ES2217050T3 - El uso de dominios aislados de colageno de tipo iv para modificar las interacciones de celulas y tejidos. - Google Patents
El uso de dominios aislados de colageno de tipo iv para modificar las interacciones de celulas y tejidos.Info
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Abstract
Un monómero NC1 aislado de colágeno tipo IV para uso como un medicamento, en que el monómero NC1 se selecciona del grupo que comprende un monómero NC1 á1, un monómero NC1 á2 y sus construcciones de proteína sustancialmente homólogas que contienen los elementos estructurales específicos dentro del correspondiente dominio NC1 que lleva actividad.
Description
El uso de dominios aislados de colágeno de tipo
IV para modificar las interacciones de células y tejidos.
Esta invención se refiere a productos para la
manipulación de interacciones intercelulares e intertisulares. Esta
invención proporciona productos para la inhibición de la adherencia
celular a los componentes de la matriz extracelular o para la
formación de la lámina basal funcional, y para la manipulación de
los resultados de esas uniones. Así, esta invención está
relacionada con la modificación de interacciones celulares, con
componentes extracelulares, y con métodos para mantener el fenotipo
celular, la etapa de desarrollo, y la plasticidad in vivo e
in vitro.
La membrana basal (lámina basal) es una matriz
extracelular semejante a una hoja que es un componente básico de
todos los tejidos. La lámina basal asegura la compartimentación de
los tejidos, y actúa como un filtro para las sustancias que se
mueven entre los compartimentos de los tejidos. Típicamente, se ha
comprobado que la lámina basal está estrechamente asociada con un
epitelio, o endotelio en todos los tejidos de un animal incluyendo
vasos y capilares. Los componentes de la lámina basal son segregados
por células, y después se juntan para formar una intrincada red
extracelular. La formación de una lámina basal biológicamente activa
es importante para el desarrollo y diferenciación de las células
asociadas.
El Cnidario, Hidra, es un metazoo simplificado
cuya pared abdominal está compuesta por una bicapa epitelial, con
una matriz extracelular intermedia (ECM) denominada la mesoglea. Se
ha expuesto que la mesoglea de Hidra tiene un número de componentes
vistos en la ECM o en las membranas basales de invertebrados y
vertebrados superiores, que incluyen: fibronectina, colágeno de tipo
IV, laminina, y proteoglicano de sulfato de heparano. La agregación
de células de Hidra implica la morfogénesis completa de hidra adulta
de pelets de células de hidra disociadas. Durante este proceso de
desarrollo, las células se segregan a una bicapa epitelial y después
depositan una nueva matriz extracelular antes de la continuación de
la morfogénesis.
Los componentes de la matriz extracelular (ECM)
desempeñan un papel crítico en el desarrollo mediante sus
influencias sobre los procesos celulares como división celular,
unión celular, migración celular, y diferenciación celular
(estudiado por Timpl. et al., 1989, Int. Rev. Pathol.
29:1-112; Damsky y Bernfield, 1991, Current
Opn. en Cell Bio. 3:777-778; Hynes, 1992,
Cell 69:11-25). Se ha establecido que las
interacciones ECM/célula las utilizan una amplia gama de especies de
vertebrados e invertebrados para incluir esos organismos primitivos
como el Cnidario Hidra. Hidra es particularmente interesante en este
aspecto porque representa uno de los primeros filos animales en
desarrollar capas de tejido definidas separadas por una matriz
extracelular acelular (Field et al., 1988, Science
239:748-752). Estudios previos han mostrado
que la ECM de hidra, denominada mesoglea, contiene colágeno de
tipo IV, laminina, fibronectina, y proteoglicanos de sulfato de
heparano (Sarras et al., 1991a Dev. Biol.
148:481-494). Estas moléculas se sintetizan
continuamente y se depositan en la mesoglea de hidra adulta y
durante la regeneración de la cabeza de la hidra (Hausman et
al., 1971, J. Exp. Zool. 177:435-446).
Otros estudios han mostrado que los procesos relativos al desarrollo
en la hidra como la regeneración de la cabeza dependen de la
formación normal de ECM. Estos estudios han mostrado que la
regeneración de la cabeza en la morfogénesis de la hidra puede
bloquearse utilizando fármacos que perturban la reticulación del
colágeno o fármacos que interfieren en la extensión de la cadena GAG
de proteoglicano (Sarras et el., 1991b, Dev. Biol..
148:495-500). Estos estudios se han extendido
muy recientemente al sistema de agregado celular de la hidra. Este
sistema permite formar un pelet con células de hidra disociadas y
después observar la regeneración completa del organismo de hidra
adulta dentro de 72-96 horas a través del proceso de
citodiferenciación y morfogénesis (Gierer et al., 1972,
Nature New Biol. 239:98-101; Sarras et
al., 1993, Dev. Biol. 157:383-398). Los
estudios de desarrollo de la hidra y el papel de la ECM se han
centrado enormemente en un enfoque químico (Barzanski et al.,
1974, Amer. Zool. 14:575-581; Sarras et
al., 1991ab, supra). Los agregados celulares de la hidra
forman primeramente una bicapa epitelial y después depositan una ECM
antes de que ocurra la morfogénesis. El desarrollo de agregados
celulares de hidra se bloquea por fármacos que perturban la
formación de ECM y por anticuerpos surgidos contra la mesoglea de
hidra aislada. Estos estudios demuestran que pueden llevarse a cabo
estudios funcionales de interacción de ECM/célula bajo condiciones
in vivo con la hidra.
Se ha descrito que el colágeno de tipo IV es un
componente estructural principal de membranas basales y también se
ha descrito que está presente en la ECM de la hidra. La forma
protomérica de colágeno de tipo IV se forma como un heterotrímero
compuesto por un número de diferentes cadenas de subunidades
llamadas \alpha1(IV), \alpha2(IV) etc. El
heterotrímero de colágeno de tipo IV se caracteriza por tres
dominios estructurales distintos: el dominio no colagenoso (NC1) en
el extremo carboxilo; el dominio colagenoso de triple hélice en la
región media, y el dominio colagenoso 7S en el extremo amino (Figura
1) (Martín et al., 1988, Adv. Protein Chem.
39:1-50; Gunwar et al., 1991, J. Biol.
Chem. 266:14088-14094). El colágeno de tipo
IV existe como una estructura supramolecular en la ECM y se
considera que esta estructura sirve como un armazón que proporciona
estabilidad mecánica a la ECM (Timpl et al., 1986,
supra) y como andamiaje para la unión y alineación de otras
moléculas de la ECM como la fibronectina, laminina, eutectina, y
proteoglicanos de sulfato de heparano (Gunwar et al., 1991,
supra). La función biológica del colágeno de tipo IV se
relaciona críticamente con la formación de una ECM intacta ya que la
interrupción de la reticulación del colágeno por
\beta-aminopropionitrilo interfiere con la
formación de mesoglea y esto conduce a un bloqueo en la morfogénesis
de la hidra normal (Sarras et al., 1991b, 1993,
supra).
El desarrollo de agregados celulares de la hidra
implica morfogénesis completa de estructuras de la hidra adulta
dentro de 96 horas a partir de los pelets formados con células de
hidra disociadas (Gierer et al., 1972, supra; Sato
et al., 1992, Dev. Biol. 151:111-116;
Technau et al., 1972, Dev. Biol.
152:117-127; Sarras et al., 1993,
supra). Morfológicamente, el desarrollo de agregado celular
de la hidra puede dividirse en dos etapas. La etapa inicial es desde
el Tiempo 0 a 24 horas cuando los agregados evolucionan desde una
masa celular sólida hasta un quiste lleno de líquido donde la pared
externa está formada por una bicapa con una ECM intermedia
denominada mesoglea. Esta etapa implica clasificación de las células
activas entre células ectodérmicas y endodérmicas (Technau et
al., 1992, supra) y subsiguiente formación de mesoglea
una vez que se ha establecido la bicapa. Las últimas etapas de
desarrollo (24-96 horas) implican procesos
normalmente asociados con histogénesis de tejidos; es decir,
alteraciones en la forma de las capas epiteliales, migración
celular, diferenciación celular, y otros procesos que dan lugar a
morfogénesis de estructuras de pie, cabeza, y tentáculos. Con
relación a las etapas iniciales de desarrollo de agregado celular de
la hidra, se ha mostrado que la regeneración de la cabeza en
agregados no se debe a agrupación de células desde las regiones de
cabeza originales. Se ha sugerido que la regeneración de la cabeza
surge de novo (Gierer et al., 1972, supra;
Technau et al., 1992, supra) desde focos de gradientes
de desarrollo establecidos alrededor del agregado esférico. Esto
indica que la diferenciación o transdiferenciación celular en
células de la región de la cabeza ocurre activamente durante el
desarrollo de agregado celular de la hidra. Además de la información
posicional y de las posibles influencias del activador, las células
pueden diferenciarse o transdiferenciarse bajo las influencias de
otras indicaciones del desarrollo, como las señales que surgen de la
ECM.
Estudios previos han mostrado que en los
vertebrados, la fibronectina interacciona con varios colágenos
durante el montaje de la matriz, incluyendo el colágeno de tipo IV
(Carter, 1984, J. Cell. Bio. 99:105-114).
Además, anticuerpos del dominio de unión de colágeno a fibronectina
tenían la capacidad de bloquear el montaje de la ECM por
fibroblastos de pulmón humano. (MacDonald, 1982, J. Cell. Biol.
92:485-492). Otros estudios suscitan dudas
en cuanto a la interacción, mientras que los anticuerpos
policlonales del dominio de unión de colágeno bloqueaban el montaje
de la ECM, los dominios de unión de colágeno purificado no tenían
efectos inhibidores en este proceso de montaje (McDonald et
al., 1987, J. Biol.Chem. 262:2957-2967;
Hynes, 1990, Cell 48:549-554). En general, la
fibronectina (FN) aparece antes que el colágeno durante el montaje
de matrices de vertebrados, sin embargo, en el caso de la formación
de la ECM de la hidra, FN y colágeno aparecen en la mesoglea
aproximadamente al mismo tiempo, basándose en estudios
inmunofluorescentes. El colágeno de tipo IV se ha considerado
importante en varias enfermedades humanas (Hudson et al.,
1993, J. Biol. Chem 268:26033-26036). La
membrana basal y sus componentes tienen un papel en la adhesión,
migración y proliferación de linfocitos (Li and Chuang, 1992, J. Of
Immunology 149:3174-3181).
Neilson et al
(J.Biol..Chem.268:8402-8405 (1993) describe que el
dominio NC1 de la cadena \alpha3(IV) es la diana probable
para autoanticuerpos en pacientes con síndrome de Goodpasture (GP);
y describe experimentos en los que la especificidad de anticuerpos
GP para los cinco dominios NC1 se determinaba utilizando dominios
NC1 recombinantes como el antígeno. Se encontró que los anticuerpos
GP reaccionaban fuertemente con el dominio NC1 \alpha3(IV)
pero no eran reactivos cuando se ensayaban contra los otro cuatro
monómeros recombinantes.
El papel fundamental que la ECM desempeña en el
desarrollo de tejido y en la diferenciación celular reverbera a
través de filos y reinos, para centrar la atención sobre los
elementos más básicos que se requieren para todas las interacciones
tisulares. El uso de la hidra como sistema modelo para el estudio de
elementos básicos de interacciones tisulares complejas es un enfoque
reconocido. En lugar de intentar deducir la interacción entre
tejidos aislados de animales de orden superior, los mismos
mecanismos y fenómenos se pueden examinar in vivo utilizando
el animal completo, en la hidra . Este enfoque ha conducido al uso
de la hidra para estudiar los efectos de la glucosa sobre la
morfología de tejidos, en un esfuerzo por comprender los efectos
patológicos de la diabetes no controlada sobre los glomérulos del
riñón, con excelentes resultados (Zhang et al., 1990.,
Diabetología 33:704-707).
Recientemente el gen \beta
1-laminina se ha clonado y secuenciado en la hidra,
mostrando homología muy alta con el equivalente humano. Están
presentes asimismo los homólogos de fibronectina y colágeno. Es un
reflejo sobre el papel fundamental que desempeña la ECM, que la
hidra y los animales de orden superior muestran las mismas
interacciones de matriz celular, con componentes, interacciones de
dominios, moléculas receptoras y respuesta a señales extracelulares
similares. Las hormonas de mamíferos e incluso de humanos, cuando se
aplican a la hidra dan lugar a bioactividad y efectos sobre el
comportamiento celular. Es posible usar insulina humana para
estimular la proliferación celular en la hidra. Otras actividades de
cruce con filos pueden atribuirse también a muchos factores de
crecimiento, es decir, EGF (factor de crecimiento epidérmico),
TGF-\beta, FGF (factor de crecimiento de
fibroblasto), PDGF, por nombrar algunos.
Métodos específicos para la manipulación de la
adherencia celular a la ECM, lámina basal, o células adyacentes
serían útiles para la manipulación in vivo de tejidos y
células. Los métodos que estudian los elementos fundamentales de las
interacciones básicas de células y tejidos son aplicables a todos
los sistemas que muestran características similares. Esos usos in
vivo incluyen, pero no están limitados a, inhibición de
formación de lámina basal, inhibición de interacciones de lámina
basal/célula, y estimular a las células a mantener la plasticidad
fenotípica. Esos métodos serán también útiles para la manipulación
in vitro de células y tejidos, por ejemplo, en el
mantenimiento de cultivos celulares en estados no diferenciados u
homeostáticos, dispersión no enzimática de células desde las
uniones, o el mantenimiento de células confluentes en suspensión
para propagación, mantenimiento, o recogida.
Esta invención proporciona un monómero NC1
aislado de colágeno tipo (IV) para usar como un medicamento para
inhibir la formación de la membrana de la lámina basal, en el
desarrollo de células o tejidos. Los monómeros empleados en esta
invención pueden usarse en métodos para cultivo in
vitro de células que comprenden poner en contacto las células
a cultivar con los monómeros para interrumpir la formación de la
lámina basal o los contactos de la matriza extracelular. Los
monómeros empleados en esta invención pueden también utilizarse en
métodos para interrumpir la formación de la membrana de la lámina
basal en tejidos poniendo en contacto los tejidos con los
monómeros.
El monómero NC1 aislado de colágeno de tipo (IV)
empleado en esta invención se selecciona del grupo que comprende un
monómero NC1\alpha1, un monómero NC1 \alpha2 y sus
construcciones de proteína sustancialmente homólogas que contienen
los elementos estructurales específicos dentro del dominio NC1
correspondiente que comporta actividad.
La figura 1 presenta dos diagramas que ilustran
segmentos de colágeno de tipo IV (1A) y fragmentos proteolíticos de
fibronectina (1B) usados en experimentos de bloqueo.
La figura 2 es una gráfica que ilustra los
resultados del bloqueo de la morfogénesis de agregados observada con
monómero de dominio NC1 y dominio 7S, cuando todos los fragmentos de
colágeno de tipo IV se comparan sobre una base molar igual (0,03
\muM). De izquierda a derecha: grupo de control; monómero NC1;
hexámero NC1; fragmento 80-kDa de NC1; dominio 7S;
colágeno de tipo I. Los resultados se dan como % de la morfogénesis
normal como se describe más abajo.
La figura 3 son fotografías de agregados
celulares de la Hidra representativos a 96 horas de desarrollo. Los
agregados control desarrollan estructuras de cabeza y de tentáculos
(3A), mientras que los agregados bloqueados permanecen en la etapa
quística característica de 24 horas (3B). Bar= 286 \mum.
La figura 4 es una gráfica que ilustra el efecto
de la concentración de los distintos agentes de bloqueo. A
concentraciones más altas, el hexámero del dominio NC1 también
mostró efectos de bloqueo, mientras que no se observó bloqueo con el
fragmento 80-kDa de NC1. De izquierda a derecha,
grupo de control; monómero NC1 (MN) a 0,03 \muM; hexámero de
dominio NC1 (HEX) a 0,1 \muM; hexámero de dominio NC1 (HEX) a 0,03
\muM; fragmento 80-kDa de dominio NC1 a 0,3
\muM; fragmento 80-kDa (80K) a 0,03 \muM;
dominio 7S (7S)a 0,1 \muM; y dominio 7S (7 S) a 0,03
\muM. Los resultados se dan como % de morfogénesis normal como se
describe más abajo.
La figura 5 son micrografías electrónicas que
muestran la morfología representativa de las células de
agregadoscontrol (5A) y bloqueados (5B).
La figura 6 es una gráfica que ilustra los
resultados del bloqueo de la formación de agregados utilizando
fibronectina y fragmentos proteolíticos derivados de fibronectina.
Todas las muestras se ensayaron a 0,5mg/ml. De izquierda a derecha:
BSA (Albúmina de Suero Bovino); FN (fibronectina intacta); 120K ( el
fragmento 120-kDa de FN); 45 K (el fragmento
45-kDa de FN); 40K (el fragmento
40-kDa de FN); 30K (el fragmento kDa de FN); RGDS
(péptido RGDS); RADS (péptido RADS). Los resultados se dan como % de
morfogénesis normal como se describe más abajo. Se observó que la
efectividad de los agentes de bloqueo es dependiente de la
concentración.
La figura 7 ilustra los efectos de los dominios
NC1 (Hexámero) y 7S de colágeno de tipo IV a concentración de 50
\mug/ml sobre la angiogénesis de cultivos orgánicos de aorta
torácica de ratón.
La figura 8 ilustra los efectos del dominio NC1
(Hexámero) de colágeno de tipo IV sobre la angiogénesis de cultivos
orgánicos de aorta torácica de ratón. Las concentraciones de dominio
empleadas en este experimento fueron 0 \mug/ml (control); 0,5
\mug/ml; 5 \mug/ml; y 50 \mug/ml.
La figura 9 ilustra los efectos del dominio 7S de
colágeno de tipo IV sobre la angiogénesis de cultivos orgánicos de
aorta torácica de ratón. Las concentraciones de dominio empleadas en
este experimento fueron 0 \mug/ml (control); 0,5 \mug/ml; 5
\mug/ml y 50 \mug/ml.
La figura 10 son fotografías de segmentos de
aorta torácica de ratón incrustados en Matrigel^{TM} (matriz de
membrana basal EHS, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)
a 5 días de cultivo. Muestra control (0 \mug/ml de dominios NC1
(Hexámero) y 7S mostraron crecimiento de microvasos desde el tejido
cultivado a la matriz (figura 10A). En contraste, la angiogénesis se
inhibió en muestras cultivadas con 50 \mug/ml de dominio 7S
(figura 10B) y dominio NC1 (Hexámero) (figura 10C).
Nuestros estudios indican que la formación de una
estructura de ECM apropiada que implique fibronectina y colágeno de
tipo IV es crítica para el desarrollo de agregado celular y que la
perturbación de la formación de ECM afecta adversamente a la
división celular y la diferenciación celular durante la formación de
agregaciones celulares complejas y tejidos. Esto es ilustrativo del
papel crítico que la ECM y las interacciones
célula-ECM desempeñan en el desarrollo de tejidos en
todos los organismos que tienen tejidos diferenciados. Cambios
estructurales en la mesoglea, la inhibición de la proliferación
celular, y cambios en los modelos de diferenciación celular
acompañaron el bloqueo de los agregados celulares. Así el colágeno
de tipo IV es crítico en las primeras etapas del desarrollo de
agregados celulares cuando la mesoglea se forma inicialmente y que
la perturbación del desarrollo de agregado por fragmentos de
colágeno de tipo IV da lugar a alteraciones en la división celular
de la hidra, la diferenciación celular, y la morfogénesis. Se ha
demostrado que los componentes de colágeno de tipo IV son un
elemento crítico en la formación de cualquier célula para contactos
con ECM (lámina basal), y que aplicando los métodos apropiados, esta
interacción puede manipularse de manera predecible.
Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones
específicas de esta invención, y de ningún modo pretenden limitar la
amplitud o el alcance de las enseñanzas de esta memoria descriptiva.
Un experto en la técnica ordinario será capaz de seguir las
enseñanzas de esta memoria descriptiva y usar esta invención en
otras realizaciones específicas.
Todos los experimentos utilizaron Hidra
vulgarie (antes llamada Hidra attenuata). Los animales se
cultivaron como se ha descrito antes (Sarras et al., 1991a,
supra) y no se alimentaron durante 24 horas antes de su
uso.
Los agregados de células de la hidra se
prepararon conforme a Gierer et al., (1972, supra) con
modificaciones descritas por Sarras et al. (1993, supra
). Se incubaron en placas de microvaloración (NUNS, Dinamarca)
con un agregado/pocillo/10\mul de solución de incubación o en
placas de 96 pocillos (Falcon) con tres a cinco
agregados/pocillo/
50\mul de solución de incubación. Se utilizaron antibióticos en todas las etapas de preparación de los agregados para asegurar que los agregados utilizados en este estudio estaban libres de cualquier población bacteriana simbiónica (Sarra et al., 1993, supra). Varios análisis indicaron que los agregados estaban libres de bacterias bajo estas condiciones. A 24 horas de la formación de pelets celulares, los agregados celulares de la hidra desarrollan uniones tabicadas entre células epiteliales (Wood et al., 1980, J. Ultrastruc. Res. 70:104-117). Esas uniones previenen la introducción de macromoléculas desde el medio a la mesoglea. Por consiguiente, se añadieron sondas de matriz exógenas (por ejemplo, fibronectina, colágeno de tipo IV, y fragmentos de colágeno de tipo IV, péptidos o anticuerpos) al medio de cultivo inmediatamente después de la formación de pelet (Tiempo 0). Los agregados celulares de hidra de control se cultivaron en un medio con hidra, albúmina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO), o suero no inmune. Después de 24 horas de incubación, los agregados (tanto los grupos de control como los experimentales) se transfirieron a un medio con hidra de nueva aportación y se continuó el cultivo hasta 96 horas.
50\mul de solución de incubación. Se utilizaron antibióticos en todas las etapas de preparación de los agregados para asegurar que los agregados utilizados en este estudio estaban libres de cualquier población bacteriana simbiónica (Sarra et al., 1993, supra). Varios análisis indicaron que los agregados estaban libres de bacterias bajo estas condiciones. A 24 horas de la formación de pelets celulares, los agregados celulares de la hidra desarrollan uniones tabicadas entre células epiteliales (Wood et al., 1980, J. Ultrastruc. Res. 70:104-117). Esas uniones previenen la introducción de macromoléculas desde el medio a la mesoglea. Por consiguiente, se añadieron sondas de matriz exógenas (por ejemplo, fibronectina, colágeno de tipo IV, y fragmentos de colágeno de tipo IV, péptidos o anticuerpos) al medio de cultivo inmediatamente después de la formación de pelet (Tiempo 0). Los agregados celulares de hidra de control se cultivaron en un medio con hidra, albúmina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO), o suero no inmune. Después de 24 horas de incubación, los agregados (tanto los grupos de control como los experimentales) se transfirieron a un medio con hidra de nueva aportación y se continuó el cultivo hasta 96 horas.
Los fragmentos de colágeno de tipo IV empleados
en los experimentos de bloqueo se ilustran en la Figura 1 (A). El
monómero NC1- una mezcla de \alpha1 (IV) + \alpha2 (IV);
hexámero NC1; fragmento truncado protomérico 80-kDa
(dominio NC1 con parte de triple hélice); y el dominio 7S, se
obtuvieron todos de digestión enzimática y subsiguiente purificación
cromatográfica de la membrana basal de glomérulos de riñón bovino o
membrana basal de cristalino bovino (Langeveld et al., 1988,
J. Biol. Chem. 263:10481-10488; Gunwar et
al., 1991, supra). Anticuerpos para el dominio NC1
(\alpha1(IV) +\alpha2 (IV)) de colágeno de tipo IV se
generaron en conejos inmunizados con subunidades monoméricas
aisladas del dominio globular de colágeno de tipo IV de membrana
basal de riñón de bovino (Langeveld et al., 1988,
supra). Las concentraciones molares exactas de estos
fragmentos se determinaron por espectrofotometría y análisis de
composición de aminoácidos.
Los criterios para la morfogénesis fueron como
sigue. El desarrollo morofológico de agregados celulares de la hidra
se estudió utilizando un microscopio de disección (Wild, Herbugg).
Se realizaron observaciones en tiempo 0, 24, 48, 72 y 96 horas. La
morfogénesis normal de agregados celulares de la hidra entre el
tiempo 0 y 96 horas ha sido descrita anteriormente por Gierer et
al., (1972, supra) y Sarras et al., (1993,
supra). Se consideró desarrollo anormal (bloqueo) de
agregados celulares de hidra si un agregado no mostraba estructuras
de cabeza y de tentáculos a las 96 horas, es decir, se mantenía en
estado quístico (Figura 3). Se calculó el porcentaje de agregados
con estructuras de cabeza y de tentáculos a 96 horas de desarrollo y
se reunieron y se representaron gráficamente los datos para cada
grupo de diferentes experimentos. Se investigó un mínimo de cinco
agregados por grupo y todos los experimentos se repitieron al menos
tres veces, excepto donde se indica. Utilizando un ensayo
estadístico ANOVA, se tomó un valor P<0,05 como el nivel de
diferencia significativa en todos los grupos analizados. El ensayo
estadístico ANOVA se utilizó para los análisis de todos los
datos.
Se utilizó la microscopía electrónica de
transmisión para examinar la delicada estructura y morfología de
agregados testigos y tratados. Los agregados celulares se
sumergieron en fijador de Karnovsky durante la noche a 4ºC y después
se fijaron en OsO_{4} durante 1 hora. Las muestras se tiñeron
después en bloc en acetato de
uranil-magnesio al 0,5% durante la noche a 4ºC.
Después de deshidratación e infiltración, las muestras se
incrustaron en resina de Spurr. Se cortaron bloques con un microtomo
de Reichert-Jung, se tiñeron con acetato de uranilo
y citrato de plomo, y se observaron con un microscopio electrónico
de transmisión JOEL 100S. El análisis de la morfometría se llevó a
cabo como se ha descrito previamente. (Zhang et al.,
supra).
La exploración inmunofluorescente para el
colágeno de tipo IV en agregados celulares de hidra en distintos
momentos después de la formación de pelet mostró que la señal se
detectaba a las 48 horas y se hacía progresivamente más fuerte y
permanecía en la mesoglea todo el tiempo en todas las últimas etapas
del desarrollo de agregados. La Figura 3 ilustra la apariencia
típica de agregados testigos y bloqueados a las 96 horas. Los
agregados bloqueados fracasaron en desarrollarse más allá de la
etapa de 24 horas, y permanecieron en una etapa quística o se
desagregaron en células disociadas a las 96 horas.
Como se ve en la Figura 2, el dominio 7S, y
monómeros del dominio NC1 fueron los más efectivos en el bloqueo de
la morfogénesis de agregados celulares de la hidra cuando se
ensayaron fragmentos sobre una base molar igual. Este bloqueo era
también dependiente de la concentración. El hexámero NC1 bloqueó el
desarrollo de agregado a concentraciones más altas, mientras que el
fragmento 80-kDa no mostró ningún efecto (Figura 4).
El anticuerpo del dominio NC1 tenía un efecto de bloqueo similar
(Tabla 1).
^{a} Se presentan datos como valores medios
\pm SEM (Nº con morfogénesis normal/Nº total tratado
^{b} Ab policlonal contra dominio NC1
(\alpha1(IV) + \alpha2(IV) de colágeno de tipo IV
de riñón bovino
^{c} Ab policlonal Ab (ICN BIochemicals) contra
fibronectina de plasma humano.
Estudios similares se llevaron a cabo utilizando
fibronectina como el inhibidor. La fibronectina intacta, fragmentos
proteolíticos, péptidos RGDS, y anticuerpos contra fibronectina se
ensayaron para determinar su efecto sobre el desarrollo de agregados
celulares de hidra. La Figura 1 (B) muestra un diagrama de la
relación de los distintos fragmentos a la molécula de fibronectina
intacta. De éstos, se encontró que la fibronectina intacta y su
dominio de unión a gelatina 30-kDa eran efectivos a
0,5 mg/ml en el desarrollo de agregados de bloqueo (Figura 6). Se
observó que la efectividad era dependiente de la concentración. Los
anticuerpos contra fibronectina también mostraron efectos de bloqueo
(Tabla 1).
Se utilizó microscopía electrónica de transmisión
para estudiar la ultraestructura de la mesoglea bajo las influencias
de cada molécula de ECM introducida exógenamente. Los agregados
bloqueados se procesaron para análisis TEM en distintos tiempos de
los experimentos y la estructura de su mesoglea se comparó con la de
los agregados testigos fijados en el mismo momento de desarrollo. En
comparación con las muestras de grupo testigo (Figura 5A), la
ultraestructura de la mesoglea en agregados bloqueados era reducida
en espesor, irregular en su borde epitelial, y parecía haber perdido
algo de su organización ultraestructural normal (Figura 5). El
análisis morfométrico (Tabla 2) indicó que la mesoglea de agregados
bloqueados se reducía en espesor aproximadamente un 50% en
comparación con los testigos y esta reducción era significativa,
como se determinó utilizando análisis estadísticos. Esta
ultraestructura de la mesoglea alterada se observó con todos los
reactivos de bloqueo ensayados.
| Tratamiento (desde tiempo 0 a 24 h.) | Anchura epitelial de mesoglea |
| reflejada por mediciones del área^{a} | |
| BSA^{b} | 1434 \pm 582 \ |
| 30 kDa^{c} | 724 \pm 245* |
| Anti-FN^{d} | 969 \pm 458* |
| \begin{minipage}[t]{140mm}^{a} Todas las micrografías de EM de mesoglea se tomaron a aumentos de 8.000 y se imprimieron al mismo tamaño. Una sección de 80 mm se puso entre corchetes a lo largo de la mesoglea sobre cada placa y se midió la mesoglea dentro del área entre corchetes por el programa informático, SigmaScan. La unidad de medida es mm^{2}. Bajo estas condiciones de medida, el área refleja los cambios de anchura interepitelial como se ha descrito antes (Zhang et al., 1990, supra). Los datos se representan como valores medios \pm SD.\end{minipage} | |
| ^{b} Albúmina de suero bovino a concentración de 0,1 mg/ml. | |
| ^{c} Fragmento de unión a gelatina 30-kDa de fibronectina a 0,1 mg/ml. | |
| ^{d} Anticuerpo contra fibronectina a dilución 1:100 | |
| ^{*}Estadísticamente diferente del grupo BSA (valor P<0,05) |
Para determinar si la inhibición de la
proliferación celular era responsable del bloqueo de la
morfogénesis de agregados celulares, los agregados se trataron
desde el tiempo 0 a 96 horas con hidroxiurea (HU) 10 M, que se ha
mostrado que inhibe la síntesis de DNA en células de hidra (Bode
et al., 1976, J. Cell Sci. 20:29-46).
Aunque HU bloqueó completamente la síntesis de DNA, el fármaco no
inhibió la morfogénesis de agregados celulares de la hidra.
Un papel crítico para el colágeno en el proceso
de la formación de matriz se deduce de estudios previos farmaco-
lógicos que implican agentes lantríticos (Barzanski et al.,
1974, supra; Sarras et al., 1993, supra). En
esta demostración, los dominios de colágeno de tipo IV fueron
efectivos para perturbar la formación de mesoglea y para bloquear
el desarrollo de agregados. A este respecto el monómero del
dominio NC1 y el fragmento del dominio 7S fueron los más efectivos
en el bloqueo del desarrollo de agregado cuando todos los fragmentos
de colágeno de tipo IV se compararon sobre una base molecular
igual. Otros han propuesto que el dominio NC1 y el dominio 7S son
los sitios en que el protómero de colágeno de tipo IV está implicado
en la formación de puentes intermoleculares durante la formación
del reticulado supramolecular (Martin et al., 1988, Adv.
Protein Chem. 39:1-50).
No está claro por qué el hexámero C1 más grande y
el fragmento de 80-kDa eran menos efectivos que el
monómero NC1 más pequeño para bloquear el desarrollo. El mismo
fenómeno se vió con la fibronectina, mientras que el bloqueador más
efectivo, el fragmento 7S, tiene una masa más grande que 100 kDa.
Sobre una base de masa total, el dominio 7S tiene una proporción
relativamente alta de residuos de hidratos de carbono asociados con
la cadena de polipéptidos (15-18%), y los análisis
adicionales de estos residuos de hidratos de carbono indican que
tienen características estructurales únicas como la presencia de
residuos de \alpha-D-gal
terminales sobre grupos oligosacáridos con enlace de N (Langenveld
et al., 1991, supra; Nayak et al., 1991,
J.Biol. Chem. 266:13978-13987). La incapacidad del
colágeno tipo IV para bloquear el desarrollo es coherente con el
hecho de que no ha sido detectado en mesoglea de hidra.
El efecto de los componentes de la mesoglea sobre
el comportamiento celular de la hidra puede ser considerado a dos
niveles. En un nivel, la mesoglea puede considerarse como
simplemente una unidad estructural que se requiere como un cimiento
para la estabilidad y mantenimiento de la bicapa epitelial. A otro
nivel, sin embargo, los componentes de ECM en la mesoglea
proporcionan indicaciones de desarrollo que modulan los procesos
celulares como división, migración y diferenciación celulares
durante la morfogénesis de la hidra. Está claro que los componentes
de ECM no son simplemente moléculas estructurales. Se ha mostrado
que la fibronectina y el colágeno de tipo IV controlan la
proliferación y diferenciación celular endotelial (Tagami et
al., 1992, Cell Tissue. Res. 268:225-232;
Ingber, 1990,PNAS USA 87:3579-3853). Se ha
mostrado que las interacciones mecanoquímicas entre células de
músculo estriado en medusas y la mesoglea injertada pueden inducir
o inhibir replicación de DNA y transdiferenciación celular. En
estos ejemplos, mientras la proliferación celular se inhibe en
agregados bloqueados morfológicamente, es también evidente que
puede ocurrir morfogénesis de agregado normal incluso en ausencia
de proliferación celular. Por consiguiente, una reducción de la
división celular en agregados bloqueados puede no explicar el
bloqueo observado en la morfogénesis de agregados.
La homología entre el sistema modelo de la hidra
y lo que se conoce acerca de los mecanismos reguladores y de
desarrollo de organismos superiores hace aplicable el uso de
fragmentos de colágeno de tipo IV en este sistema a las mismas
interacciones de célula y tejido en otros organismos. Los métodos
presentes se aplican a, entre otras cosas, la inhibición de
metástasis, control de la división celular, reducción de la
formación de tejido cicatrizal, intervención en la formación de
tejido epitelial, inhibición de angiogénesis, reducción de
complicaciones debidas a adherencia de células en trasplantes de
órganos, inhibición angiogénica de tejido, o la inhibición de
adhesión y movilidad de linfocitos.
Los productos de esta invención son completamente
útiles para el mantenimiento de células en cultivo, donde ese
mantenimiento requiere mantenimiento de fenotipo y morfología
celular con mínima adherencia. Es bien reconocido que hay muchos
factores críticos que contribuyen al mantenimiento y propagación
satisfactorios de células en cultivo. Es decir, la división celular
puede depender del anclaje, y en algunos casos mostrará inhibición
dependiente de la densidad. Generalmente, la mayoría de los cultivos
hechos de células disociadas de tejidos, a diferencia de las
bacterias, no se adaptan a vivir en suspensión y requieren una
superficie sólida sobre la que crecer y dividirse. Las células se
desarrollan ahora en cultivos, así que se adhieren al plástico. Las
células pueden variar en las exigencias de los medios de cultivo, y
la naturaleza de los soportes, y algunas células no crecerán sin los
componentes de ECM apropiados revestidos sobre las placas de
plástico. Métodos reconocidos para el cultivo de células de
mamíferos pueden encontrarse en las referencias generales como
"Mammalian Cell Biotechnology", editada por M. Butler, Oxford
University presss, 1991, y "Readings in Mammalian Cell
Culture", 2ª edición, editado por R. Pollack, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1981.
Los productos de esta invención proporcionarán
medios por los que la exigencia de la adherencia se elimina
proporcionando las células con una cantidad efectiva de los dominios
de colágeno de tipo IV que permitirá a las células mantenerse en
solución mientras aún parecen estar unidas a ECM. Esto mejorará
enormemente el uso de cultivos de células en biorreactores y otras
aplicaciones comerciales a gran escala. El uso del dominio NC1 o 7S
en aproximadamente la misma concentración efectiva por célula como
se demuestra en el ejemplo anterior, mantendrá los cultivos de
células ligados eficazmente sin adhesión. Además, el aislamiento y
manipulación de las células no requerirá el uso de agentes
farmacológicos generales que efectúan muchas funciones celulares de
una manera imprecisa y no específica.
Los cultivos primarios, los aislados directamente
de tejidos animales, pueden usarse para formar cultivos secundarios
de células específicas. De esta manera, las células pueden ser
subcultivadas durante varias semanas o meses, presentando el
fenotipo y morfología de las células madres. La mayor parte de las
células de los vertebrados morirán en cultivo después de un número
finito de divisiones, por ejemplo, las células de piel humanas
pueden durar típicamente varios meses dividiéndose de 50 a 100 veces
antes de morir. Pueden surgir, sin embargo, líneas de células
variantes que son inmortales al poder propagarse en cultivo celular
indefinidamente. Estas células usualmente crecen mejor cuando están
unidas a un soporte sólido, y típicamente cesarán de crecer una vez
que han formado una capa confluente sobre la superficie, lo que
demuestra inhibición por contacto. Las líneas celulares preparadas a
partir de células cancerígenas difieren de las preparadas a partir
de células normales en muchos aspectos. Esas células tienden a
proliferar sin soporte sólido, y crecerán a densidad mucho más
grande que las células normales.
Así los productos de esta invención pueden
emplearse para afectar a los cultivos celulares primarios y
secundarios de modo que se comporten como si estuvieran en contacto
con un soporte sólido, pero sin los efectos de inhibición por
contacto celular. Así las líneas de células madres pueden mantenerse
in vitro bajo condiciones que estimularán el mantenimiento de
fenotipo y morfología celulares.
Un área de gran interés es el aislamiento y
cultivo de células germinales embrionarias o pluripotentes in
vitro para eventual manipulación y uso in vivo. El
aislamiento y mantenimiento de esas células relativamente
indiferenciadas, y la propagación de esas células permitiría la
producción de vastas cantidades de células específicas que podrían
formar la base de la regeneración o sustitución de tejidos. Así las
enseñanzas de esta invención pueden aplicarse al mantenimiento de
aislados celulares pluripotentes, y permitir la propagación de estas
células cuando inhiben cambios y diferenciación morfológicos in
vitro.
La angiogénesis, el proceso de formación de
nuevos vasos sanguíneos, desempeña un importante papel en procesos
fisiológicos como el desarrollo embrionario y postnatal así como en
la reparación de heridas. La formación de vasos sanguíneos también
puede inducirse por procesos patológicos que incluyen inflamación
(por ejemplo, retinopatía diabética y artritis) o neoplasia (por
ejemplo, cáncer) (Folkman, 1985, Perspect. Biol. Med., 29,
10). La neovascularización se regula por factores de crecimiento
angiogénicos secretados por células normales o tumorales así como
por la composición de la matriz extracelular y por la actividad de
enzimas endoteliales (Nicosia y Ontinetti, 1990, Lab. Invest.,
63, 115).
Durante las etapas iniciales de la angiogénesis,
brotes de células endoteliales aparecen a través de los vacíos en
la membrana basal de los vasos sanguíneos preexistentes (Nicosia y
Ontinetti, 1990, supra, Schoefl, 1963, Virchous Arch. Pathol.
Anat. 337, 97-141;Ausprunk y Folkman, 1977,
Microvasc Res. 14, 53-65; Paku y Paweletz,
1991, Lab. Invest. 63, 334-346). Cuando se
forman nuevos vasos sanguíneos, su membrana basal sufre complejos
cambios estructurales y de composición que se cree afectan a la
respuesta angiogénica (Nicosia et al., 1994, Exp. Biology,
164, 197-206). Los primeros modelos de
cultivo planar han mostrado que las moléculas de la membrana basal
modulan la adherencia, la migración y proliferación y el
comportamiento organizativo de las células endoteliales (Nicosia
et al., 1994, supra). Estudios más recientes con
modelos de cultivo aórtico tridimensionales que simulan más
estrechamente las condiciones angiogénicas que ocurren durante la
curación de heridas in vivo, sugieren que la membrana
basal es un regulador dinámico de la angiogénesis cuya función varía
según sus componentes moleculares (Nicosia et al., 1994,
supra).
Con modificaciones, los procedimientos de Nicosia
y Ontinetti (1990), supra, y Nicosia et al.,
supra, se utilizaron para experimentos diseñados para ensayar
el efecto de colágeno de tipo IV sobre la angiogénesis bajo
condiciones in vitro. El modelo se ha usado para estudiar los
efectos de los factores de crecimiento y las moléculas de la matriz
extracelular sobre la respuesta angiogénica y emplea anillos
aórticos cultivados en geles de colágeno tridimensionales bajo
condiciones libres de suero. Estos experimentos se describen más
abajo.
Los experimentos se realizaron con ratones macho
Swiss Webster que tenían de 1 a 3 meses de edad. Después de
anestesia, la aorta torácica se extirpó bajo condiciones asépticas y
se transfirió a un medio de crecimiento estéril MCDB 131 (Clonctics,
San Diego, CA) que contiene antibióticos. La grasa se disecó fuera
de la aorta y se obtuvieron aproximadamente seis a ocho segmentos
torácicos de 1 mm de cada muestra. Los segmentos se transfirieron a
placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos. Sobre los pocillos de
estas placas se depositaron 100 microlitros de Mtrigel^{TM}
(membrana basal EHS, Collaborative Biomedicals Products, Bedford,
MA) antes de transferir los segmentos aórticos. El Matrigel^{TM}
se diluyó 1:1 con el medio de crecimiento MCDB 131 antes de su uso.
Los segmentos se centraron en los pocillos y se colocaron después
sobre las muestras 100 microlitros adicionales de Matrigel^{TM}.
Los segmentos aórticos se incrustaron por tanto en la matriz de la
membrana basal. Cada pocillo recibió después 300 microlitros de
medio de crecimiento MCDB 131. Las placas se colocaron en un
incubador mantenido a 37ºC con CO_{2}al 5%. Las muestras se
observaron diariamente durante un período de 7 días. Los microvasos
de crecimiento reciente se sometieron a recuento utilizando un
microscopio de fase inversa en distintos tiempos durante el período
de cultivo, pero los datos se expresaron en los días de cultivo 3 y
5. Para ensayar el efecto del colágeno de tipo IV sobre la
angiogéneis, dominios de conocidas concentraciones se mezclan con
Matrigel^{TM} y con el medio de crecimiento MCBD 131. El medio de
crecimiento MCDB 131 de nueva aportación (dominios de colágeno plus
y minus) se cambió cada 3 días.
Después de establecer el curso en el tiempo de la
angiogénesis bajo condiciones testigos (medio de crecimiento
Matrigel^{TM} más MCDB 131), los experimentos se llevaron a cabo
utilizando varias concentraciones de dominios NC1 (hexámero) y 7S
con colágeno tipo IV (aislado de cristalino de bovino). Los datos
representan los análisis de al menos 3 muestras por condición
experimental. En el primer experimento (Figura 7) el análisis indicó
que a una concentración de 50 microgramos/ml, el dominio NC1 y el
dominio 7S inhibían siginificativamente la angiogénesis según
seguimiento los días 3 y 5 de cultivo. En el segundo experimento, se
analizaron varias concentraciones de estos dominios. Como se indica
en la figura 9, el dominio 7S a 50 microgramos/ml de nuevo inhibió
significativamente la angiogénesis en los días 3 y 5. La inhibición
se redujo a 5 y 0,5 microgramos/ml. Como se indica en la Figura 8,
el dominio NC1 fue menos efectivo en el bloqueo de la angiogénesis
en comparación con lo observado en el primer experimento (Figura 7).
Además, en comparación con el dominio 7S, hubo menos correlación
entre concentración y acción inhibitoria.
La Figura 10 contiene fotografías de segmentos de
aorta torácicos de ratón incrustados en Matrigel^{TM} (matriz de
membrana basal EHS, Collaborative Biomedical Products, Bedford MA)
en 5 días de cultivo en la presencia o ausencia de 50 \mug/ml de
dominios de colágeno de tipo IV. La muestra testigo (sin dominios)
exhibió crecimiento de microvasos desde el tejido cultivado a la
matriz (Figura 10A). En contraste, se observó inhibición de la
angiogénesis en tejidos cultivados en presencia de 50\mug/ml de
dominio 7S (Figura 10B) y dominio NC1 (hexámero) (Figura 10C).
Los resultados de estos experimentos sugieren que
como se ha observado anteriormente con los agregados de células de
hidra, el dominio 7S de colágeno de tipo IV es más efectivo como
agente de bloqueo en comparación con el dominio NC1.
En resumen, los productos de esta invención son
aplicables a la inhibición de metástasis, el control de la división
celular, reducción de la formación de tejido cicatrizal,
intervención en la formación de tejido epitelial, inhibición de
angiogénesis, reducción de complicaciones debidas a adherencia de
células en trasplante de órganos, inhibición de invasión angiogénica
de tejido, o la inhibición de la adherencia y movilidad de
linfocitos, el mantenimiento de aislados de células pluripotentes
in vitro mientras inhiben los cambios y diferenciación
morfológicos. En la práctica de la invención, el intervalo de la
cantidad o dosificación de los dominios NC1 (Hexámero) de colágeno
de tipo IV empleados es uno que efectivamente inhibe o interrumpe la
adherencia celular a componentes de la matriz extracelular o la
formación de lámina basal funcional. En general, una cantidad
inhibitoria de dominio que puede emplearse oscila entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 50 \mug/ml.
Claims (18)
1. Un monómero NC1 aislado de colágeno tipo IV
para uso como un medicamento, en que el monómero NC1 se selecciona
del grupo que comprende un monómero NC1 \alpha1, un monómero NC1
\alpha2 y sus construcciones de proteína sustancialmente homólogas
que contienen los elementos estructurales específicos dentro del
correspondiente dominio NC1 que lleva actividad.
2. Un monómero NC1 aislado de colágeno tipo IV
según la reivindicación 1, en que el monómero es un monómero NC1
\alpha2 o sus construcciones de proteína sustancialmente homólogas
que contienen los elementos estructurales específicos dentro del
correspondiente dominio NC1 que lleva actividad.
3. Un monómero NC1 aislado de colágeno tipo IV
según la reivindicación 1, en que el monómero es un monómero NC1
\alpha1, o sus construcciones de proteínas sustancialmente
homólogas que contienen los elementos estructurales específicos
dentro del correspondiente dominio NC1 que lleva actividad.
4. Un monómero NC1 aislado de colágeno tipo IV
según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, ó 3 para usar
como un medicamento para inhibir una o más de la formación de
membrana de la lámina basal, angiogénesis, metástasis, formación de
tejido cicatrizal, y la adhesión en trasplantes de órganos.
5. Uso de un monómero NC1 aislado de colágeno
tipo IV según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 en
la preparación de un medicamento para inhibir la formación de la
membrana de la lámina basal.
6. Uso de un monómero NC1 aislado de colágeno
tipo IV según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 en
la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.
7. Uso de un monómero NC1 aislado de colágeno
tipo IV según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 en
la preparación de un medicamento para inhibir la metástasis.
8. Uso de un monómero NC1 aislado de colágeno
tipo IV según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4 en
la preparación de un medicamento para inhibir la formación de tejido
cicatrizal.
9. Uso de un monómero NC1 aislado de colágeno
tipo IV según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4 en
la preparación de un medicamento para inhibir la adhesión en
trasplantes de órganos.
10. Un anticuerpo que reconoce un monómero NC1
aislado de colágeno tipo IV para uso como un medicamento, en que el
monómero NC1 se selecciona del grupo que comprende un monómero NC1
\alpha1 y un monómero NC1 \alpha2.
11. Un anticuerpo según la reivindicación 10 en
que el monómero NC1 es un monómero NC1 \alpha2.
12. Un anticuerpo según la reivindicación 10 en
que el monómero NC1 es un monómero NC1 \alpha1.
13. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11 o 12 en la preparación de un medicamento
para inhibir una o más de la formación de membrana de la lámina
basal, angiogénesis, metástasis, formación de tejido cicatrizal, y
la adhesión en trasplantes de órganos.
14. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11, 12 o 13 en la preparación de un
medicamento para inhibir la formación de la membrana de la lámina
basal.
15. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11, 12 o 13 en la preparación de un
medicamento para inhibir la angiogénesis.
16. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11, 12 o 13 en la preparación de un
medicamento para inhibir la metástasis.
17. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11, 12 o 13 en la preparación de un
medicamento para inhibir la formación de tejido cicatrizal.
18. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 10, 11, 12 o 13 en la preparación de un
medicamento para inhibir la adhesión en trasplantes de órganos.
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