KR19990066981A - 치료용 맥관형성억제 조성물 및 방법 - Google Patents
치료용 맥관형성억제 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
맥관형성을 억제하고 종양 퇴행을 유발할 수 있는, 약 20 kDa이고 콜라겐 유형 XVIII의 C-말단 단편에 상응하는 내피 세포 증식의 억제제, 및 맥관형성-관련 질환의 치료 방법.
Description
현재 직접적인 증거의 몇몇 정보는 맥관형성이 충실성 종양의 생장과 지속 및 이들의 전이에 필수임을 암시한다[참조문헌: Folkman, 1989; Hori et al., 1991; Kim et al., 1993; Millauer et al., 1994]. 맥관형성을 촉진하기 위해서, 종양은 섬유아세포 생장인자(FGF 및 BFGF)(Kandel et al., 1991) 및 혈관 내피세포 생장인자/혈관 투과인자(VEGF/VPF)를 포함한 각종 맥관형성 인자의 생성을 상향조절한다. 그러나, 다수의 악성종양은 또한 앤지오스태틴 및 트롬보스폰딘을 포함한 맥관형성 억제제도 생성한다[참조문헌:Chen et al., 1995; Good et al., 1990; O′Reilly et al., 1994]. 맥관형성 표현형이 신혈관신생의 이러한 양성 조절자와 음성 조절자 간의 궁극적인 균형의 결과인 것으로 추론되고 있다[참조문헌:Good et al., 1990; O′Reilly et al., 1994; Parangi et al., 1996; Rastinejad et al., 1989]. 맥관형성의 몇몇 다른 내생성 억제제가 동정되었지만, 이들 모두가 종양의 존재와 연관되어 있는 것은 아니다. 이러한 것들에는 혈소판 인자 4(Gupta et al., 1995; Maione et al., 1990), 인터페론α, 인터루킨-12 및/또는 인터페론-γ(Voest et al., 1995)에 의해 유도되는 인터페론-유도성 단백질 10(Angiolillo et al., 1995; Strieter et al., 1995), gro-β(Cao et al., 1995), 및 프로락틴의 16 kDa N 말단 단편(Clapp et al., 1993)이 포함된다. 내피세포 증식을 특이적으로 억제하는 알려져 있는 유일한 맥관형성 억제제는 앤지오스태틴이다(O′Reilly et al. 1994).
앤지오스태틴은 대략 38 kDa의 내피세포 증식의 특이적 억제제이다. 앤지오스태틴은 플라스미노겐의 5 개의 크링글 중 적어도 3 개를 함유하는 플라스미노겐의 내부 단편이다. 앤지오스태틴은 특정 종양 모델에서 종양의 중량을 감소시키고 전이를 억제하는 것으로 나타났다(O′Reilly et al., 1994). 이하에서 사용되는 "앤지오스태틴"이란 용어는 전술한 바와 같은 앤지오스태틴; 내피세포 증식 억제활성을 지닌 앤지오스태틴의 펩티드 단편; 및 내피세포 증식 억제활성을 지니고 있는 앤지오스태틴의 아미노산과 실질적인 서열 상동성(본원에서 정의됨)을 지니고 있는 앤지오스태틴 동족체를 말한다.
발명의 개요
본 발명은 단백질 억제제 및 이의 사용방법에 관한 것이다. 단백질은 내피증식 및 맥관형성의 강력하고 특이적인 억제제이다. 억제제를 이용한 전신요법은 종양 유도성 맥관형성의 거의 완전한 억제를 초래하고 이는 강력한 항-종양활성을 보인다.
억제성 단백질은 대략 18,000 내지 대략 20,000 Da(18 내지 20 kDa)의 분자량을 갖고 배양된 내피세포에서의 내피세포 증식을 억제할 수 있다. 단백질은 이의 바람직한 N 말단 아미노산 서열에 의해 더욱 특징지워 질 수 있으며 이의 처음 20 개 아미노산은 다음과 같다:
His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (서열번호 1)
본 발명의 바람직한 내피세포 증식 억제제는 전술한 특징을 지닌 단백질이며, 쥐 혈관내피종 세포주 EOMA로부터 분리정제될 수 있다. 이러한 억제성 단백질은 엔도스태틴이라 불리워왔다.
본 발명은 바람직하지 않은 맥관형성을 일으킨 인간이나 동물에 실질적으로 정제된 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 유도체를 포함하는 조성물을 맥관형성 억제에 충분한 용량으로 투여함으로써 바람직하지 않고 통제되지 않은 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행과정을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 종양생장의 치료 또는 억제에 특히 유용하다. 예비혈관신생된 전이 종양에 걸린 인간이나 동물에 엔도스태틴을 투여함으로써 이러한 종양의 생장이나 확대가 예방된다.
본 발명은 또한 생물학적 유체 및 조직내 엔도스태틴의 검출과 측정, 및 조직내 엔도스태틴의 위치분석을 위한 진단방법 및 키트를 포함한다. 진단방법 및 키트는 당해분야의 통상의 기술을 가진 자에게 익히 공지된 여타의 형태를 취할 수 있다. 본 발명은 또한 엔도스태틴에 특이성을 띠는 항체의 결합을 억제하는 엔도스태틴 및 항체에 특이성을 띠는 항체도 포함한다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 엔도스태틴에 특이성을 보이는 항체는 맥관형성에 의해 매개된 암 또는 기타 질환의 발병 또는 재발에 진단 또는 예측적인 엔도스태틴의 존재와 양을 검출하기 위한 진단키트에 사용될 수 있다. 엔도스태틴에 특이성을 띠는 항체는 또한 인간 또는 동물에 투여되어 엔도스태틴에 대하여 인간 또는 동물을 수동면역시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 맥관형성 억제가 감소된다.
본 발명은 또한 체액내의 엔도스태틴과 결합하는 항체의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단방법 및 키트를 포함한다. 진단방법 및 키트는 당해분야의 통상의 기술을 가진 자에게 익히 공지된 여타의 형태를 취할 수 있다.
본 발명은 또한 양전자 방출 단층촬영술, 방사선촬영술, 유동 혈구계산술, 방사선수용체 결합 분석, 및 면역조직화학을 포함한(이로써 제한되지 않음) 당해기술로 엔도스태틴 결합부위의 검출 및 가시화에 사용하기 위한 기타분자 또는 단백질로 표지되거나 동위원소로 표지될 수 있는 엔도스태틴 펩티드 단편을 포함한다.
이러한 엔도스태틴 펩티드는 또한 엔도스태틴 수용체에서 효능제 및 길항제로서 작용하고, 이에 따라 엔도스태틴의 생물학적 활성을 증진시키거나 차단한다. 이러한 펩티드는 엔도스태틴 수용체의 분리에 사용된다.
본 발명은 또한 치료 및 연구용의 세포독성제에 결합된 엔도스태틴, 엔도스태틴 단편, 엔도스태틴 항혈청, 또는 엔도스태틴 수용체 효능제 및 길항제도 포함한다.
본 발명은 엔도스태틴의 전사 및 해독에 관여하는 리보핵산 및 데옥시리보핵산용 분자탐침을 포함한다. 이러한 분자탐침은 조직 및 세포내 엔도스태틴 생합성의 검출 및 측정 수단을 제공한다.
다양한 형태의 재조합 엔도스태틴 단백질이 종양이 있는 동물에 투여될 때 지속 방출성 항-맥관형성 화합물로서 작용할 수 있다는 것은 놀라운 발견이다. 지속 방출성 화합물의 바람직한 형태는 다시 접히지 않은 채로 재조합 생성된 엔도스태틴이다.
또한, 본 발명은 전술한 아미노산 서열을 암호화하고 엔도스태틴 및 이의 내피세포 증식 억제 펩티드 단편을 암호화하는 상응하는 뉴클레오티드 코돈을 포함하는 핵산서열을 포함한다.
본 발명은 또한 내피세포 관련 질환 및 장애를 진단하기 위한, 엔도스태틴 단백질 및 펩티드 단편, 상응하는 핵산서열, 및 억제제와 이의 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 이용방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 엔도스태틴에 특이성을 보이는 수용체의 동정방법 및 이러한 방법으로 동정분리한 수용체 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 콜라겐 유형 XVIII으로부터의 엔도스태틴을 방출할 수 있는 효소, 엔도스태틴 아미노산 서열을 함유하는 기타 분자, 및 이의 펩티드의 동정방법에 관한 것이다. 이러한 엔도스태틴 생성효소도 본 발명의 양태이다.
중요한 의학적 방법은 자궁내막 혈관신생이 억제되고 배(胚) 이식이 일어나지 못하거나 유지되지 못하도록 유효량의 엔도스태틴을 여성에 투여하는 피임 형태이다.
본 발명의 특히 중요한 양태는 환자의 맥관형성-관련 질환, 특히 맥관형성-의존성 암의 치료 및 환자의 맥관형성-의존성 암의 치유를 위한 신규하고 유효한 방법의 발견이다. 이러한 방법은 예기치 않게도 종양생장의 억제 및 종양크기의 감소의 의학적으로 중요한 결과를 제공한다. 본 방법은 본 발명의 엔도스태틴과 다른 하나의 항-맥관형성 화합물, 바람직하게는 앤지오스태틴의 동시투여에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 맥관형성-의존성 암의 치료 또는 치유에 효과적인, 엔도스태틴, 및 임의로는 앤지오스태틴을 함유하는 제형도 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적은 엔도스태틴 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 맥관형성에 의해 매개되는 질환 및 진행과정의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 체액 또는 조직내 엔도스태틴의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단 또는 예측방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관종, 충실성 종양, 백혈병, 전이, 모세관확장증 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 맥관형성, 플라크 신혈관신생, 관상측부, 뇌측부, 동정맥 기형, 허혈성 하지 맥관형성, 각막 질환, 피부조홍, 신혈관성 녹내장, 당뇨성 망막증, 수정체 뒤의 섬유증식증, 관절염, 당뇨성 신혈관신생, 반점성 퇴행, 창상 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경, 및 태반형성(이에 제한되지 않음)을 포함한 맥관형성에 의해 매개되는 질환 및 경과 치료용 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암의 생장을 억제하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 체액내 엔도스태틴에 특이성을 보이는 항체의 존재를 검출하고 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔도스태틴 분자의 특정 영역에 선택성을 보이는 엔도스태틴에 대한 항체로 이루어진 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 검출 또는 예측방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체내 및 시험관내에서의 엔도스태틴 결합부위 가시화 및 정량에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔도스태틴 생합성의 검출 및 정량에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 최소한의 부작용을 갖는 암 치료법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 암 생장을 억제하거나 이를 치료하기 위한 세포독성제와 결합된 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적, 특징과 이점은 기술된 양태의 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위를 고찰한 연후에 자명해진다.
선행 관련출원 전후참조
본 출원은 임시출원 제60/005,835호(1995.10.23); 임시출원 제60/023,070(1996.08.02); 및 임시출원 제60/026,263(1996.09.17)에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 특허출원 각각은 전부 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명은 맥관형성-의존성 암과 같은 맥관형성-관련 질환의 치료에 유용한 맥관형성 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 맥관형성-의존성 암 치유용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 엔도스태틴 측정용 진단 분석법 및 키트, 엔도스태틴의 위치분석용 조직화학적 키트, 엔도스태틴 생합성 모니터용 분자탐침, 엔도스태틴에 특이성을 띠는 항체, 엔도스태틴 수용체에 대한 펩티드 효능제 및 길항제의 개발, 및 엔도스태틴 펩티드와 결합된 세포독성제에 관한 것이다.
도 1: EOMA 세포로부터 조건화 배지에 의한 모세관 내피세포 증식의 억제도.
유착성 EOMA 세포 또는 기본배지로부터 수거한 조건화 배지를 72 시간 증식분석에서 1 ng/㎖ bFGF와 함께 소 모세관 내피세포에 적용한다. 내피세포 증식은 EOMA 조건화 배지에 의해 억제된다. 각각의 바는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2: EOMA 조건화 배지로부터 내피세포 증식 억제제의 정제도.
유착성 EOMA 세포로부터 수거한 조건화 배지를 헤파린 세파로스 컬럼 상에서 분별한다. 내피세포 증식 억제활성은 대략 0.8 M NaCl에서 용출되었다.
도 3: 겔 여과에 의한 내피세포 증식 억제제의 정제도.
헤파린 세파로스 컬럼 크로마토그래피로부터의 정제된 억제제를 겔 여과 컬럼에 적용하며 단일 피크로 용출되었다.
도 4: 역상 컬럼 크로마토그래피에 의한 내피세포 증식 억제제의 정제도.
헤파린 세파로스 및 겔 여과 크로마토그래피로 정제한 억제제를 역상 컬럼에 적용한다. 억제제는 아세토니트릴 대략 45 %에서 컬럼으로부터 단일 밴드로서 용출되었다.
도 5: 내피세포 증식 억제제의 N 말단 아미노산 서열도.
내피세포 증식의 정제된 억제제의 N 말단 서열을 콜라겐 유형 18의 도식적 다이아그램과 관련하여 나타내었다. N 말단 서열은 콜라겐 유형 XVIII에 대한 대략 20 kDa C 말단 단편(실선 암영으로 도시)과 동일함을 보여준다. 개방 박스는 콜라겐 유형 XVIII의 콜라게나제 영역을 나타낸다.
도 6: 루이스 폐암의 재조합 마우스 엔도스태틴 억제제 처리도.
이.콜라이에서 생성된 재조합 억제제를 종양크기가 대략 150 mm3인 루이스 폐암을 시딩한 마우스에 투여한다. 억제제는 20 ㎎/㎏/일로 투여한다. 종양크기는 대략 처리 12 일 후 비검출 수준으로 퇴행하였다.
도 7: 재조합 엔도스태틴을 사용한 전신요법에 의한 루이스 폐암 1차 종양의 퇴행도.
(A) 마우스를 루이스 폐암세포로 등에 피하이식한다. 종양이 대략 200 ㎣(체중의 1 %)로 되었을 때 재조합 마우스 엔도스태틴(20 ㎎/㎏/일)에 의한 전신요법을 개시한다. 엔도스태틴 억제제 처리한 마우스에서의 종양은 신속하게 퇴행하였으며 생리식염수 처리 대조군에 비해 ＞99 %까지 억제되었다. 각각의 포인트는 5 마리의 마우스에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. 실험은 필적할 만한 결과가 수득되면서 반복된다.
(B) 엔도스태틴에 의한 전신요법 11 일 후 대표적인 처리 및 비처리 종양 보유 마우스. 생리식염수 처리 마우스(우측)는 궤양이 생긴 표면을 동반하면서 신속히 성장하는 적색 종양을 보인다. 엔도스태틴 처리 마우스(좌측)는 작고 희미한 잔상 종양(화살표)을 보인다.
(C) 엔도스태틴 처리 마우스에서의 잔상 질환. 5 마리의 엔도스태틴 처리 마우스 중 3 마리를 치료 16 일 후에 참수한다. 검시결과 최초의 1 차 이식부위(화살표)에서 작은 백색 잔상 종양이 나타났다.
도 8: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴에 의한 쥐 T241 섬유육종의 처리도.
마우스를 T241 섬유육종 세포로 시팅한다. 대조군 마우스는 생리식염수로 처리한다. 실험용 마우스를 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴 20 ㎎/㎏/일로 처리한다.
도 9: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴에 의한 쥐 B16F10 흑색종의 처리도.
마우스를 쥐 B16F10 흑색종 세포로 시팅한다. 대조군 동물은 생리식염수로 처리한다. 실험동물을 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴 20 ㎎/㎏/일로 처리한다.
도 10: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴에 의한 EOMA 혈관내피종의 처리
마우스를 EOMA 혈관내피종 세포로 시팅한다. 대조군 동물은 생리식염수로 처리한다. 실험동물을 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴 20 ㎎/㎏/일로 처리한다.
도 11: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 또는 인간 엔도스태틴에 의한 루이스 폐암의 처리
마우스를 루이스 폐암 세포로 시팅한다. 대조군 동물은 생리식염수로 처리한다. 실험동물을 마우스 서열로부터 유도된 재조합 엔도스태틴 또는 인간 서열로부터의 재조합 엔도스태틴으로 처리하며, 여기에서 두 엔도스태틴 모두 이.콜라이에서 재조합 생성된다. 마우스 엔도스태틴을 20 ㎎/㎏/일 또는 2.5 ㎎/㎏/일로 투여하고, 인간 엔도스태틴을 20 ㎎/㎏/일로 투여한다.
도 12: 맥관형성 억제에 있어서의 엔도스태틴 결과 및 루이스 폐암 1 차 종양의 아폽토시스 증가
루이스 폐암을 이식한 생리식염수 : 엔도스태틴 처리 마우스로부터의 종양의 조직학적 절편을 증식(PCNA), 아폽토시스(TUNEL), 및 맥관형성(vWF)에 대해 분석한다. 처리 : 비처리 종양에서 종양세포의 증식 지수(A)에 있어 유의할 만한 어떠한 차이도 존재하지 않았다. 이와는 대조적으로, 종양세포의 아폽토시스 지수(B)는 엔도스태틴 처리 마우스에서 8 배(p ＜ 0.001) 증가하였다. 혈관밀도(C)는 vWF에 대한 항체로 염색한 절편에서 하이 파워 필드(HPF) 당 모세혈관의 수를 계수함으로써 측정된다. 맥관형성은 엔도스태틴 처리 마우스의 잔존하는 현미경적 크기의 종양에 있어 거의 완전히 억제되었다.
도 13: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴을 사용한 루이스 폐암의 사이클 잠복요법도.
마우스를 루이스 폐암 세포로 등에 피하이식한다. 20 ㎎/㎏/일의 용량으로 투여한 재조합 마우스 억제제(엔도스태틴)에 의한 전신요법을 종양이 대략 200 ㎣(체중의 1 %)이 되었을 때 개시한다. 엔도스태틴 억제제 처리한 마우스에서 종양은 치료한지 대략 15 일 후 본질적으로 비검출 수준으로 신속히 퇴행하였다. 처리를 종료하였을 때, 종양의 크기는 신속히 증가하였고 뒤이어 치료를 재개함으로써 동일한 비검출 수준으로 처리될 수 있다. 도면에서의 피크와 밸리는 엔도스태틴에 의한 억제의 순환효과를 보여준다.
도 14: 이.콜라이로부터의 재조합 마우스 앤지오스태틴 및 엔도스태틴에 의한 병행요법도.
마우스를 루이스 폐암 세포로 등에 피하이식한다. 재조합 마우스 엔도스태틴(20 ㎎/㎏/일) 및 재조합 마우스 앤지오스태틴(20 ㎎/㎏/일)을 병용한 전신요법을 종양이 대략 300 ㎣이 되었을 때 개시한다. 병행요법 처리한 마우스에서 종양은 약 15 일 후 본질적으로 비검출 수준으로 신속히 퇴행하였다. 중요하게는, 퇴행종양이 휴지상태로 남았고 처리 종결 후 크기나 양에 있어 증가하지 않았다. 이는 실질직인 의학적 의미가 있는 예상치 못한 결과이다.
본 출원인은 시험관내에서 증식하는 내피세포에 가했을 때 내피세포 증식 억제능을 지니고 있는 새로운 부류의 단백질 분자를 발견해 내었다. 따라서, 이들 단백질 분자는 엔도스태틴으로서 기능적으로 정의되어 왔지만, 이러한 기능적 정의가 시험관내 또는 생체내 내피세포 생장 억제에 대한 엔도스태틴의 생물학적 활성을 전혀 제한하지 않음을 이해하여야 한다.
"엔도스태틴"이란 용어는 각각 비환원 및 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 크기가 바람직하게는 18 내지 20 kDa인 단백질을 의미한다. 엔도스태틴이란 용어에는 또한 18 내지 20 kDa 단백질의 전구체형도 포함된다. 엔도스태틴이란 용어에는 또한 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖고 내피세포의 증식을 억제할 수 있는 18 내지 20 kDa 단백질 및 변형 단백질 및 펩티드가 포함된다. 예를 들면, 아미노산의 구조적으로 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환이 단백질의 구조, 형태 또는 활성을 심각하게 변경시키지 않는 아미노산의 사일런트 치환은 당해분야에 익히 공지되어 있다. 이러한 사일런트 치환도 첨부된 청구의 범위안에 포함시키고자 한다.
"엔도스태틴"이란 용어가 하나 이상의 아미노산이 엔도스태틴의 말단 중 하나 또는 둘다로부터 제거되거나, 단백질의 내부 영역으로 제거되는 길이가 단축된 단백질 또는 펩티드를 포함하며, 생성되는 분자가 여전히 내피세포층 증식 억제활성을 보유하고 있음이 감지될 것이다. "엔도스태틴"이란 용어에는 또한 하나 이상의 아미노산이 엔도스태틴의 말단 중 하나 또는 둘다에 첨가되거나 단백질의 내부 위치에 첨가되는 길이가 늘어난 단백질 또는 펩티드가 포함되며, 생성되는 분자는 여전히 내피세포층 증식 억제활성을 보유한다. 예를 들면, 제 1 위치에 티로신이 첨가된 이러한 분자는 분석용125I에 의한 방사성요오드화와 같은 표지에 유용하다. 기타 방사성 동위원소로 표지하는 것도 엔도스태틴 수용체를 함유하는 표적세포 파괴를 위한 분자도구를 제공하는데 유용할 수 있다. 리신과 같은 분자를 이용한 기타 표지도 엔도스태틴 수용체를 갖는 세포의 파괴기구를 제공할 수 있다.
"실질적인 서열 상동성"이란 엔도스태틴 동족체 서열내의 아미노산 잔기 서열과 엔도스태틴의 서열 간의 적어도 대략 70 % 상동성, 바람직하게는 적어도 대략 80 % 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 대략 90 % 상동성을 의미한다.
엔도스태틴이라 용어의 정의에는 엔도스태틴 단백질의 변형물, 이의 아단위체 및 펩티드 단편도 포함된다. 이러한 변형에는 천연 또는 비천연 아미노산(이에 제한되지 않음)을 포함하여, 기타분자로 특정부위에서 천연 아미노산이 치환되는 것이 포함된다. 이러한 치환은 엔도스태틴의 생물학적 활성을 변성시킬 수 있고 생물학적 또는 약리학적 효능제 또는 길항제를 생성할 수 있다. 엔도스태틴이란 용어에는 또한 서열번호 1에 나타내고 표 1에 나타낸 처음 20 개의 N 말단 아미노산의 서열로 이루어진 엔도스태틴의 N 말단 단편도 포함된다. 처음 20 개의 N 말단 아미노산으로 된 이러한 서열은 새로 동정된 콜라겐 유형 XVIII의 C 말단 단편에 상응한다.
표 1은 3 문자 및 1 문자 아미노산 표시의 대응을 보여준다.
| 아미노산 잔기 약어1 HIS H2 THR T3 HIS H4 GLN Q5 ASP D6 PHE F7 GLN Q8 PRO P9 VAL V10 LEU L11 HIS H12 LEU L13 VAL V14 ALA A15 LEU L16 ASN N17 THR T18 PRO P19 LEU L20 SER S |
엔도스태틴의 N 말단 아미노산 서열은 아미노산 1105에서 개시하여 아미노산 1124에서 종결하는 마우스 콜라겐 α 1 유형 XVIII에서 발견된 내부 20 개 아미노산 펩티드 단편에 상응한다. 억제제의 N 말단 아미노산 서열은 또한 아미노산 1132에서 개시하여 아미노산 1151에서 종결하는 인간 콜라겐 α 1 유형 XVIII에서 발견되는 내부 20 아미노산 펩티드 단편에 상응한다.
엔도스태틴은 쥐 혈관내피종 EOMA로부터 분리될 수 있다. 엔도스태틴은 재조합원, 동물에 이식한 유전자 변형 세포, 종양, 및 세포 배양균 및 기타 공급원으로부터 생성될 수 있다. 엔도스태틴이 신경계의 세포에서도 만들어지는 것으로 예상된다.
엔도스태틴은 혈청, 뇨 및 복수(이로써 제한되지 않음)를 포함한 체액으로부터 분리되거나 화학 또는 생물학적 방법(예를 들면, 세포배양, 재조합 유전자 발현, 펩티드 합성, 및 전구체 분자의 시험관내 효소 촉매작용에 의한 활성 엔도스태틴 생성)에 의하여 합성될 수 있다. 재조합 기술에는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)용 이용한 DNA원으로부터의 유전자 증폭, 및 역전사 효소/PCR을 이용한 RNA원으로부터의 유전자 증폭이 포함된다.
엔도스태틴은 특이적으로 결합하여 내피세포 증식을 억제한다. 본 발명의 억제제 단백질 분자는 피임제로서, 및 맥관형성-관련 질환, 특히 맥관형성-의존성 암 및 종양 치료용으로 유용하다. 단백질 분자는 또한 맥관형성-의존성 암 및 종양 치유용으로도 유용하다. 맥관형성-의존성 암 및 종양 치료 및 치유를 위한 이들 신규 화합물의 예상하지 못한 놀라운 능력은 의약분야에서의 장기간 느껴온 실현하지 못한 필요성에 부합하고, 인류에 주요한 혜택을 제공한다.
본원에서 사용되는 중요한 용어는 다음과 같이 정의된다. "암"이란 맥관형성-의존성 암 및 종, 즉 생장(부피 및/또는 크기의 팽창)에 혈액을 공급하게 될 혈관의 수 및 밀도의 증가를 요하는 종양을 의미한다. "퇴행"이란 종양 집단 및 크기의 감소를 의미한다.
본 발명의 내피세포층 증식 억제 단백질은 당해분야에 익히 공지된 자동 단백질 합성방법에 의하여 제조될 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 내피세포층 증식 억제 단백질, 즉 엔도스태틴은 공통 또는 유사 N 말단 아미노산 서열을 공유하는 단백질인 인간 α 1 유형 XVIII 콜라겐 및 마우스 α 1 유형 XVIII 콜라겐과 같은 공지된 대형 단백질로부터 분리해 낼 수 있다. 유사한 N 말단 아미노산 서열을 갖는 기타 유망한 엔도스태틴 원료에는 예를 들면, Bos taurus 프리개스트릭 에스테라제, 인간 α 1 유형 15 콜라겐, 슈도모나스 종으로부터 유도된 NAD-의존성 포메이트 디하이드로게나제(EC 1.2.1.2), 소 아데노바이러스 유형 3의 s11459 헥손 단백질, CELF21D12 2F21d12.3 캐노랩다이티스 엘리건스(Caenorhabditis elegans) 유전자 산물, 토마토 골든 모자이크 바이러스로부터 유도된 VAL1 TGMV AL1 단백질, 인간 아데노바이러스 12로부터 유도된 s01730 헥손 단백질, 사카로마이시스 세레비지애가 포함된다. 예를 들면, 엔도스태틴과 밀접하게 관련된 펩티드는 아미노산 502 내지 521에 상응하는 BOVMPE 1 프리개스트릭 에스테라제(BOS TAURUS) 유전자 서열, 및 아미노산 316에서 개시하여 335에서 종결하는 인간으로부터의 콜라겐 α 1 유형 15로부터 유도될 수 있다.
수동 또는 자동화된 단백질 합성을 포함한, 이들 및 기타 공급원으로부터 유도된 단백질 및 펩티드는 소 모세관 내피세포 증식분석과 같은 생물학적 활성분석을 이용하여 내피세포 증식 억제활성에 대해 신속하고도 용이하게 시험할 수 있다. 억제활성에 대한 다른 생물학적 분석법으로는 병아리 CAM 분석, 마우스 각막 분석, 및 분리되거나 합성된 단백질의 이식된 종양에의 투여가 포함된다. 병아리 CAM 분석은 본원에서 참조로 전부 인용되는 문헌[참조: O′Reilly, et al. in "Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, vol. 79 (2), October 21, 1994, pp. 315-328]에 기재되어 있다. 간단히 말해서, 난황이 온전한 3 일 된 병아리 배(胚)를 난으로부터 분리하여 페트리 디쉬에 놓는다. 배양 3 일 후에 시험하고자 하는 단백질이 들어있는 메틸셀룰로스 디스크를 개개 배의 CAM에 적용한다. 48 시간 배양 후에 배와 CAM을 관찰하여 내피세포층의 생장이 억제되었는지 여부를 측정한다. 마우스 각막 분석은 생장인자 함유 펠릿을 추정된 내피세포층 생장 억제제를 함유하는 다른 펠릿과 함께 마우스의 각막에 이식하고 각막에서 동화되는 모세관의 패턴을 관찰하는 단계를 수반한다.
본 출원인의 발명은 또한 본 발명의 내피세포층 증식 억제 단백질 분자, 및 이러한 단백질 분자에 특이적으로 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 상응하고 이들을 암호화하는 핵산서열도 포함한다. 생물학적 활성 단백질 분자, 단백질에 상응하는 핵산서열, 및 본 발명의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체는 내피세포층 진행과정의 생체내 조정, 및 예를 들면, 유전자 요법에 의한 내피세포-관련 질환의 진단 및 치료에 유용하다.
엔도스태틴 및 엔도스태틴 동족체에 상응하고 이들을 암호화하는 핵산서열은 아미노산 서열의 지식, 및 당해분야에 인식된 코돈(3 개의 핵산염기의 서열)과 아미노산 간의 대응성에 기초하여 제조할 수 있다. 코돈의 3 번째 염기가 다양할 수 있으며 여전히 동일 아미노산을 암호화하는 유전암호의 축퇴성으로 해서 다수의 상이한 가능한 암호화 핵산서열이 특정 단백질 또는 펩티드 단편에 대해 유도가능하다.
핵산은 당해분야에 익히 공지되어 있는 자동화 시스템을 이용하여 합성된다. 전체서열이 합성될 수 있거나 일련의 소형 올리고뉴클레오티드가 제조되고 뒤이어서 함께 연결하여 완전한 길이의 서열을 수득한다. 다른 방안으로는 핵산서열은 N 말단 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 올리고뉴클레오티드 탐침 및 유전물질의 클로닝을 위한 익히 공지된 기술을 이용하여 유전자 뱅크로부터 유도될 수 있다.
본 발명은 또한 암과 같은 맥관형성-매개 질환의 진단 또는 예측을 위한 체액 및 조직내 엔도스태틴의 검출도 포함한다. 본 발명은 또한 세포 및 조직내의 엔도스태틴 결합부위 및 수용체의 검출도 포함한다. 본 발명은 또한 엔도스태틴의 생성을 촉진하고, 및/또는 실질적으로 정제된 엔도스태틴, 또는 엔도스태틴 효능제 또는 길항제, 및/또는 엔도스태틴 항혈청 또는 엔도스태틴 항혈청에 대한 항혈청을 환자에 투여함으로써 관절염 및 종양(이로써 제한되지는 않음)을 포함한 맥관형성성 질환 및 진행과정을 치료 또는 예방하는 방법도 포함한다. 부수적인 치료방법으로는 세포독성제와 결합된 엔도스태틴, 엔도스태틴 단편, 엔도스태틴 항혈청, 또는 엔도스태틴 수용체 효능제 및 길항제의 투여를 포함한다. 엔도스태틴이 동물기원 또는 인간기원일 수 있다는 점을 이해하여야 한다. 엔도스태틴은 또한 화학반응에 의해서 또는 발현 시스템과 함께 재조합 기술을 사용하여 합성생산할 수 있다. 엔도스태틴은 또한 엔도스태틴 단편과의 서열 상동성 또는 동일성을 띠는 엔도스태틴 전구체를 포함한 상이한 분자를 효소절단하여 항-맥관형성 활성을 지닌 펩티드를 수득함으로써 생성될 수 있다.
엔도스태틴과 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 수동 항체요법을 사용하여 재생, 발생, 및 창상 치유 및 조직복구와 같은 내피세포층-의존성 진행과정을 조정할 수 있다. 또한, 엔도스태틴 항체의 Fab 영역에 대한 항혈청을 투여하여 엔도스태틴에 대한 내생성 엔도스태틴 항혈청의 결합능을 차단할 수 있다.
엔도스태틴 및 엔도스태틴 동족체에 특이성을 띠는 항체는 당해분야에 익히 공지된 기술과 프로토콜에 따라 제조된다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 체액내 본 발명의 내피세포층 증식 억제제의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여, ELISA, 샌드위치 면역분석법 및 방사선면역분석법(RIA)을 포함한 경쟁성 및 비-경쟁성 면역분석법과 같은 당해분야에 익히 공지된 면역분석법 포맷에 사용되고 있다. 체액의 예로는 혈액, 혈청, 복막액, 흉막액, 뇌척수액, 자궁액, 타액, 및 점액이 포함되며 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 단백질, 핵산서열 및 항체는 내피세포-관련 질환 및 장해의 진단 및 치료용으로 유용하다. 특히 중요한 내피세포 진행과정은 맥관형성, 즉 혈관의 형성과정이다. 맥관형성-관련 질환은 본 발명의 내피세포 증식 억제 단백질을 사용하여 진단 및 치료할 수 있다. 맥관형성-관련 질환으로는 예를 들면, 충실성 종양, 백혈병과 같은 혈액성 종양, 및 종양 전이를 포함한 맥관형성-의존성 암; 양성 종양, 예를 들면, 혈관종, 어쿠스틱 신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종; 류마티스성 관절염; 건선; 맥관형성성 안질환, 예를 들면, 당뇨성 망막증, 조숙 망막증, 반점성 퇴행, 각막이식 거부증, 신혈관성 녹내장, 수정체 뒤의 섬유증식증, 피부조홍; 오슬러-웨버 증후군; 심근성 맥관형성; 플라크 신혈관신생; 모세관확장증; 혈우병자 관절; 섬유성 혈관종; 및 창상 육아가 포함되며 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 내피 세포 증식 저해 단백질은 내피 세포의 과도하거나 비정상적인 자극을 유발하는 질환의 치료에 있어 유용하다. 이러한 질환은 장 고착증, 동맥 경화증, 공피증 및 비대 반흔, 즉 켈로이드를 포함하는데, 여기에만 한정되지는 않는다. 이 단백질은 또한 고양이 스크래치 병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Helobacter pylori)과 같은 병리학적 결과인 맥관형성을 지닌 질환의 치료에도 또한 유용하다.
이 내피 세포 증식 저해 단백질은 배 이식을위해 요구되는 자궁 혈관신생을 감소시키거나 방해함으로써 피임제로 사용될 수 있다. 이리하여, 본 발명은 배 이식을 막기에 충분한 양의 저해 단백질을 여성에게로 투여시킬 경우의 효과적인 피임법을 제공한다. 피임법의 한 양태에서, 배 이식을 차단하기에 충분한 양의 저해 단백질을 교차 및 수정이 일어나기 전 또는 후에 투여함으로써 피임의 효과적인 방법인, 가능한 "모닝 애프터"법이 제공된다. 이 진술에 구애됨이 없이, 자궁내막의 혈관신생의 저해는 배반포의 이식을 방해하는 것으로 여겨진다. 유사한 자궁 수란관 점막 혈관화의 저해는 배반포 이식을 방해하고, 이에 따라 수란관 임신 발생이 예방된다. 투여 방법은 환제, 주사(정맥, 피하, 근육내), 좌약, 질용 스폰지, 질용 탐폰, 및 자궁내 장치를 포함할 수 있지만, 이것에만 한정되는 것은 아니다. 엔도스태틴 투여는 태반의 정상적인 증진된 혈관화를 방해하고, 또한 성공적으로 이식된 배반포내의 혈관의 발달 및 배와 태아의 발생을 차단할 것으로 여겨진다.
반대로, 수용체 길항제로 작용하는 엔도스태틴 동족체에 의한 엔도스태틴 수용체의 차단은 내피 세포층 형성 및 혈관화를 조장할 수 있다. 이러한 효과는 자궁내막의 부적당한 혈관화 및 이와 관련된 불임, 상처 치료, 베이거나 절제된 부분의 치료, 당뇨병 환자에 있어 혈관, 특히 망막 및 말초 혈관 문제의 치료, 근육 및 피부를 포함하는 이식된 조직의 혈관화 조장, 특히 심장 또는 심장 조직의 이식에 이은 심근의 혈관화의 조장, 바이패스 수술 후, 증진된 세포 독성 배출을 위한 고체 및 상대적으로 비관 종양의 혈관화의 조장, 및 신경계(대뇌 피질 및 척수에만 한정되지는 않음)로의 혈류 증진과 같은 조건에 바람직할 수 있다.
다시 접히지 않은 채로 불용성인 재조합 엔도스태틴은 또한 환자에게 투여될 경우 지속적인 방출 저장소로 작용하는 유력한 항맥관형성 화합물이라는 것은 놀라운 발견이다.
본 발명은 또한 내피 세포-관련 질환 및 장애를 진단하기 위해, 엔도스태틴 및 엔도스태틴의 내피 세포 증식 저해 펩티드 단편의 사용법, 엔도스태틴 및 이의 활성 펩티드 단편에 대응하는 핵산 서열, 및 특히 엔도스태틴 및 이의 펩티드와 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 엔도스태틴-특이 수용체의 동정법, 및 이에 의해 동정되고 단리된 수용체 분자를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 엔도스태틴 수용체의 정량법도 제공하고 있다.
본 발명의 특히 중요한 양태는 환자의 맥관형성-의존성 암을 치료하고 고치기 위해 신규하면서 효과적인 방법을 발견하는데 있다. 종양 생장을 저해하고 종양 덩어리를 극미한 크기로 만들도록 지속적인 퇴행을 야기시키는 엔도스태틴과 앤지오스태틴을 충분한 양으로 동시투여하면 맥관형성-의존성 암이 치료되는 것을 우연히 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명은 또한 맥관형성-의존성 암 및 종양을 치료하거나 치유에 효과적인 제형도 포함한다.
좀더 특히, 곤충 세포 또는 이. 콜라이로부터 재조합 마우스 엔도스태틴은 맥관형성 및 전이 및 1차 종양의 생장을 효과적으로 저해한다. 지속적인 방출의 신규 방법에 있어, 이. 콜라이 유래 재조합 엔도스태틴을 맥관형성을 저해하기에 충분한 양의 다시 접히지 않은 채로 현탁액의 형태로 투여한다. 재조합 엔도스태틴을 종양의 퇴행을 야기시키기에 충분한 양을 투여할 경우 종양의 크기를 감소시킨다. 엔도스태틴으로 치료할 경우 체중의 1 내지 2%의 1차 종양을 150 배 이상으로 퇴화시켜 극미한 휴지성 병변이 되도록 한다. 휴지성 종양의 면역 조직 화학 분석은 높은 속도의 종양 세포 아폽토시스에 의해 균형이 조절된 종양 세포의 높은 증식이 수반된 차단된 맥관형성을 보여주고 있다. 엔도스태틴으로 처리된 임의의 마우스에게 있어 유독성의 증거는 없다.
본 발명의 부분으로서 당해분야의 당업자에게 익히 공지된 재조합 DNA법 또는 합성 펩티드 화학법에 의해 생성될 수 있는 환자의 혈액 또는 소변과 같은 체액 또는 엔도스태틴으로부터 엔도스태틴을 분리할 수 있을 것으로 기대한다. 단백질 정제법은 당해분야에 익히 공지되어 있고 엔도스태틴 정제법, 및 차단제 활성 분석법의 특정 예는 하기 실시예에서 제공되고 있다. 유사한 기술을 사용하여 인간 내인성 엔도스태틴의 분리를 달성한다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 엔도스태틴을 생성하는 방법 중 한 예는 앞서 기술되고 하기에서 좀더 상세히 기술된 바와 같이 엔도스태틴의 동정 및 정제(1), 정제된 저해제의 N-말단 아미노산 서열의 결정(2), 합성적으로 N-말단 아미노산 서열에 대응하는 DNA 올리고누클레오티드 탐침의 제조(3), 인간 또는 포유동물 DNA로부터 유래된 DNA 유전자 뱅크의 제조(4), DNA 올리고누클레오티드 탐침으로 유전자 은행의 탐침화(5), 올리고누클레오티드와 하이브리드화하는 클론의 선별(6), 클론으로부터 저해 유전자의 분리(7), 발현 벡터와 같은 적당한 벡터로 유전자의 삽입(8), 미생물 또는 저해 유전자를 발현시킬 수 있는 다른 발현 시스템으로 유전자-함유 벡터의 삽입(9), 및 재조합 생성된 저해제의 분리(10)의 단계를 수반한다. 상기 기술은 실험용 참고서인 "Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2판, 1989" 에서 좀더 상세히 기술하고 있다.
조직으로부터 메신저 RNA의 분리(1), 역전사 효소를 사용하여 대응하는 DNA 서열을 제조(2)한 다음 적당한 프라이머로 PCR을 사용하여 활성 엔도스태틴 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열의 증폭(3)에 의해 높은 수준의 엔도스태틴을 발현시키는 세포 또는 (종양 세포와 같은)조직으로부터 엔도스태틴 유전자도 또한 분리될 수 있다.
엔도스태틴 또는 생물학적으로 활성이 있는 이의 단편을 생성하는 또 다른 방법은 펩티드 합성에 의한 것이다. 하기에서 좀더 상세히 기술된 분석 시스템을 사용하여 일단 생물학적으로 활성이 있는 엔도스태틴 단편을 발견하면, 이는 예를 들면, 자동화된 펩티드 서열법에 의해 서열화될 수 있다. 이와는 달리, 일단 엔도스태틴을 암호화하는 유전자 또는 DNA 서열을 분리하면, 예를 들면 앞서 기술된 방법에 의해, 아미노산 서열에 관한 정보를 제공하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 이리하여, 트립신에 의한 절단과 같은 특정 방법에 의해 생물학적으로 활성이 있는 단편을 생성하거나, 단편이 서열화된 N-말단이라면, 상응하는 DNA 서열로부터 나머지 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
예를 들면 N-말단 20개의 아미노산과 같이, 일단 펩티드의 아미노산 서열이 공지된다면, 당해분야에 익히 공지된 기술, "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford England.에 의해 예시된 바에 따라 단편을 합성할 수 있다. 유사하게는, 결과적으로 함께 연결된 다수의 단편을 합성하여 보다 큰 단편을 형성할 수 있다. 이들 합성 펩티드 단편은 또한 시험관내 및 생체내에서 효능 및 길항 활성을 시험하기 위해 특정 위치에서 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 조직과의 결합에 있어 높은 친화성을 보유한 펩티드 단편을 사용하여 친화성 컬럼상에서 엔도스태틴 수용체를 분리할 수 있다. 엔도스태틴 수용체의 분리 및 정제는 엔도스태틴의 활성 메카니즘을 밝히는데 있어 기본적인 단계이다. 이는 약물의 전개를 용이하게 하여 엔도스태틴 수용체의 활성과 생물학적 활성을 위한 최종 경로를 조절한다. 수용체의 분리는 뉴클레오티드 탐침의 작제가 원상태 및 용액에서 혼성화 기술을 사용하여 수용체의 위치 및 합성을 모니터하게끔 해 준다.
엔도스태틴은 맥관형성에 의해 매개된 질환의 치료 또는 방법에 있어 효과적이다. 본 발명은 효과적인 양의 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 효능제 및 길항제로 맥관형성 매개 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 맥관형성 매개 질환은 충실성 종양; 백혈병과 같은 혈액성 종양; 종양 전이; 예를 들면 혈관종, 어쿠스틱 신경종,신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종과 같은 양성 종양; 류마티스성 관절염; 건선; 예를 들면, 당뇨성 망막증, 조숙 망막증, 반점성 퇴행, 각막 이식 거부증, 신혈관성 녹내장, 수정체 뒤의 섬유증식증, 피부조홍과 같은 눈 맥관형성 질환; 오슬러 웨버증후군; 심근성 맥관형성; 플라크 신혈관신생; 모세관확장증; 혈우병자 관절; 섬유성 혈관종; 및 창상 육아가 포함되며, 이것에만 한정되지는 않는다. 엔도스태틴은 내피 세포를 과도하거나 비정상적으로 자극하는 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환에는 장내 고착증, 동맥 경화증, 공피증 및 비대 반흔, 즉 켈로이드가 포함되지만, 이것에만 한정되지는 않는다. 배반포 이식 및 태반, 배반포, 배 및 태아의 발달을 위해 요구되는 혈관화를 막는 피임제로 엔도스태틴을 사용할 수 있다.
엔도스태틴의 합성 펩티드 단편은 다양한 용도를 가진다. 방사선 사진 및 막 결합 기술을 사용하여 결합 부위의 표시 및 정량을 위해 높은 특이성 및 결합성을 지닌 엔도스태틴 수용체와 결합하는 펩티드를 방사성 동위 원소를 써서 식별하고 적용한다. 이러한 응용법은 중요한 진단 및 조사 도구를 제공한다. 엔도스태틴 수용체의 결합 특성에 관한 지식은 수용체와 결합된 형질도입 메카니즘에 관한 조사를 용이하게 해 준다.
또한, 생체 내에서 양전자 방출 단층 촬영법 또는 다른 현대 방사선 사진 기술을 사용하여 일시적인 동위 원소로 펩티드를 표지하면 수용체 결합 부위 표시가 가능해져 엔도스태틴 결합 부위로 종양의 위치를 확인할 수 있다.
이러한 합성 펩티드 내의 아미노산의 계획적인 치환은 수용체와 결합하는 엔도스태틴을 증가시키거나 감소시키는 엔도스태틴 수용체에 대한 높은 친화성 펩티드 효능제 및 길항제를 생성한다. 미소전이의 생장을 억압하기 위해 이러한 아고니스트를 사용하여, 암의 확장을 제한시킨다. 부적당한 혈관화의 조건에서는 엔도스태틴에 대한 길항제를 적용하여 앤지오스태틴의 저해 효과를 차단하고 가능한한 맥관형성을 촉진시킨다. 이러한 처리는 당뇨병에 있어 상처 치료를 촉진하는 치료상의 효과를 가질 수 있다.
배양된 종양 세포로부터 엔도스태틴 수용체의 분리를 위한 친화성 컬럼을 전개시키기 위해 엔도스태틴 펩티드를 적용한다. 엔도스태틴 수용체의 분리 및 정제에 이어 아미노산의 서열을 분석한다. 다음, 수용체의 발현을 위해 뉴클레오티드 탐침을 벡터로 삽입시킨다. 이러한 기술은 당해분야에 익히 공지되어 있다. 엔도스태틴 수용체의 종양 세포로의 형질감염은 내인성 또는 외인성 엔도스태틴에 대한 이들 세포의 반응성을 증진시켜 이전 생장 속도를 감소시킨다.
리신과 같은 세포 독성제를 엔도스태틴 및 높은 친화성의 엔도스태틴 펩티드 단편과 연결함으로써, 엔도스태틴과 결합하는 세포 파괴의 수단을 제공한다. 이들 세포는 미소전이 및 1차 종양에만 한정되지 않고 여러 위치에서 발견된다. 원하는 위치로의 전달을 최대화하도록 고안된 방법에 의해 세포 독성제와 연결된 펩티드를 주입한다. 예를 들면, 리신과 결합된 고 친화성 엔도스태틴 단편을 캐뉼러를 통해 표적 부위를 제공하는 혈관으로 전달하거나 직접 표적 부위로 전달한다. 또한 통제된 방법으로 주입 캐뉼러와 연결된 삼투압 펌프를 통해 이 시제를 전달한다. 엔도스태틴 길항제의 병행은 맥관형성의 자극제로도 적용될 수 있어 조직의 혈관화를 증가시킨다. 이 치료법은 전이 암을 파괴하는데 효과적인 수단을 제공한다.
본 발명에 따라, 엔도스태틴을 질환의 치료를 위한 다른 조성물 및 과정과 화합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 종래에는 엔도스태틴과 결합된 수술, 방사 또는 화학요법으로 종양을 치료할 수 있었고 이 후에는 환자에게 엔도스태틴을 계속적으로 투여시켜 미소전이의 휴지 상태를 연장시키고 임의의 나머지 일차 종양을 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 엔도스태틴은 또한 저해제에 특이적인 항체를 생성하기 위해서도 사용될 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 모두 가능하다. 체액 또는 조직 내의 엔도스태틴을 검출하거나 정량하기 위해 당해분야의 당업자에게 익히 공지된 진단법 및 키트에서는 엔도스태틴과 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 이 시험의 결과는 암 및 다른 맥관형성 매개 질환의 유발 또는 재발에 대한 진단 또는 예측을 위해 사용될 수 있다.
엔도스태틴은 또한 진단법 및 키트에서 엔도스태틴과 결합 가능한 항체를 검출하고 정량하기 위해서도 사용될 수 있다. 이 키트는 엔도스태틴의 존재하에 원상태에서 일차 종양에 의해 가리워진 미소전이의 확산을 지적하는 순환 엔도스태틴 항체에 대한 검출을 가능케 한다. 이러한 순환 항-엔도스태틴 항체를 지닌 환자는 종양 또는 암을 발생시킬 확률이 높고, 치료 또는 병의 일시적인 차도 후에도 재발할 우려가 높다. 항-엔도스태틴 항체의 Fab 단편을 항원으로 사용하여 항-엔도스태틴 항체에 의한 순환 엔도스태틴의 제거를 무마시키기 위해 사용 가능한 항-엔도스태틴 Fab 단편 항혈청을 발생시킨다.
본 발명의 다른 양태는 과도한 내인성 엔도스태틴의 작용을 차단하는 방법이다. 이는 시스템의 원하지 않은 엔도스태틴에 특이적인 항체로 인간 또는 동물을 수동 면역시켜 행해질 수 있다. 이런 처리법은 비정상적인 배란, 월경 및 태반 형성, 및 맥관형성을 치료하는데 있어 중요할 수 있다. 이는 전이 과정상의 엔도스태틴 제거의 효과를 검사하기에 유용한 수단을 제공한다. 엔도스태틴 항체의 Fab 단편은 엔도스태틴에 대한 결합 부위를 함유하고 있다. 당해분야의 공지된 기술을 사용하여 엔도스태틴 항체로부터 이 단편을 분리한다. 엔도스태틴 항혈청의 Fab 단편을 항원으로 사용하여 항-Fab 단편 혈청의 생성을 유발시킨다. 엔도스태틴의 Fab 단편에 대한 이러한 항혈청의 주입은 엔도스태틴을 엔도스태틴 항체와 결합시키는 것을 막는다. 치료상의 이점은 내인성 항-엔도스태틴 항체를 중화시키고 항-엔도스태틴의 Fab 단편과 엔도스태틴과의 결합을 차단시킴으로써 수득된다. 이러한 치료법의 총체적인 효과는 목적 세포로 도달하는 내인성 순환 엔도스태틴의 능력을 용이하게 함으로써, 전이의 확장을 감소시킨다.
본 발명은 내피 세포 저해 활성을 지닌 임의의 엔도스태틴 유도체를 포함할 것으로 이해될 수 있다. 본 발명은 전체 엔도스태틴 단백질, 엔도스태틴 단백질의 유도체 및 생물학적으로 활성적인 엔도스태틴 단백질의 단편을 포함한다. 이는 아미노산 치환을 가지거나 아미노산 작용 그룹에 부착된 당 또는 다른 분자를 가진 엔도스태틴 활성을 지닌 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 엔도스태틴 및 엔도스태틴 수용체를 암호화하는 유전자, 및 이 유전자에 의해 발현된 단백질도 포함한다.
앞서 기술된 엔도스태틴 활성을 지닌 단백질 및 단백질 단편은 당해분야의 당업자에게 공지된 제형 방법을 사용하여 약학적으로 수용가능한 제형에서 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로 제공될 수 있다. 표준 경로에 의해 이러한 제형을 투여할 수 있다. 일반적으로, 국부, 경피, 복막내, 두개골내, 경구, 직장 또는 비경구(예를 들면, 정맥내, 척추내, 피하 또는 근육내) 루트에 의해 병행물을 투여할 수 있다. 또한, 예를 들면, 엔도스태틴을 조직적으로 서서히 방출시키기 위한 종양 또는 이식 부위에서, 원하는 약물 전달 장소 근처에 이식된 화합물, 중합체의 지속적인 방출을 허용하는 생분해성 중합체로 엔도스태틴을 혼입시킬 수 있다. 캐뉼러를 통해 직접적인 전이 생장 또는 종양으로의 맥관 공급과 같이, 관심 부위로 고농도의 엔도스태틴의 통제된 전달을 제공하기 위해 삼투성 미니펌프도 또한 사용할 수 있다. 본원에서 참조 문헌으로 인용되는 예를 들면, "Brem et al., J. Neurosurg, 74 : 441-446 (1991)"에서는 생분해성 중합체 및 이의 용도에 관해 상세히 기술하고 있다.
본 발명의 엔도스태틴의 투여량은 치료되는 질환의 상태와 컨디션 및 인간 또는 동물의 체중과 컨디션 및 화합물의 주입 경로와 같은 다른 임상 요인에 의존할 것이다. 인간 또는 동물 치료를 위해서는, 대략 0.5 mg/kg 내지 500 mg/kg의 엔도스태틴을 투여할 수 있다. 좀더 바람직한 범위는 1 mg/kg 내지 100 mg/kg이고 가장 바람직한 범위는 2 mg/kg 내지 50 mg/kg이다. 특정 인간 또는 동물의 엔도스태틴 반감기에 따라, 하루에 여러 번 내지 일주일에 한 번꼴로 엔도스태틴을 투여할 수 있다. 본 발명은 인간 및 가축 모두를 위한 용도로 응용될 수 있음이 이해되어진다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 장기간에 걸쳐 주어진, 일회 및 복수회의 투여를 고려 중에 있다.
엔도스태틴 제형은 경구, 직장, 눈(유리체내 또는 카메라내를 포함), 코, 국부(구강 및 혀밑 포함), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복막내, 근육내, 정맥내, 피부내, 두개골내, 기관내, 및 경막외 포함) 투여에 적당한 것을 포함한다. 엔도스태틴 제형은 단위 투여량 형태로 편리하게 존재할 수 있고 종래의 약학적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약학적 담체 또는 부형제와의 결합을 일으키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 액체 담체 또는 잘게 나뉘어진 고형 담체 또는 이둘 모두를 활성 성분과 균질하면서도 밀접하게 결합시켜 제형을 제조한 다음, 필요하다면, 생성물의 형상을 만든다.
비경구 투여에 적당한 제형은 의도된 수용자의 혈액으로 등장성인 제형을 만드는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 예를 들면, 봉입된 앰풀 및 유리병인 단위-투여량 또는 복수회-투여량 용기에 존재할 수 있고, 예를 들면, 사용 전 즉시 주사를 위한 물인 멸균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 동결 건조(냉동 건조) 상태에서 저장될 수 있다. 앞서 기술된 종류의 멸균 분말, 입상 및 정제로부터 즉석 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다.
바람직한 단위 투여량 제형은 본원에서 앞서 상술된 바와 같이, 매일 투여량 또는 단위, 매일 피투여량 또는 투여된 성분의 적당한 분획을 포함하는 것이다. 특히 앞서 언급된 성분 뿐만 아니라, 본 발명의 제형은 제형 유형에 있어 문제를 지닌 당해분야의 종래의 다른 시제를 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
특정 항혈청의 발생을 위한 항원, 엔도스태틴 결합 부위에서 활성적인 아고니스트 및 길항 물질, 엔도스태틴과 결합하는 세포의 표적 사멸을 위한 세포 독성제와 연결 가능한 펩티드에만 한정되지 않은 여러 적용에 있어 본래의 엔도스태틴 분자의 상이한 펩티드 단편을 유용하게 합성할 수 있다. 이들 펩티드를 포함한 아미노산 서열은 분자의 외부 영역에서의 위치를 기준으로 선택되고 항혈청과의 결합에 있어 용이하다. 분자의 중간 영역뿐만 아니라, 엔도스태틴의 아미노 및 카복실 말단은 합성 가능한 단편 중에서 각각 따로 발현된다. 엔도스태틴의 아미노 말단으로부터 20번째 아미노산 및 카복실 말단은 티로신 또는 라이신 잔기를 함유할 수 있거나 함유하도록 변형될 수 있으면 다수의 기술에 의해 표지되어진다. 이들 잔기를 가지지 않은 단편에 티로신 또는 라이신을 첨가함으로서 펩티드상의 반응성 아미노 및 하이드록실 그룹의 표지가 용이해진다. 이 펩티드 서열을 서열 자료 은행을 사용하여 공지된 서열과 비교하여 잠정적인 서열 상동을 결정한다. 이 정보는 다른 분자와 높은 정도의 서열 상동을 나타내는 서열의 제거를 용이하게함으로써, 엔도스태틴에 대한 항혈청, 효능제 및 길항제의 발생에 있어 높은 특이성을 위한 잠재성을 증진시킨다.
HPLC 및 질량 분광계로 체크된 표준 미량 화학 용이성 및 순도에서 펩티드를 합성할 수 있다. 펩티드 합성법, HPLC 정제법 및 질량 분광 광도계법은 당해분야의 전문가에게 일반적으로 공지되어 있다.
펩티드 및 엔도스태틴은 또한 하기에서 기술한 바와 같이, 재조합 이. 콜라이, 또는 곤충 또는 효모 발현 시스템에서도 생성되고 컬럼 크로마토그래피로 정제된다.
표준 방법을 사용하여 엔도스태틴 및 펩티드로부터 유도된 엔도스태틴을 다른 분자와 결합시킬 수 있다. 엔도스태틴의 아미노 말단으로부터 20번째인 아미노산 및 카복실 말단 모두는 티로신 및 라이신 잔기를 함유할 수 있고 예를 들면 종래의 기술(티로신 잔기-클로르아민 T, 이오도겐, 락토퍼록시다제; 라이신 잔기-볼톤-헌터제)을 사용하여 방사성 동위원소 표지를 하는 다수의 기술로 동위원소 및 비동위원소적으로 표지된다. 이러한 결합 기술은 당해분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다. 설프하이드랄, 카복실, 아미드, 페놀 및 이미다졸(이것에만 한정되지 않음)을 포함하는 아미노산 상에 유용한 작용 그룹을 기준으로 결합 기술을 선택한다. 결합에 효과적으로 사용되는 다양한 시약은 나머지들 중, 글루타르알데히드, 디아조화된 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논을 포함한다.
동위 원소, 효소, 담체 단백질, 세포 독성제, 형광 분자 및 다양한 적용을 위한 다른 화합물과 엔도스태틴 펩티드를 화학적으로 결합시킨다. 특정 반응을 위해 적당한 다양한 기술을 사용하여 결합 반응의 유효도를 측정한다. 예를 들면, 높은 특이 활성의 클로르아민 T 및 Na125I를 사용하여125I 를 지닌 엔도스태틴 펩티드 또는 단백질의 방사성 동위 원소 표지를 달성한다. 나트륨 메타비설파이트로 반응을 완료하고 혼합물을 일회용 컬럼상에서 탈염시킨다. 표지된 펩티드를 컬럼으로부터 용출시키고 분획을 수집한다. 각각의 분획으로부터 분취량을 제거하고 감마 계수관에서 방사능을 측정한다. 이 방법에서, 표지된 엔도스태틴 펩티드로부터 반응하지 않은 Na125I를 분리한다. 최상의 특이 방사능을 지닌 펩티드 분획을 엔도스태틴 항혈청과의 결합능 분석과 같은 차후의 용도를 위해 저장한다.
펩티드 접합의 다른 적용은 폴리클로날 항혈청의 생성을 위한 경우이다. 예를 들면, 라이신 잔기를 함유한 엔도스태틴 펩티드를 글루타르알데히드를 이용하는 정제 소 혈청 알부민과 연결시킨다. 방사성 동위 원소로 식별된 펩티드의 혼입을 측정함으로써 반응 효율을 결정한다. 투석에 의해 반응하지 않은 글루타르알데히드 및 펩티드를 분리한다. 차후의 용도를 위해 접합체를 저장한다.
엔도스태틴에 대한 항혈청을 발생시킬 수 있다. 펩티드 합성 및 정제 후, 당해분야의 전문가에게 익히 공지된 설정 기술을 이용하여 모노클로날 및 폴리클로날 항체 모두를 발생시킨다. 예를 들면, 토끼, 양, 염소 또는 다른 동물에서 폴리클로날 항체를 유도시킬 수 있다. 소 혈청 알부민 또는 엔도스태틴 자체와 같은 담체 분자에 접합된 엔도스태틴 펩티드를 등, 목, 옆구리, 및 때로는 풋패드 상의 다수의 부위에서 에멀션화시키고 피하 주사된 보조 혼합물과 병행한다. 매 2 내지 4주와 같은 일정한 간격으로 효능 촉진 주사를 행한다. 예를 들면, 각 주사후 대략 7 내지 10일간의 확장 후 가장자리 귀 정맥을 사용하여, 정맥천자에 의해 혈액 샘플을 수득한다. 혈액 샘플을 4℃에서 밤새 응고시키고 4℃, 대략 2400x g에서 약 30분간 원심분리시킨다. 혈청을 제거하고, 등분하여 즉시 사용을 위해서는 4℃에서 또는 차후 분석을 위해서는 -20 내지 -90℃에서 저장한다.
폴리클로날 항혈청의 발생으로부터 모든 혈청 샘플 또는 모노클로날 항혈청의 생성으로부터 배지 샘플을 적정치 측정을 위해 분석한다. 여러가지 방법, 예를 들면, 도트 블랏 및 밀도 분석을 이용하여 적정치를 결정하고, 단백질 A, 제 2 항혈청, 냉각된 에탄올 또는 목탄-덱스트란을 사용하여 방사성 동위 원소로 식별된 펩티드-항체 복합체의 침착에 이어 감마 계수 회로를 사용해 활성도를 측정한다. 시판된 친화성 컬럼상에서 최고의 적정치를 나타낸 항혈청도 또한 정제한다. 친화성 컬럼내의 겔과 엔도스태틴 펩티드를 결합시킨다. 컬럼을 통해 항혈청 샘플을 통과시키고 항-엔도스태틴 항체는 컬럼에 부착되어 남아있게 된다. 차후 이 항체를 용출시키고, 수집하여 적정치 측정 및 특이성을 평가한다.
최고의 적정치를 지닌 엔도스태틴 항혈청을 시험하여 a) 항원의 최상의 특이 결합 및 최하의 비특이 결합을 위한 최적 항혈청의 희석, b) 표준 치환 곡선에서 증가량의 엔도스태틴 펩티드와의 결합능, c) 엔도스태틴 관련 종을 포함하면서, 관련 펩티드 및 단백질과의 잠재적인 가교-반응성, d) 혈장, 소변, 조직의 추출물, 및 세포 배양 배지에서의 엔도스태틴 펩티드의 검출능을 설정한다.
엔도스태틴의 측정을 위한 키트도 또한 본 발명의 한 부분으로 인식되고 있다. 최고의 적정치 및 특이성을 소유하고 혈장, 소변, 조직의 추출물 및 세포 배양 배지에서의 엔도스태틴 펩티드를 검출할 수 있는 항혈청을 추가로 검사하여 신속, 확실, 좋은 감도 및 특정 측정을 위한 키트의 사용 및 앤지오스태틴의 위치 측정을 용이하게 하도록 설정한다. 이 분석 키트는 하기의 기술을 포함하지만 이들에만 한정되지는 않는다: 경쟁 및 비경쟁 분석법, 방사 면역 분석 시험법, 생체 발광 및 화학 발광 분석법, 형광 분석 시험법, 샌드위치 분석법, 면역 형광 분석법, 도트 블랏법, ELISA를 포함한 효소 결합 분석법, 마이크로타이터 플레이트, 소변 또는 혈액의 빠른 모니터링을 위한 항체 코팅 스트립 또는 딥스틱, 및 면역 세포 화학법. 각각의 키트 범위를 위해, 분석의 감도, 정밀도, 신뢰도, 특이성 및 재생성을 설정한다. 치환 또는 활성의 표준 곡선상의 20%, 50% 및 80% 지점에서 분석내 및 분석간 편차를 설정한다.
조사 및 임상에서 일반적으로 사용되는 분석 키트의 한 예는 형광 면역 분석(RIA) 키트이다. 하기에서는 엔도스태틴 RIA에 관해 설명하고 있다. 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 펩티드의 성공적인 방사성옥소화 및 정제 후, 적당한 완충액 시스템에서 최고의 적정치를 소유한 항혈청을 몇번 희석하여 10,000 cpm과 같이 상대적으로 일정한 양의 방사능을 함유한 튜브에 첨가한다. 다른 튜브는 비특이 결합을 결정하기 위해 완충액 또는 예비 면역 혈청을 함유한다. 4℃에서 24 시간동안 배양한 후, 단백질 A를 첨가하고 튜브를 실온에서 90 분간 와동, 배양시킨 다음, 4℃에서 대략 2000-2500 X g로 원심분리시켜 표지된 항원과 결합된 항체 복합체를 침착시킨다. 흡기에 의해 상등액을 제거하고 감마 계수 장치로 펠렛 중의 방사능을 계산한다. 비특이 결합의 공제 후, 표지된 펩티드의 대략 10 내지 40%와 결합하는 항혈청 희석도가 추가로 특징지워진다.
다음, 방사능으로 표지된 펩티드 및 항혈청을 함유한 튜브에 기지량의 펩티드를 첨가하여 항혈청 발생을 위해 사용된 엔도스태틴 펩티드의 희석 범위(대략 0.1 pg 내지 10 pg)를 평가한다. 예를 들면, 24 내지 48 시간 정도의 추가적인 배양 기간 후, 단백질 A를 첨가하고 튜브를 원심 분리시키며, 상등액을 제거한 다음 펠렛 중의 방사능을 계산한다. 방사성으로 비표지된 엔도스태틴 펩티드에 의한 표지된 펩티드의 결합의 치환은 표준 곡선을 제공한다. 여러 농도의 다른 엔도스태틴 펩티드 단편, 플라스미노겐, 다양한 종으로부터 엔도스태틴, 및 상동 펩티드를 분석 튜브에 첨가하여 엔도스태틴 항혈청의 특이성을 특징짓는다.
엔도스태틴을 추출하는데 성공적으로 적용된 추출 기술을 사용하여 일차 및 이차 종양, 루이스 폐암, 엔도스태틴 생성 세포, 태반, 자궁, 및 뇌, 간 및 장과 같은 다른 조직의 배양을 포함하는 다양한 조직(이것에만 한정되지는 않음)의 추출물을 제조한다. 동결 건조 또는 조직 추출물의 Speed Vac 후, 분석 완충액을 첨가하고 상이한 분취량을 RIA 튜브에 배치한다. 공지된 엔도스태틴 생성 세포의 추출물은 표준 곡선과 평행인 치환 곡선을 생성하는 반면, 엔도스태틴을 생성하지 않는 조직의 추출물은 엔도스태틴 항혈청으로부터 방사성으로 표지된 엔도스태틴을 치환하지 않는다. 또한, 루이스 폐암을 지닌 동물로부터 소변, 혈장 및 뇌척수액의 추출물을 증가량의 분석 튜브에 첨가한다. 평행 치환 곡선은 조직 및 신체액 중의 엔도스태틴을 측정하기 위한 엔도스태틴 분석의 유용성을 지적하고 있다.
분취량을 역상 HPLC를 적용시킴으로써 엔도스태틴을 함유한 조직 추출물을 추가로 특징짓는다. 용출액 분획을 수집하고, Speed Vac에서 건조시키며, RIA 완충액에서 재구축시킨 다음 엔도스태틴 RIA로 분석한다. 엔도스태틴 용출 위치에 대응하는 분획에 엔도스태틴 면역반응성의 최대량을 위치시킨다.
분석 키트는 사용 설명서, 항혈청, 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 펩티드, 및 결합된 엔도스태틴-엔도스태틴 항체 복합체의 침착을 위한 가능한 방사성 표지된 엔도스태틴 및/또는 시약을 제공한다. 키트는 종양을 지닌 및 지니지 않은 동물 및 인간의 생물학적 유체 및 조직 추출물 중의 엔도스태틴의 측정을 위해 유용하다.
조직 및 세포 중의 앤지오스태틴의 위치 측정을 위해서는 다른 키트가 유용하다. 이 엔도스태틴 면역 조직 화학 키트는 사용 설명서, 엔도스태틴 항혈청, 및 형광 이소티오시아네이트와 같은 형광 분자 또는 일차 항혈청을 나타내는데 사용된 몇몇 다른 시약과 결합된 가능한 블로킹 혈청 및 이차 항혈청을 제공한다. 면역 조직 화학 기술은 당해분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다. 이 엔도스태틴 면역 조직 화학 키트는 광학 및 전자 현미경 모두를 사용하여 조직 구간 및 배양된 세포 중의 엔도스태틴의 위치 측정을 가능케 해 준다. 이는 조사 및 임상 목적 모두를 위해 사용된다. 예를 들면, 종양을 생검 실시하거나 수집하고 마이크로톰으로 조직 구간을 절단하여 엔도스태틴 생성 부위를 조사한다. 이러한 정보는 암의 검출 및 치료에 있어 진단 및 가능한 치료 목적을 위해 유용하다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 반면에, 본원의 상세한 설명을 숙지한 후, 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구항의 범위와 동떨어짐 없이 당해분야의 전문가에게 제안할 수 있는 다양한 기타 양태, 변형 및 등가물에 의존할 수 있음이 명확히 이해되어야 한다.
실시예 1
혈관내피종 세포로부터 모세혈관 내피 세포 증식 저해제의 동정
내피 세포 증식 저해제의 생성 증거를 위해 쥐 혈관내피종 세포주, EOMA(Obeso et al., 1990)를 측정한다. 다수의 공지된 맥관형성의 내인성 저해제는 시험관 내에서 내피 세포의 증폭을 저해한다.
조건화 배지 수집: 37℃ 및 10%의 CO2배양기에서 10% 송아지 혈청(BCS) 및 1% 글루타민-페니실린-스트렙토마이신(GPS)으로 보충된 DMEM 중에 쥐 혈관내피종 세포주 EOMA의 세포를 유지시킨다. EOMA 세포(즉, EOMA 세포 생장을 위해 사용된 배양 배지)로부터 조건화 배지를 소 모세혈관 내피 세포에 적용하고, 72 시간 증폭 분석에서 bFGF로 자극시킨다. 조건화 배지는 대조군과 비교할 때 모세혈관 내피 세포의 증식을 역으로 저해한다. 저해의 패턴은 내피 세포 증식의 저해 및 촉진 활성의 존재와 일치한다(도 1).
실시예 2
앤지오스태틴에 기인하지 않은 내피 세포 증식의 저해 활성
EOMA 세포에 의해 생성된 모세혈관 내피 세포 증식의 저해제가 앤지오스태틴인지 여부를 결정하기 위해, 수집된 조건 배지를 라이신 컬럼(SepharoseTM크로마토그래피 비드에 접합된 라이신)에 적용한다. 라이신 세파로스는 앤지오스태틴과 결합하고 정제를 위해 사용되고 있다(O'Reilly et al., 1996). 내피 세포 저해 활성은 병류 분획에서만 관찰되고 결합된 분획에서는 관찰되지 않는다(데이터를 나타내지 않음). 라이신 세파로스와 저해 활성 결합의 결여는 내피 세포 증식의 신규 저해제가 앤지오스태틴이 아님을 암시하고 있다.
실시예 3
내피 세포 증식을 특이하게 저해하는 EOMA 세포의 조건 배지로부터 20 kDa 단백질의 정제
여러 맥관형성 저해제는 헤파린에 대한 친화성을 가지고 있기 때문에, 본 발명자는 라이신 세파로스 컬럼으로부터 헤파린 세파로스 컬럼으로 병류를 적용한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 저해 활성은 헤파린과 상대적으로 높은 친화성으로 결합하고 10 mM 트리스 pH 7.4에서 0.6-0.8 M NaCl로 용출시킨다. 저해 활성의 추가적인 정제를 위해, 샘플을 농축시키고 겔 여과(Bio-Rad Bio-Gel P-100 미세 겔 또는 Pharmacia Sephacryl S-200HR 겔) 컬럼을 적용(도 3을 보라)한데 이어, C4컬럼을 지닌 역상 HPLC를 여러 번 반복한다. 도 4에서 예시한 바와 같이, 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 40 내지 45%의 아세토니트릴을 지닌 C4컬럼으로부터 저해 방사능을 용출한다. 최종 C4 컬럼 후, 가시 균질도로 정제된 SDS-PAGE에 의해, 분자량이 대략 20 kDa(치환) 또는 18 kDa(비치환)인 단백질과 저해 방사능을 결합시킨다.
실시예 2 및 3에 관해, 제조자의 추천에 따라 라이신 세파로스, 헤파린 세파로스, 세프아크릴 S-200 HR 겔(스웨덴 웁살라 Pharmacia), Bio-Gel P-100 미세 폴리아크릴아마이드 겔(미국 캘리포니아 리치몬드의 Bio-Rad Laboratories), 및 SynChropak RP-4(100 x 4.6 mm) C4 역상 컬럼(Synchrom, Inc., 인디애나 라파옛)을 제조한다. 헤파린-세파로스 컬럼(50 x 2.4 cm)을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.4) 중의 50 mM NaCl로 평형을 유지시킨다. 수집된 조건 배지를 적용하고 컬럼을 평형 완충액으로 세척한다. 컬럼을 10 mM 트리스-HCl(pH 7.4)에서 50 mM-2M NaCl(총용적이 200 ml)의 연속적인 속도로 용출시킨데 이어, (pH 7.4) 10 mM 트리스-HCl중의 2M NaCl 100 ml로 용출시킨다. 분획을 수집하고 각각의 분취량을 모세혈관 내피 세포에 적용한다. 증식을 저해하는 분획을 PBS로 투석(MWCO = 6,000-8,000)시키고 4000 MWCO Nanospin 농축기(Gelman Sciences, 미시간 앤아버)를 사용하여 농축시킨다.
Bio-Gel P-100 컬럼 또는 세프아크릴 S-200 HR 컬럼(75 x 1.5 cm)을 PBS로 평형화시킨다. 헤파린 세파로스 크로마토그래피로부터 샘플을 적용하고 컬럼을 평형 완충액으로 플루팅시킨다. 분획을 수집하고 각각의 분취량을 내피 세포에 적용한다. 내피 세포 증식을 저해하는 분획을 상기와 같이 농축시키고 투석시킨다.
SynChropak RPG(100 x 4.6 mm)을 사용된 H2O/0.1% 트리플루오로아세트산(TFA), HPLC-등급 시제(Pierce, 일리노이 락포드)로 평형을 유지시킨다. 겔 여과 크로마토그래피로부터 샘플을 컬럼에 적용하고 0.1%TFA 중의 아세토니트릴의 속도 0.5 ml/분에서 컬럼을 플루팅시킨 다음 분획을 수집한다. 각각의 분취량을 진공 원심분리에 의해 증발시키고, PBS로 재현탁시킨 다음, 모세혈관 내피 세포에 적용한다. SynChropak C4 컬럼상에서 적어도 차후 2회의 순환에 의해 겉보기 균질도 저해 방사능을 추가로 정제한다.
20 kDa 억제제를 추가로 규명하기 위해서, 이것을 내피 및 비-내피 기원의 여러 세포주에 대해 시험한다. BCE 분석을 위해서, 소의 모세혈관 내피 세포를 상술된 바와 같이 수득하고 배양한다 (Folkman et al., 1979). 증식 분석을 위해서, 세포를 PBS로 세척하고 트립신의 0.05% 용액에 분산시킨다. 세포 현탁액(25,000 세포/㎖)을 DMEM + 10% BCS + 1% GPS로 제조하고, 겔화된 24-웰 배양 플레이트(0.5 ㎖/웰)에 플레이팅하고, 24시간 동안 배양한다(37℃, 10% CO2). 배지를 0.25 ㎖의 DMEM + 5% BCS + 1% GPS로 대체하고 시험 샘플을 적용시킨다. 배양 20분후, 배지 및 bFGF를 최종 용적 0.5 ㎖의 DMEM + 5% BCS + 1% GPS + 1 ng/㎖ bFGF를 수득하기 위해서 첨가한다. 72시간 후, 세포를 트립신에 분산시키고 헤마톨(Hematall)(Fisher Scientific, 펜실베니아 피츠버그)에서 재현탁하고, 콜터(Coulter) 카운터에 의해 카운팅한다.
비-내피 세포 증식 세포 증식 분석
소 대동맥 평활근 (SMC), 소 망막 색소 내피 (RPE), 밍크 폐 내피 (MLE), 루이스 폐암종 (LLC), 및 EOMA 세포 및 3T3 섬유아세포를 10% CO2및 37℃ 배양기에서 유지한다. 증식 분석을 위해서, 세포를 PBS로 세척하고 0.05% 트립신 용액에 분산시킨다. 세포 증식 분석의 최적의 조건이 각각의 다른 세포 유형에 대해서 설정된다. 태 송아지 혈청 (FCS)을 RPE, MLE 및 LLC 세포에 사용하고 BCS를 나머지 세포 유형에 사용한다. 세포 현탁액(SMC, RPE, MLE에 대해 20,000 세포/㎖, 3T3에 대해 15,000 세포/㎖, LLC, EOMA에 대해 10,000 세포/㎖)을 DMEM + 10% 소 혈청 + 1% GPS로 제조하고, 겔화된 24-웰 배양 플레이트(0.5 ㎖/웰)에 플레이팅하고, 24시간 동안 배양한다(37℃, 10% CO2). 배지를 0.5 ㎖의 DMEM + 5% 소 혈청 + 1% GPS로 대체하고 시험 샘플을 적용시킨다. 72시간 후, 세포를 트립신에 분산시키고 헤마톨(Hematall)(Fisher Scientific, 펜실베니아 피츠버그)에서 재현탁하고, 콜터 카운터에 의해 카운팅한다.
표 2에 도시된 바와 같이, 내피 세포만이 현저하게 억제된다.
| 억제 | 비-억제 |
| 소 모세혈관 내피 세포 | 소 동맥 평활근 세포 |
| 소 망막 색소 내피 세포 | |
| 3T3 섬유아세포 | |
| 밍크 폐 내피 세포 | |
| EOMA혈관내피종 세포 | |
| 루이스 폐암 세포 |
억제는 100 ng/㎖의 용량에서 처음 관찰되고 최대의 억제는 600 ng/㎖ 이상의 용량에서 관찰된다. 모세혈관 내피 세포 증식을 억제하기 위해서 사용되는 용량보다 1 로그 단위 더 높은 용량에서 비-내피 기원의 세포에 대해 현저한 억제가 관찰되지 않는다.
실시예 4
20 kDa 단백질 발현 동정의 콜라겐 XVIII의 단편으로의 미세서열 분석
상기 실시예에 기재된 바와 같이, 조건 배지로부터의 모세혈관 내피 세포 증식 억제제 20 kDa를 균질하게 정제하고, SDS-PAGE에 의해 용해하고, PVDF(Bio-Rad, 캘리포니아 리치몬드)로 일렉트로블로팅하고, 폰소 에스(Ponceau S) 균주에 의해 검출하고, 막으로부터 절단한다. N-말단 서열을 트리플루오로아세트산의 가스-상 운반으로 작동되는 PE/ABD 모델 470A 단백질 서열분석기 (캘리포니아의 포스터 시티)에서 자동화된 에드만(Edman) 분해에 의해 결정한다.
서열 라이브러리 조사 및 정렬을 조합된 진뱅크(GenBank), 브룩헤이븐 단백질(Brookhaven Protein), SWISS-PROT, 및 PIR 데이터베이스에 대해서 실행한다. 조사를 BLAST 네트워크 서비스의 사용을 통하여 국립 생물공학 정보 센터(the National Ceter for Biotechnology Information)에서 실행한다.
억제제의 미세서열 분석 결과 콜라겐 XVIII의 C-말단 단편과 동일한 것으로 밝혀졌다. 콜라겐 XVIII의 분자 클로닝 및 서열은 Olsen과 그의 공동 작업자 및 Rehn 및 Pihlajaniemi [참고문헌: Oh et al., 1994; Rehn and Pihlajaniemi, 1994]에 의해서 최초로 기재되었다. 콜라겐 XVIII는 3개의 스플라이스 변종[참고문헌: Muragaki et al., 1995; Rehn and Pihlajaniemi, 1995]을 갖는 N-말단 영역, 인터럽션을 갖는 일련의 콜라겐 유사 도메인, 및 35 kDa C-말단 비-콜라겐성(NC1) 도메인으로 이루어진 신규 콜라겐이다. 내피 세포 증식의 정제된 억제제의 18-아미노산 N-말단 미세서열 분석은 이것이 NC1 도메인(도 5)의 C-말단 단편과 동일하다는 것을 확증한다. 콜라겐 XVIII의 이러한 억제 단편을 "엔도스태틴"이라고 명명하고 이것은 엔도스태틴 활성을 갖는 분자들의 그룹에 포함된다.
실시예 5
재조합 마우스 엔도스태틴(바큘로바이러스 또는 이. 콜라이)의 시험관내 내피 세포 증식 및 생체내 맥관형성 억제
본 발명의 내피 증식 세포 억제제는 단백질을 발현하기 위해서 사용되는 시스템에서 재조합으로 발현될 수 있다. 이러한 발현 시스템의 제한되지 않는 예에는 세균 발현 시스템, 효모 발현 시스템 및 곤충 바이러스 발현 시스템이 포함된다.
재조합 마우스 엔도스태틴을 BacPAK 바큘로바이러스 발현 시스템(CLONTECH Laboratories)을 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 발현시킨다. 간단히 말해서, 마우스 콜라겐 XVIII의 단일 서열을 암호화하는 cDNA 단편 및 C-말단부(엔도스태틴 영역)를 pBacPAK8 전달 벡터로 삽입한다. BacPAK6 바이러스 DNA(발현 벡터) 및 pBacPAK8-엔도스태틴 클론(변형된 전달 벡터)의 플라스미드 DNA를 곤충 Sf21 세포로 공형질감염하고 발현된 마우스 엔도스태틴을 함유하는 배지를 수집한다. BacPAK6을 독립적인 복제에 무능하게 만들기 위해서 BSU36 효소로 먼저 분해한다. 발현된 마우스 엔도스태틴을 함유하는 배지를 10 mM Tris (pH 7.4) 중의 50 mM NaCl로 평형시킨 1.5 x 40 cm 헤파린 세파로스 컬럼에 적용시킨다. 컬럼을 평형 완충제로 세척하고 후속적으로 10 mM Tris (pH 7.4) 중의 0.2M NaCl, 0.4M NaCl, 0.6M NaCl, 및 1M NaCl로 용출한다. 모든 크로마토그래피를 4℃에서 실행한다. 0.6 M NaCl 용출제(72시간 증식 분석에서 소 모세혈관 내피 세포를 억제함)를 PBS에 대해서 투석(6-8000 MWCO)하고 헤파린 세파로스 컬럼에 재적용시킨다. 컬럼을 10 mM Tris (pH 7.4) 중의 50 mM NaCl 내지 1.2M NaCl의 농도구배로 용출한다. 각 분획의 분취량을 상기와 같이 소 모세혈관 내피 세포에 적용시키고 증식을 억제하는 분획을 수집하고, PBS에 대해 투석하고, 나노스핀 플러스(Nanospin Plus) (Gelman Sciences) 원심분리 농축기 (MWCO = 10,000)를 사용하여 농축한다. 농축된 샘플의 SDS-PAGE는 20 kDa의 겉보기 Mr의 분리된 밴드를 나타낸다.
이. 콜라이로부터 재조합 마우스 엔도스태틴의 발현 및 정제
콜라겐 XVIII의 cDNA의 C-말단부를 pETKH1 벡터(pET11d 유도체) (Studier et al., 1990)로 클로닝된 마우스 엔도스태틴의 cDNA를 증폭시키기 위해서 사용한다. 유도는 아미노산 서열 MARRASVGTD (RRAS = 단백질 키나제 A 인식 서열)과 N-말단의 6개 히스티딘 잔기 다음 마우스 엔도스태틴의 서열(pTB01#8)을 운반하는 융합 단백질의 생성을 유발한다. pTB01#8 플라스미드를 BL21:DE3으로 형질전환하고 융합 단백질을 상술된 바와 같이(QiaExpressionist Handbook, Qiagen) Ni+2-NTA-비드에서 정제한다. 간단히 말해서, 이. 콜라이를 O.D.600이 0.8 내지 0.9가 될 때까지 배양하고 이어서 융합 단백질의 발현을 1 mM IPTG로 3시간 동안 유도한다. 세균을 펠릿화하고 8M 우레아, 10 mM 이미다졸을 함유하는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에서 재현탁하고 1시간 동안 실온에서 배양한다. 현탁액을 15분 동안 20,000 g에서 원심분리하고 상등액을 Ni+2-NTA 비드로 1시간 동안 실온에서 배양한다. 현탁액을 컬럼으로 전달하고 8M 우레아, 0.1M Na-포스페이트, 10 mM 이미다졸을 함유하는 10 mM Tris-HCl (pH 6.25)로 세척한다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충제로 용출한다. 엔도스태틴을 함유하는 분획을 PBS에 대해서 널리 투석한다. 투석 도중, 엔도스태틴이 침전한다. 침전된 엔도스태틴을 PBS로 재현탁하고 단백질 농도를 2 내지 4 mg/㎖로 조정하고 엔도스태틴을 사용시까지 -20℃에서 저장한다. 마우스 연구를 위해서, 엔도스태틴을 PBS 중의 현탁액으로서 제공한다. 병아리 융모요막 분석을 위해서, 엔도스태틴을 물에 대해서 추가로 투석하고 이어서 동결건조한다.
재조합 마우스 엔도스태틴을 바큘로바이러스 및 이. 콜라이 시스템 모두에서 생성한다. 후속적인 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 사용하여, 재조합 마우스 엔도스태틴을 곤충 세포 배지로부터 확실히 균질하게 정제한다. Ni+2-NTA-아가로스를 이. 콜라이-유도 마우스 엔도스태틴을 정제하기 위해서 사용한다.
SDS-PAGE는 바큘로바이러스 및 이. 콜라이-유도 재조합 엔도스태틴 각각(데이터를 나타내지 않음)에 대해 확실히 균질하게 정제된 약 20 kDa 또는 약 22 kDa (감소)의 분리된 밴드를 나타낸다. 모두를 사용하기 전에 PBS에 대해서 투석한다. 투석후, 이. 콜라이 시스템으로부터의 물질이 침전하고 이것을 후속적인 생체내 연구를 위한 현탁액으로서 제공한다. 바큘로바이러스로부터의 재조합 엔도스태틴은 구체적으로 말해서 용량-의존 방식으로 소 모세혈관 내피 세포의 증식을 억제한다. 억제가 100 ng/㎖의 용량에서 관찰되고 최대의 억제는 600 ng/㎖ 이상의 용량에서 관찰된다. 엔도스태틴을 내피 세포 증식을 억제하기 위해서 사용되는 용량보다 1 로그 단위 이하 더 높은 용량에서 시험할 경우 비-내피 기원 또는 EOMA 세포 증식의 현저한 억제가 관찰되지 않는다.
침전된(다시 접히지 않은) 물질은 불용성으로 인하여 시험관 내에서 시험할 수 없다. 그러나, 낮은 퍼센티지가 투석도중 PBS에 용해되고 이러한 분획이 내피 세포 분석을 위해 사용된다. 추가로, 다시 접힌 후, 이것이 용해되고 내피 증식을 억제한다(데이터를 나타내지 않음). 이러한 가용성 물질을 내피 세포에 적용시킬 경우, 최초 엔도스태틴 및 바큘로바이러스-유도 엔도스태틴에 필적할만한 농도에서 억제성임이 밝혀졌다.
재조합 마우스 엔도스태틴의 생체내 맥관형성 억제능을 시험하기 위해서, 병아리 융모요막(CAM) 분석[참고문헌: Folkman, 1985; Nguyen et al., 1994]을 사용한다. 간단히 말해서, 3일된 백색 레그혼 수정란(Spafas, 커네티컷 노르위치)을 깨뜨리고, 손상되지 않은 난황을 갖는 배를 100 x 20 mm 페트리 디쉬(Folkman, 1985)에 배치한다. 3일 배양(37℃ 3% CO2) 후, 엔도스태틴을 함유하는 메틸셀룰로스(Fisher Scientific, 뉴져지 페어 론) 디스크를 개개의 배의 CAM에 적용시킨다. 디스크를 테플론 로드에서 10 ㎕의 0.45% 메틸셀룰로스 중 (H2O 중) 엔도스태틴의 탈수에 의해서 제조한다. 48시간 배양한 후, 배 및 CAM을 입체현미경에 의해서 관찰한다.
10 ㎕ 디스크 당 10 내지 20 ㎍의 용량에서, 시험된 모든 CAM(n=5/그룹)의 이. 콜라이 및 바큘로바이러스-유도 엔도스태틴 모두에 대한 생체내 맥관형성의 유력한 억제가 존재한다. 이. 콜라이 유도-엔도스태틴 침전물은 5일에 걸쳐서 서서히 용해되고 이식된 CAM에 대한 지속되는 맥관형성 효과를 생성한다. 반대로, 가용성 바큘로바이러스-유도 엔도스태틴은 24시간 내에 용해되고 48시간의 기간내에 최대의 맥관형성 효과를 생성한다. 시험된 병아리 배에 독성의 증거는 없다.
인간 엔도스태틴을 유사한 방법을 사용하여 재조합으로 생성한다.
실시예 6
재조합 마우스 엔도스태틴의 전이 생장 억제
종양 성장이 맥관형성 의존성이므로, 루이스 폐암 전이를 바큘로바이러스 시스템에서 발현되는 재조합 마우스 엔도스태틴으로 전신처리한다. 600 내지 1200 mm3의 루이스 폐암을 갖는 동물을 참수하여 종양 위의 피부를 베타딘과 에탄올로 소제한다. 라미나 유동 후드에서, 종양 조직을 무균 조건하에서 절제한다. 0.9% 표준 생리식염수 중의 종양 세포의 현탁액을 생존성 종양의 체를 통한 통과 및 직경 22 내지 30 게이지의 일련의 연속적으로 작아지는 피하 주사바늘에 의해서 제조한다. 최종 농도를 1 x 107세포/㎖로 조정하고 현탁액을 얼음에 배치한다. 부위를 에탄올로 소제한 후, 인접한 중심선의 마우스 등의 피하에 0.1 ㎖의 생리식염수 중의 1 x 106세포를 주입한다.
종양이 1500 m3의 크기일 때, 대략 이식 14일 후, 마우스는 종양 제거 수술을 받는다. 절개를 단순한 단속적인 봉합으로 봉한다. 수술한 날로부터, 마우스는 매일 재조합 (바큘로바이러스) 마우스 엔도스태틴 또는 생리식염수의 복강내 주입을 받는다. 마우스는 피하 주입에 의하여 매일 한번 0.3 mg/kg/일의 엔도스태틴을 받는다. 대조군 마우스가 전이 질환으로부터 병이날 때(즉, 처리 13일후), 모든 마우스를 참수하여서 부검한다. 폐 표면 전이를 4배의 입체현미경에 의해서 카운팅한다.
루이스 폐암 전이의 증대는 피하에 주입된 0.3 mg/kg/일 용량의 엔도스태틴의 투여에 의해서 거의 완전히 억제된다 (7±3 전이/마우스, n=4, p<0.001). 반대로, 루이스 폐암 제 1기 종양의 제거후 생리식염수로 처리한 마우스에서, 폐 전이는 신속하게 증대한다 (77±7 전이/마우스). 종양 부담을 반영하는 폐 중량은 엔도스태틴 처리된 마우스에서 240 ± 25 mg 대 대조군 마우스(p < 0.001)에서 760 ± 30 mg이다. 추가로, 엔도스태틴으로 처리된 마우스에서 중량 손실 또는 독성의 증거는 없다.
실시예 7
재조합 마우스 엔도스태틴 제 1기 종양의 증대를 억제한다.
바큘로바이러스 시스템으로부터의 엔도스태틴의 수득은 이. 콜라이 시스템의 수득보다 더 낮고, 즉, 1 내지 2 mg/ℓ 대 30 내지 40 mg/ℓ이다. 그러므로, 제 1기 종양 증거에 대한 엔도스태틴 치료의 효과를 연구하기 위해서 이. 콜라이-유도 엔도스태틴을 사용한다. 루이스 폐암 제 1기 종양을 치료하기 위해서 이. 콜라이로부터의 재조합 마우스 엔도스태틴을 충분한 양으로 생성한다. 엔도스태틴을 침전된 정제 단백질의 현탁액으로서 적어도 100 내지 200 mm3의 루이스 폐암을 생성하는 마우스에 투여한다. 단백질을 통상적인 방법에 의해서 정제하지만 마우스에 투여하기 전에 다시 접히지 않는다. 주입된 침전물은 24 내지 48 시간에 걸쳐서 서서히 재흡수된다.
동물의 지속된-방출 방법으로서 다시 접히지 않은 재조합 단백질의 주입된 데포우 사용에 대한 전례를 알지 못한다. 그럼에도 불구하고, 엔도스태틴이 점진적으로 생체내에 재흡수되고 연장된 항-종양 및 맥관형성 활성을 유발하는 유력한 맥관형성 활성을 갖는 것으로 입증된다. 그러므로, 이러한 데이터는 재조합 단백질의 조절된 방출의 신규한 일반적 방법을 제안한다. 이러한 이론적 근거를 기초로하여, 유사한 성과를 갖는 이. 콜라이로부터의 다시 접히지 않은 재조합 앤지오스태틴을 제공한다.
따라서, 본 발명의 양태는 내피 세포 증식 억제 단백질을 치료될 환자 및 질환에 따라 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 12시간, 좀더 바람직하게는 적어도 24시간 또는 48시간의 기간에 걸쳐서 지속된 방출 데포우를 제공하기 위해서 다시 접힌 상태의 재조합 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 동족체를 투여하는 것이다. 임의의 재조합 및 다시 접히지 않은 안기오스틴을 치료될 환자 및 질환에 따라 적어도 8시간, 바람직하게는 적어도 12시간, 좀더 바람직하게는 적어도 24시간 또는 48시간의 기간에 걸쳐서 안기오스틴 단백질을 방출할 수 있는 단백질의 지속된 방출 데포우를 유사하게 제공하기 위해서 투여한다.
마우스를 상술된 바와 같은 루이스 폐암으로 이식한다. 종양을 다이얼-측경기로 측정하고 용적을 면적의 제곱 x 길이 x 0.52의 공식을 사용하여 측정하고, 처리된 종양 용적 대 대조군 종양 용적 (T/C)의 비를 최후시점에 대해 측정한다. 3 내지 7일 내에 발생한 종양 용적이 100 내지 200 mm3(체중량의 0.5 내지 1%)이 된 후, 마우스를 무작위적으로 두 그룹으로 나눈다. 한 그룹은 1일 1회 종양으로부터 떨어진 부위에 피하 주입된 PBS 중의 현탁액으로서 재조합 마우스 엔도스태틴(이. 콜라이)을 받는다. 다른 한 그룹은 비히클만으로 필적할만한 주입을 받는다. 실험을 종결하고 대조군 마우스가 죽기 시작할 때 마우스를 참수하여서 부검한다.
루이스 폐 제 1기 종양의 증대는 엔도스태틴으로의 전신 요법에 의해 유력하게 억압된다. 엔도스태틴 용량의 증가는 개선된 효능(데이터를 나타내지 않음)과 연관된다. 10 mg/kg의 용량에서, 종양 증대는 비히클만으로 처리된 대조군 쥐와 비교시 97% 억제된다. 두개의 개별적인 실험의 1일 1회 제공된 20 mg/kg 용량에서, 성립된 제 1기 종양(99% 이상 억제, p<0.001)이 거의 완전히 퇴보한다. 이러한 놀랍고도 예상치 못한 결과가 도 6 및 7에 도시된다.
도 8, 9, 10 및 11은 여러 상이한 종양 모델에서 종양 증대를 억제하기 위한 재조합 마우스 엔도스태틴의 유효도를 도시한다. 또한 종양 증대를 억제하기 위해 인간으로부터 유도된 엔도스태틴의 유효성을 도시한다.
잔존하는 적은 종양의 면역조직화학적 분석(도 12)은 엔도스태틴 처리된 종양의 맥관형성의 유력한 억제를 도시한다. 추가로, 엔도스태틴 및 생리식염수 처리된 마우스의 종양의 증식 지수는 두 그룹에서 동일하게 높은 수준인 반면, 아폽토틱 지수는 엔도스태틴 처리후 8배 증가한다. 따라서, 엔도스태틴 처리는 앤지오스태틴에 대해 상술된 것과 유사한 유형의 종양 잠복을 유발한다 (Holmgren et al., 1995; O'Reilly et al., 1996). 추가로, 처리된 마우스에 약물에 관련된 독성의 증거는 없다.
엔도스태틴 처리 중단후, 5 내지 14일 내에 재발된 종양이 혈관으로 퍼지게 되고, 결과적으로 마우스를 참수한다 (데이터를 나타내지 않음). 특히, 상술된 바와 같은 N-말단 표지된 산물에 필적할만한 방식으로 발현되고 정제되고 투여된, C-말단 다히스티딘 표지를 갖는 이. 콜라이-유도 재조합 마우스 엔도스태틴이 CAM 분석에서 맥관형성을 억제하지 않고 루이스 폐암의 증대에 어떠한 영향도 미치지 않는다(데이터를 나타내지 않음)는 것을 알아내었다. 이러한 데이터는 재조합 엔도스태틴의 항-종양 및 맥관형성 방지 활성이 엔도스태틴의 특정 구조로 인한 것이고 샘플내 오염물로 인한 것이 아님을 강하게 입증한다.
도 13은 루이스 폐암을 이. 콜라이로부터 유도된 재조합 마우스 엔도스태틴으로 순환 처리한 결과이다. 이러한 결과는 종양 덩어리의 재생가능한 엔도스태틴-의존성 퇴행에 이어서 엔도스태틴 처리의 종결후 종양의 증대를 명백히 나타낸다.
이러한 결과는 쥐 혈관내피종이 또한 생체내 맥관형성 및 종양 증대의 유력한 억제제인, 시험관내 내피 세포 증식의 신규하고 특정한 억제제 20 kDa를 생성함을 나타낸다. 이 억제제, 엔도스태틴의 N-말단은 콜라겐 XVIII의 C-말단 단편과 동일하다. 재조합 엔도스태틴의 전신 투여는 맥관형성을 유력하게 억제하고, 전이를 현미경적 크기로 유지하고, 제 1기 종양을 1 mm3이하로 퇴행시키고, 150배 이상의 감소를 유발한다. 마우스를 처리하기만 하면 종양의 재증대, 약물 내성의 증거, 및 독성은 존재하지 않는다. 엔도스태틴보다 더 긴 콜라겐 유형 XVIII의 C-말단 도메인의 일부 단편이 내피 세포 증식을 억제하지 않음(데이터를 나타내지 않음)을 주지하는 것이 흥미있다.
엔도스태틴은 앤지오스태틴(O'Reilly et al., 1994)을 발견하기 위해서 사용된 것과 동일한 전략, 즉, 종양으로부터의 분리에 의해 발견된다. 종양이 맥관형성 억제제원이어야 함이 역-직관적이지만, 본원에 보고된 결과는 이러한 접근을 확인하는 것으로 보인다.
이것은 왜 맥관형성 억제제가 맥관형성의 종양에 존재해야 하는가라는 의문을 유발시킨다. 하나의 가능성은 억제제가 맥관형성 표현형으로의 스위치를 수행하는 종양 세포에 의한 생성의 하향-조절후 '잔류'될 수 있다는 점이다. 이것은 p53의 제 2 대립인자가 돌연변이되거나 또는 결실된 Li-Fraumeni 세포에 의해 생성되는 트롬보스포딘의 경우에서 나타난다 (Dameron et al., 1994).
제 2의 가능성은 종양 증대를 동반하고 모세혈관 증대의 중요한 성분인 단백질 분해 활성이 또한 순환하는 맥관형성 억제제를 스스로 억제성이 아닌 전구체 단백질로부터 이동시킬 수 있다는 점이다. 예를 들면, 앤지오스태딘은 맥관형성 및 내피 세포 증식을 억제하지만 플라스미노겐은 그렇지 않다 (O'Reilly et al., 1996; O'Reilly et al., 1994). 엔도스태틴에 대해서, 유사한 유형이 나타난다.
엔도스태틴 처리하에 퇴행되는 종양의 조직학은 맥관형성이 차단된 하나 이상의 미세혈관 주위의 종양 세포의 혈관주위 커핑을 나타낸다. 종양 세포는 종양 크기에 있어 순이득 없이 높은 아폽토시스에 의한 균형잡힌 고증식을 나타낸다. 이러한 데이터는 최근에 제안된 신유형의 종양 잠복의 모델과 일치한다 (Holmgren et al., 1995). 또한, 엔도스태틴은 시험관내 내피 세포의 증식을 억제하지만, 루이스 폐암 세포 또는 엔도스태틴이 정제되어 나온 평활근, 상피, 섬유아세포, 및 EOMA 세포주를 포함하는 기타 세포 유형에는 어떠한 영향도 미치지 않는다.
종양 세포가 처음부터 억제제를 감당할 수 없다는 사실에도 불구하고, 내피 세포 증식의 특정한 억제제가 현미경적 크기로 종양을 퇴행시키고 이것을 잠복 상태로 고정시킬 수 있다는 사실은 내피군이 종양 세포에 대해서 강력한 증대 조절 통제를 발휘할 수 있음을 나타낸다.
엔도스태틴으로의 결과는 처리의 목적상, 종양에 대해서 각각이 나머지 하나의 증대를 자극할 수 있는 두가지 별개의 세포군; 종양 세포군 및 내피 세포군으로 생각하는 것이 유리하다. 각 세포군의 증대는 그 세포 유형을 선택적으로 또는 특이적으로 표적화하는 제제, 즉, 세포독성 화학처리 및 맥관형성 방지 처리에 의해 최상으로 억제될 수 있다. 또한, 두 세포군의 배합된 처리가 한 세포 유형만의 처리보다 더 좋을 수 있다.
이러한 이론을 시험하기 위해서 마우스를 루이스 폐암으로 시딩하고, 약 300 mm2의 크기로 획득된 생성된 종양을 25일 동안 각각 20 mg/kg/일 용량의 앤지오스태틴과 엔도스태틴을 포함하는 배합 처리로 처리한다. 종양이 처리 약 10일까지 현미경 수준으로 퇴행한다. 종양이 도 14에 도시된 바와 같이 약 3개월 동안, 심지어 처리가 종결된 후에도 퇴행 및 잠복 상태로 존재한다는 것은 전혀 예상치 못한 결과이다. 더욱 장기간의 실험은 앤지오스태틴과 엔도스태틴의 배합으로의 초기 종양 처리는 이때에 실질적인 기간을 알 수 없는 매우 장기간의 잠복을 유발한다.
이러한 장기간의 잠복은 당해분야 전문가에게 치료로 고려된다. 예를 들면, 처리가 암 치료제로서 효과적인 시기를 측정하기 위한 NIH 지침은 종양이 종양의 정상적인 복제기인 10시간 동안 잠복상태로 (즉, 크기에 있어 증가하지 않음) 존재한다는 점이다. 엔도스태틴과 앤지오스태틴을 병용하여 달성된 잠복은 이러한 판정기준을 훨씬 초과한다.
따라서, 본 발명의 중요한 양태는 앤지오스태틴과 엔도스태틴 또는 엔도스태틴 동족체의 배합을 맥관형성-의존성 암의 환자에게 투여시 맥관형성-의존성 암의 장기 잠복, 또는 치료를 유발하기에 충분한 양으로 포함하는 조성물이다. 투여는 용량이 환자와 특정 암에 따라서 결정되지만, 일반적으로 적어도 0.2 mg/kg/일, 바람직하게는 적어도 2.0 mg/kg/일, 좀더 바람직하게는 적어도 20 mg/kg/일인 경우에 주입에 의해서 조직적으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 적어도 10일, 바람직하게는 적어도 20일, 좀더 바람직하게는 적어도 25일 동안 매일 투여된다. 대안적인 계 투여 경로는 조성물이 예를 들면, 분해 환경 불활성화로부터 단백질을 보호하기 위해서 경피성으로 펌프에 의해서 코팅된 마이크로비드로 제형된 경우에 경구 투여를 포함한다.
이와는 달리, 조성물을 종양과 같은 맥관형성-의존성 부위에 국소 투여하는 경우 다른 용량 및 처리 기간을 사용할 수 있다. 이러한 투여는 예를 들면, 부위로 또는 부위 가까이로의 외과적 이식 또는 국부 주사일 수 있다.
실시예 8
엔도스태틴에 대한 추정된 수용체의 분리
엔도스태틴과 앤지오스태틴 모두 내피 세포 증식의 특정 억제제인 것으로 보인다. 그러므로, 엔도스태틴은 내피 세포 표면에 오로지 발현된 특정 구조에 결합하는 것같다. 내피 세포 증식의 기타 특정 억제제의 존재를 모른다.
엔도스태틴에 특이적으로 결합하는 단백질을 동정하고 분리시키는 것은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면 친화성 크로마토그래피 및 발현 클로닝에 의해서 수행된다.
친화성 크로마토그래피소 모세혈관 내피 세포 (BCE)를 [35S]-메티오닌으로 방사능표지하고, 모든 세포 및 막 추출물을 제조하여 엔도스태틴으로 제조된 친화력 컬럼에 적용시킨다. 음성 대조군으로서, 섬유아세포 단백질 추출물을 동일한 방법으로 분리한다. 결합된 단백질을 NaCl 농도 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용출하고 다른 분획을 표준 SDS-PAGE 및 오토라디오그래피를 사용하여 분석한다. 이 절차는 엔도스태틴 컬럼에 단단히 결합되고 내피 세포 유도 분획에만 존재하는 단백질을 수득한다. 두 세포 유형의 겔 전기영동 유형의 비교는 BCE 세포 고유의 발현 단백질을 나타낸다. 단백질 서열을 후속적으로 측정하고 상응하는 유전자를 클로닝한다. 소 모세혈관 내피 세포의 cDNA 라이브러리를 제조하고 엔도스태틴-특이성 결합 단백질의 cDNA를 편재하기 위해서 PCR 기술을 기초로 한 분해성 올리고로 스크리닝한다. 분해성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 상응하는 cDNA로의 하이브리드화는 또한 엔도스태틴 결합 단백질의 유전자를 동정하기 위해서 사용된다. 다른 접근법은 상세한 설명에 상술된 방법으로 펩티드 서열에 대해 항체를 발생시키는 것과 동일한 라이브러리를 면역스크리닝하는 것이다.
발현 클로닝BCE 세포의 cDNA 라이브러리를 제조한다. 폴리-A mRNA를 증식이 미리 엔도스태틴에 의해 억제된 BCE 세포로부터 분리한다. 이러한 세포는 엔도스태틴 결합 단백질을 발현한다. 상응하는 cDNA 라이브러리를 다양한 DNA의 높은 발현을 허용하는 세포로 형질감염시킨다. 표면에 수용체 단백질을 발현하는 세포로의 엔도스태틴의 결합 활성이 이러한 세포의 양성 선택으로서 사용된다. 이러한 세포에 대해 선택하기 위해서, 정제된 엔도스태틴을 바이오틴으로 표지하고 따라서 스트렙타비딘 커플링된 자기-비드 또는 FACS 분류를 사용하여 검출한다. 이와는 달리, 엔도스태틴에 대한 항체를 스크리닝을 위해 사용한다. 양성 세포의 선택후, 상응하는 플라스미드를 분리하고 증폭하고 높은 발현 세포로 다시 형질감염시킨다. 양성 선택을 여러번 되풀이한 후, 플라스미드를 엔도뉴클레아제 분해 및 PCR을 사용하여 동일한 삽입물에 대해 분석한다. 이러한 데이터를 사용하여, 보충 그룹을 형성하고, 서열분석하고 BLAST 네트워크 프로그램으로 분석한다. 컴퓨터 분석에 추가로 개별 cDNA를 높은 발현 세포로 재-형질감염시키고 다른 조건하(즉, 비-표지 엔도스태틴과의 경쟁, 결합의 시간-코스, 스캐차드(Scatchard) 분석 등, 바꾸어 말하면, 당해분야 전문가들에게 공지된 "고전적인" 수용체 특성화 절차의 사용)의 엔도스태틴 결합 활성에 대해 시험한다.
실시예 9
맥관형성 활성을 책임지는 마우스 엔도스태틴 단백질의 최소 영역의 측정
다른 PCR 프라이머를 디자인하고 상응하는 cDNA를 이. 콜라이 발현 시스템으로 클로닝하고, 다른 엔도스태틴 분획을 균질하게 정제한다. cDNA의 전체 길이는 N- 및 C-말단 모두로부터 절단된다. 제 1 스크린으로서 모세혈관 내피 증식 분석 및 병아리 배 분석을 잔여 활성을 측정하기 위해서 전 길이 단편과 비교하여 사용한다.
실시예 10
콜라겐 XVIII로부터 엔도스태틴을 방출할 수 있는 추정된 효소의 측정
콜라겐 XVIII는 비-소섬유성 콜라겐 유형 족에 속하고 1315-, 1527-, 및 1774 아미노산 잔기를 갖는 세가지 다른 스플라이싱 변체로 발견될 수 있다 (Rehn, PNAS 91:4234, 1994). 차이는 유전자의 N-말단부의 변형에 의해 유발되고 그러므로 모든 세가지 스플라이싱 변체는 잠재적으로 그 자체가 비-콜라겐성 도메인 11 (NC11)의 단편인 엔도스태틴원이 될 수 있다. 콜라겐 XVIII의 기능은 알려져 있지 않지만, 이의 메시지가 매우 혈관신생된 기관에서 실질적으로 발현되므로 혈관주위 매트릭스 집합의 역할 및/또는 구조가 제안되었다 (Oh, et al., Genomics, 19:494, 1994). 콜라겐 XVIII의 기능에 대한 제 1 단서는 내피 세포 증식의 잠정적인 억제자로서 엔도스태틴의 정제로부터 유래한다.
엔도스태틴이 혈관내피종(EOMA)의 조건 배지로부터 정제된 이러한 예비적인 데이터 및 초기 관찰로부터, 콜라겐 XVIII로부터 엔도스태틴을 방출하는 효소가 동정될 수 있는지를 질문한다.
NC11 도메인을 암호화하는 최종 325 아미노산 잔기는 이. 콜라이와 곤충 세포 바큘로바이러스 시스템에서 발현되고, 정제된 단백질은 콜라겐 XVIII의 이러한 영역을 클로닝하는 효소를 동정하기 위한 기질로서 사용된다. PCR에 의해서, NC11 도메인을 암호화하는 cDNA 단편이 IPTG로의 유도후 표적 단백질의 높은 발현을 허용하는 이. 콜라이 발현 벡터(pET 시리즈)로 클로닝된다. 이와는 달리, 곤충 세포 발현에 적합한 벡터를 사용한다. 단백질을 Ni2+-NTA-비드를 사용하여 정제를 위해 C-말단에 편재된 HIS6-TAG로 태깅한다. Ni2+-NTA-알칼라인 포스파타제 접합체는 웨스턴 블로팅에 의해 C-말단을 검출할 수 있다. C-말단에 HIS6-TAG를 갖고 또한 헤마글루티닌(HA-tag)을 N-말단에 암호화할 다른 작제물을 제작한다. 이것은 HA-특이성 모노클로날 항체로의 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 단백질의 N- 및 C-말단은 EOMA 상등액 및 다른 메탈로프로티나제 추출물로의 배양후에 이어진다.
분할 산물은 SDS-PAGE 분석 또는 웨스턴 블로팅에 의해서 검출되고, 단백질은 Ni2+-NTA 비드를 사용하여 재정제하고 이미다졸로 용출하고, PBS에 대해서 투석하고 다양한 시험관내 생체내의 억제자 활성(즉, 내피 세포 증식, 병아리배, 및 마우스 각막 분석)에 대해 시험한다. 정제된 분할 산물이 억제 활성을 나타낼 경우, N-말단 아미노산 서열화가 수행되고 EOMA 상등액으로부터 획득된 엔도스태틴의 원 개시 서열에 비교한다. 따라서, 분할 절차는 종양-생성 마우스를 시험하기 위한 충분한 단백질을 정제하고 이 활성을 전 길이 NC11 도메인의 활성에 비교하기 위해서 확대할 수 있다.
참 고 문 헌
서열목록
(1) 일반적인 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
(B) 거리: 롱우드 애버뉴 300
(C) 도시: 보스톤
(D) 주: 매사츄세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호 (ZIP): 02115
(G) 전화: (617) 735-7050
(H) 팩스: (617) 232-7485
(ii) 발명의 명칭: 치료용 맥관형성억제 조성물 및 방법
(iii) 서열 번호: 1
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 본쇄: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 최초원:
(A) 유기체: 쥐
(F) 조직 유형: 콜라겐
(xi) 서열 기재: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 본쇄: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 최초원:
(A) 유기체: 쥐
(F) 조직 유형: 콜라겐
(xi) 서열 기재: 서열 번호 1:
Claims (33)
- 분리된 엔도스태틴.
- 제 1 항에 있어서, 비-환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 18 kDa이고, 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 20 kDa이며, 쥐 혈관내피종 EOMA 세포주로부터 분리될 수 있으며, 특히 배양된 내피 세포 증식의 특이적 억제능을 추가 특징으로 하는 분리된 단백질을 포함하는 분리된 엔도스태틴.
- 제 1 항에 있어서, 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 서열번호 1과 실질적인 서열 상동성을 갖는 엔도스태틴.
- 제 1 항에 있어서, 단백질이 콜라겐 유형 XVIII의 C-말단 펩티드 단편과 실질적인 서열 상동성을 갖는 엔도스태틴.
- 제 1 항에 있어서, 재조합 발현 시스템에서 제 1 항의 단백질을 재조합 생성하고 재조합 생성된 단백질을 다시 접히지 않은 형태로 분리함을 포함하는 방법에 의해 제조되는 엔도스태틴.
- 제 5 항에 있어서, 재조합 발현 시스템이 이. 콜라이 또는 바큘로바이러스인 엔도스태틴.
- 엔도스태틴 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 엔도스태틴 단백질이 비-환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 18 kDa이고, 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 20 kDa이며, 쥐 혈관내피종 EOMA 세포주로부터 분리될 수 있으며, 배양된 내피 세포 증식의 특이적 억제능을 추가 특징으로 하는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 서열번호 1과 실질적인 서열 상동성을 갖는 화합물.
- 제 7 항에 있어서, 단백질이 콜라겐 유형 XVIII의 C-말단 펩티드 단편과 실질적인 서열 상동성을 갖는 화합물.
- 엔도스태틴 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 분리된 항체를 포함하는 화합물.
- 제 11 항에 있어서, 엔도스태틴 단백질이 비-환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 18 kDa이고, 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 20 kDa이며, 쥐 혈관내피종 EOMA 세포주로부터 분리될 수 있으며, 배양된 내피 세포 증식의 특이적 억제능을 추가 특징으로 하는 화합물.
- 제 11 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 화합물.
- 제 11 항에 있어서, 엔도스태틴 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 서열번호 1과 실질적인 서열 상동성을 갖는 화합물.
- 제 11 항에 있어서, 엔도스태틴 단백질이 콜라겐 유형 XVIII의 C-말단 펩티드 단편과 실질적인 서열 상동성을 갖는 화합물.
- 쥐 혈관내피종 세포주 EOMA를 생장시키기 위해서 사용된 배양 배지를 수집하고(a) 배지를 헤파린 컬럼 크로마토그래피에 의해 분획화함(b)을 포함하는 방법에 의해 제조되고, 비-환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 18 kDa이고 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 20 kDa인 단백질이고 배양 세포에서 내피 세포 증식을 특이적으로 억제할 수 있는 분리된 엔도스태틴.
- 제 1 항의 엔도스태틴의 처리를 필요로 하는 환자에게 맥관형성 억제 충분량으로 투여함을 포함하는 맥관형성-관련 질환의 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서, 엔도스태틴이 재조합 생성된 단백질이고, 재조합 생성된 단백질을 다시 접히지 않은 형태로 투여하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 재조합 생성된 엔도스태틴이 적어도 8시간에 걸쳐 단백질의 지속된 방출을 제공하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 맥관형성-관련 질환이 맥관형성-의존성 암, 양성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 맥관형성성 안질환, 오슬러-웨버 증후군, 심근성 맥관형성, 플라크 신혈관신생, 모세관확장증, 혈우병자 관절, 섬유성혈관종, 창상 육아, 장 고착증, 동맥경화증, 공피증, 비대 반흔, 고양이 스크래치 질환 및 헬로박터 파이로리 궤양으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 맥관형성 관련 질환이 맥관형성-의존성 암인 방법.
- 제 1 항의 엔도스태틴의 처리를 필요로 하는 환자에게 종양 퇴행 유도에 충분한 양으로 투여함을 포함하는 맥관형성-의존성 암 종양 환자의 치료 방법.
- 제 22 항에 있어서, 엔도스태틴이 재조합 생성된 단백질이고, 재조합 생성된 단백질을 다시 접히지 않은 형태로 투여하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 재조합 생성된 단백질이 적어도 8시간에 걸쳐 단백질의 지속된 방출을 제공하는 방법.
- 맥관형성-의존성 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 맥관형성-의존성 암 환자에게 투여시 맥관형성-의존성 암의 맥관형성을 효과적으로 억제할 수 있는 양으로 제공되는, 제 1 항의 엔도스태틴과 배합된 앤지오스태틴을 포함하는 조성물의 맥관형성-의존성 암 치료량을 투여함을 포함하는 맥관형성-의존성 암 환자의 치료 방법.
- 제 25 항에 있어서, 앤지오스태틴과 엔도스태틴 중 적어도 하나가 재조합 생성된 단백질이고,재조합 생성된 단백질이 다시 접히지 않은 형태로 투여되는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 재조합 생성된 단백질이 적어도 8시간 동안 단백질의 지속된 방출을 제공하는 방법.
- 여성에게 배 이식을 방지하기에 충분한 양의 제 1 항의 엔도스태틴을 투여함을 포함하는 피임 방법.
- 제 28 항에 있어서, 엔도스태틴이 재조합 생성된 단백질이고, 재조합 생성된 단백질을 다시 접히지 않은 형태로 투여하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 재조합 생성된 단백질이 적어도 8시간에 걸쳐 단백질의 지속된 방출을 제공하는 방법.
- 앤지오스태틴과 엔도스태틴이 맥관형성-의존성 종양 환자에게 투여시 조성물이 맥관형성-의존성 종양의 종양 덩어리를 효과적으로 퇴행시킬 수 있도록 하는 양으로 제공되는, 제 1 항의 엔도스태틴과 배합된 앤지오스태틴을 포함하는 조성물.
- 비-환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 18 kDa이고, 환원 겔 전기영동에 의해 측정하여 약 20 kDa이며, 엔도스태틴과 실질적인 서열 상동성을 갖고 배양된 내피 세포 증식의 특이적 억제능을 추가 특징으로 하는 단백질을 재조합적으로 발현함을 포함하는 엔도스태틴 단백질의 제조 방법.
- 제 32 항에 있어서, 엔도스태틴 단백질이 세균 발현 시스템, 이스트 발현 시스템 및 곤충 바이러스 발현 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 발현 시스템에서 생성되는 방법.
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