JP2002509895A

JP2002509895A - 細胞および組織相互作用を修飾するためのｉｖ型コラーゲンの単離ドメインの使用

Info

Publication number: JP2002509895A
Application number: JP2000540848A
Authority: JP
Inventors: ビリージー．ハドソン、; マイケルピー．、ジュニアサラス、
Original assignee: ユニヴァースティオブカンザスメディカルセンター
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2002-04-02
Also published as: WO1999049885A3; EP1064018A2; PT1064018E; DE69919684D1; AU3202599A; CA2318432A1; AU748751B2; ES2224627T3; EP1064018B1; ATE274351T1; DE69919684T2; WO1999049885A2; CA2318432C; DK1064018T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの単離ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーと、腫瘍または動物組織を接触させることを含む、血管形成、腫瘍増殖および転移、および細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用を阻止するための方法およびキットを提供する。本発明の特定の実施形態において、ＩＶ型コラーゲンの単離ドメインは、ＮＣ１（α１）、（α２）、（α３）、または（α６）鎖モノマー、またはＮＣ１（α１）、（α２）、（α３）、または（α６）鎖モノマーと実質的に同じ構造を有するタンパク質作成物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（相互参照）本出願は、１９９８年１０月２９日に提出された米国特許出願番号第６０／１
０６，１７０号；１９９８年３月２７日に提出された第６０／０７９，７８３号
；および１９９８年１０月３０日に提出された第０９／１８３，５４８号（これ
は、１９９７年２月１８日に提出された米国出願番号第０８／８００，９６５号
、現在は米国特許第５，８５６，１８４号の継続であり、これは、１９９５年６
月３０日に提出された米国出願番号第０８／４９７，２０６号、現在は米国特許
第５，６９１，１８２号の継続である）の一部継続出願であり、これら全てを参
考としてその全体を本明細書に組込む。

【０００２】（技術分野）本発明は、血管形成、腫瘍増殖および転移、および細胞外マトリックスとの内
皮細胞の相互作用を阻止するための方法およびキットに関する。

【０００３】（発明の背景）新規血管の形成プロセスである血管形成は、胚および出生後の発達などの生理
学的プロセス並びに創傷修復に重要な役割を果たしている。血管の形成はまた、
炎症（例えば糖尿病性網膜症および関節炎）または新形成（例えば癌）を含む生
理学的プロセスにより誘導され得る（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９８５、Ｐｅｒｓｐｅ
ｃｔ，Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２９、１０）。新血管新生は、腫瘍または正常細胞
により分泌される血管形成因子並びに細胞外マトリックスの組成物により、およ
び内皮酵素活性により調節される（ＮｉｃｏｓｉａおよびＯｔｔｉｎｅｔｔｉ、
１９９０、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６３、１１５）。

【０００４】血管形成の初期の段階では、内皮細胞芽は、既存の血管の基底膜の間隙を通っ
て出現する（ＮｉｃｏｓｉａおよびＯｔｔｉｎｅｔｔｉ、１９９０、上記；Ｓｃ
ｈｏｅｆｌ、１９６３、ＶｉｒｅｈｏｕｓＡｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ
．３３７、９７−１４１；ＡｕｓｐｒｕｎｋおよびＦｏｌｋｍａｎ、１９７７、
Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１４、５３−６５；ＰａｋｕおよびＰａｗｅｌｅ
ｔｚ、１９９１、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３、３３４−３４６）。新血管が形
成されると、その基底膜は、複雑な構造的かつ組成的変化を受け、これは血管形
成応答に影響を及ぼすと信じられている（Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４；Ｅｘｐ
．Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６４、１９７−２０６）。初期の平面状の培養モデルによ
り、基底膜分子は、内皮細胞の付着、遊走および増殖および組織学的挙動を調節
することが示された（Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４、上記）。ｉｎｖｉｖｏで
の創傷治癒中の血管形成状態をより厳密に擬似した３次元大動脈培養モデルを用
いた、より近年の研究により、基底膜は、その機能がその分子成分により変化す
る、血管形成の動的なレギュレーターであることが示唆される（Ｎｉｃｏｓｉａ
、１９９４、上記）。

【０００５】全ての固形腫瘍の増殖における一般的な特徴として、血液供給を必要とするこ
とがある。それ故、数多くの研究室が、増殖因子およびその受容体に基づいた抗
血管形成化合物の開発に焦点をあててきた。このアプローチによりある程度成功
したが、血管形成に役割を果たしていることが知られている増殖因子の数は多い
。それ故、腫瘍および関連の炎症細胞は、血管形成を誘導できる多種多様な因子
を産生するようであるので、増殖因子アンタゴニストの癌の処置への使用は限定
され得る可能性がある。

【０００６】これに関して、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への内皮細胞の接着などの、血
管形成の一般的な特徴を標的にした戦略が、ヒトの腫瘍増殖に対して著明な生理
学的な影響を与えることが期待され得る。この考えは、αｖβ３およびαｖβ５
インテグリンなどの特異的ＥＣＭ細胞接着受容体のアンタゴニストは血管形成を
遮断できるという事実により支持される。さらに、αｖβ３インテグリンは、サ
イトカインで活性化された内皮および平滑筋細胞で最も顕著に発現され、また、
血管形成に必要であることが示された（Ｖａｒｎｅｒら、ＣｅｌｌＡｄｈｅｓ
ｉｏｎａｎｄＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ３：３６７−３７４（１９９５
）；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：５６９−５７１（１９９４））
。この知見に基づき、抗血管形成療法に対する可能性ある強力で新規なアプロー
チは、異なるＥＣＭ成分内の重要な調節ドメインを特異的に標的化し得る。

【０００７】基底膜（基底層）は、シート様の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であり、全組
織の基本成分である。基底層は、組織の区画化を提供し、組織区画間を伝わる基
質のフィルターとして作用する。典型的には、基底層は、血管および毛細血管を
含む動物の全ての組織で上皮または内皮と密接に結合して見出される。基底層成
分は、細胞により分泌され、その後、自己会合して複雑な細胞外ネットワークを
形成する。生物学的に活性な基底層の形成は、会合細胞の発達および分化に重要
である。

【０００８】ＩＶ型コラーゲンは、基底膜の主要な構造成分であることが示された。プロト
マー形のＩＶ型コラーゲンは、α１（ＩＶ）からα６（ＩＶ）と呼ばれる多くの
異なるサブユニット鎖から作られたヘテロ三量体として形成される。現在まで、
広範な相同性をもつ２つのクラスに属する６つの遺伝学的に異なるα鎖が同定さ
れ、その相対量は組織特異的であることが実証された。ＩＶ型コラーゲンのヘテ
ロ三量体は、３つの異なる構造ドメインを特徴とする：カルボキシ末端の非コラ
ーゲン性（ＮＣ１）ドメイン；中間領域の三重らせん体コラーゲン性ドメイン；
およびアミノ末端の７Ｓコラーゲン性ドメイン（Ｍａｒｔｉｎら、１９８８、Ａ
ｄｖ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．３９：１−５０；Ｇｕｎｗａｒら、１９９１
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４０８８−１４０９４）。

【０００９】組換えα（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの発現能は、血管形成、腫瘍転移、基底膜へ
の細胞の結合、およびＩＶ型コラーゲン分子の会合などの、多くの生物学的プロ
セスに対する特定のドメインの効果を研究する機会を提供する。

【００１０】（発明の要約）本発明は、血管形成、腫瘍増殖および転移、および細胞外マトリックスとの内
皮細胞の相互作用を阻止するための方法およびキットを提供し、各方法は、α１
、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる群から選択された、１つ以
上の単離型ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーと、腫瘍または動物組織を接触
させることを含む。

【００１１】（好ましい実施形態の詳細な説明）本出願内で、特記しない限り、使用した技術は、分子クローニング：実験マニ
ュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、コールドスプリングハーバーラボラト
リープレス）、遺伝子発現技術（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、第１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、「タンパク質精製ガイド」、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編（１９９
０）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社）；ＰＣＲプロトコル：方法および適用ガ
イド（Ｉｎｎｉｓら、１９９０、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンディエゴ
、カリフォルニア州）、動物細胞の培養：基本技術マニュアル、第２版（Ｒ．Ｉ
．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７、Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）
、および遺伝子移行および発現プロトコル、ｐ．１０９−１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕ
ｒｒａｙ編、ＴｈｅＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ社、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ニュージャ
ージー州）などの、数個の公知の参考文献のいずれかに見出され得る。

【００１２】本明細書で使用したＩＶ型コラーゲンドメインなる語は、非コラーゲン性ＮＣ
１ドメイン（六量体）および７Ｓコラーゲン性ドメイン、並びにＮＣ１α鎖モノ
マーを含む分子群を包含する。

【００１３】本発明は、ＩＶ型コラーゲンＮＣ１αモノマー（すなわち、α１、α２、α３
、およびα６）の使用法を含み、これは、任意の多細胞生物から単離されるか、
または組換えタンパク質発現により、任意の多細胞生物由来の該モノマーをコー
ドする遺伝子から産生された、モノマーを含み、およびまた、該モノマーへの様
々な修飾、付加および／または欠失を包含すると定義される。

【００１４】１つの態様において、本発明は、α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノ
マーからなる群から選択された、単離ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーを１
つ以上含む、ポリペプチド組成物の、血管形成を阻止するに有効な量と、腫瘍ま
たは動物組織を接触させることを含む、動物組織における血管形成を阻止するた
めの方法およびキットを提供する。

【００１５】別の態様において、本発明は、α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマ
ーからなる群から選択された、単離ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーを１つ
以上含む、ポリペプチド組成物の、腫瘍増殖を阻止するに有効な量と、腫瘍また
は組織を接触させることを含む、組織における腫瘍増殖を阻止するための方法お
よびキットを提供する。

【００１６】別の態様において、本発明は、α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマ
ーからなる群から選択された、単離ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーを１つ
以上含む、ポリペプチド組成物の、転移を阻止するに有効な量と、腫瘍または組
織を接触させることを含む、組織における腫瘍転移を阻止するための方法および
キットを提供する。

【００１７】さらなる態様において、本発明は、α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モ
ノマーからなる群から選択された、単離ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーを
１つ以上含む、ポリペプチド組成物の、細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互
作用を阻止するに有効な量と、腫瘍または組織を接触させることを含む、組織に
おける細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用を阻止するための方法および
キットを提供する。

【００１８】６つのα鎖ｃＤＮＡの各々のＮＣ１をコードするドメインを、前記したように
、組換えタンパク質発現ベクターにクローン化した（Ｓａｄｏら、Ｋｉｄｎｅｙ
Ｉｎｔｌ．５３：６６４−６７１（１９９８）、参考としてその全体を本明細
書に組込む）。ベクターを使用してヒト腎臓２９３細胞を安定にトランスフェク
トし、これにより組換えタンパク質が産生される。記載の通りに産生された組換
えＩＶ型コラーゲンα鎖モノマーのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図１７Ａ−
Ｆに示す。最初の１７つのアミノ酸は、タンパク質分泌を容易にするための、Ｂ
Ｍ４０シグナル配列（これは成熟タンパク質から切断される）に対応する。全て
の分泌タンパク質（すなわち成熟タンパク質）は、配列ＡＰＬＡで開始され、次
に、アミノ末端の親和性タグ、ＤＹＫＤＤＤＤＫが続く。このタグは、材料の精
製および同定を容易にし、組換えＮＣ１α鎖モノマーの生物活性には干渉しない
。

【００１９】ＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーは、組換えＤＮＡ技術または生化学ペプ
チド合成技術の使用を含む、当分野で既知の任意の方法により、または、ＮＣ１
ドメインを、ウシ水晶体莢膜およびウシ腎臓糸球体などの基底膜源などの動物源
から単離することにより産生できる（Ｐｅｃｚｏｎら、Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ
．３０：１５５−１６５（１９８０）；Ｌａｎｇｅｖｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３：１０４８１−１０４８８（１９８８）；Ｇｕｎｗａｒら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４０８８−１４０９４（１９９１））。

【００２０】本発明の実施において、使用するＩＶ型コラーゲンＮＣ１α鎖モノマーの量ま
たは用量範囲は、血管形成、腫瘍増殖、腫瘍転移、および／または内皮細胞−細
胞外マトリックス相互作用を効果的に阻止するものである。使用できる阻止量の
ＮＣ１α鎖モノマーは、一般に、約０．０１μｇ／ｋｇ体重ないし約１０ｍｇ／
ｋｇ体重、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇないし約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で
ある。

【００２１】ＮＣ１α鎖モノマーは、経口、非経口、噴霧吸入、経直腸、または局所を含む
、任意の適切な経路により、慣用的な医薬的に許容される担体、アジュバント、
および媒体を含む投薬単位製剤で投与され得る。本明細書で使用した非経口なる
語は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内
、注入技術または腹腔内を含む。好ましい実施形態において、ＮＣ１α鎖モノマ
ーは、静脈内または皮下投与する。

【００２２】ＮＣ１α鎖モノマーは、固体形（顆粒、粉末または坐剤を含む）、または液体
形（例えば溶液、懸濁液またはエマルション）で製造され得る。本発明のＮＣ１
α鎖モノマーは、様々な溶液中に適用され得る。本発明に従って使用するに適切
な溶液は無菌であり、十分量のＮＣ１α鎖モノマーを溶かし、目的の適用には有
害ではない。

【００２３】ＮＣ１α鎖モノマーは、滅菌などの慣用的な医薬操作にかけ得、および／また
は保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等の慣用的なアジュバントを含み得
る。

【００２４】投与用に、ＮＣ１α鎖モノマーは、通常、指定の投与経路に適切な１つ以上の
アジュバントと組合わせる。化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末
、アルカン酸のセルロールエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム
塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、
および／またはポリビニルアルコールと混合し得、慣用的な投与のために錠剤化
またはカプセル化し得る。別に、本発明の化合物は、食塩水、水、ポリエチレン
グリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液
、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、
および／または様々な緩衝液に溶解し得る。他のアジュバントおよび投与形態は
、医薬分野では公知である。担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリル
またはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を単独で、またはワックス
または当分野で公知の他の材料と共に含み得る。

【００２５】本発明は、添付の実施例を参考にしてより良く理解され得、これは、説明の目
的のみのためであり、ここに添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範
囲を制限するものと捉えるべきではない。

【００２６】実施例１血管形成に対するｉｎｖｉｔｒｏでの効果修飾を加えて、ＮｉｃｏｓｉａおよびＯｔｔｉｎｅｔｔｉ（１９９０）、上記
、およびＮｉｃｏｓｉａら（１９９４）、上記の方法を、ｉｎｖｉｔｒｏ条件
下でＩＶ型コラーゲンの血管形成に対する効果を試験するために設計された実験
に使用した。このモデルを使用して、増殖因子および細胞外マトリックス分子の
血管形成反応に対する効果を研究し、無血清条件下で３次元コラーゲンゲルに大
動脈環培養物を使用する。これらの実験を下記に概略する。

【００２７】Ａ．方法実験を１−３ヶ月令のスイスウェブスター雄マウスを用いて実施した。麻酔後
、無菌条件下で胸大動脈を切断し、抗生物質含有無菌ＭＣＤＢ１３１無菌増殖培
地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、サンディエゴ、カリフォルニア）に移した。脂肪を、
大動脈から解剖し、約６−８つの１ｍｍの胸部セグメントを、各試料から得た。
セグメントを４８ウェルの組織培養プレートに移した。これらのプレートのウェ
ルに、１００μｌのマトリゲル（ＥＨＳ基底膜、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ
）を、大動脈セグメントを移す前に重層した。マトリゲルを、使用前に、ＭＣＤ
Ｂ１３１増殖培地で１：１に希釈した。セグメントを、ウェルの中心に置き、そ
の後、追加の１００μｌのマトリゲルを試料上に配置した。よって、大動脈セグ
メントは基底膜マトリックスに包埋された。その後、各ウェルに、３００μｌの
ＭＣＤＢ１３１増殖培地を加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した
インキュベーター中に入れた。試料を７日間毎日観察した。新しく増殖している
微小血管を、培養期間中様々な時間点で倒立顕微鏡を使用して計測したが、デー
タは培養の３および５日目を表す。血管形成に対するＩＶ型コラーゲンの効果を
試験するために、既知濃度のドメインを、マトリゲルおよびＭＣＤＢ１３１増殖
培地と混合した。新鮮なＭＣＤＢ１３１増殖培地（コラーゲンドメイン含有およ
び非含有）を３日毎に交換した。

【００２８】Ｂ．結果対照条件下（マトリゲルとＭＣＤＢ１３１増殖培地）で血管形成の時間経過を
確立した後、様々な濃度のＩＶ型コラーゲン（ウシ水晶体から単離）ＮＣ１（六
量体）および７Ｓドメインを使用して実験を実施した。データは、１つの実験条
件あたり、少なくとも３つの試料の分析を示す。第一の実験（図１）で、分析に
より、５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＮＣ１ドメインおよび７Ｓドメインは、培養の
３および５日目に監視したところ、有意に血管形成を阻止することが示された。
第二の実験で、様々な濃度のこれらのドメインを分析した。図３に示されるよう
に、５０μｇ／ｍｌの７Ｓドメインは、ここでも、３および５日目に有意に血管
形成を阻止した。阻止は、５および０．５μｇ／ｍｌの濃度で減少した。図２に
示されるように、ＮＣ１ドメインは、第一の実験（図１）で観察されたものと比
較して、血管形成の遮断の効力は低かったが、依然として効力があった。さらに
、７Ｓドメインと比較して、濃度ないし阻止作用に関連は少なかった。

【００２９】図４Ａ−Ｃは、５０μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンドメインの存在下および非
存在下での、培養５日目の、マトリゲル（ＥＨＳ基底膜マトリックス、Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、ベッドフォード
、マサチューセッツ）に包埋したマウス胸大動脈セグメントの写真である。対照
試料（ドメイン非含有）は、培養組織からマトリックスへの微小血管の増殖を示
した（図４Ａ）。これに対し、血管形成阻止は、５０μｇ／ｍｌの７Ｓ（図４Ｂ
）およびＮＣ１（六量体）ドメイン（図４Ｃ）の存在下で培養した組織で観察さ
れた。

【００３０】実施例２皮下フィブリンは血管形成を引き起こす組換えヒトＩＶ型コラーゲンＮＣ１（α３）モノマー（Ｓａｄｏら、Ｋｉｄｎ
ｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ５３：６６４−６７１（１９９８））を、
Ｄｖｏｒａｋら（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５７（６）：６７３−６８６（１９８
７））により記載された方法の修飾形である、皮下に手術で配置したフィブリン
植込錠を含む、フィッシャー３４４ラットに静脈内注射した。その後、植込錠を
除去し、倒立顕微鏡を使用して直接分析した。分析は、対照および実験群におけ
る、増殖してフィブリンになった血管数の計測を含む。

【００３１】簡潔には、４つのフィブリン植込錠を、フィッシャー３４４ラット（２つが背
側および２つが腹側）に手術で皮下に植え込んだ。ラットの平均体重は、約１２
５ｇであった。

【００３２】３頭のラット（ＥＸＰ）に、対照（フィブリンのみ）、１００μｌの１００μ
ｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（約０．８０ｍｇ／ｋｇ体重）、１
００μｌの１００μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン六量体（約０．８０ｍｇ／ｋｇ
体重）、またはＰＢＳ中１．２６ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えコラーゲンＩＶ型Ｎ
Ｃ１（α３）モノマー（１２０μｇタンパク質、または約０．９６ｍｇ／ｋｇ体
重）を尾静脈注射して投与し、３頭のラット（Ｃ）に、１００μｌのＰＢＳを尾
静脈注射して投与した。組換えタンパク質の注射は５用量について隔日に投与し
た。注射計画は以下の通りであった：１日目：（植込日）注射し、血液サンプルを採取（ＥＸＰおよびＣ）３日目：注射（ＥＸＰおよびＣ）５日目：注射し、血液サンプルを採取（ＥＸＰおよびＣ）７日目：注射（ＥＸＰおよびＣ）９日目：注射し、血液サンプルを採取（ＥＸＰおよびＣ）１１日目：採取し、植込錠を固定（血液サンプルを保存）（ＥＸＰおよびＣ
）１つの実験の結果は、以下の通りであった：２週間のｉｎｖｉｖｏ実験：対照（フィブリン単独）約６６ＢＶＩＶ型水晶体コラーゲンの７Ｓドメイン（１００μｇ／ｍｌ）なしＩＶ型水晶体コラーゲンの六量体（１００μｇ／ｍｌ）なしモノマー（α３）なし結果は、１植込錠あたりの平均血管数（ｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌ）として示
される。本研究の結果は、ＩＶ型コラーゲンの単離ドメイン（α３モノマーを含
む）は、ｉｎｖｉｖｏのフィブリン血塊植込モデルで毛細血管増殖を有意に阻
止できることを実証する。続く実験において、阻止効果が時折時間と共に減弱す
るのが見られ、このことは、より高用量またはより頻繁な注射がさらにより効果
的であり得ることを示唆する。

【００３３】類似の実験を、組換えヒトＩＶ型コラーゲンＮＣ１（α１）モノマー（１００
μｌの１μｇ／μｌ溶液；約０．８０ｍｇ／ｋｇ体重）を使用し、処置の１１日
目の、増殖してフィブリンとなった血管の数を対照群と比較して実施した。１群
あたり３頭のラットを用いて分析し、各ラットは４つの植込みを有する。これら
の実験により、α１モノマーの投与により、ｉｎｖｉｖｏでフィブリン血塊植
込モデルで毛細血管の増殖を有意に阻止することが実証された（図５）。

【００３４】実施例３組換えＮＣ１（α２）ドメインは、ｉｎｖｉｖｏで血管形成を阻止
する我々は、次に、ニワトリ胚ＣＡＭ血管形成アッセイにおいて、可溶性ＮＣ１α
鎖モノマーの全身投与の効果を試験した。

【００３５】１０日目のニワトリ胚のＣＡＭに、記載のように（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ９２：３９１−４００（１９９８））、ｂＦＧＦを用いて血管形成を誘導した
。２４時間後、胚を、全容量１００μｌの無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、
様々な濃度の組換えＮＣ１α鎖モノマーで全体処理した。２日後、胚を屠殺し、
フィルターディスクおよびＣＡＭ組織を取り出した。フィルターディスクの限局
領域での血管形成性血管分枝点の数を計測することにより、血管形成を定量した
。血管形成係数は、実験処置から対照処置を引いた分枝点の数として定義される
。

【００３６】初期の実験において、組換えα１またはα２ＮＣ１ドメインを、１胚あたり５
０μｇの濃度で注射した。この濃度で、ＮＣ１ドメインは、９０％以上の胚の細
胞死により実証されるように高度に毒性であることが示された。しかし、より低
い用量では、それらは十分に耐用され、強力な抗血管形成活性を示した。全部で
６つの個々の血管形成実験を、ＮＣ１ドメインを用いて実施した。しかし、２つ
の実験において、ｂＦＧＦ誘導は低く、それ故、結果の解釈は困難であった。Ｎ
Ｃ１α２ドメインは、血管形成阻止において、α１ＮＣ１ドメインよりも、一貫
し、強力であるようであった。事実、３０μｇのＮＣ１α２の全身投与により、
血管形成係数のｂＦＧＦ誘導増加の阻止および血管分枝点の平均数により測定し
たところ、９０％以上血管形成が阻止された（図６−９）。これに対し、ＮＣ１
α１ドメインは、実験を通じて阻止活性の変化（０−５０％）を示した。

【００３７】実施例４組換えＮＣ１ドメインは、ｉｎｖｉｖｏで黒色腫腫瘍増殖を阻止す
る全ての固形腫瘍の増殖は、その増殖継続のための栄養を提供する血管形成に依
存しているので、血管形成を阻止できる試薬は、腫瘍増殖を有意に阻止し得る。
それ故、我々は、ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対する効果について、ＩＶ型コ
ラーゲンの組換えＮＣ１ドメインの効果を試験した。

【００３８】ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対するＮＣ１ドメインの効果を試験するために
、我々は、ニワトリ胚腫瘍増殖アッセイを利用した。簡潔には、３つの異なる腫
瘍型の単一の細胞懸濁液を、１０日目のニワトリ胚のＣＡＭに適用した。腫瘍は
、ＣＳ−１黒色腫細胞（５×１０^６）、ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫細胞（４×１
０^５）、およびＨｅｐ−３ヒト類表皮癌細胞（２×１０^５）を含んだ。胚に、２
４時間後、様々な濃度のＮＣ１α鎖モノマーを全体的に注射した。次に、胚を、
全７日間、インキュベートし、その後、屠殺した。得られた腫瘍を摘除し、湿潤
重量を決定した。全６つの腫瘍増殖アッセイを３つの異なる腫瘍型を用いて実施
した。１０μｇのＮＣ１α２ドメインの１回の注射により、対照に比し、約７０
％ＣＳ１黒色腫腫瘍増殖は阻止された（図１０）。類似の実験で、用量反応曲線
を、ＣＳ−１腫瘍を用いて完了させた。ＮＣ１α２の全身投与により、ｉｎｖ
ｉｖｏでＣＳ−１黒色腫腫瘍増殖は用量依存的に阻止され、最大阻止は、３０μ
ｇの単一用量後であった（図１１）。ＮＣ１α１の全身投与によっても、ＣＳ−
１腫瘍増殖は阻止されたが、それは可変であり、ある実験では腫瘍増殖を阻止で
きなかった（図１０参照）。類似の実験で、ＮＣ１α２は、１回の３０μｇの全
身注射後に約５０％ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫腫瘍増殖を阻止したが、ＮＣ１α
１およびα４は全く効果を及ぼさなかった（図１２）。最後に、ＮＣ１α２（３
０．０μｇ）およびα３の全身投与により、Ｈｅｐ−３ヒト類表皮癌腫瘍増殖は
、それぞれ約４０％および６０％阻止され、α１は、Ｈｅｐ−３腫瘍増殖を約３
０％阻止したが、ＮＣ１α５ドメインは腫瘍増殖を阻止しなかった（図１３）。

【００３９】我々は、これらのｉｎｖｉｖｏ研究から、腫瘍増殖は、単離ＮＣ１α鎖モノ
マーにより阻止できると結論づける。これらの分子は、単独で、または増強かつ
より効果的な抗腫瘍療法の提供のために、既存の抗腫瘍剤の使用を補完するため
に使用できる。

【００４０】実施例５固定ＮＣ１ドメインは、ヒト内皮細胞接着を支持する新規な血管が形成されるためには、内皮細胞は、接着能およびＥＣＭを介して
遊走する能力を有していなければならない。さらに、この内皮細胞−ＥＣＭ相互
作用は、新規血管形成に必要なシグナル伝達事象を促進し得る。それ故、ＩＶ型
コラーゲンは、細胞接着を支持することが知られているＥＣＭタンパク質である
ので、我々は、内皮細胞接着を支持するＮＣ１ドメインの能力を試験した。

【００４１】マイクロタイタープレートを、２５μｇ／ｍｌの精製ＮＣ１ドメインで覆膜し
、次いで、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートし、非特異
的相互作用を遮断した。その後、ヒト内皮細胞（ＥＣＶ３０４）を、１時間固定
ＮＣ１ドメインに付着させた。非接着細胞を、洗浄により除去し、付着した細胞
を、付着した細胞から溶出したクリスタルバイオレットの光学密度（Ｏ．Ｄ．）
を測定することにより定量した。データの棒は、三つで一組のウェルからのＯ．
Ｄ．の平均＋／−標準誤差を示す。

【００４２】固定ＮＣ１α２、α３、およびα６ドメインは、内皮細胞接着を支持したが、
ＮＣ１α１、α４、およびα５ドメインは、細胞接着があるとしても僅かしか促
進しなかった（図１４）。可溶性ＮＣ１α１（ａ１）およびα２（ａ２）は、ペ
プシン処理したＩＶ型コラーゲンへの内皮細胞接着を約５０％阻止した（図１５
）。

【００４３】合わせると、これらの知見により、ＩＶ型コラーゲンのα１、α２、α３、お
よびα６鎖由来の単離組換えＮＣ１ドメインは、ヒト内皮細胞接着を媒介でき、
および／またはｉｎｖｉｔｒｏでＥＣＭタンパク質への内皮細胞接着を阻止で
きることが実証され、および、単離ＮＣ１ドメインの強力な抗血管形成および抗
腫瘍活性は、血管形成に必要な細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用の破
壊に起因することが示唆される。

【００４４】実施例６内皮細胞遊走血管形成および腫瘍転移などの浸潤性細胞プロセスはまた、細胞運動性を必要
とする。従って、我々は、ｉｎｖｉｔｒｏで、ヒト内皮細胞遊走を支持する単
離ＮＣ１ドメインの能力を評価した。これらの実験は、実質的に、Ｂｒｏｏｋｓ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１３９０−１３９８（１９９７）の方
法に従って実施した。

【００４５】これらの実験の結果により、ＮＣ１α２、α３、およびα６ドメインは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでヒト内皮細胞遊走を支持できるが、α１、α４、およびα５ドメ
インは、内皮細胞遊走を維持する能力があったとしても僅かしか示さないことが
示される（図１６）。

【００４６】実施例７ルイス肺ｉｎｖｉｖｏ腫瘍における効力上記の研究により、ＩＶ型コラーゲンの特定のドメインは、ｉｎｖｉｔｒｏ
で細胞遊走を促進できることが示された。従って、我々は、ｉｎｖｉｖｏで内
皮細胞遊走を支持するＮＣ１ドメインの能力を評価した。

【００４７】既知のプロトコル（Ｐｅｃｚｏｎら、Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ．３０：１５５
−１６５（１９８０））によりウシ水晶体莢膜基底膜の酵素的消化により単離さ
れた、α（ＩＶ）ＮＣ１ドメイン六量体を、肺腫瘍の転移および血管形成の両方
の良好なモデルと考えられる標準的なプロトコルを使用して、転移ルイス肺マウ
ス腫瘍モデルで試験した（例えば、Ｔｅｉｃｈｅｒら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１８：２５６７−２５７３（１９９８）；Ｇｕｉｂａｕｄら、Ａｎｔｉ
ｃａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ８：２７６−２８２（１９９７）：Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：７１５−７１８（１９９６））。

【００４８】各研究は、非処置群と６つの処置群から構成された。１処置群あたり１０頭の
動物が含まれ、対照には４０頭のマウスが含まれた。各研究において、全処置は
、腫瘍接種の１日後に開始し、７投与量を２日間毎に１回静脈内投与した。α（
ＩＶ）ＮＣ１六量体の用量は、１００μｇ／マウスまたは２００μｇ／マウスで
あった。ルイス肺研究において、腫瘍細胞接種量は、１×１０^６生細胞であった
。全動物を、研究中１週間に２回体重測定した。最後の処置の１日後に開始し、
５頭のマウスを各対照群から定期的に屠殺し、肺腫瘍負荷を測定した。対照動物
の肺が、意味ある評価を提供するに十分な腫瘍負荷を有する１４日目に実験を終
了させた。その時、全ての残存動物の肺を切除し、秤量し、直径が２ｍｍ以上の
腫瘍病巣の数を計測した。得られたデータにより、両方のα（ＩＶ）ＮＣ１六量
体の用量が、可視肺転移の数を有意に減少させることが示され（Ｍａｎｎ−Ｗｈ
ｉｔｎｅｙ順位和検定、ｐ＜０．０５）、対照では８つの可視肺転移に対して、
５つ（１００μｇ／マウス）および４つ（２００μｇ／マウス）であり、また、
１００μｇ／マウスの用量は、肺重量を、対照における中央値５２０ｍｇから、
実験における中央値４６２ｍｇまで減少させたが、２００μｇ／マウスで処置し
たマウスの肺重量中央値は６２０ｍｇであった。

【００４９】他のｉｎｖｉｖｏ研究により、肺への腫瘍細胞転移は、ネズミＢ１６黒色腫
、ヒトＡ３７５ＳＭ黒色腫異種移植片へのＩＶ型コラーゲンドメインの静脈内注
射を使用して、５０％以上減少できることが実証された。さらに、ＮＣ１六量体
の注射もまた、別々のルイス肺腫瘍研究において肺腫瘍数を有意に減少させた。

【００５０】我々は、上記の全ての研究から、血管形成、腫瘍増殖および転移、およびＥＣ
Ｍへの内皮細胞接着は、ＩＶ型コラーゲンの単離組換えドメインにより阻止でき
ると結論づける。本発明は、従って、血管形成の阻止、並びに、黒色腫、癌腫、
肉腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉種、お
よび白血病を含むがこれに限定されない固形および血液由来の腫瘍などの、望ま
しくない血管形成を伴う疾病および状態の処置を含む、様々な用途に広く適用可
能である。

【００５１】本発明は、さらに、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、網膜新血管新生、脈絡叢
新血管新生、黄斑変性症、角膜新血管新生、未熟網膜症、角膜移植片拒絶、血管
新生性緑内障、水晶体後請求項印胃増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、
コンタクトレンズ疲労、アトピー性角膜炎、上方輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎
、シェーグレン（ｓｏｇｒｅｎ）、酒さ性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔ
ｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的火傷、細
菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉
腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺変性、辺縁角質溶解、外傷、全身性狼瘡、多発
性動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンズジョンソン病
、放射状角膜切除術、鎌状赤血球貧血、皮疹、弾性繊維性仮性黄色腫、ページェ
ット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞病、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、
ライム病、イールズ病、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔｓｄｉｓｅａｓｅ）、
近視、視窩、スターガールト病、網膜の炎症、慢性網膜剥離、過粘度症候群、ト
キソプラスマ症、レーザー後合併症、維管血管組織の異常増殖、血管腫、オース
ラー−ウェバーランデュ病、後天性免疫不全症候群、眼新生血管病、骨関節症、
慢性炎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アテローム動脈硬化症および類天
疱瘡を含むがこれに限定されない、望ましくない血管形成を伴う非腫瘍原性疾病
および状態の処置に適用可能である。米国特許第５，７１２，２９１号参照。

【００５２】本発明はまた、腫瘍増殖および転移の阻止、瘢痕組織形成の減少、器官移植に
おける細胞接着に起因する合併症の減少、およびリンパ球接着および移動性の阻
止のための方法に広く適用可能である。

【００５３】本発明の基本的な新規な特徴が示され記載されたが、説明した形および詳細に
おける様々な省略、置換および変更が、本発明の精神から逸脱することなく、当
業者によりなされ得る。例えば、様々な修飾、付加、および／または置換を、Ｉ
Ｖ型コラーゲンαモノマー鎖に施すことができ、これは、本発明により包含され
る。それ故、特許請求の範囲により示されるもののみに限定される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、５０μｇ／ｍｌの濃度でのＩＶ型コラーゲンのＮＣ１（六量体）およ
び７Ｓドメインの、マウス胸大動脈器官培養物の血管形成に対する効果を示す。

【図２】図２は、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメインの、マウス胸大動脈器官培養物の血
管形成に対する効果を示す。この実験で使用したドメインの濃度は、０μｇ／ｍ
ｌ（対照）；０．５μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌであった。

【図３】図３は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１（六量体）ドメインの、マウス胸大動脈器
官培養物の血管形成に対する効果を示す。この実験で使用したドメインの濃度は
、０μｇ／ｍｌ（対照）；５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍ
ｌであった。

【図４】図４は、培養５日目の、マトリゲル（ＥＨＳ基底膜マトリックス、Ｃｏｌｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、ベッドフォード
、マサチューセッツ）に包埋したマウス胸大動脈セグメントの写真である。対照
試料（０μｇ／ｍｌのＮＣ１（六量体）および７Ｓドメイン）は、培養組織から
マトリックスへの微小血管の増殖を示した（図４Ａ）。これに対し、血管形成は
、５０μｇ／ｍｌの７Ｓドメイン（図４Ｂ）およびＮＣ１（六量体）ドメイン（
図４Ｃ）と共に培養した試料では阻止された。

【図５】図５は、ラットにおけるフィブリン植込錠を使用した血管形成に対する、組換
え（α１）ＩＶ型コラーゲンモノマーの静脈内注射のｉｎｖｉｖｏ効果を実証
するデータのグラフ表示である。

【図６】図６は、組換え（α１）および（α２）ＮＣ１モノマーは、ｉｎｖｉｖｏで
血管形成係数のｂＦＧＦ誘導増加を阻止することを実証するデータのグラフ表示
である。

【図７】図７は、組換え（α２）ＮＣ１モノマーの、ｉｎｖｉｖｏでの全血管分枝点
のｂＦＧＦ誘導増加に対する、用量反応効果を実証するグラフ表示である。

【図８】図８は、組換え（α２）ＮＣ１モノマーの、ｉｎｖｉｖｏでの血管形成係数
のｂＦＧＦ誘導増加に対する、用量反応効果を実証するデータのグラフ表示であ
る。

【図９】図９は、組換え（α２）ＮＣ１モノマーの、ｉｎｖｉｖｏでの血管形成係数
のｂＦＧＦ誘導増加に対する、用量反応効果を実証するデータのグラフ表示であ
る。

【図１０】図１０は、組換え（α１）および（α２）ＮＣ１モノマーの、ｉｎｖｉｖｏ
での平均ＣＳ−１黒色腫腫瘍に対する効果を実証するデータのグラフ表示である
。

【図１１】図１１は、組換え（α２）ＮＣ１モノマーの、ｉｎｖｉｖｏでの平均ＣＳ−
１黒色腫腫瘍に対する、用量反応効果を実証するデータのグラフ表示である。

【図１２】図１２は、組換え（α１）、（α２）、および（α４）ＮＣ１モノマーの、ｉ
ｎｖｉｖｏでの平均ＨＴ１０８０腫瘍重量に対する効果を実証するデータのグ
ラフ表示である。

【図１３】図１３は、組換え（α１）、（α２）、（α３）および（α５）ＮＣ１モノマ
ーの、ｉｎｖｉｖｏでの平均ＨＥＰ−３腫瘍重量に対する効果を実証するデー
タのグラフ表示である。

【図１４】図１４は、固定化ＮＣ１αモノマーへのヒト内皮細胞の接着を実証するデータ
のグラフ表示である。

【図１５】図１５は、ペプシン処理したＩＶ型コラーゲンへのヒト内皮細胞接着に対する
、可溶性α１およびα２ＮＣ１モノマーの効果を実証するデータのグラフ表示で
ある。

【図１６】図１６は、ｉｎｖｉｔｒｏでの、ヒト内皮細胞遊走に対する、単離組換えＮ
Ｃ１モノマーの効果を実証するデータのグラフ表示である。

【図１７】図１７Ａ−Ｆは、各ＩＶ型コラーゲンα鎖モノマーの配列を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/10 Ａ６１Ｐ 19/08 19/02 27/02 19/08 27/06 27/02 27/10 27/06 29/00 27/10 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/12 31/04 31/18 31/12 35/00 31/18 35/04 35/00 37/02 35/04 43/00 37/02 １１１ 43/00 Ｃ０７Ｋ 14/78 １１１Ａ６１Ｋ 37/12 Ｃ０７Ｋ 14/78 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸＦターム(参考） 4B024 AA01 GA18 HA01 4C084 AA02 AA06 BA11 CA62 MA02 NA14 ZA331 ZA361 ZA891 ZA961 ZB151 ZB261 ZC351 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA22 EA24 EA28 EA29 FA71 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる群
から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含む、
ポリペプチド組成物の、血管形成を阻止するに有効な量と、腫瘍または動物組織
を接触させることを含む、動物組織における血管形成を阻止する方法。
【請求項２】 α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる群
から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含む、
ポリペプチド組成物の、腫瘍転移を阻止するに有効な量と、腫瘍または組織を接
触させることを含む、組織における腫瘍転移を阻止する方法。
【請求項３】 α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる群
から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含む、
ポリペプチド組成物の、腫瘍増殖を阻止するに有効な量と、腫瘍または組織を接
触させることを含む、組織における腫瘍増殖を阻止する方法。
【請求項４】ａ．α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからな
る群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含
む、ポリペプチド組成物の、動物組織における血管形成を阻止するに有効な量、
およびｂ．動物組織における血管形成を阻止するに有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単
離ＮＣ１α鎖モノマーを使用するための説明書を含む、請求項１の方法を実施す
るためのキット。
【請求項５】ａ．α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからな
る群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含
む、ポリペプチド組成物の単離ドメインの、組織における腫瘍転移を阻止するに
有効な量、およびｂ．動物組織における腫瘍転移を阻止するに有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単
離ＮＣ１α鎖モノマーを使用するための説明書を含む、請求項２の方法を実施た
めのキット。
【請求項６】ａ．α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからな
る群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含
む、ポリペプチド組成物の単離ドメインの、組織における腫瘍増殖を阻止するに
有効な量、およびｂ．動物組織における腫瘍増殖を阻止するに有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単
離ＮＣ１α鎖モノマーを使用するための説明書を含む、請求項３の方法を実施た
めのキット。
【請求項７】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α１鎖モノ
マーである、請求項１の方法。
【請求項８】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α２鎖モノ
マーである、請求項１の方法。
【請求項９】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α３鎖モノ
マーである、請求項１の方法。
【請求項１０】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α６鎖モ
ノマーである、請求項１の方法。
【請求項１１】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α１鎖モ
ノマーである、請求項２の方法。
【請求項１２】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α２鎖モ
ノマーである、請求項２の方法。
【請求項１３】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α３鎖モ
ノマーである、請求項２の方法。
【請求項１４】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α６鎖モ
ノマーである、請求項２の方法。
【請求項１５】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α１鎖モ
ノマーである、請求項３の方法。
【請求項１６】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α２鎖モ
ノマーである、請求項３の方法。
【請求項１７】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α３鎖モ
ノマーである、請求項３の方法。
【請求項１８】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α６鎖モ
ノマーである、請求項３の方法。
【請求項１９】 α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる
群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含む
、ポリペプチド組成物の、細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用を阻止す
るに有効な量と、腫瘍または動物組織を接触させることを含む、動物組織におけ
る細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用を阻止する方法。
【請求項２０】ａ．α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーから
なる群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上
含む、ポリペプチド組成物の、動物組織における細胞外マトリックスとの内皮細
胞の相互作用を阻止するに有効な量、およびｂ．動物組織における細胞外マトリックスとの内皮細胞の相互作用を阻止するに
有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを使用するための説明
書を含む、請求項１９の方法を実施するためのキット。
【請求項２１】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α１鎖モ
ノマーである、請求項１９の方法。
【請求項２２】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α２鎖モ
ノマーである、請求項１９の方法。
【請求項２３】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α３鎖モ
ノマーである、請求項１９の方法。
【請求項２４】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α６鎖モ
ノマーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１六量体を含むポリペプチド
組成物の、腫瘍転移を阻止するに有効な量と、腫瘍または組織を接触させること
を含む、組織における腫瘍転移を阻止する方法。
【請求項２６】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１六量体を含むポリペプチド
組成物の、腫瘍増殖を阻止するに有効な量と、腫瘍または組織を接触させること
を含む、組織における腫瘍増殖を阻止する方法。
【請求項２７】ａ．ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１六量体を含むポリペプ
チド組成物の、動物組織における腫瘍転移を阻止するに有効な量、およびｂ．動物組織における腫瘍転移を阻止するに有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単
離ＮＣ１六量体を使用するための説明書を含む、請求項２５の方法を実施するた
めのキット。
【請求項２８】ａ．ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１六量体を含むポリペプ
チド組成物の、動物組織における腫瘍増殖を阻止するに有効な量、およびｂ．動物組織における腫瘍増殖を阻止するに有効な量の、ＩＶ型コラーゲンの単
離ＮＣ１六量体を使用するための説明書を含む、請求項２６の方法を実施するた
めのキット。
【請求項２９】 α１、α２、α３、およびα６ＮＣ１鎖モノマーからなる
群から選択された、ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーを１つ以上含む
、ポリペプチド組成物の、血管形成を阻止するに有効な量を、血管形成により媒
介される疾病または状態を有する哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物にお
ける血管形成により媒介される疾病または状態を処置する方法。
【請求項３０】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α１ＮＣ
１鎖モノマーを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α２ＮＣ
１鎖モノマーを含む、請求項２９の方法。
【請求項３２】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α３ＮＣ
１鎖モノマーを含む、請求項２９の方法。
【請求項３３】ＩＶ型コラーゲンの単離ＮＣ１α鎖モノマーは、α６ＮＣ
１鎖モノマーを含む、請求項２９の方法。
【請求項３４】血管形成により媒介される疾病または状態は、固形腫瘍お
よび血液由来腫瘍、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、網膜新血管新生、脈絡叢新
血管新生、黄斑変性症、角膜新血管新生、未熟網膜症、角膜移植片拒絶、血管新
生性緑内障、水晶体後繊維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、コンタク
トレンズ疲労、アトピー性角膜炎、上方輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェー
グレン（ｓｏｇｒｅｎ）、酒さ性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌ
ｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的火傷、細菌性潰瘍
、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モー
レン潰瘍、テリエン周辺変性、辺縁角質溶解、外傷、全身性狼瘡、多発性動脈炎
、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンズジョンソン病、放射状
角膜切除術、鎌状赤血球貧血、皮疹、弾性繊維性仮性黄色腫、ページェット病、
静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞病、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、ライム病
、イールズ病、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔｓｄｉｓｅａｓｅ）、近視、視
窩、スターガールト病、網膜の炎症、慢性網膜剥離、過粘度症候群、トキソプラ
スマ症、レーザー後合併症、繊維血管組織の異常増殖、血管腫、オースラー−ウ
ェバーランデュ病、後天性免疫不全症候群、眼新生血管病、骨関節症、慢性炎症
、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アテローム動脈硬化症および類天疱瘡から
なる群から選択される、請求項４５の方法。