PT767676E

PT767676E - Utilizacao de dominios isolados de colagenio do tipo iv para modificar as interaccoes de celulas e tecidos

Info

Publication number: PT767676E
Application number: PT95926149T
Authority: PT
Inventors: Michael P Sarras Jr; Billy G Hudson
Original assignee: Univ Kansas Medical Center
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 2002-03-28
Also published as: DE69524094D1; PT1129721E; US5567609A; DE69524094T2; DK0767676T3; ATE262922T1; US5691182A; US6680293B2; US6384012B1; DE69532835T2; US5856184A; EP0767676A1; DK1129721T3; US6448222B1; US6419924B1; AU3000895A; DE69532835D1; US20030013194A1; ES2164160T3; WO1996000582A1

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE DOMÍNIOS ISOLADOS DE COLAGÉNIO DO TIPO IV PARA MODIFICAR AS INTERACÇÕES DE CÉLULAS E TECIDOS"

Antecedentes da Invenção

Campo da invenção

Esta invenção refere-se a métodos para a manipulação de interacções intercelulares e inter-tecido. A presente invenção proporciona métodos para a inibição da adesão celular aos componentes da matriz extracelular ou para a formação de uma lâmina basal funcional, e para a manipulação dos resultados destas adesões. Assim, a presente invenção refere-se à modificação das interacções celulares, com os componentes extracelulares, e a métodos para manutenção do fenótipo da célula, estádio de desenvolvimento, e plasticidade in vivo e in vi tro.

Descrição da Técnica Anterior A membrana basal (lâmina basal) é uma matriz extracelular tipo folha que é um componente básico de todos os tecidos. A lâmina basal proporciona a compartimentação de tecidos, e actua como um filtro para substâncias que viajam entre os compartimentos dos tecidos. Tipicamente, a lâmina basal encontra-se intimamente associada com um epitélio, ou endotélio em todos os tecidos de um animal incluindo os vasos sanguíneos e capilares. Os componentes da lâmina basal são segregados por células, e depois auto-montados para formar uma intrincada rede extracelular. A formação de uma lâmina basal biologicamente activa é importante para o desenvolvimento e diferenciação das células associadas. A Cnidariana, Hidra, é um metazoário simplificado cuja parede do corpo é composta por uma camada epitelial com uma

matriz interveniente extracelular (ECM) denominada mesoglea) . A mesoglea da hidra mostrou possuir um número de componentes observado na ECM ou em membranas basais de invertebrados superiores e vertebrados, incluindo estes: fibronectina, colagénio do tipo IV, laminina, e o proteoglicano sulfato de heparano. A agregação das células da hidra envolve a morfogenese completa de uma hidra adulta a partir de sedimentos de células de hidra dissociadas. Durante este processo de desenvolvimento, as células segregam-se numa bicamada epitelial e depositam depois uma nova matriz extracelular antes da continuação da morfogénese.

Os componentes da matriz extracelular (ECM) desempenham um papel critico no desenvolvimento através dos seus efeitos nestes processos celulares, como a divisão celular, a ligação de células, a migração de células, e diferenciação celular (revisto por Timpl et al., 1989, Int. Rev. Exp. Pathol. 29:1-112; Damsky e Bernfield, 1991, Current Opn. in Cell Bio. 3:777-778; Hynes, 1992, Cell 69:11-25). Tem sido estabelecido que as interacções ECM/célula são utilizadas por uma vasta gama de espécies de vertebrados e invertebrados para incluir organismos tão primitivos tais como a Cnidariana, Hidra. A hidra é particularmente interessante neste respeito porque representa um dos primeiros animais do filo a desenvolver camadas de tecido definidas separadas por uma matriz acelular extracelular (Field et al., 1988, Science 239:748-752). Estudos prévios mostraram que a ECM de hidra, denominado mesoglea, contém colagénio do tipo IV, laminina, fibronectina, e proteoglicanos de sulfato de heparano (Sarras et al., 1991a, Dev. Biol. 148:481-494). Estas moléculas são continuamente sintetizadas e depositadas na mesoglea de hidras adultas e durante a regeneração da cabeça das hidras (Hausman et al., J. Exp. Zool. 177:435-44 6). Outros estudos mostraram que os processos de desenvolvimento em hidra tais como a regeneração da cabeça são dependentes da normal formação de ECM. Estes estudos mostraram que a regeneração da 2 ...... - \

cabeça na morfogénese da hidra pode ser bloqueada utilizando fármacos que perturbam a ligação cruzada do colagénio ou fármacos que interferem com a extensão da cadeia de GAG de proteoglicano (Sarras et al., 1991b, Dev. Biol. 148:495-500).

Estes estudos foram mais recentemente estendidos ao sistema de agregação de células de hidra. Este sistema permite a formação de um sedimento com as células de hidra dissociadas e observam então a regeneração completa do corpo de hidra adulto em 72-96 horas através do processo de citodiferenciação e morfogénese (Giere et al., 1972, Nature New Biol. 239:98-101; Sarras et al., 1993, Dev. Biol. 157:383-398). Tais estudos de desenvolvimento em hidra e o papel da ECM focaram fortemente uma abordagem química (Barzanski et al., 1974, Amer. Zool. 14:575-581; Sarras et al., 1991ab, supra). Os agregados de células de hidra formam primeiro uma bicamada epitelial e depositam depois uma ECM antes que a morfogénese prossiga. O desenvolvimento do agregado de células de hidra é bloqueado por fármacos que perturbam a formação de ECM e por anticorpos produzidos contra a mesoglea de hidra isolada. Estes estudos demonstraram que estudos funcionais da interacção ECM/célula podem ser realizados em condições in vivo com hidra.

Foi demonstrado que o colagénio do tipo IV era um dos principais componentes das membranas basais e foi também demonstrado estar presente na ECM de hidra. A forma protomérica de colagénio do tipo IV é formada por um heterotrímero constituído por um número de cadeias diferentes de subunidades denominadas al(IV), a2(IV) etc. O heterotrímero de colagénio do tipo IV é caracterizado por três domínios estruturais distintos: o domínio não colagenoso (NC1) na extremidade carboxílica; o domínio colagenoso de tripla hélice na região média; e o domínio colagenoso 7S na extremidade amina (Figura 1) (Martin et al., 1988, Adv. Protein. Chem. 39:1-50; Gunwar et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14088-14094). O colagénio do tipo IV existe como uma estrutura supramolecular na ECM e pensa-se que esta estrutura 3

•r>>-7 sirva como uma rede que proporciona estabilidade mecânica à ECM (Timpl et al., 1986, supra) e como um esqueleto para a ligação e alinhamento de outras moléculas de ECM tais como fibronectina, laminina, eutectina, e proteoglicanos de sulfato de heparano (Gunwar et al., 1991, supra). A função biológica do colagénio do tipo IV cctá relacionada de forma critica com a formação de uma ECM intacta uma vez que a interrupção da ligação cruzada do colagénio per β-aminopropionitrilo interfere com a formação de mesoglea e isto leva a um bloqueio na morfogénese normal da hidra (Sarras ec al., 1991b, 1993, supra). 0 desenvolvimento de agregados de células de hidra envolve a morfogénese ccmpleta de estruturas de hidra adulta em 96 horas a partir de sedimentos formados com células de hidra dissociadas. (Grierer et al., 1972, supra; Sato et al., 1992, Dev. Biol. 151:111-116; Technau et al., 1992, Dev. Biol. 151:117-127; Sarras et al., 1993, supra). Morfologicamente, o desenvolvimento de agregados de células de hidra podem ser divididos em dois estádios. 0 estádio inicial é do Tempo 0 a 24 horas quando os agregados se desenvolvem a partir de uma massa de células sólida num cisto preenchido com fluido em que a parede externa é formada a partir de uma bicamada epitelial com uma ECM interveniente denominada mesoglea. Este estádio envolve a selecção activa de células entre as células ectodérmicas ou endodérmicas (Technau et al., 1992, supra) e subsequente formação de mesoglea uma vez estabelecida a bicamada. Os estádios de desenvolvimento mais tardios (24-96 horas) envolvem processos normalmente associados com a histogénese de tecidos; nomeadamente, alterações na forma das camadas epiteliais, migração de células, diferenciação celular, e outros processos que resultam em morfogénese do pé, cabeça, e estruturas do tentáculo. Em relação aos estádios iniciais do desenvolvimento de agregado de células de hidra, foi demonstrado que a regeneração da cabeça em agregados não se deve ao agrupamento de células a partir das regiões da cabeça original. Foi sugerido 4

que a regeneração da cabeça surge de novo (Gierer et al. , 1972, supra; Technau et al., 1992, supra) a partir de foci de gradientes de desenvolvimento estabelecidos à volta do agregado esférico. Isto indica que a diferenciação ou transdiferenciação de células em células da região da cabeça ocorre activamente durante o desenvolvimento do agregado de células dc hidra. Adicionalmente à formação posicionai e a possíveis influências activadoras, as células podem diferenciar-se ou transdiferenciar-se sob as influências de outras indicações de desenvolvimento tais como sinais que surgem a partir de ECM.

Estudos anteriores demonstraram que em vertebrados, a fibronectina interage com vários colagénios durante a formação da matriz, incluindo colagénio do tipo IV (Cárter, 1984, J. Cell Bío. 99:105-114). Adicionalmente, os anticorpos contra o domínio de ligação do colagénio da fibronectina possuem a capacidade de bloquear a formação de ECM pelos fibroblastos de pulmão humanos. (McDonald, 1982, J. Cell Biol. 92:485-492). Outros estudos criaram dúvidas em relação à interacção, enquanto que anticorpos policlonais contra o domínio de ligação do colagénio bloquearam a formação da matriz, os domínios de ligação do colagénio purificados não tiveram quaisquer efeitos inibidores neste processo de formação (McDonald et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:2957-2967; Hynes, 1990, Cell "^βΤδΤ^δδϊ)". Em' geral a fibronectina (FN) surge antes do colagénio durante a formação de matrizes em vertebrados, contudo, no caso da formação de ECM de hidra, a FN e o colagénio aparecem na mesoglea mais ou menos ao mesmo tempo, com base em estudos de imunof luorescência. O colagénio do tipo IV foi implicado como sendo importante em várias doenças humanas (Hudson et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:26033-26036). A membrana da base e os seus componentes têm um papel na adesão, migração e proliferação dos linfócitos (Li e Cheung, 1992, J. of Iimunology 149:3174-3181). 0 papel fundamental que a ECM desempenha no desenvolvimento do tecido e da diferenciação celular estende-se ao longo de 5

Γ\ filos e reinos, para centrar atenção nos elementos mais básicos que são necessários para todas as interacções de tecidos. A utilização de hidra como um sistema modelo para o estudo de elementos básicos de interacções complexas de tecidos é uma abordagem reconhecida. Em vez de tentar deduzir a interacção entre tecidos isolados d© animais de ordens superiores, os mesmos mecanismos e fenómenos podem ser examinados in vivo utilizando o animal completo, em hidra. Esta abordagem levou à utilização de hidra para estudar os efeitos da glucose em morfologia de tecido, num esforço para compreender os efeitos patológicos da diabetes descontrolada em glomérulos de rim, com excelentes resultados (Zhang et al., 1990, Diabetologia 33:704-707) .

Recentemente, o gene da βΐ-laminina foi clonado e sequenciado em hidra, apresentando homologia muito elevada com o seu homólogo humano. Os homólogos da fibronectina e do colagénio também estão presentes. É um reflexo do papel fundamental que a ECM desempenha, que a hidra e animais de ordens superiores apresentem as mesmas interacções de matriz celular, com componentes, interacções do domínio, moléculas receptoras e resposta a sinais extracelulares semelhantes. As hormonas de mamíferos, e mesmo de humanos, quando aplicadas a hidra resultam em bioactividade e em efeitos no comportamento celular. É possível utilizar insulina humana para estimular a proliferação celular em hidra. Outras actividades que se estendem a vários filos também podem ser atribuídas a muitos factores de crescimento, i.e. EGF (factor de crescimento epidérmico), TGF-β, FGF (factor de crescimento dos fibroblastos), PDGF, para referir apenas alguns.

Seriam úteis métodos específicos para a manipulação de adesão de células a ECM, lâmina basal, ou células adjacentes, para a manipulação in vivo de tecidos e de células. Os métodos que se dirigem a elementos fundamentais de interacções básicas de células e tecidos são aplicáveis a todos os sistemas que 6

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/ apresentam características semelhantes. Tais utilizações in vivo incluem, e não estão limitadas a, inibição da formação da lâmina basal, inibição das interacções de lâmina basal/célula, e encorajamento das células para manter plasticidade fenotipica. Esses métodos também serão úteis para a manipulação in vitro de cclulac c tecidos, por exemplo na manutenção dc culturas dc células em estados indiferenciados ou homeostáticos, dispersão não enzimática de células de agrupamentos, na manutenção de células confluentes na suspensão para a propagação, manutenção, ou colecção.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona métodos para a inibição da formação da membrana da lâmina basal, no desenvolvimento de células ou tecidos, compreendendo colocar em contacto a célula ou tecido com um ou mais domínios isolados do colagénio do tipo IV. A presente invenção também proporciona métodos para a cultura in vitro de células compreendendo colocar em contacto as células a ser cultivadas com um domínio isolado de colagénio do tipo IV para destruir a formação de lâmina basal ou contactos de matriz extracelular. A presente invenção proporciona ainda métodos para destruir a formação de membrana de lâmina basal em tecidos compreendendo colocar em contacto õs tecidos' cóm um domínio isolado de colagénio do tipo IV. Numa realização específica da presente invenção, o domínio isolado de colagénio do tipo IV é o domínio 7S ou NC1, ou construções proteicas possuindo substancialmente a mesma estrutura como os elementos activos no domínio 7S ou NC1.

Assim, a presente invenção proporciona métodos para a interferência com interacções de células com componentes da lâmina basal que compreendem colocar em contacto as células ou tecidos com um domínio isolado de colagénio do tipo IV, e numa realização preferida o domínio isolado é ou o domínio 7S ou o domínio NC1 de colagénio do tipo IV ou construções proteicas 7

substancialmente homólogas destes que contêm os elementos estruturais específicos no domínio 7S e NCl que conferem actividade.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 são dois diagramas ilustrando segmentos de colagénio do tipo IV (IA) e fragmentos proteolíticos de fibronectina (1B) utilizados em experiências de bloqueamento. A Figura 2 é um gráfico que ilustra os resultados do bloqueamento de morfogénese de agregado observado com o monómero do domínio NCl e com o domínio 7S, quando todos os fragmentos de colagénio do tipo IV são comparados com uma base de molaridade igual (0,03 μΜ) . Da esquerda para a direita: grupo de controlo, monómero NCl; hexâmero de NCl; fragmento de 80-kDa de NCl; domínio 7S; colagénio do tipo I. Os resultados são apresentados como % de morfogénese normal como descrito abaixo. A Figura 3 são fotografias de agregados de células de Hidra representativos com 96 horas de desenvolvimento. Os agregados de controlo desenvolvem estruturas de cabeça e de tentáculo (3A) enquanto que os agregados bloqueados permanecem no estádio cístico de 24 horas caracteristico (3B) . Barra = 286 μπι. A Figura 4 é um gráfico que ilustra o efeito de concentração dos vários agentes de bloqueamento. A concentrações mais elevadas, o hexâmero do domínio NCl também apresentou efeitos de bloqueamento, enquanto que não foi observado bloqueamento com o fragmento de 80 kDa de NCl. Da esquerda para a direita: grupo de controlo; monómero de NCl (MN) a 0,03 μΜ; hexâmero do domínio NCl (HEX) a 0,1 μΜ; hexâmero do domínio de NCl (HEX) a 0,03 μΜ; fragmento de 80 kDa do domínio NCl (80K) a 0,3 μΜ; fragmento de 8

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80 kDa do domínio de NC1 (80K) a 0,03 μΜ; domínio 7S (7 S) a 0,1 μΜ; e domínio 7S (7 S) a 0,03 μΜ. Os resultados são apresentados como % da morfogénese normal como descrito abaixo. A Figura 5 são fotografias de microscopia electrónica que apresentam a morfologia representativa de células agregadas de controlo (5A) e bloqueadas (5B) . A Figura 6 é um gráfico que ilustra os resultados do bloqueamento da formação de agregados utilizando fibronectina e fragmentos proteolíticos derivados da fibronectina. Todas as amostras foram testadas a 0,5 mg/mL. Da esquerda para a direita: BSA (Albumina de Soro Bovino); FN (fibronectina intacta) ; 120K (o fragmento de 120 kDa de FN) ; 45K (o fragmento de 45 kDa de FN) ; 40K (o fragmento de 40 kDa de FN); 30K (o fragmento de 30 kDa de FN) ; RGDS (péptido RGDS) ; RADS (péptido RADS) . Os resultados são apresentados como % da morfogénese normal como descrito abaixo. Foi determinado que a eficiência dos agentes de bloqueamento está dependente da concentração. A Figura 7 ilustra os efeitos dos domínios de NC1 (Hexâmero) e de 7S de colagénio do tipo IV a uma concentração de 50 pg/mL em angiogénese de culturas de orgãos da aorta torácica de murganho. A Figura 8 ilustra os efeitos do domínio de NC1 (Hexâmero) de colagénio do tipo IV em angiogénese de culturas de órgãos da aorta torácica de murganho. As concentrações do domínio empregues nesta experiência foram de 0 pg/mL (controlo); 0,5 pg/mL; 5 pg/mL e 50 pg/mL. A Figura 9 ilustra os efeitos do domínio 7S do colagénio do tipo IV em angiogénese de culturas de órgãos da aorta torácica de murganho. As concentrações do domínio empregues nesta 9

experiência foram de 0 pg/mL (controlo); 0,5 pg/mL; 5 μg/mL e 50 pg/mL. A Figura 10 são fotografias de segmentos da aorta torácica de murganho embebidas em Matrigel™ (matriz da membrana da base de EHS, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) aos 5 dias de cultura. O espécimen de controlo (0 pg/mL de domínios NC1 (Hexâmero) e 7S) exibiu crescimento de microvasos a partir do tecido em cultura para a matriz (Figura 10) . Em contraste, a angiogénese foi inibida em espécimens cultivados com 50 pg/mL do domínio 7S (Figura 10B) e do domínio de NC1 (Hexâmero) (Figura 10C) .

Descrição das Realizações Preferidas

Os estudos indicam que a formação de uma estrutura de ECM apropriada envolvendo fibronectina e colagénio do tipo IV é crítica para o desenvolvimento de agregado celular e que a perturbação da formação de ECM afecta adversamente a divisão e a diferenciação celular durante a formação de agregações celulares complexas e tecidos. Isto ilustra o papel crítico que a ECM e as interacções célula-ECM desempenham no -desenvolvimento do tecido em todos os organismos que possuem tecidos diferenciados. Alterações estruturais na mesoglea, inibição de proliferação celular, e alterações nos padrões de diferenciação celular acompanham o bloqueamento de agregados celulares. Assim, o colagénio do tipo IV é crítico para os estádios precoces do desenvolvimento de agregados celulares quando a mesoglea é formada inicialmente e essa perturbação do desenvolvimento de agregados por fragmentos de colagénio do tipo IV resulta em alterações na divisão de células de hidra, diferenciação celular, e morfogénese. Está demonstrado que os componentes do colagénio do tipo IV são um elemento crítico na formação de qualquer célula para contacto com ECM (lâmina basal), e que 10

Γ\ ---fA- Í A ΛΙ'^ (—ίτ Λ aplicando os métodos apropriados, esta interacção pode ser manipulada de uma forma previsível.

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar as realizações específicas da presente invenção, e não pretendem de forma alguma limitar a extensão ou âmbito dos ensinamentos realizados na presente especificação. Um especialista na técnica será capaz de apreender os ensinamentos da presente especificação e utilizar a presente invenção noutras realizações específicas.

Exemplo 1 Interrupção do Desenvolvimento de Agregados Celulares

Todas as experiências utilizaram Hydra vulgarie (anteriormente der.ominada Hydra attenuata) . Os animais foram cultivados como descrito anteriormente (Sarras et al., 1991a, supra) e não foram alimentados durante 24 h antes da utilização.

Os agregados celulares de hidra foram preparados de acordo com Gierer et al., (1972, supra) com modificações descritas por Sarras et al. (1993, supra). Estes foram incubados ou em placas de microtitulação (NUNS, Dinamarca) com um agregado/poço/10 μΙ, de solução de incubação ou em placas de 96 poços (Falcon) com três a cinco agregados/poço/50 pL de solução de incubação. Foram utilizados antibióticos durante todos os passos de preparação de agregados para assegurar que os agregados utilizados neste estudo estavam isentos de quaisquer populações bacterianas simbióticas (Sarra et al., 1993, supra). Várias análises indicaram que os agregados estavam isentos de bactérias nestas condições. Durante as 24 h de formação de sedimento celular, os agregados celulares de hidra desenvolveram junções septadas entre as células epiteliais (Wood et al., 1980, J. Ultrastruc. Res. 70: 104-117). Estas junções impedem a introdução de macromoléculas do meio para a mesoglea. Por isso, as sondas de matriz exógena (p. ex. f ibronectina, colagénio do tipo IV, e fragmentos de colagénio do tipo IV, péptidos ou anticorpos) foram adicionadas ao meio de cultura imediatamente após a formação do sedimento (Tempo 0) . Os agregados de células de 11 s-\

hidra de controlo foram cultivados em meio de hidra, albumina do soro bovino (Sigma, St. Louis, MO), ou soro não imune. Após 24 h de incubação, os agregados (tanto grupos de controlo como experimentais) foram transferidos para meio de hidra fresco e a cultura foi mantida até às 96 horas.

Os fragmentos de colagénio do tipo IV que foram utilizados em experiências de bloqueamento estão ilustrados na Figura 1 (A). 0 monómero NC1 - uma mistura de al(IV), a2(IV); hexâmero NC1; fragmento truncado protomérico de 80 kDa (domínio NC1 com parte de hélice tripla) ; e o domínio 7S, foram todos obtidos por digestão enzimática e subsequente purificação cromatográfica de membrana da base de glomérulos de rim bovino ou membrana da base de lente de bovino (Langeveld et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 10481-10488; Gunwar et al., 1991, supra). Foram criados anticorpos contra o domínio NCl(cxl(IV) + a2(IV)) de colagénio do tipo IV em coelhos imunizados com subunidades monoméricas isoladas a partir do domínio globular de colagénio do tipo IV de membrana da base de rim de bovino (Langeveld et al., 1988, supra). As concentrações molares precisas destes fragmentos foram determinadas por espectrofotometria e análise de composição de aminoácidos.

Os critérios para a morfogénese são como se segue. O desenvolvimento morfológico dos agregados celulares de hidra foram estudados utilizando um microscópio de dissecção (Wild, Herbrugg). As observações foram realizadas nos Tempos 0, 24, 48, 72, e 96 h. A morfogénese normal dos agregados de células de hidra entre os Tempos 0 e 96 h foram descritos anteriormente por Gierer et al., (1972, supra) e Sarras et al., (1993, supra). O desenvolvimento anormal (bloqueamento) de agregados celulares de hidra foi considerado se um agregado não apresentou estruturas de cabeça e de tentáculo às 96 h, i.e., foi retido num estádio cístico (Figura 3) . A percentagem de agregados com estruturas de cabeça e de tentáculo às 96 h de desenvolvimento foi calculada e os resultados para cada grupo a partir de diferentes 12

/ experiências foram reunidos e representados graficamente. Foi testado um mínimo de cinco agregados por grupo e todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes excepto quando indicado. Utilizando um teste estatístico ANOVA, foi tomado um valor P < 0,05 como o nível de diferença significativo em todos os grupos analisados. O toste estatístico ANOVA foi utilizado para todas as análises de resultados.

Foi utilizada microscopia electrónica de transmissão para examinar a estrutura fina e a morfologia de agregados de controlo e tratados. Os agregados celulares foram imersos em fixador de Karnovsky durante a noite a 4°C e pós-fixados em 0s04 a 1% durante 1 h. As amostras foram então coradas en bloe em acetato de magnésio de uranilo a 0,5% durante a noite a 4°C. Após desidratação e filtração, as amostras foram embebidas em resina de Spurr. Os blocos foram cortados com um micrótomo Reichert-Jung, corados com acetato de uranilo e citrato de chumbo, e visualizados utilizando um microscópio electrónico de transmissão JOEL 100S. A análise de morfometria foi realizada como descrito anteriormente (Zhang et al.f 1990, supra). A pesquisa por imunofluorescência para colagénio do tipo IV em agregados de células de hidra a vários pontos após a formação do sedimento demonstrou que o sinal foi detectado ás 48 h, e se tornou progressivamente mais forte e permanecéu "na" mesoglea "ao longo de todos os passos posteriores de desenvolvimento de agregados. A Figura 3 ilustra o aspecto típico de agregados de controlo e de bloqueamento às 96 h. Os agregados bloqueados não se desenvolvem para além do estádio das 24 h, e ou permanecem num estádio cístico ou se desagregam em células dissociadas pelas 96 h.

Como apresentado na Figura 2, o domínio 7S, e o domínio dos monómeros NC1 tiveram um máximo de eficiência no bloqueamento da morfogénese de agregados celulares de hidra quando os fragmentos foram testados numa base molar equivalente. Este bloqueamento também era dependente ria concentração. O hexâmero NC.1 bloqueou o 13

desenvolvimento de agregados a combinações mais elevadas enquanto que o fragmento de 80 kDa não apresentou qualquer efeito (Figura 4). O anticorpo contra o domínio NC1 possui um efeito de bloqueamento semelhante (Tabela 1).

Tabela 1 Tratamento com Anticorpo contra Componentes de ECM

Tratamento % de morfogénese normal soro não imune 1:10-1:100 79 ± 7,25 (54/68)a Ar.ti-NCl 1:10b 0(0/15) Anti-NCl 1:40 0(0/6) Anti-NCl 1:80 100 (3/3) Anti-FN 1:10° 0(0/15) Anti-FN 1:50 0(0/12) Anti-FN 1:100 32 ± 15,5(10/30) Anti-FN 1:200 33 ± 19,25(5/15) a Os resultados são apresentados como médias ± SEM (No. com morfogénese normal/No. total tratado). bAb policlonais contra o domínio de NC1 (al(IV) + a2(IV)) de colagénio do tipo IV de rim de bovino. cAb policlonal (ICN Biochemicals) contra fibronectina de plasma humano.

Foram realizados estudos semelhantes utilizando fibronectina como inibidor. Foram testados fibronectina intacta, fragmentos proteolíticos, péptidos RGDS, e anticorpo contra a fibronectina para determinar o seu efeito no desenvolvimento de agregados celulares em hidra. A Figura 1 (B) apresenta um diagrama da relação entre os vários fragmentos e a molécula de fibronectina intacta. Dcstco, vcrificou-3e que a fibronectina intacta e o domínio de ligação à gelatina de 30 kDa eram eficazes a 0,5 mg/mL no bloqueamento do desenvolvimento de agregados (Figura 6) . Verificou-se que a eficiência estava dependente da concentração, os anticorpos contra a fibronectina também apresentaram efeitos de bloqueamento (Tabela 1) . 14

Foi utilizada microscopia electrónica de transmissão para estudar a ultraestrutura da mesoglea sob a influência de cada molécula de ECM introduzida exogenamente. Os agregados de bloqueamento foram processados por análise de TEM em vários pontos de tempo das experiências e a ultraestrutura da sua mesoglea foi comparada com a dos agregados de controlo fixados no mesmo tempo de desenvolvimento. Em comparação com os espécimens do grupo de controlo (Figura 5A), a ultraestrutura da mesoglea em agregados bloqueados foi reduzida em espessura, era irregular na sua fronteira epitelial, e parece ter perdido alguma da sua organização ultraestrutural normal (Figura 5B) . A análise morfométrica (Tabela 2) indicou que a mesoglea de agregados bloqueados foi reduzida em espessura em aproximadamente 50% em comparação com controlos e esta redução foi significativa como determinado utilizando análises estatísticas. Esta ultraestrutura alterada da mesoglea foi observada com todos os reagentes de bloqueamento testados.

Tabela 2 Análise Morfométrica

Tratamento (do Tempo 0 a 24 horas) Largura inter-epitelial da mesoglea de acordo com medições de áreas3 1434±582 7241245* 9691458* BSAb 30 kDac Anti-FNd aTodas as micrografias da mesoglea foram tiradas com uma ampliação de 8000X e impressas no mesmo tamanho. Uma secção de 80 mm foi marcada com setas ao longo da mesoglea em cada impressão e a mesoglea dentro da área delimitada pelas setas foi medida pelo programa de computador SigmaScan. A unidade de medida é mm2. Nestas condições de medição, a área reflecte as alterações de espessura inter-epitelial como previamente descrito (Zhang et al., 1990, supra). Os resultados são apresentados como média ± DP. bConcentração de albumina do soro bovino a 0,1 mg/mL. cFragmento de 30 kDa de fibronectina de ligação a gelatina a 0,1 mg/mL. dDiluição de anticorpo para fibronectina de 1:100. ♦Estatisticamente diferente do grupo de BSA (valor de P <0,05). 15 \ ΓΝ \

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Para determinar se a inibição da proliferação celular foi responsável pelo bloqueio da morfogénese do agregado de células, foram tratados agregados desde o tempo 0 a 96 h com hidroxiureia (HU) a 10 μΜ, que mostrou inibir a síntese de ADN em células de hidra (Bode et al., 1976, J. Cell Sei. 20:29-46). Embora HU bloqueasse completamente a sinlese de ADN, o fármaco não inibiu a morfogénese dos agregados de células de hidra.

Um papel crítico para o colagénio no processo de formação da matriz foi deduzido de estudos farmacológicos prévios envolvendo agentes lantríticos (Barzanski et al., 1974, supra; Sarras et al., 1993, supra). Na presente demonstração, domínios de colagénio do tipo IV foram eficazes em perturbar a formação de mesoglea e em bloquear a formação do agregado. Neste respeito, o monómero do domínio NC1 e o fragmento do domínio 7S foram os mais eficazes no bloqueio do desenvolvimento do agregado quando todos os fragmentos de colagénio do tipo IV foram comparados numa base de igualdade molar. Outros propuseram que o domínio NC1 e o domínio 7S são os sítios do protómero de colagénio do tipo IV envolvidos na ponte intermolecular durante a formação da rede supramolecular (Martin et al., 1988, Adv. Protein Chem. 39:1-50). Não está claro porque é que o hexâmero NC1 maior e o fragmento de 80 kDa foram menos eficazes do que o monómero NC1 menor no bloqueio do desenvolvimento. O mesmo fenómeno foi observado com a fibronectina, enquanto o bloqueador mais eficaz, o fragmento 7S, possui uma massa maior do que 100 kDa. Numa base de massa total, o domínio 7S possui uma proporção relativamente elevada de resíduos de carbohidratos associados com a cadeia polipeptídica (15-18%), e análise posterior a estes resíduos de carbohidratos indicou que estes possuem características estruturais únicas tais como a presença de resíduos a-D-Gal terminais em grupos de oligossacáridos ligados a N (Langenveld et al., 1991, supra; Nayak et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:139/8-13987). A incapacidade do colagénio do tipo I em 16 -V'- \ \~ Ή /" \ t- bloquear o desenvolvimento é consistente com o facto de não ter sido detectado na mesoglea da hidra. 0 efeito dos componentes da mesoglea no comportamento das células de hidra pode ser visto a dois niveis. A um nível, a mesoglea pode ser vista simplesmente como uma entidade estrutural gue é necessária como uma fundação para a estabilidade e manutenção da bicamada epitelial. A outro nível, no entanto, os componentes da ECM na mesoglea proporcionam pistas de desenvolvimento que modulam tais processos celulares tais como a divisão, migração, e diferenciação celular durante a morofogénese da hidra. É óbvio que os componentes da ECM não são simplesmente moléculas estruturais. Foi mostrado que a fibronectina e o colagénio do tipo IV controlam a proliferação e a diferenciação celular epitelial (Tagami et al.r 1992, Cell Tissue Res. 268:225-232; Ingber, 1990, PNAS USA 87:3579-3583). Foi mostrado que as interacções mecano-químicas entre as células do músculo estriado em medusas e mesoglea enxertada pode induzir ou inibir a replicação de ADN e a transdiferenciação de células. Nos presentes exemplos, enquanto a diferenciação celular é inibida em agregados morfologicamente bloqueados, parece também que a morfogénese normal dos agregados pode ocorrer mesmo na ausência de proliferação de células. Assim, a redução da divisão celular em agregados bloqueados pode não contar para o bloqueio observado na morfogénese de agregados. A homologia entre o sistema modelo da hidra e o que é conhecido acerca dos mecanismos de desenvolvimento e regulação de organismos superiores faz da utilização dos fragmentos de colagénio do tipo IV neste sistema aplicável às mesmas interacções de células e tecidos em outros organismos. Os presentes métodos são aplicáveis a, entre outras coisas, a inibição de metástases, controlo de divisão celular, redução da formação de tecido cicatricial, intervenção na formação de tecido epitelial, inibição de angiogénese, redução de complicações devidas a adesão celular em transplantes de órgãos. 17 \

inibição da invasão angiogénica do tecido, ou a inibição da adesao de linfócitos e mobilidade.

Exemplo 2 Manutenção de Cultura de Células

Os mÁtndnç da presente invenção são baotantcs úteis para a manutenção de células em cultura, em que tal manutenção requer a manutenção co íenótipo celular e morfologia com adesão mínima. É reconhecido que existem muitos factores críticos que contribuem para a manutenção e propagação de células em cultura com sucesso. Ncmeacamc-nte, a divisão celular pode estar dependente de ancorarem, e nalguns casos apresenta inibição dependente da densidade. Geralmente a maioria das culturas constituídas por células dissociadas de tecidos, ao contrário das bactérias, não estão adaptadas a viver em suspensão e necessitam de uma superfície sólida para crescerem e dividirem. As células são agora cultivadas em cultura, uma vez que aderem ao plástico. As células podem variar nas necessidades do meio de cultura, e a natureza dos suportes, e algumas células não crescem sem os componentes de ECM próprios a revestir a placa plástica. Os métodos reconhecidos para a cultura de células de mamíferos podem ser encontrados em referências tão gerais tais como "Mammalian Cell Biotechnology", editado por M. Butler/ Oxford University Press, 1991, e "Readings in Mammalian Cell Culture", 2a Edição, editado por R. Pollack, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981.

Os métodos da presente invenção proporcionam um meio pelo qual a necessidade de adesão é eliminada por proporcionar às células uma quantidade eficaz de domínios de colagénio do tipo iv que permitem às células permanecer em solução enquanto parecem estar ainda ligadas a ECM. Isto melhorará a utilização de culturas de células em biorreactores e outras aplicações comerciais de larga escala. A utilização do domínio NC1 ou 7S em cerca da mesma concentração eficaz por célula como demonstrado 18 -~7 -~7

\ no exemplo anterior manterá as culturas de células efectivamente ligadas sem adesão. Além disso, o isolamento e manipulação de células não requer a utilização de agentes farmacológicos gerais que afectam muitas funções celulares de uma forma imprecisa e não específica.

As culturas primárias isoladas directamente de tccidoo animais, podem ser utilizadas para formar culturas secundárias de células especificas. Desta forma, as células podem ser sub-cultivadas durante várias semanas ou meses, apresentando o fenótipo e a morfologia das células parentais. A maior parte das células de vertebrados morrem em cultura depois de um número finito de divisões, por exemplo as células da pele podem continuar tipicamente a dividir por vários meses desde 50 a 100 vezes antes de morrerem. Podem no entanto aparecer linhas de células variantes que são imortais na medida em que podem ser propagadas em cultura de células indefinidamente. Estas células normalmente crescem melhor quando agarradas a um suporte sólido, e param tipicamente de crescer quando formam uma camada confluente na superfície, demonstrando inibição por contacto. As linhas de células preparadas a partir de células cancerosas diferem destas preparadas a partir de células normais de muitas formas. Estas células tendem a proliferar sem suporte sólido, e crescem até uma densidade muito maior do que ás células normais.

Assim, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para afectar culturas primárias e secundárias de células de modo a que se portem como se em contacto com um suporte sólido, mas sem os efeitos de inibição celular por contacto. Assim as linhas parentais podem ser mantidas in vitro em condições que promovem a manutenção do fenótipo e morfologia das células.

Uma área de grande interesse é o isolamento e cultura de células da medula pluripotentes ou embrionárias in vitro para eventual manipulação e utilização in vivo. O isolamento e manutenção destas células relativamente indiferenciadas, e a propagação destas permite a produção de grandes quantidades de 19 células especificas que podem formar a base da regeneração ou substituição de tecido. Assim as revelações da presente invenção podem ser aplicadas à manutenção de isolados de células pluripotentes, e permitir a propagação destas células enquanto inibem as alterações morfológicas e a diferenciação in vitro.

Exemplo 3 - Efeitos In Vifcro na Angiogénese A angiogénese, o processo de formação de novos vasos sanguíneos, desempenha um papel importante em processos fisiológicos tais como o desenvolvimento embrionário e pós-natal, assim como na reparação de feridas. A formação de vasos sanguíneos pode também ser induzida por processos patológicos envolvendo inflamação (por exemplo, retinopatia diabética e artrite) ou neoplasia (por exemplo, cancro) (Folkman, 1985, Prospect. Biol. Med., 29, 10). A neovascularização é regulada por factores de crescimento angiogénicos segregados por células de tumor ou normais assim como a composição da matriz extracelular e pela actividade das enzimas endoteliais (Nicosia e Otinetti, 1990, Lab. Invest., 63, 115).

Durante os estádios iniciais de angiogénese, aparecem rebentos de células epiteliais através de intervalos da membrana basal dos vasos sanguíneos pré-existentes (Nicosia e Ottinetti, 1990, supra; Schoefl, 1963, Virchous Arch. Pathol. Anat., 337, 97-141; Ausprunk e Folkman, 1977, Microvasc. Res., 14, 53-65;

Paku e Paweletz, 1991, Lab. Invest. 63, 334-346) . À medida que se formam novos vasos a sua membrana basal sofre complexas alterações estruturais e de composição que se crê afectarem a resposta angiogénica (Nicosia et al., 1994, Exp. Biology, 164, 197-206). Modelos anteriores de cultura planar mostraram que moléculas da membrana basal modulam a ligação, migração e proliferação e comportamento organizacional de células endoteliais (Nicosia et al., 1994, supra). Estudos mais recentes com modelos tridimensionais de cultura aórtica que simulam mais de perto as condições angiogénicas que ocorrem durante a

cicatrizaçâo de feridas in vivo sugerem que a membrana basal é um regulador dinâmico da angiogénese cuja função varia de acordo com os seus componentes moleculares (Nicosia et al., 1994, supra) .

Foram utilizados com modificações os métodos de Nicosia e Ottineti (1000) , supra, e Nicosia et al., (1994), supra, em experiências concebidas para testar o efeito do colagénio do Tipo IV na angiogénese sob condições in vitro. 0 modelo foi utilizado para estudar os efeitos de factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular na resposta angiogénica e emprega anéis aórticos cultivados em géis de colagénio tridimensionais em condições de isenção de soro. Estas experiências estão delineadas abaixo. A. Métodos

As experiências foram efectuadas com murganhos Swiss Webster machos com 1 a 3 meses de idade. Após anestesia, foi excisada a aorta torácica em condições de assepsia e transferida para meio de crescimento estéril MCDB 131 (Clonctis, San Diego, CA) contendo antibióticos. A gordura foi dissecada da aorta e foram obtidos de cada amostra aproximadamente seis a oito segmentos torácicos de 1 mm. Os segmentos foram transferidos para placas de cultura de tecidos de 48 poços. Os poços destas placas foram cobertos com 100 microlitros de Matrigel™ (membrana basal EHS, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) antes da transferência dos segmentos aórticos. A Matrigel™ foi diluída de 1:1 com meio de cultura MCDB 131 antes da utilização. Os segmentos foram centrados nos poços e 100 microlitros adicionais de Matrigel™ foram então colocados sobre as amostras. Os segmentos aórticos foram então embebidos na matriz da membrana basal. Cada poço recebeu então 300 microlitros de meio de crescimento MCDB 131. As placas foram colocadas numa incubadora mantida a 37°C com CO2 a 5%. As amostras foram observadas diariamente durante um período de 7 dias. Os novos microvasos em 21

crescimento foram contados utilizando um microscópio de inversão de fase a vários tempos durante o período de cultura, mas os dados são expressos a 3 e 5 dias de cultura. Para testar o efeito do colagénio do tipo IV na angiogénese, são misturados domínios em diferentes concentrações com o Matrigel™ e com o meio de crescimento MCDB 131. o meio de crescimento mcdb 131 fresco (domínios de colagénio mais e menos) foi mudado em cada 3 dias. B. Resultados

Após ter sido estabelecido o tempo de duração da angiogénese sob condições controlo (Matrigel™ mais meio de crescimento MCDB 131) , as experiências foram efectuadas utilizando várias concentrações dos domínios NC1 (hexâmero) e 7S de colagénio do Tipo IV (isolado a partir de lentes bovinas). Os resultados representam a análise de pelo menos três amostras por condição experimental. Na primeira experiência (Figura 7), as análises indicaram que a uma concentração de 50 microgramas/mL, o domínio NC1 e o domínio 7S inibiram significativamente a angiogénese tal como monitorizado aos 3 e 5 dias de cultura. Na segunda experiência, foram analisadas várias concentrações destes domínios. Como indicado na Figura 9, o domínio 7S a 50 microgramas/mL inibiu de novo significativamente a angiogénese aos 3 e 5 dias. A inibição foi reduzida a concentrações de 5 e 0,5 microgramas/mL. Como indicado na Figura 8, o domínio NC1 foi menos eficaz no bloqueio da angiogénese quando comparado com a observada na primeira experiência (Figura 7) . Adicionalmente, quando comparado com o domínio 7S, apresentava menos correlação entre a concentração e a acção inibitória. A Figura 10 são fotografias de segmentos aórticos torácicos de murganho embebidos em Matrigel™ (matriz da membrana basal EHS, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) a 5 dias de cultura na presença ou ausência de 50 μg/mL de domínios de colagénio do tipo IV. A amostra controlo (sem domínios) exibiu 22 crescimento de microvasos a partir do tecido cultivado na matriz (figura 1UA). Em contraste, a inibição da angiogénese foi observada em tecidos cultivados na presença de 50 μg/mL do domínio 7S (Figura 10B) e domínio NC1 (hexâmero) (Figura 10C) .

Os resultados destas experiências sugerem que como observado anteriormente com os ayifcjyados de células de hidra, O domínio /S de colagénio do Tipo IV é mais eficaz como agente bloqueante quando comparado com o domínio NC1.

Em resumo, o método da presente invenção é aplicável à inibição de metástases, controlo da divisão celular, redução da formação do tecido cicatricial, intervenção na formação de tecido epitelial, inibição de angiogénese, redução de complicações devido a adesão de células em transplantes de órgãos, inibição da invasão angiogénica de tecido, ou a inibição da adesão e mobilidade de linfócitos, a manutenção de isolados de células pluripotentes in vitro inibindo alterações morfológicas e diferenciação. Na prática da invenção, a quantidade ou intervalo de dosagem dos domínios NC1 (Hexâmero) e 7S de colagénio do Tipo IV empregues é tal que inibe eficazmente ou interrompe a adesão celular aos componentes da matriz extracelular ou a formação da lâmina basal funcional. Em geral, uma quantidade inibidora de domínio que pode ser empregue varia entre cerca de 5 a cerca de 50 μg/mL.

Lisboa, 30 de Novembro de 2001

ΓΕ OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 23

Claims

Γ Γ\

/ r-rv θ' REIVINDICAÇÕES 1. Domínio isolado de colagénio do tipo IV para utilização como um medicamento.
2. Domínio isolado de colagénio do tipo IV para utilização como um medicamento na inibição da formação da membrana da lâmina basal no desenvolvimento de células ou tecidos.
3. Método para cultivar células in vitro compreendendo o contacto de células a ser cultivadas com pelo menos um domínio isolado de colagénio do tipo IV para interromper a formação da membrana da lâmina basal ou contactos com a matriz extracelular.
4. Domínio isolado de colagénio do tipo IV para utilização como um medicamento na interrupção da formação de contacto da lâmina basal com células ou tecidos.
5. Domínio isolado de colagénio do tipo IV para utilização como um medicamento na inibição de angiogénese em tecido.
6. Domínio isolado de colagénio do tipo IV para utilização como um medicamento de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 4 ou 5, em que o domínio isolado de colagénio do tipo IV é o domínio 7S ou NC1 ou construções de proteína possuindo substancialmente a mesma estrutura dos domínios 7S ou NC1.
7. Utilização de um ou mais domínios isolados de colagénio do tipo IV para a preparação de um medicamento que inibe a formação da membrana lâmina basal no desenvolvimento de células ou tecidos. 1
8. Utilização de um ou mais domínios isolados de colagénio do tipo IV para a preparação de um medicamento que interrompe a formação do contacto da lâmina basal com células ou tecidos.
9. Utilização de um ou mais domínios isolados de colagénio do tipo IV para a preparação de um medicamento que inibe a anaiogénese cm tecido.
10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, em que o domínio isolado de colagénio do tipo IV é o domínio 7s ou NC1 ou construções de proteína possuindo substancialmente a mesma estrutura do domínio 7S ou NC1.
11. Método para o cultivo in vitro de células de acordo com a reivindicação 3, em que o domínio isolado de colagénio do tipo IV é o domínio 7S ou NC1 ou construções de proteína possuindo substancialmente a mesma estrutura do domínio 7S ou NC1.

Lisboa, 30 de Novembro de 2001 rr oficiai., da propriedade industrial 2