適切を伴つているか
もしれない。この問題はS1/S1dマウス変異モデルで要求
されたものと同様なニツチをいくつか調製することによ
つて是正されるかもしれない。この方法論に従えば、上
で記述されたものと同じ高線量照射概要、何回かに分け
られた照射概要を用いて両方の腸骨稜か又は１腸骨稜と
１大腿骨がより大きなニツチとして調製される。それぞ
れトランスフエクトされVIII-C因子を発現する、ヒト骨
髄培養由来の供給基質細胞の１回、又は複数回の植えつ
けがそれから行われる。
ター発現にもかかわらず、適切なレベルのVIII-C因子検
出の失敗は、相対的基質細胞数の不適切を伴つているか
もしれない。この問題はS1/S1dマウス変異モデルで要求
されたものと同様なニツチをいくつか調製することによ
つて是正されるかもしれない。この方法論に従えば、上
で記述されたものと同じ高線量照射概要、何回かに分け
られた照射概要を用いて両方の腸骨稜か又は１腸骨稜と
１大腿骨がより大きなニツチとして調製される。それぞ
れトランスフエクトされVIII-C因子を発現する、ヒト骨
髄培養由来の供給基質細胞の１回、又は複数回の植えつ
けがそれから行われる。
VIII-C因子遺伝子を含むウイルスベクターが、感染あ
るいはトランスフエクシヨンいずれかによつてヒト基質
細胞内に導入することができる。組換えウイルスDNA
は、適当なヘルパーウイルスの存在下で増殖でき、感染
ビリオン（virion）にパツケージされることができる、
またあるいはパツケージング−欠陥ウイルス産生株にお
いて増殖されることができる。感染ウイルスは、例えば
マウスNIH/3T3やΨ２のような組換え体ウイルスDNAにト
ランスフエクトされた細胞株から産生することができ
る。細胞はセプコ Cepkoら、1984、セル Cell 37:105
7、に記述されたように育つことができて、感染は８μg
/mlのポリ−ブレン poly brene（シグマSigma）存在下
で行われる。
るいはトランスフエクシヨンいずれかによつてヒト基質
細胞内に導入することができる。組換えウイルスDNA
は、適当なヘルパーウイルスの存在下で増殖でき、感染
ビリオン（virion）にパツケージされることができる、
またあるいはパツケージング−欠陥ウイルス産生株にお
いて増殖されることができる。感染ウイルスは、例えば
マウスNIH/3T3やΨ２のような組換え体ウイルスDNAにト
ランスフエクトされた細胞株から産生することができ
る。細胞はセプコ Cepkoら、1984、セル Cell 37:105
7、に記述されたように育つことができて、感染は８μg
/mlのポリ−ブレン poly brene（シグマSigma）存在下
で行われる。
レトロウイルスは、１本鎖RNA分子を含み、ウイルス
感染に用いることができる；それらのRNAは細胞内で２
本鎖プロウイルスDNAに変換され、ロングターミナルリ
ピート（LTR）を作るためウイルスの配列の１末端が重
複化（duplication）された後宿主のゲノムに組み込ま
れる。組換え体レトロウイルスのヘルパー抜きのストツ
クは、ヘルパー細胞株を組換え体レトロウイルスベクタ
ーでトランスフエクシヨンした後、その細胞株で産生さ
れる。ヘルパー細胞株はそのレトロウイルスゲノムの組
みこまれたコピーを持つている。そのプロウイルスは、
組換え体ゲノムの複製とカプシド化（encapsidation）
に必要な実行機能のすべてを供給するが、自分自身のRN
Aをカプシド化する能力に欠けている。
感染に用いることができる；それらのRNAは細胞内で２
本鎖プロウイルスDNAに変換され、ロングターミナルリ
ピート（LTR）を作るためウイルスの配列の１末端が重
複化（duplication）された後宿主のゲノムに組み込ま
れる。組換え体レトロウイルスのヘルパー抜きのストツ
クは、ヘルパー細胞株を組換え体レトロウイルスベクタ
ーでトランスフエクシヨンした後、その細胞株で産生さ
れる。ヘルパー細胞株はそのレトロウイルスゲノムの組
みこまれたコピーを持つている。そのプロウイルスは、
組換え体ゲノムの複製とカプシド化（encapsidation）
に必要な実行機能のすべてを供給するが、自分自身のRN
Aをカプシド化する能力に欠けている。
SV40由来のプラスミドベクターは、サルCOS細胞内で
外染色体的に（extrachromosomally）複製することがで
きる（グルツマン Gluzman,1981、セル Cell 23:17
5）。様々な真核細胞内で（例えばヒト、サル、イヌな
ど）自律的に複製できるベクターがパウエルズPouwels
ら、eds.,“クローニングベクターズ Cloning Vector
s"、1985、Elsevier Sci.Pub.,B.V.,に記述されてお
り、ここでは参考文献として付記されている。動物細胞
用の、レプリコン（replicon）なしのベクターはたいて
い大腸菌用のレプリコンを持つ。そのようなベクター
は、パウエルズ Pouwelsらによつてやはり記述されて
いるのだが、動物細胞内で外染色体的に複製することが
できない；トランスフオーマント（transformant）は宿
主ゲノムに組みこまれて選択マーカーが発現した時のみ
分離され得る。動物細胞ベクターの詳細な記述はライビ
ーRigby,1983、J.Gen.Virol.64:255;エルダー Elder
ら、1981、Ann.Rev.Genet.15:295;サブラマニ Subrama
niら、1983、Anal.Biochem.135:1に見い出される。
外染色体的に（extrachromosomally）複製することがで
きる（グルツマン Gluzman,1981、セル Cell 23:17
5）。様々な真核細胞内で（例えばヒト、サル、イヌな
ど）自律的に複製できるベクターがパウエルズPouwels
ら、eds.,“クローニングベクターズ Cloning Vector
s"、1985、Elsevier Sci.Pub.,B.V.,に記述されてお
り、ここでは参考文献として付記されている。動物細胞
用の、レプリコン（replicon）なしのベクターはたいて
い大腸菌用のレプリコンを持つ。そのようなベクター
は、パウエルズ Pouwelsらによつてやはり記述されて
いるのだが、動物細胞内で外染色体的に複製することが
できない；トランスフオーマント（transformant）は宿
主ゲノムに組みこまれて選択マーカーが発現した時のみ
分離され得る。動物細胞ベクターの詳細な記述はライビ
ーRigby,1983、J.Gen.Virol.64:255;エルダー Elder
ら、1981、Ann.Rev.Genet.15:295;サブラマニ Subrama
niら、1983、Anal.Biochem.135:1に見い出される。
安定なトランスフオーマントの選択はたくさんの遺伝
的マーカーを用いて行うことができる、例えばマイコフ
エノリン酸（myco-phenolin acid）耐性をコードする大
腸菌gpt遺伝子、抗生物質G418耐性をコードするTN5由来
のneo遺伝子、DHFR-細胞の表現型をDHFR+に変えるネズ
ミ細胞又は大腸菌由来のdhfr配列、そしてTK-細胞の表
現型をTK+細胞にするヘルペス シンプレクス ウイル
ス herpes simplex virusのtK遺伝子など。
的マーカーを用いて行うことができる、例えばマイコフ
エノリン酸（myco-phenolin acid）耐性をコードする大
腸菌gpt遺伝子、抗生物質G418耐性をコードするTN5由来
のneo遺伝子、DHFR-細胞の表現型をDHFR+に変えるネズ
ミ細胞又は大腸菌由来のdhfr配列、そしてTK-細胞の表
現型をTK+細胞にするヘルペス シンプレクス ウイル
ス herpes simplex virusのtK遺伝子など。
強力なプロモーター、例えばSV40ウイルスの初期（ea
rly）と後期（late）プロモーター（Psv40E、Psv40
L）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（major l
ate promoter）（P AdmL）、7.5KDのタンパク質をコー
ドするバクシニア（vaccinia）遺伝子のプロモーター、
そしてネズミ メタロサイオナイン（metallothionei
n）遺伝子のプロモーターなど、の条件下で興味の対象
の遺伝子を入れることによつてその遺伝子が効果的に発
現するような、安定したヒト基質細胞株を作り上げるこ
とが可能である。
rly）と後期（late）プロモーター（Psv40E、Psv40
L）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（major l
ate promoter）（P AdmL）、7.5KDのタンパク質をコー
ドするバクシニア（vaccinia）遺伝子のプロモーター、
そしてネズミ メタロサイオナイン（metallothionei
n）遺伝子のプロモーターなど、の条件下で興味の対象
の遺伝子を入れることによつてその遺伝子が効果的に発
現するような、安定したヒト基質細胞株を作り上げるこ
とが可能である。
望む遺伝子のトランスフエクシヨンに用いられるだろ
うもう１つのベクターは、レトロウイルスpN2-FAT（ガ
ーバー Garverら、1987、同上）で、これは挿入された
遺伝子、この場合ヒトα１−抗トリプシンをコードする
遺伝子、の転写のためのSV40初期プロモーターを含んで
いる。このα１抗トリプシン遺伝子は制限酵素Hind III
とXho Iによる切断（部分的）と、もし必要ならばこれ
らの末端又は挿入遺伝子の末端の、常套技術に従つた変
形によつてとり除き望む遺伝子でおき変えられることが
できる。
うもう１つのベクターは、レトロウイルスpN2-FAT（ガ
ーバー Garverら、1987、同上）で、これは挿入された
遺伝子、この場合ヒトα１−抗トリプシンをコードする
遺伝子、の転写のためのSV40初期プロモーターを含んで
いる。このα１抗トリプシン遺伝子は制限酵素Hind III
とXho Iによる切断（部分的）と、もし必要ならばこれ
らの末端又は挿入遺伝子の末端の、常套技術に従つた変
形によつてとり除き望む遺伝子でおき変えられることが
できる。
レトロウイルス仲介の遺伝子移動は、例えばウイルソ
ンら、1988、Proc.Nat.Aca.Sci 85:3014に、複製欠陥レ
トロウイルスを用いて大人のラツト肝細胞内に遺伝子を
導入する方法が記述されているように、あらゆる適切な
方法によつて行うことができる。
ンら、1988、Proc.Nat.Aca.Sci 85:3014に、複製欠陥レ
トロウイルスを用いて大人のラツト肝細胞内に遺伝子を
導入する方法が記述されているように、あらゆる適切な
方法によつて行うことができる。
【図面の簡単な説明】 第１図は、植えつけ後１カ月で移植された供給マウスか
ら、または非移植照射マウスから外植された付着細胞の
説明図である。 第２図は、S1/S1dマウスから確立されたLTBMCからの造
血原細胞の成長を示すグラフである。 第３図は、ヒト第VIII因子を含むレトロウイルスベクタ
ーの模式図である。
ら、または非移植照射マウスから外植された付着細胞の
説明図である。 第２図は、S1/S1dマウスから確立されたLTBMCからの造
血原細胞の成長を示すグラフである。 第３図は、ヒト第VIII因子を含むレトロウイルスベクタ
ーの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター・エイチ・レバノン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01609，ウスター，ナイン・アイルスバ リー・ロード（番地なし) (56)参考文献 Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔ．，82 （1989）ｐ136−143 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 48/00 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】生物学的に活性な酵素をコードする遺伝子
でトランスフェクトされており、ヒト患者に導入したと
きに骨腔内表面に付着する、骨髄基質細胞。 - 【請求項２】酵素が血液中に通常見いだされる蛋白質で
あることをさらに特徴とする、請求項１記載の骨髄基質
細胞。 - 【請求項３】酵素がリンフォカイン、成長因子、造血因
子または血液凝固因子である、請求項１記載の骨髄基質
細胞。 - 【請求項４】酵素がヒト第VIII-C因子である、請求項１
記載の骨髄基質細胞。 - 【請求項５】酵素が抗−トロンビンIIIである、請求項
１記載の骨髄基質細胞。 - 【請求項６】基質細胞が患者自身の細胞に由来すること
をさらに特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項
記載の骨髄基質細胞。 - 【請求項７】請求項１ないし６のいずれか１項記載の骨
髄基質細胞において、ヒト患者に該細胞を導入すること
により、患者に不足している酵素を生物学的に活性な型
で産生させ患者の血流中に分泌させるための治療におい
て使用するための骨髄基質細胞。 - 【請求項８】請求項１ないし６のいずれか１項記載の骨
髄基質細胞および照射源において、患者に該細胞を導入
し、照射領域において該基質細胞は破壊せず造血系細胞
を破壊するために有効な量で骨、好ましくは長骨を照射
することにより、患者に不足している酵素を産生させ患
者の血流中に分泌させるための、治療において組み合わ
せて使用するための骨髄基質細胞および照射源。
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| CA2389488A1 (en) | 1999-10-29 | 2001-05-17 | Philadelphia Health & Education Corporation | Isolation and expansion of human marrow stromal cells |
| EP1234047A1 (en) * | 1999-12-01 | 2002-08-28 | Centre for Translational Research in Cancer | Drug inducible system and use thereof |
| WO2004044142A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Mesenchymal stem cells and methods of use thereof |
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-
1990
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- 1990-02-01 DE DE69012601T patent/DE69012601T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-02-01 ES ES90301044T patent/ES2060942T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-02 JP JP2024304A patent/JP2865354B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-22 US US08/408,536 patent/US5849287A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-19 US US08/914,631 patent/US5993801A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔ．，８２（１９８９）ｐ１３６−１４３ |
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| EP0381490A3 (en) | 1991-05-15 |
| JPH0314524A (ja) | 1991-01-23 |
| DE69012601D1 (de) | 1994-10-27 |
| DE69012601T2 (de) | 1995-01-19 |
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| EP0381490B1 (en) | 1994-09-21 |
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