DE69111919T2

DE69111919T2 - Verfahren zur unterdrückung der angiogenese von tumoren.

Info

Publication number: DE69111919T2
Application number: DE69111919T
Authority: DE
Inventors: Noel Bouck; Deborah Good; Peter Polverini; Farzan Rastinejad
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-10
Publication date: 1995-12-07
Anticipated expiration: 2011-01-11
Also published as: WO1991010424A1; US5192744A; JPH04504429A; CA2050290A1; EP0463152B1; DE69111919D1; DK0463152T3; EP0463152A4; ATE126065T1; EP0463152A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Das Gebiet dieser Erfindung ist die Angiogenese fester Tumore. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit Verfahren und therapeutischen Mitteln zum Hemmen der Tumorneovaskularisierung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Wenn sich eine normale Zelle zu einem Tumor entwickelt, erfährt sie eine Reihe von Veränderungen. Auf genetischer Ebene werden Onkogene aktiviert und vielfältige Tumor- Suppressorgene werden inaktiviert. Auf physiologischer Ebene wird das Wachstum verstärkt, die Immunität wird umgangen und eine Neovaskularisierung wird induziert. Die Neovaskularisierung scheint eine Voraussetzung dafür zu sein. Experimentelle feste Tumore sind ohne Blutzufuhr nicht in der Lage, über einige Millimeter Dicke zu wachsen. Die meisten natürlichen, festen Tumore entwickeln angiogene Faktoren, welche die neuen Gefäße anziehen, von denen sie abhängen. [Zu einer Erörterung angiogener Faktoren und dem ungelösten Problem, wie die Tumorneovaskularisierung zu hemmen ist, sie Folkman und Klagsburn, Science, 235:442-447 (1987).] Es ist zunehmend offensichtlich geworden, daß sobald sich ein fester Tumor im Körper gebildet hat, jeder Zunahme der Tumorzellenpopulation eine Zunahme neuer Kapillaren vorausgehen muß, die im Tumor zusammenlaufen. Demzufolge hat es fortlaufende Forschungsbemühungen gegeben, die auf die Frage gerichtet sind, was das ungestüme Kapillarenwachstum verhindert und was den Ruhezustand der Kapillaren-Endotheliumszellen normaler Gewebe aufrecht erhält.
Es hat ferner eine aktive Suche nach einem therapeutischen Mittel oder Mitteln stattgefunden, die eine Kapillarenrückbildung bewirken können. Das Auffinden eines derartigen Mittels hat sich als ein sehr schwieriges Problem erwiesen. Ungefähr der einzige nachweisbare Unterschied zwischen der Tumorangiogenese und anderen Typen einer nicht-neoplastischen Angiogenese ist eine größere Intensität und Beständigkeit der durch Tumore induzierten Angiogenese. Es ist allgemein anerkannt worden, daß ein therapeutisches Mittel, das eine Tumorneovaskularisierung wirksam hemmen kann, beim Einschränken oder sogar völligen Aufhalten des Tumorwachstums von großem Wert sein sollte.
In einer Untersuchung der Angiogenese führten Bouck et al. Versuche mit einer Reihe von Zellhybriden durch, welche aus Fusionen zwischen einer chemisch transformierten Hamster-Zellinie und normalen menschlichen Fibroblasten stammten [Cancer Res. 46:5101-5105 (1986)]. Diese Forscher berichteten, daß die Unabhängigkeit der Verankerung der Zellen (die bei diesen Zellen zu 100% der Fähigkeit zur Tumorbildung entspricht) anfänglich unterdrückt wird und daß sie das menschliche Chromosom 1 behalten müssen, um reprimiert zu bleiben. Diese Forscher fanden weiter, daß die unterdrückten Hybride in einem Ratten-Hornhauttest keine angiogene Antwort auslösen konnten. Im Gegensatz dazu wurde von denjenigen Hybriden, bei denen eine Unabhängigkeit der Verankerung exprimiert ist und die das menschliche Chromosom 1 verloren haben, gefunden, daß sie stark angiogen sind.
Dr. Noel Bouck, Dr. Peter J. Polverini und ihre Mitarbeiter in den Abteilungen für Mikrobiologie-Immunologie und Pathologie der Northwestern University Medical School berichteten über weitere Arbeiten mit ihren Hamster-Zellinien [Rastinejad et al., Proceedings, 78th Ann. Meeting, Amer. Assoc. Cancer Res., Bd. 228:61, Zusammenfassung 241 (März 1987)]. Zur Erforschung der Möglichkeit, daß Phänotypen der Unabhängigkeit der Verankerung und der Angiogenese von einem gemeinsamen Überträgerstoff abhängen, wurde der transformierende Wachstumsfaktor (TGF-B) verwendet. Zum Testen auf angiogene Aktivität wurden Mischversuche ausgeführt, um das Fehlen einer angiogenen Antwort auf ein Gemisch normaler Babyhamster-Nierenzellen (BHK) und einer TGF-B produzierenden transformierten Zellinie zu untersuchen. Es wurde gefunden, daß die normalen BHK-Zellen oder ihr konditioniertes Medium die Angiogenese hemmten, wenn sie zusammen mit transformierten Zellen in die Hornhaut eingeführt wurden. Es wurde gefolgert, daß in den nicht-krebserzeugenden Linien ausgeschiedene Faktoren die angiogene Antwort auf TGF-B unwirksam machen können.
1988 berichteten dieselben Forscher (Rastinejad et al.) über das Auffinden eines Angiogenesehemmers unter der Kontrolle eines Krebs-Suppressorgens [Proceedings, 79th Ann. Meeting, Amer. Assoc. Cancer Res., Bd. 29:45, Zusammenfassung 1809 (März 1988)]. Es wurde berichtet, daß bei einer normalen Babyhamster-Nierenzellinie (BHK) die Inaktivierung eines Suppressorgens durch Karzinogenbehandlung die Expression der Verankerungsunabhängigkeit und Tumorbildungfähigkeit erlaubte [Bouck und Head, In Vitro Cell and Devel. Biol. 21:463 (1985)]. Bezeichnenderweise fiel dieser Verlust einer Suppressorgenfunktion mit dem Ver- lust der Fähigkeit, einen Faktor zu entwickeln zusammen, welcher die Neovaskularisierung in der gesunden Rattenhornhaut hemmt, aber verankerungsabhängige Revertanten waren nicht in der Lage, Transformationsinfusionen zu unterdrücken und konnten den Hemmer nicht erzeugen. Unter Verwenden der Fähigkeit dieses unbekannten Faktors zum Hemmen der Wanderung von Rinder-Endotheliumszellen in einer modifizierten Boyden-Kammer, wurde der Faktor bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt. Diese Ergebnisse legten nahe, daß eine Funktion des in den normalen BHK- Zellen vorhandenen Krebs-Suppressorgens das Vermitteln der Freisetzung eines Hemmers der Angiogenese ist, welche für das fortschreitende Tumorwachstum lebensnotwendig ist.
Der BHK-Zellen-Angiogenesehemmer unbekannter Struktur entspricht einem 140 kd-Fragment menschlichen Thrombospondins [Good et al., UCLA Symposia, 21. Januar - 11. Februar 1989, J. Cellular Biochem. Suppl. 138:30, Zusammenfassung D215]. Eine starke Kreuzreaktion wurde bei dem 140 kd-BHK-Hemmer unter Verwenden eines monoklonalen Antikörpers auf Thrombospondin beobachtet und polyklonale Antikörper auf den BHK-Hemmer erkannten aus menschlichen Blutplättchen gereinigtes Thrombospondin.
Das Sequenzieren der Sequenz von 20 Aminosäuren am Amino- Terminus des vorstehend angeführten BHK-Hemmers zeigte, daß wenigstens 16 der 20 Reste mit einer bei Rest 294 beginnenden Sequenz des menschlichen Blutplättchen-Thrombospondins identisch waren. Weiter war die gesamte Aminosäurenzusammensetzung des BHK-Hemmers derjenigen außerordentlich ähnlich, welche aus der cDNA-Sequenz aus menschlichem Thrombospondin von Rest 294 bis zu ihrem Carboxylterminus vorhergesagt wurde. Ferner waren bei einem Hornhauttest sowohl menschliches Thrombospondin als auch der BHK-Hemmer in der Lage, die durch den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) induzierte Neovaskularisierung in derselben Konzentration zu blockieren. [Siehe Bouck et al., Current Commun. Molecular Biol. in "Recessive Oncogenes and Tumor Suppression", Cavenee et al., Hrsg., Seiten 179-183 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Rastinejad et al., Cell 56:345-355 (10. Februar 1989)].

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf die Behandlung mensch- licher Patienten mit wachsenden festen Tumoren und damit verbundener Neovaskularisierung und auf die Behandlung anderer Krankheiten gerichtet, wo eine Neovaskularisierung ein zum Krankheitsfortschritt beitragender Faktor ist. Ein bevorzugtes Verfahren dieser Erfindung zum Verzögern des Tumorwachstums umfaßt das Verabreichen eines Neovaskularisierungshemmers, der aus Fragmenten menschlichen Thrombospondins besteht, die zum Hemmen der Vaskularisierung befähigt sind, an den Ort des Tumors des Patienten. Beim Durchführen der Behandlung sollten die Hemmerfragmente in der Umgebung des behandelten Tumors in einer zum Verzögern der Vergrößerung des Tumors wirksamen Menge zugegen sein. Im Hinblick auf andere Krankheiten, die eine Kontrolle der Neovaskularisierung erfordern, sollte die verwendete Hemmermenge zum Hemmen der Gefäßneubildung an der Stelle, wo sie erfolgt, wirksam sein.

GENAUE BESCHREIBUNG

Beim Entwickeln der vorliegenden Erfindung wurde der BHK- Angiogenesehemmer wie bei Rastinejad et al. (1989), vorstehend zitiert, beschrieben gereinigt. Von diesem Hemmer wurde gefunden, daß er ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 140 kd ist, wobei das Glykoprotein der Aminosäurenstruktur des menschlichen Thrombospondinmonomerfragments von Rest 294 bis zu seinem Carboxylterminus eng entspricht. Der BHK-Hemmer wurde mit menschlichem Thrombospondin in seiner natürlichen trimeren Form unter Verwenden eines bei Bouck et al. (1986), vorstehend zitiert, beschriebenen Rattenhornhauttests verglichen. Die Testmaterialien wurden 1:1 mit Hydron (Poly-2- hydroxyethylmethacrylat) gemischt. Kleine, eine definierte Menge des Testmaterials enthaltende Pellets wurden entweder mit oder ohne 50 ng basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) in die Hornhaut des Rattenauges implantiert. Ein positives Ansprechen wurden vermerkt, wenn nach 7 Tagen ein anhaltendes Wachstum neuer Blutgefäße vom Hornhautrand zum Implantat beobachte wurde. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle A zusammengefaßt. TABELLE A Hemmung der Hornhaut-Neovaskularisierung durch Hamsterzellen-gp140-Hemmer und Thrombospondin positive Hornhäute/Summe Testmaterial Puffer gp140-Hemmer Thrombospondin
Wie von den voranstehenden Daten gezeigt wird, besitzt menschliches Thrombospondin eine dem gp140-BHK-Hemmer vergleichbare Hemmaktivität.
Menschliches Thrombospondin (HTSP) ist ein Glykoprotein, das in den alpha-Granula von Blutplättchen gefunden wird. Es wird bei der Aktivierung durch verschiedene Agonisten aus Blutplättchen ausgeschieden. HTSP ist in trimerer, monomerer und fragmentierter Form ausgiebig untersucht worden. [Siehe zum Beispiel Santoro und Frazier, Methods in Enzymology, 144:438-446 (1987); Majack und Bornstein, Cell Membranes Methods - Reviews, 3:55-77 (1987), und Haverstick et al., Biochemistry 23:5597-5603 (1984)]. Die zitieren Majack und Bornstein stellen auf Seite 59, Figur 2, die Verwandtschaft des natürlichen Trimers mit Fragmenten des enzymatischen Abbaus schematisch dar. Das menschliche Thrombospondingen ist kloniert worden und das Thrombospondinmonomer ist sequenziert worden. [Siehe Waller und Hynes, J. Cell Biol. 103:1635-1648 (1986); Donoviel, J. Biolog. Chem. 263:18590-18593 (1988), und Hennessy et al., J. Cell. Biol. 108:729-736 (1989).]
Thrombospondin ist in seiner natürlichen trimeren Form ein 420 kd-Glykoprotein. Die einzelnen Monomeren, die zum Bilden der trimeren Struktur disulfidverknüpft sind, besitzen eine lineare Reihe getrennter funktioneller Domänen, welche mehrfache Bindungsstellen enthalten. Diese Domänen schließen eine Heparin-bindende Domäne, die mit einem Aminoterminus-Endteil verbunden ist, eine Plasminogen-bindende Domäne im zentralen Bereich und eine Blutplättchen-bindende Domäne ein, die mit einem Carboxylterminus-Endteil verbunden ist. Es wird erneut auf Majack und Bornstein, vorstehend zitiert, Seite 59, Figur 2, Bezug genommen.
Wie von Santoro und Frazier (1987), Majack und Bornstein (1987) und Haverstick et al. (1984), alle vorstehend zitiert, beschrieben, können Thrombospondinfragmente leicht durch enzymatische Verdaus hergestellt werden. Enzyme, wie etwa Chymotrypsin, Thrombin, Trypsin, Elastase und Thermolysin spalten 25 bis 35 kD-Segmente aus dem Aminoende der Monomeren. Die verbleibenden 140 kd-Fragmente bleiben in trimerer Form vereint. Wenn Chymotrypsin oder Thermolysin zur Enzymolyse eingesetzt werden, werden die Monomeren ebenfalls zu 120 kD-Fragmenten verkleinert, deren Aminoenden nicht nur wie beschrieben beschnitten sind, sondern bei denen auch ein 18-25 kD-Segment von ihren Carboxylenden abgeschnitten ist. Das 25-35 kD-Fragment enthält eine Heparin-bindende Stelle, während das 18-25 kD-Fragment eine Blutplättchen-bindende Stelle enthält. Ein Gemisch sowohl der 120 kd- als auch der 140 kd-Fragmente kann in demselben Verfahren hergestellt werden.
Die 140 kd- und 120 kD-Fragmente werden üblicherweise in trimerer Form erhalten und können durch Inkubation mit Dithiothreit in die monomere Form gespalten werden. Wenn das Trimer des 140 kd-Fragments oder das Trimer des 120 kd-Fragments mit Chymotrypsin in Anwesenheit von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enzymatisch behandelt wird, werden zwei weitere Fragmente, ein sich vom Aminoende des 120 kd-Fragments erstreckendes 70 kD-Fragment und ein sich vom Carboxylende des 120 kd-Fragments erstreckendes 50 kD-Fragment erhalten. Das 70 kD- und das 50 kd-Fragment liegen in monomerer Form vor. Das 50 kD- Fragment enthält die Bindungsregion für Fibrinogen. Das 70 kD-Fragment enthält die Region, die als Angiogenesehemmer wirkt, und ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendbar. Wenn dies zutrifft, kann erwartet werden, daß eine weitere Fragmentierung des 70 kD-Fragments möglich sein sollte.
Es gibt Verfahren zum Bestätigen, ob die Hemmaktivität gegen eine Neovaskularisierung erhalten ist oder nicht, was es somit einfach macht, die Brauchbarkeit für die Zwecke dieser Erfindung zu bestätigen. Verfügbare Verfahren schließen den Rattenhornhauttest ein. Ausgewählte Fragmente können durch gentechnische Verfahren als rekombinante Fragmente hergestellt werden, da das Gen für HTSP isoliert und kloniert worden ist (Zitate vorstehend angegeben). Von anderen Änderungen wird ebenfalls erwartet, daß sie machbar sind. Diese schließen entglykosylierte Formen des HTSP-Trimers, Monomers oder von Fragmenten die durch bekannte Verfahren zum entglykosylieren von Glykoproteinen hergestellt werden können [siehe Edge et al., Analyt. Biochem. 118:131-137 (1981) zu einem Entglykosylierungsverfahren mittels Trifluorethansulfonsäure.] Wahlweise können das HTSP-Gen für das Monomer oder Gensegmente für Fragmente desselben in Zellen exprimiert werden, die nicht zu einer Glykosylierung des Monomers führen. Obschon es bevorzugt sein kann, glykosylierte Formen der HTSP-Hemmer dieser Erfindung zu verwenden, wird nicht angenommen, daß dies wesentlich ist. Weiter können zur Herstellung von Hemmern durch biochemische oder gentechnologische Verfahren entglykosylierte Formen weniger teuer als glykosylierte Formen sein.
Da Thrombospondin ein Mehrfachdomänen-Glykoprotein mit anderen Körperfunktionen ist, ist es bevorzugt, die Hemmer dieser Erfindung durch extravaskuläre Verfahren zu verabreichen. Es ist zum Beispiel von HTSP bekannt, daß es eine Blutplättchenaggregation bewirkt und es wäre daher nicht ratsam, HTSP in seiner natürlichen Form auf einem parenteralen Weg zu verabreichen. Durch vorstehend beschriebenes Abschneiden von HTSP-Fragmenten oder durch Verwenden einer ausgewählten Sequenz des HTSP-Gens zum Erzeugen beschnittener Formen können Hemmer hergestellt werden, die hauptsächlich die aktive Region enthalten, welche die Angiogenese hemmt. Es kann daher sicher sein, derartige modifizierte Fragmentformen auf parenteralen Wegen zu verabreichen.
Wirksame extravaskuläre Wege stehen zur Verfügung. Bei inneren Tumoren kann der Hemmer durch bekannte Techniken direkt implantiert werden. Er kann zum Beispiel mit langsam freisetzenden Polymeren, wie etwa Poly-2-hydroxyethylmethacrylat oder Methylenvinylacetatcopolymerisat kombiniert werden. Wenn der Hemmer mit derartigen Verzögerungsmitteln kombiniert wird, kann er in Form von Pellets mit bekanntem Hemmergehalt zubereitet werden und ausgewählte Mengen der Pellets können direkt in den Tumor implantiert werden. Bei Hauttumoren, welche ebenfalls als feste Tumore eingeordnet werden, kann der Hemmer mit einer topischen Salbe kombiniert und direkt auf die Tumoroberfläche aufgebracht werden. Verfahren zum Herstellen derartiger Verabreichungsträger, sei es zur Pelletimplantation oder zur direkten Oberflächenanwendung, werden in den folgenden Beispielen weiter beschrieben. Andere Verfahren, die brauchbar sein können, schließen die Zubereitung des Hemmers in Aerosolform zur Anwendung auf Lungentumore mittels Standardvorrichtungen ein, die von Atemwegstherapeuten zum Zuführen von Aerosolen eingesetzt werden.
Im allgemeinen wird angenommen, daß die Hemmer dieser Erfindung zum Hemmen des Wachstums rasch wachsender Tumore wie etwa Melanome von größtem Wert sind. Alle festen Tumore hängen jedoch im Wachstum vom Entstehen neuer Kapillargefäße ab und von dem Verfahren dieser Erfindung wird angenommen, daß es allgemein auf innere, feste Tumore und auf alle in der Haut wachsende Krebsformen anwendbar ist. Wenn ein fester Tumor chirurgisch entfernt wird, kann an den Ort des entfernten Tumors ein Implantat verbracht werden, wodurch die Angiogenese eines etwaigen, sich rückbildenden Tumors an derselben Stelle gehemmt wird.
Die zum Verringern der Vergrößerung eines Tumors erforderliche Dosis schwankt mit der Größe und dem Ort des Tumors. Die Mengen können von 1 Mikrogramm (ug) bis 1 Milligramm (mg) reichen. Es wird angenommen, daß bevorzugte Mengen üblicherweise von Mengen von 100 ug bis 800 ug je Dosis reichen. Im allgemeinen wird auf die Tumorstelle eine Menge angewandt, die zum Verzögern des Tumorwachstums ausreicht. Die zu diesem Zweck erforderliche Menge kann durch Standardverfahren überwacht werden. Wenn der Tumor trotz der Anwendung des Hemmers immer noch wächst, werden zusätzliche Mengen verabreicht. Vorzugsweise wird eine zum im wesentlichen Aufhalten der Zunahme der Tumorgröße oder in manchen Fällen zum Verringern der Tumorgröße ausreichende Dosis verwendet. Ein derartiges Ergebnis kann durch eine Anzahl Verfahren beobachtet werden, die vom Ort und Typ des betreffenden Tumors abhängen. Diese Verfahren schließen ein: visuelle Beobachtung von Oberflächentumoren, Palpation, radiologische Messung (d.h. Röntgenstrahlen bei Lungentumoren, Mammogramme bei Brusttumoren usw.), Verwendung von Ultraschall mit computergestützten tomographischen Sannern (CAT-Scans), Abbildung mit magnetischer Resonanz, Radionuklidscannen und andere klinische Standardtechniken, die zum Überwachen besonderer Tumortypen verwendet werden.
Außer festen Tumoren können die Hemmer dieser Erfindung als therapeutische Mittel für andere Krankheiten verwendet werden, an denen angiogene Fehlfunktionen beteiligt sind. Diese Erkrankungen schließen eine Diabetes-Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Psoriasis, Angiofibrome, Immun- und Nichtimmunentzündung (einschließlich rheumatoider Arthritis), Kapillarenwachstum innerhalb atherosklerotischer Plaques, Hämangiome, Karposi-Sarkom, Endometriose und unerwünschte Schorfbildung bei der Wundheilung ein. Die zu verwendende Menge sollte ausreichend sein, um die Angiogenese an der Stelle, an der sie auftritt, teilweise oder vollständig zu verhindern.
Die Herstellung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbarer Hemmer und ihre Verabreichungsweisen werden durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Herstellung reinen menschlichen Thrombospondins (HTSP) aus Vollblut

Menschliches Vollblut, vorzugsweise in ACD (8 g/l Zitronensäure, 22 g/l Trinatriumcitrat, 24,5 g/l Glucose, pH 4,5), 9 Teile Blut auf 1 Teil ACD, frisch gesammelt, wird 15 Minuten bei Raumtemperatur und 180 x g zentrifugiert. Das blutplättchenreiche Plasma (PSP) wird in ein neues Röhrchen überführt und 1/5 Volumen ACD wird zugesetzt. Die Plättchen werden durch 10 Minuten Zentrifugation bei Raumtemperatur und 1100 x g pelletiert und anschließend in Puffer, der 0,15 M NaCl, 4,3 mM K&sub2;HPO&sub4;, 4,3 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 24 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mM Glucose, pH 6,5, enthält, erneut suspendiert. Die Blutplättchen werden zweimal in dem vorstehenden Puffer gewaschen und anschließend in 8 ml TCS-Puffer (0,15 M NaCl, 0,02 M Tris, pH 7,6, 1 mM CaCl&sub2;), der 5 mM Glucose je Einheit Blutplättchen enthält, erneut suspendiert. Die gewaschenen Blutplättchen werden durch Zusatz von 0,5 E/ml menschlichem Thrombin (Sigma) aktiviert und 1-2 Minuten bei 37ºC inkubiert, bis große Aggregate gebildet sind. Die Reaktion wird durch Zugabe von 4 E/ml Hirudin und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Sigma) angehalten. Das Material wird bei 1000 x g zentrifugiert. Fibronectin wird aus dem Überstand durch Chromatographie an mit TCS-Puffer bei 4ºC äquilibrierter Gelatine-Sepharose (Pharmacia) entfernt. Das durchfließende Material wird gesammelt und eine mit TCS-Puffer äquilibrierte Heparin-Sepharosesäule (Pharmacia) wird damit beladen und mit 0,25 M NaCl gewaschen und das Thrombospondin wird durch Erhöhen der NaCl-Konzentration auf 0,6 M eluiert. Zum Entfernen niedermolekularer Verunreinigungen wird eine mit TCS-Puffer äquilibrierte Bio-Gel A-Säule (Bio Rad Laboratories) von 0,5 m damit beladen. Das Thrombospondin eluiert in dem Leervolumen und wird bei -70ºC in 20% Gew./Vol. Sucrose enthaltendem TCS-Puffer bei -70ºC gelagert. [Siehe Santoro und Frazier, Methods in Enzymology, 144:438-446 (1987), zu analogen Verfahren.]

BEISPIEL 2

Verkleinerung reinen menschlichen Thrombospondins (HTSP) auf seine monomere Form

Reines Thrombospondintrimer wird in 25 mM Dithiothreit (DTT) (oder eine höhere DTT-Konzentration, wenn es als notwendig befunden wird) 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Das DTT wird anschließend aus der Thrombospondinzubereitung durch Dialyse gegen zwei Wechsel eines 1000fachen Überschusses TCS-Puffer bei 4ºC entfernt. Ein Teil der Zubereitung wird auf eine vollständige Verkleinerung der trimeren 450 kd-Form zu der monomeren 190 kD-Form auf einem 6%igen, nicht-verkleinernden Polyacrylamidgel geprüft.

BEISPIEL 3

Derivatisierung der 140 kD- und 120 kDFragmente menschlichen Thrombospondins

Zum Herstellen eines 140 kd-Thrombospondinfragments aus dem mit 180 kd wird das calciumarme Monomer 1 Stunde bei 37ºC mit 4 E/ml Thrombin behandelt. Wahlweise kann das calciumarme Thrombospondinmonomer mit Trypsin, das mit L- Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon behandelt wurde (TPCK-behandeltes Trypsin), 5 Minuten bei 22ºC und einem Verhältnis Enzym zu Substrat von 1:20 behandelt werden. Die Reaktionen werden durch Verwenden von 1 mM Diiodpropylfluorphosphat (DFP) für das Thrombin angehalten. Die Fragmente können durch Gelchromatographie über eine bei 4ºC äquilibrierte Heparin-Sepharosesäule weiter gereinigt werden. Die 140 kd-Fragmente, denen die N-terminale Heparin-bindende Domäne fehlt, eluieren im Durchfließenden, wogegen unverdautes, ganzes Thrombospondin zurückgehalten wird. Wahlweise kann die Ionenaustauschchromatographie zum Trennen der beiden Sorten verwendet werden.
Das 120 kd-Fragment, dem sowohl die N-terminale 30 kD- als auch die C-terminale 25 kD-Domäne fehlt, wird durch 120 Minuten Behandlung von Thrombospondin mit 4 E/ml Thrombin bei 22ºC hergestellt. Die Reaktion wird wie vorstehend angehalten. [Siehe Lawler et al., J. Cell. Biol. 260:3762 (1987) zu einem ähnlichen Verfahren.] Bei beiden vorstehenden Reaktionen können die gewünschten Fragmente durch Ultrafiltration durch eine YM-Membrane (Amicon) oder durch Gelfiltration weiter gereinigt werden.

BEISPIEL 4

Derivatisierung von Thrombospondin-70 kD-Untereinheiten

Zum Herstellen monomerer 70 kD-Thrombospondinfragmente wird calciumarmes Thrombospondin in TBS (0,02 M Tris, pH 7,6, 0,15 M NaCl), das entweder 5 mM EDTA oder 10 mM Mg&spplus;&spplus; enthielt [Dixit et al., J. Biol. Chem. 261:1962 (1986)], dialysiert, gefolgt von 15 Minuten Verdau dieses calciumarmen Thrombospondins mit 0,5% Chymotrypsin (Sigma) bei 25ºC. Die Reaktion kann wie in Beispiel 2 beschrieben oder durch ein anderes geeignetes Reagenz beendet werden. Der Verdau wird auf eine mit TBS äquilibrierte Sephadex G-100-Säule aufgebracht und das 70 kD-Trimer wird aus der Säule eluiert [Galvin et al., J. Cell Biol. 104:1413 (1987)].

BEISPIEL 5

Verkleinerung der trimeren Thrombospondinfragmente zu den monomeren 140 kd- und den 120 kD- und 70 kD-Fragmenten

Falls die 140 kd-, 120 kD- und 70 kD-Fragmente in trimerer Form vorliegen, können sie mittels der Verfahren von Beispiel 2 zu ihren monomeren Formen reduziert werden.

BEISPIEL 6

Entglykosylierung unversehrten Thrombospondins und seiner trimeren oder monomeren Fragmente

N-Verknüpfte Oligosaccharide können durch die folgende Vorschrift entfernt werden. Eine Probe von 20 ug (2 ug/ml) ganzem Thrombospondin oder einem seiner Fragmente, das wie vorstehend in 0,5% SDS isoliert wurde, wird 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Auf diese Inkubation folgend werden 10,8 ul 0,55 M Natriumphosphat, pH 8,6, zusammen mit 3 ul 100 mM 1,10-Phenanthrolinhydrat in Methanol und 5 ul 7,5% NP-40 zugesetzt. N-Glykanase (250 E/ml, Genzyme) wird auf eine Endkonzentration von 2,5 u/ml zugesetzt. Die Probe wird 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Auf diese Inkubation folgend wird die Probe auf den Verlust der Kohlenhydrat-Struktureinheit durch Analyse auf 6% SDS-Polyacrylamidgel geprüft [Laemmli, Nature 227:680 (1970)]. Die unglykosylierte Probe wird auf eine mit PBS bei 4ºC äquilibrierte Superose-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) aufgebracht und die Proteine werden in demselben Puffer eluiert. Der Hauptproteinpeak bei einem Molekulargewicht, das einem ungefähr 6% geringeren Molekulargewicht entspricht als demjenigen, welches von dem glykosylierten Peptid erwartet wird, wird abgenommen und mittels eines Centricon-30-Mikrokonzentrators gegen TCS dialysiert. Ein alternatives Verfahren, das zusammen mit dem vorstehenden Verfahren zum Entfernen O-verknüpfter Kohlenhydrate verwendet werden kann, wird bei Edge et al., Analyt. Biochem. 118:131-137 (1981), beschrieben.

BEISPIEL 7

Verfahren zum Herstellen injizierbarer oder implantierbarer, langsam freisetzender Pellets

Mikrogrammengen HTSP (Monomer oder Trimer), das wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben hergestellt wurde, oder ein aktives TSP-Fragment, das wie in Beispiel 3 bis 6 beschrieben hergestellt wurde, werden in eines von mehreren langsam freisetzenden, nichtentzündlichen Polymeren eingebaut. Die beiden am häufigsten verwendeten sind Poly-2-hydroxyethylmethacrylat (Hydron Chargen-Nr. 110, Interferon Sciences, Inc., New Brunswick, N.J.) und Ethylen-Vinylacetat-Polymer (EVA, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI). Beide Materialien wirken mit gleicher Wirksamkeit. [Siehe Langer und Folkman, Nature 263:797-800 (1976), zu Beschreibungen von Zubereitungen und Verwendung dieser Verzögerungsmittel.]
Zum Beispiel werden sterile Hydron -Gießlösungen durch Lösen des Hydronpulvers in absolutem Ethanol (12% Gew./Vol.) bei 37ºC unter 24 h fortwährendem Rühren hergestellt. Ein gleiches Volumen Hydron und aktives Mittel (z.B. HTSP) (50%) werden vereinigt und 10 ul Lösung werden auf die Oberfläche eines sterilen, 1,2 cm langen Teflon -Stabes (DuPont Corp.) mit 3,2 mm Durchmesser pipettiert, welcher auf die Oberfläche einer Petrischale geklebt war. Nach 1-2 h Trocknen können die Scheiben mit ungefähr 2 mm Durchmesser bei 4ºC aufbewahrt oder sofort implantiert werden.
Wahlweise werden EVA-Pellets durch ihr Lösen zu 40 Gew.-% in Methylenchlorid bei 37ºC hergestellt. Das aktive Mittel (z.B. HTSP) wird anschließend der EVA-Lösung zugesetzt und kleine (10 ul) Mengen werden in Glasformen pipettiert und im Vakuum luftgetrocknet. Getrocknete Pellets werden ausgiebig in Methanol mit 10-15 Wechseln gewaschen, um etwaiges freies Methylenchlorid zu entfernen. Die Pellets sind darauf zur Verabreichung bereit.

BEISPIEL 8

Verabreichung langsam freisetzender Pellets

Wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellte Pellets können unter Verwendung eines Trokars mit weiter Bohrung (16er Maß) implantiert werden, um die Pellets genau zu positionieren. Unter Betäubung wird der Schaft des Trokars mit Pellets, die 1 ug- bis 1 mg-Mengen TPS-Monomer oder Trimer oder aktive Fragmente enthalten, beladen. Mehrere Pellets können an einer einzigen Stelle oder an mehrfachen Stellen innerhalb des Tumors angebracht werden. Zum Untersuchen der Wirksamkeit der Hemmantwort werden angiographische Untersuchungen ausgeführt, um sicherzustellen, ob bei den Tumorgefäßen irgendeine Verzögerung oder Regression stattgefunden hat. Sobald der Tumor das Wachsen eingestellt hat oder eine deutliche Größenverringerung erfahren hat, kann er entfernt werden. Wahlweise kann die Implantation wiederholt werden, insbesondere bei großen Tumoren, wo zum Verringern der Tumorgröße ein längeres Aussetzen gegenüber dem Hemmer notwendig ist.

BEISPIEL 9

Behandlung von Hautkrebs

Die hierin beschriebenen Hemmer können auch in Kombination mit gereinigtem Kollagen zu Salben oder Suspensionen formuliert werden, um halbfeste oder Suspensionsträger herzustellen. Herkömmliche ölige, den Hemmer enthaltenden Formulierungen können als Salbe verwendet werden. Derartige Formulierungen setzten den Hemmer an der Stelle des Hautkrebses mit Langzeitwirkung frei.
Aus im Handel erhältlichen Quellen erhaltenes gereinigtes menschliches Hautkollagen kann in den Salben verwendet werden. Der Hemmer kann in die Kollagenlösung eingearbeitet werden, wo die Kollagenhemmerlösung unter alkalischen Bedingungen geliert. Dünne Filme können durch Verteilen des flüssigen Kollagenhemmers auf Glasplatten hergestellt werden. Die dünnen Folien können anschließend oben auf einen auf der Hautoberfläche wachsenden Krebs gelegt und mit einer halbdurchlässigen Membran abgedeckt werden, um den Luftaustausch zu erlauben. Wahlweise kann der Hemmer zusammen mit Dimethylsulfoxid zum Erhöhen der Absorption des Hemmers in den Hauttumor in eines von mehreren Materialien auf Vaselinegrundlage eingearbeitet und als Salbe verwendet werden, wobei sie mehrere Male täglich auf den Oberflächenkrebs aufgetragen werden kann. Es kann nötig sein, die Oberfläche des Tumors anzuritzen, um das Eindringen des Hemmers in das Neoplasma zu verstärken.
Die Typen Oberflächenkrebs, wo dies nützlich sein könnte, schließen das Basalzellenkarzinom, Plattenepithelkarzinom und Melanom ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Häufigkeit der topischen Anwendung kann durch regelmäßiges Prüfen auf eine Verringerung der Tumorgröße empirisch beurteilt werden.

BEISPIEL 10

Testverfahren zum Bestätigen der Hemmwirkung von TSP-Fragmenten

Aus menschlichen Blutplättchen oder aus Segmenten des menschlichen Thrombospondingens hergestellte menschliche Thrombospondinfragmente können zum Bestätigen der Hemmaktivität gegen Angiogenese durch eine Anzahl eingeführter Verfahren getestet werden. Von allen folgenden Verfahren wird angenommen, daß sie zu diesem Zweck brauchbar sind. Zum Bestätigen der Hemmwirkungsbestimmung können zwei oder mehr der folgenden Bestimmungen verwendet werden.

A. Untersuchung von TSP-Fragmenten auf Hemmwirkung in der Rattenhornhaut

Das zum Bilden einer Hornhauttasche verwendete chirurgische Verfahren ist im wesentlichen mit dem zuerst von Gimbrone et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:413-427 (1974), für die Kaninchenhornhaut beschriebenen identisch. F344- Inzucht-Ratten stehen zur Routineverwendung zur Verfügung, jeder Rattenstamm ist aber geeignet. Männliche oder weibliche, 150-200 g wiegende Ratten werden mit Pentobarbitalnatrium (29 mg/kg Körpergew.) betäubt. Die Augen werden durch Klammern des oberen Augenlids mit einem nicht-traumatischen Hämostaten an Ort und Stelle festgehalten und treten leicht hervor. Mittels einer Bar Parker-Klinge Nr. 11 wird ein Einschnitt von 1,5 mm ungefähr 1 mm vom Mittelpunkt der Hornhaut in das Stroma aber nicht durch es hindurch ausgeführt. In Abhängigkeit von der Erfahrung kann dieses Verfahren mit oder ohne Verwendung eines Präpariermikroskops durchgeführt werden. Ein gebogener, ungefähr 1,5 mm breiter und 5 mm langer Irisspatel (Nr. 10093-13, Fine Science Tools, Inc., Belmont, CA) wird anschließend unter die Lippe des Einschnitts eingeführt und durch das Stroma wird zum äußeren Augenwinkel sachte stumpf aufgeschnitten. Leichter Fingerdruck gegen den Augapfel hilft, ihn während des Aufschneidens festzuhalten. Der Spatel ist vormarkiert, so daß der Stiel nicht mehr als 2,5 mm seitlich in das Stroma eindringt. Sobald die Hornhauttasche hergestellt ist, wird der Spatel entfernt und die Entfernung zwischen dem Hornhautrand und dem Taschenunterteil wird gemessen, um sicherzustellen, daß sie nicht näher als 1 mm ist. Das Taschenunterteil ist typischerweise zwischen 1-1,5 mm vom Hornhautrand entfernt. (Weiteres Vergrößern der Taschentiefe als soviel führt oft zu einer falschen positiven Antwort. Wenn ferner die Einschnittiefe der inneren Oberfläche der Hornhaut zu nahe liegt, tritt beständig eine unspezifische Entzündung auf.)
Die ersten 24-48 Stunden nach der Implantation sind kritisch. Falls eine unspezifische Entzündung auftreten sollte, zeigt sie sich während dieser Zeit. In solchen Fällen zeigt eine Hornhauttrübung und die Anwesenheit eines gelblichen Exsudats eine Entzündung an. So lange Keimfreiheit aufrecht erhalten wird und ein Trauma während des Eingriffs auf ein Mindestmaß zurückgeführt wird, ist eine unspezifische Entzündung selten ein Problem. Selbst bei den am sorgfältigsten ausgeführten Verfahren tritt ein vorübergehendes Hornhautödem auf. Dieses löst sich jedoch üblicherweise innerhalb 24 h auf. Unmittelbar vor dem Implantieren von Hydron- oder EVA-Pellets, welche die zu testenden reinen TSP-Fragmente enthalten, werden die Pellets mit einem Tropfen Ringer-Lactat-Lösung rehydratisiert. Pellets werden anschließend unten am Taschenunterteil angebracht, welche sich anschließen spontan schließt. Nicht mehr als die Hälfte der Tasche sollte mit Implantatmaterial gefüllt sein. Bei mehr als diesem verursacht das sich daraus ergebende vorübergehende Ödem die spontane Ausstoßung des Implantats. Die Hornhäute werden täglich oder an wechselnden Tagen mit Hilfe eines Stereomikroskops zum Überwachen der Antworten untersucht.

Bewerten des Ansprechens der Gefäße:

Der Hornhaut-Biotest wird manchmal als qualitativer Test angesehen, aber ein zahlenmäßiges quantitatives Maß ist zur Verwendung mit diesem Modellsystem ersonnen worden. Das Ansprechen wird üblicherweise an dem Tag, an dem die Tiere getötet werden, 5-7 Tage nach der Implantation, bewertet. Positive Antworten werden vermerkt, wenn ein anhaltendes Einwachsen von Kapillarschleifen oder Keimen festgestellt wird. Negative Bewertungen werden Antworten zugeordnet, wo entweder kein Wachstum festgestellt wird oder, wenn ein gelegentlicher Keim oder eine Haarnadelschleife beobachtet wird, ohne Beweise eines anhaltenden Wachstums festgestellt wird. Gelegentlich (in 10% der Fälle) werden bei Proben, die normalerweise positiv oder hemmend sind, Antworten erhalten, die weder eindeutig positiv noch negativ sind. In diesen Fällen können die Antworten gestaffelt werden. Mehrere Faktoren können dafür verantwortlich sein, d.h. leichte Unterschiedene in der Lage der Implantate innerhalb der Hornhaut, Schwankungen in der Menge und der Menge des zu testeten Materials. (Diese Technik schließt an sich einen Schwankungsgrad ein, aber dieser kann auf einem Mindestmaß gehalten werden).

Herstellung von mit kolloidalem Kohlenstoff perfundierten Ganzpräparationen

Permanente Aufzeichnungen des Ansprechens von Gefäßen werden auf die Perfusion mit Ausziehtusche folgend durchgeführt. Im Handel erhältliche, wasserfeste Ausziehtusche ist brauchbar. Die Perfusion wird mit einem einfachen Druckgefäß bewerkstelligt das zum Aufrechterhalten eines Drucks von 120 mmHg befähigt ist. Eine Perfusion wird über die Bauchschlagader durchgeführt, indem 100-200 ml warme (37ºC) Ringer-Lactat-Lösung je 150 g Ratte eingeführt werden. Sobald die Schnauze des Tiers völlig weiß geworden ist, werden ungefähr 20-25 ml Tusche injiziert, bis der Kopf und die Brustorgane völlig schwarz geworden sind. Die Augen werden anschließend sorgfältig ausgeschält und 24 h in Karnovskysches Fixativ halber Stärke oder neutrales gepuffertes Formalin gelegt. Am nächsten Tag werden die Hornhäute von dem umgebenden Augapfel und der darunterliegenden Iris abgeschnitten, in zwei Teile zerschnitten und lose zwischen zwei Glasplättchen befestigt, wo sie sachte geglättet werden. Die Hornhäute werden mit einem mit einer Kamera ausgerüsteten Präparationsmikroskop photographiert. Gewünschtenfalls kann die Antwort in Zahlen ausgedrückt werden. Zum Beispiel kann die Gefäßlänge direkt mittels lichtdurchstrahlter photographischer 4x5-Negative bei 10facher Vergrößerung gemessen werden. Drei radial ausgerichtete Messungen werden mittels eine Noniusschieblehre angestellt; zwei dieser Messungen schließen Gefäße ein, die sich am Umfang des Radius befinden und die dritte schließt die größten Gefäße entlang des Mittelpunkts des Radius ein. Die drei Messungen werden zum Liefern eines einzigen Längenmaßes für jede Antwort gemittelt. Unterschiede zwischen Gruppen werden mittels eines Student-t-Tests verglichen.

B. Tests auf angiogene Aktivität in vitro Chemotaxie von Endotheliumszellen:

Die Endotheliumszellwanderung kann mittels einer modifizierten Boyden-Kammer mit 48 Näpfchen (Nucleopore Corp.) bestimmt werden, die mit Nucleoporemembranen (5 u Porengröße) ausgerüstet ist, welche über Nacht in 3%iger Essigsäure eingeweicht, 2 Stunden in 0,1 mg/ml Gelatine inkubiert, in sterilem Wasser gespült, in steriler Luft getrocknet und bis zu 1 Monat gelagert worden sind. BCE-Zellen, die üblicherweise nicht älter als Durchgang 10 sind, sind bevorzugt. (Ältere Kulturen können eine größere Schwankung bei der Ansprechbarkeit auf chemotaktische Reize zeigen. Ferner schwanken Unterschiede in der Ansprechbarkeit von Endotheliumszellen auf chemotaktische Reize von Isolat zu Isolat, so daß Vergleiche innerhalb jedes Versuch angestellt werden sollten.)
Kammern werden unter Verwenden von 5 x 1&supmin;&sup5; in 1,5 ml DME- Medium, das mit 0,1% FBS ergänzt ist, suspendierten Zellen eingerichtet. Die Bodennäpfchen werden mit 25 ul Zellsuspension gefüllt und mit der gelatineüberzogenen Membran abgedeckt. Die Kammer wird zusammengebaut und anschließend umgedreht und 2 h inkubiert, um das Anhaften von BCE an die Membranoberfläche zu gestatten. Diese Abänderung des Standardtests ist wichtig, da die Hemmaktivität die Haftung von BCE an der Membranoberfläche beeinträchtigen kann. Die Kammer wird anschließend senkrecht gedreht, 50 ul TSP-Fragment (etwa 1-2 pg) werden zusammen mit 50 ng FGF in die obersten Näpfchen verteilt und die Kammer wird weitere 2-3 h inkubiert. Die membrangebundenen Zellen werden sorgfältig mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, mit Diff-Quick-Färbemittel (American Scientific Products) angefärbt und die Membranen werden mit Permount (Fisher Scientific) befestigt oder mit der Oberfläche, zu der die Zellen gewandert sind, an den Objektträger geklebt. Die Zahl der Zellen, die je 10 stark verstärkter (100fach) Felder gewandert sind, wird gezählt. Durch Scharfeinstellen durch die Membran ist es möglich, die Oberfläche der Membran zu erkennen, zu welcher die Zellen gewandert sind.

C. Hühnchen-Chorioallantoismembrantest (CAM)

Befruchtete Eier werden in stationärer Lage 3 Tage bei 37ºC und 70-80% relativer Feuchtigkeit inkubiert. Während dieser Zeit steigt der Embryo zur oberen Oberfläche des Eiinhalts auf. Zu Beginn des 4. Tags werden die Eier ohne Umzudrehen aufgebrochen und sorgfältig auf sterile Plastikpetrischalen abgelegt, so daß der Embryo auf der oberen Oberfläche verbleibt. Die schalenfreien Eier werden weitere 72 Stunden bei 37ºC in einer 2,5-3,5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre inkubiert, wonach die wachsenden Embryonen eine erkennbare CAM entwickeln. Scheiben, die durch Mischen von Testproben mit 1% (Gew./Vol.) Methylcellulose hergestellt wurden, werden getrocknet und auf die CAM zwischen Hauptvenen und ungefähr 0,5 cm vom Embryo entfernt gelegt. Auf weitere 48 Stunden Inkubation bei 37ºC (1,5-3,5% CO&sub2;) folgend werden die Proben auf ihre Fähigkeit, die Angiogenese zu hemmen, bewertet. Eine Hemmung erscheint als eine gefäßlose Zone, welche das Implantat umgibt, und kann oft Knicke, die durch Venen, welche die Scheibe meiden, gebildet werden, und eine verminderte Zahl Kapillaren im Bereich des Implantats enthalten.

Claims

1. Fragmente von humanem Thrombospondin, welches dazu fähig ist, die Vaskularisierung zu hemmen, zur Verwendung als ein Arzneimittel, worin die besagten Fragmente den ungefähr 70 kD Monomer-Fragmenten oder kleinen Fragmenten davon entsprechen, die durch enzymatischen Verdau von humanem Thrombospondin erhältlich sind, wobei die besagten Fragmente nicht die Heparinbindende Domäne, die mit dem Amino-terminalen Anteil des natürlichen Thrombospondin-Monomers assoziiert ist, und die Blutplättchen/Fibrinogen-bindende Domäne, die mit dein Carboxyterminalen Anteil des natürlichen Thrombospondin-Monomers assoziiert ist, enthalten.

2. Fragmente nach Anspruch 1 zum Hemmen von Angiogenese.

3. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend die Fragmente nach Anspruch 1 und einen Verabreichungsträger.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin der besagte Verabreichungsträger ein Agens für eine langsame Freisetzung ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Zusammensetzung als implantierbare Pellets formuliert ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 für die Behandlung eines internen Tumors.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin der besagte Verabreichungsträger ein topischer Träger ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7 für die Behandlung eines Hautkrebses.