KR100579660B1 - 제미니바이러스 발현시스템을 이용한 재조합 신생혈관생성억제 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물바이러스인 제미니바이러스의 레플리콘 부분을 함유한 식물발현시스템을 이용하여 형질전환된 식물조직 또는 식물체에서 재조합 엔도스타틴 또는 툼스타틴의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 동물세포나 미생물에서 생산하는 것보다 경제적으로 대량의 재조합 엔도스타틴과 툼스타틴을 생산하는 것이 가능하다.

엔도스타틴, 툼스타틴, 제미니바이러스, 레플리콘, 형질전환 식물

Description

제미니바이러스 발현시스템을 이용한 재조합 신생혈관생성 억제 단백질의 제조방법{Method for preparing a recombinant protein inhibiting angiogenesis using geminivirus expression system}

도 1은 플라스미드 pKH1-GE와 pKH2-E의 유전자 지도이다.

도 2는 재조합 아그로박테리움을 PCR 분석을 통해서 확인한 사진이다. 레인 1: pKH1-GE의 PCR 산물; 레인 2: 재조합 아그로박테리움에서 분리한 pKH1-GE의 PCR 산물; 레인 3: pKH2-E 벡터의 PCR 산물; 레인 4: 재조합 아그로박테리움에서 분리한 pKH2-E 벡터의 PCR 산물.

도 3은 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편의 전체 RNA를 엔도스타틴에 특이적인 프로브로 노던 블럿한 결과이다. 레인 1, 2, 3 및 4: pKH1-GE를 가진 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편; 레인 5, 6, 7 및 8: pKH2-E를 가진 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편; 아래 사진은 대조군인 18sRNA.

도 4는 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편 단백질을 엔도스타틴에 특이적인 프로브로 웨스턴 블럿한 결과이다. 레인 1: 대조군; 레인 2, 3, 4 및 5: pKH1-GE를 가진 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편; 레인 6, 7, 8 및 9: pKH2-E를 가진 재조합 아그로박테리움을 접종한 잎절편; 레인 10: 대장균에서 유래 의 대조군 엔도스타틴 60ng.

도 5는 재조합 아그로박테리움으로 형질전환한 식물체 단백질을 엔도스타틴에 특이적인 프로브로 웨스턴 블럿 분석한 결과이다. 레인 1: 대조군 식물체; 레인 2, 3, 4, 5 및 6: pKH1-GE를 가진 재조합 아그로박테리움으로 형질전환된 식물체; 레인 7 및 8: pKH2-E를 가진 재조합 아그로박테리움으로 형질전환된 식물체; 레인 9: 대장균에서 유래의 대조군 엔도스타틴 60ng.

발명의 분야

본 발명은 식물감염 바이러스인 제미니바이러스 레플리콘을 포함하는 발현시스템을 사용한 형질전환 식물조직이나 식물체에서 혈관신생유도억제 물질인 엔도스타틴 또는 툼스타틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

형질전환 식물에서 외래 유전자를 산업적으로 발현시킨 것은 1984년에 세균 유래의 유전자를 담배에서 발현시킴으로 처음 보고 되었다 (Gasser, C.S. et al., Science, 244, 1293-9, 1989). 현재 바이오산업의 발전에 따른 분자 농업(molecular farming)의 산업화에 대한 관심이 높아지면서 새로운 형질전환식물 을 산업적으로 응용하는 데 대한 가능성이 여러 분야에서 기대되고 있다.

분자농업이란 고부가가치의 유용단백질을 식물을 생산공장으로 활용하여 대량 생산하는 기술로 다양한 종류의 단백질을 생산하고 대규모 재배가 가능한 주체인 식물을 이용하여 고부가가치의 유용단백질을 값싸게 대량으로 생산하는 것이다. 또한 동물세포배양에 비하여는 약 1/30, 미생물 발효에 비하여 약 1/3의 비용이 소요되므로 쉽게 산업화할 수 있는 장점을 가지고 있다.

특히 분자 농업의 개발 분야 중 현재 산업화를 위해 현저하게 연구되는 분야로는 고부가가치의 의료용 단백질(인슐린, 인터페론, 성장호르몬, 각종 의료용 인체효소 등)을 값싸게 대량 생산하는 것으로 해당 유전자를 식물에 도입, 발현시켜 이로부터 유용물질을 추출하는 것이다 (Hughes, J. et al., BioPham, 4, 18-26, 1991; Fiedler, U. et al., Bio/Technology, 13, 1090-3, 1995; Jefferson, R. A. et al., EMBO J, 6, 3901-7, 1987). 이는 식물로부터 원하는 단백질의 분리. 정제에 고도의 비용이 요구되므로, 식물에서의 발현시스템을 조절하여 분리. 정제에 드는 비용을 최소화하는 기술이며 주로 고순도의 품질을 요구하는 의료용 단백질들이 그 대상이다.

따라서 현재 생명공학 기업인 Monsanto사, Dupont사 그리고 Novatis사에서는 형질전환식물을 이용한 치료용 물질의 생산에 많은 연구와 투자를 하고 있다. 그러나 식물을 이용한 유용물질의 생산은 기본적으로 형질전환 식물체에서 외래유전자 발현이 담보되어야하는데 일반적으로 전체 가용성 단백질(total soluble protein)의 0.2~5%로 아직까지는 그 발현효율이 미흡한 실정이다 (Hood, E. E. et al., Current Opinion in Bitechnol., 10, 382-6, 1999; Witcher, D. R. et al., Mol. Breed., 4, 301-12, 1998; Zhong, G. Y. et al., Mol. Breed., 5, 345-56, 1999). 그러므로 유용물질의 효율적인 대량생산을 위한 식물발현 시스템의 개발은 분자농업에 있어서 가장 큰 과제로 많은 연구가 필요하다.

식물 바이러스인 제미니바이러스(geminivirus)는 유전체 구조, 매개 곤충, 숙주식물 범위에 따라 크게 4 종 (Mastreviruses, Begomoviruses, Curtoviruses, Topocuviruses)의 속으로 나뉜다. 본 발명에서 사용한 TGMV(Tomato golden mosaic virus)는 둘로 나누어진 게놈(bipartite 게놈)을 갖는 베고모바이러스(Begomovirus)에 속한다. TGMV는 회전환복제(rolling circle replication)를 통해서 숙주세포의 핵 내에서 DNA를 복제한다 (Ugaki, M. et al, Nucleic Acids Res., 19, 371-7, 1991; Gutierrez, C., The EMBO J., 19, 792-9, 2000).

제미니바이러스가 식물세포에 있어서 효율적인 발현시스템으로의 개발될 가능성은 최근 TLCV(tomato leaf curl virus) 게놈을 이용하여 GUS(glucuronosidase)의 발현 및 활성을 확인한 연구보고에서도 알 수 있다 (Selth L. A et al., FEBS Letters, 25959, 1-4, 2002).

사람을 포함한 폐쇄 혈관계 생물에 있어서 혈관은 발생 단계에서 혈관 상피세포가 전구체로부터 분화되는 혈관형성(vasculogenesis) 과정과 기존에 존재하는 혈관으로부터 새롭게 혈관이 분리되어 형성되는 혈관신생(angiogenesis) 과정을 통하여 형성된다 (Hamilton, W. J. et al., Human embryology, William and Wilkins, Biltmore 354-66, 1962). 정상적인 성체의 경우, 혈관상피세포가 분열하거나 자라나는 경우는 거의 없으나 상처의 치료나, 새로운 조직 및 기관의 형성 시, 또 여성의 생식과 관련하여 새로운 혈관 형성이 필요한 경우에 각종 성장인자(growth factor)들에 의해 혈관 상피세포가 자극받아 분열과 성장을 유도함으로서 혈관 형성이 일어나게 된다 (Fokman, J. et al., J. Biol. Chem., 267, 931-4, 1992).

이러한 신생혈관형성은 여러 가지 질병 류마티스 관절염, 혈관종, 악성 종양(癌) 등의 질병이 진행하는데 있어서 필수적인 과정으로 신생혈관형성을 억제함으로써 질병의 진행을 억제하는 연구가 진행 중이다. 특히, 1994년부터 최근에 이르기까지 미국 하버드 의대 교수인 Folkman 등을 중심으로 한 연구진은 안지오스타틴(angiostatin)과 엔도스타틴(endostatin) 등, 혈관상피세포의 성장을 억제하는 단백질들을 계속하여 발표하였다. 이러한 단백질은 혈관상피세포의 성장을 50%정도 억제한다는 보고를 하였는데, 이러한 혈관상피세포의 성장억제 활성을 갖는 단백질은 분자량이 10kDa 내외의 비교적 작은 단백질이라는 점에서 주목할 만하다.

그 중에서도 특히 엔도스타틴과 툼스타틴(tumstatin)은 신생혈관형성의 억제물질로 혈관상피세포의 증식을 억제하는 저해제로 현재 임상실험 단계로 그 치료활성에 대한 검증을 하고 있다. 엔도스타틴은 콜라겐 XVIII의 20 kDa 크기의 C-말단 절편으로 특정적으로 혈관상피세포의 증식을 억제하고, 툼스타틴은 콜라겐 IV의 3 사슬의 절편으로 혈관상피세포의 단백질 합성을 억제하여 혈관상피세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이러한 신생혈관생성 억제제들은 앞으로 치료용으로 많은 수요가 예견되고 있으므로 이들 엔도스타틴과 툼스타틴의 대량생산 시스템의 확충이 요구되고 있다.

최근 엔도스타틴은 곤충세포와 대장균, 효모종인 Pichia pastoris 그리고 인간 혈관상피세포에서 발현된 보고가 있다 (O'Reilly et al., Cell, 88, 277-85. 1997; Boehm, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 252, 190-4, 1998; Boehm, T. et al., Yeast, 15, 563-7, 1999; Blezinger, P. et al., Nature Biotechnol., 17, 343-8, 1999; Park, J. H et al., Biotechnol. Lett., 21, 729-33, 1999). 그러나 이러한 미생물이나 동물세포에서의 유용 단백질 생산은 그의 배양과 유지에 비용이 많이 드는 단점이 있다.

한편, 제미니바이러스를 이용하여 좀더 효율적인 외래유전자 발현시스템을 개발하는 데에는 기존의 DNA 바이러스인 CaMV 프로모터를 이용하는 시스템에 비해 몇 가지 장점을 고려할 수 있다. 우선 첫 번째로 아그로박테리움을 이용한 식물 형질전환 시 보통 5 개(copy)이하의 외래유전자의 도입으로 형질전환의 효율과 외래유전자의 발현에 관한 효율의 감소를 생각할 수 있다. 그러나 제미니바이러스 레플리콘을 이용하면 에피조말 증폭(episomal amplification)을 통해 주형의 개수(copy수)를 증가함으로 외래유전자의 발현효율 증대를 기대할 수 있다.

두 번째로 회전환복제를 통해 dsDNA 중간체를 구성함으로 역전사 RNA 중간체를 구성하는 RNA 바이러스보다 DNA의 에러 유발율이 떨어짐으로 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있다.

세 번째로 단자엽 및 쌍자엽 식물에 감염하는 광범위한 숙주범위를 가지고 있어 어느 작물이건 다양한 작물에 적용할 수 있다는 장점을 가지고 있다 (Chapman, S. et al., Plant J., 2, 549-557, 1992).

이에 본 발명자들은 효율적으로 재조합 단백질의 생산이 가능한 형질전환 식물체에서 엔도스타틴과 툼스타틴을 생산하고자 예의 노력한 결과 식물 바이러스인 제미니바이러스 발현시스템을 이용하여 형질전환 식물체에서 엔도스타틴과 툼스타틴이 효율적으로 발현되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 제미니바이러스 레플리콘 사이에 엔도스타틴 유전자 또는 툼스타틴 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물조직 또는 식물체를 이용한 엔도스타틴 또는 툼스타틴의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 두개의 T-DNA 보더 사이에 2개의 제미니바이러스 레플리콘을 가지고, 상기 두 제미니바이러스 레플리콘 사이에 엔도스타틴 유전자 또는 툼스타틴 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물로 형질감염된 식물조직 또는 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 형질감염된 식물조직 또는 식물체를 배양하는 것을 특 징으로 하는 엔도스타틴 또는 툼스타틴의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 제미니바이러스의 일종인 TGMV (tomato golden mosaic virus)의 레플리콘을 이용한 발현시스템과 일반적으로 사용되는 CaMV 35S 프로모터의 조절을 받는 시스템과의 발현 양상을 비교하고 더 효율적인 외래 유전자의 발현 시스템인 것을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 형진전환 식물로 담배를 사용하였으나 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등 경제적으로 재조합 단백질을 제조할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예1: 제미니바이러스를 포함한 식물 발현벡터에 엔도스타틴 유전자의 서브클로닝

엔도스타틴 유전자는 pETKH-1벡터(ATCC 63404)로부터 센스 프라이머(서열 1)와 안티센스 프라이머(서열 2)를 이용해 PCR 방법으로 증폭하였다.

서열 1: 5'-AGATCTATGCATACTCATCAGGACTTTCAGCC-3'

서열 2: 5'-GGTACCTCACACGTGGTGGTGG-3'

증폭된 각각의 유전자를 T-벡터에 클로닝하여 DNA 시퀀싱을 통해 확인하고 클로닝에 용이하도록 BglII와 KpnI 제한효소 인식부위를 갖게 한 후 pCAMBIA 1300(CAMBIA, Australia)를 모벡터로 하여, 2 개의 레플리콘 사이에 엔도스타틴 유전자를 갖는 식물발현용 이중 벡터(binary vector)인 재조합 pKH1-GE를 제작하였다(도 1).

실시예 2: CaMV35S-유래의 벡터에 엔도스타틴 유전자의 서브클로닝

제미니바이러스 DNA 레플리콘을 함유한 벡터(pKH1-GE)의 발현 양상과 비교하기 위해 기본틀은 pKH1벡터와 정확히 같지만 제미니바이러스 레플리콘은 없고 CaMV35S 프로모터를 포함하는 pKH2 이중 벡터(binary vector)를 제조하였다.

엔도스타틴 유전자는 pETKH-1 벡터로부터 PCR 방법으로 증폭하고, pKH2 이중 벡터에 BglII와 KpnI의 제한효소 인식부위를 이용하여 서브클로닝하였다. 이렇게 제작된 엔도스타틴 DNA 단편이 삽입된 재조합 식물발현벡터를 pKH2-E라 명명하고 재조합 pKH1과 동일한 방법으로 아그로박테리움을 제조하여 실험에 사용하였다.

실시예 3: 재조합 아그로박테리움 투메파시앙스의 확인

식물 형질전환에 사용될 재조합 아그로박테리움 투메파시앙스(Agrobacterium tumefaciens)의 제조를 위해 트리 페어렌탈 메이팅(tri-parental mating)이라는 방 법을 사용하여 제조하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

항생제가 첨가되지 않은 LB 한천 배지에 pKH1-GE 또는 pKH2-E 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시앙스 LBA4404(Cat. No. 18313-015, GibcoBRL Co., U.S.A.)을 28℃에서 약 48시간동안 배양하였다.

배양후 형성된 아그로박테리움 콜로니로부터 재조합 아그로박테리움을 선별하여 식물의 형질전환에 사용하였다. 도 2에서와 같이, 선별된 아그로박테리움 클론에 엔도스타틴 유전자가 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 아그로박테리움을 이용한 담배의 형질전환 및 형질전환 식물체의 육성

재조합 pKH1-GE 또는 pKH2-E 플라스미드가 삽입되어 있는 아그로박테리움 투메파시앙스를 멸균된 LB 액체배지에 넣고 항생제 (카나마이신 50mg/ℓ)를 첨가하여 36 시간 동안 28℃, 150 rpm의 속도로 조절된 진탕배양기에서 배양하고 원심분리기에 넣고 2500 rpm으로 10 분간 원심분리 시켜 원심분리된 균을 액체 MSO배지로 현탁시켜 담배 절편의 접종에 사용하였다.

전배양된 절편을 아그로박테리움 용액에 15 분간 담근 후 멸균된 여과지에서 절편 위에 묻은 과량의 아그로박테리움을 닦아낸 후 항생제가 첨가되지 않은 재분화 배지(MS salt, 0.3% phytagel, 30 g/ℓ sucrose)에 0.2 ㎎/ℓ 3-인돌아세트산(IAA)과 1.0 ㎎/ℓ 제아틴이 첨가된 배지에 치상하여 2 일 동안 25℃에서 암배양하였다. 2 일 후 항생제(150 ㎎/ℓ 티멘틴, 30 ㎎/ℓ 하이그로마이신)가 첨가된 재분화 배지로 옮겨서 형질전환된 식물체를 선별하였다.

21 일간 형질전환체를 선별하면서 유도된 줄기가 약 2~3㎝의 길이로 성장하게 되면 뿌리를 유도하기 위하여 MSO (MS salt, 0.3% phytagel, 30 g/ℓ sucrose) 호르몬을 제거한 배지에 성장한 줄기를 절단하여 뿌리를 유도하였다. 약 2달 동안의 재분화가 완성된 형질전환 식물체는 화분으로 옮겨 토양 순화를 실시하였다.

실시예 5: 잎절편 조직 실험에서 노던블럿(Northern blot) 분석에 의한 엔도스타틴 유전자의 발현 확인 및 CaMV35S-유래의 벡터와 제미니바이러스-레플리콘 함유 벡터와의 비교검토

새로운 발현 체제를 이용한 엔도스타틴 유전자의 발현을 전사 수준에서 확인하기 위하여 잎절편에서 아그로박테리움 접종 후 4, 8, 12 그리고 16 일째 각각의 동량의 시료로부터 추출한 전체 RNA 40 ㎍을 사용하여 노던 블럿을 수행하였다(도 3).

그 결과로 제미니바이러스의 레플리콘이 함유되어 있는 pKH1 벡터 시스템을 이용한 경우 전사 수준에서의 유용 유전자 발현이 CaMV35S 프로모터를 이용한 pKH2 벡터에 비하여 효율적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 엔도스타틴의 전사 수준의 경우에 대조군의 벡터 시스템인 pKH2의 보다 최대 1.7 배 높게 나타났다.

실시예 6: 잎절편 실험에서 웨스턴 블럿(Western blot) 분석에 의한 엔도스타틴 유전자의 발현 확인 및 CaMV35S-유래의 벡터와 제미니바이러스-레플리콘 함유 벡터와의 엔도스타틴 발현 양상 비교

형질전환 담배절편으로부터 엔도스타틴 단백질의 한시 발현(transient expression) 여부를 확인하기 위하여 잎절편에서 아그로박테리움 접종 후 4, 8, 12 및 16 일째 각각의 동량의 시료로부터 추출한 단백질을 아세톤으로 농축한 105㎎의 시료를 12 % SDS-PAGE와 웨스턴 블럿(Western blot)을 수행하여 분석하였다. 항체반응 후 ECL 키트로 30 초, 1 분, 5 분 및 30 분 간격으로 X-ray 필름에 감광시키면서 단백질의 발현 양상을 확인하였다(도 4).

레인 1, 2, 3 및 4는 pKH1-GE가 삽입된 재조합 아그로박테리움으로 접종한 후 4, 8, 12 및 16 일째의 시료로 엔도스타틴 단백질의 발현을 확인한 결과이며 레인 5, 6, 7 및 8은 pKH2-E가 삽입된 재조합 아그로박테리움으로 접종하여 후 엔도스타틴 단백질의 발현을 확인한 것이다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 제미니바이러스 레플리콘이 삽입된 pKH1-GE의 경우 CaMV35S 프로모터-유래의 pKH2 벡터 시스템에 비하여 1.6 배 높은 엔도스타틴 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. 그리고 각각의 엔도스타틴 단백질의 한시 발현은 pKH1-GE의 경우 평균 2.7 ㎍/gFW와 pKH2-GE의 경우 평균 1.6 ㎍/gFW으로 발현되었다.

실시예 7: 제미니바이러스 레플리콘이 함유된 식물 발현시스템의 형질전환 식물체에서 엔도스타틴 단백질의 발현 확인

형질전환 담배식물체의 선별, 재분화 후 형성된 재분화 식물개체에서 제미니바이러스 시스템에 의한 엔도스타틴 단백질의 발현 여부와 CaMV35S-유래의 벡터에 서의 엔도스타틴 발현을 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. 각각의 pKH1-GE 또는 pKH2-E의 플라스미드가 삽입된 재조합 아그로박테리움으로 접종하고 선별된 형질전환 개체 18 주를 확립하였다.

형질전환 식물체에서 엔도스타틴 단백질의 발현 양상은(도 5) 형질전환된 식물체로부터 단백질을 추출하여 100㎍의 단백질 시료를 한시 발현방법과 동일한 과정을 거쳐 엔도스타틴 발현을 확인하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 형질전환 식물체의 경우도 한시 발현에서 나타난 결과와 같이 제미니바이러스 레플리콘이 삽입된 pKH1-GE의 경우 CaMV35S 프로모터-유래의 pKH2 벡터 시스템에 비하여 1.3 배정도 엔도스타틴 단백질의 발현이 높아짐을 확인하였다.

각각의 엔도스타틴 단백질의 발현량은 pKH1-GE의 경우 1.5 ㎍/gFW으로, pKH2-E의 경우 1.1 ㎍/gFW으로 나타났다. 제미니바이러스 레플리콘을 삽입한 새로운 식물 발현시스템은 CaMV 프로모터를 가진 Ti-플라스미드 발현시스템에 비하여 좀 더 높은 발현 양상을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 제미니바이러스를 포함한 식물 발현벡터에 툼스타틴의 유전자가 삽입된 재조합벡터의 제조

툼스타틴 유전자(Genbank accession number: AF258351)를 증폭하기 위하여 티머스 조직(thymus tissue)으로부터 전체 RNA를 준비하였고, 전체 RNA 10㎍으로부터 역전사효소(RT; Promega Co.)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 사용하고, 프라이머로 하기 서열 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 센스 프라이머는 서열 3이었고, 안티센스 프라이머는 서열 4였다.

서열 3: 5'-CCAGGTTTGAAAGGAAAACGTGGAGAC-3'

서열 4: 5'-TCAGTGTCTTTTCTTCATGCACACCTG-3'

증폭된 툼스타틴 유전자를 CaMV35S 프로모터를 포함하는 pKH1 이중 벡터(binary vector)에 NcoI와 SpeI의 제한효소 인식부위를 이용하여 서브클로닝 하여 GFP와 융합된 형태로 툼스타틴 DNA 단편이 삽입된 재조합벡터 pKH1-TG를 제작하였다.

실시예 9: 아그로박테리움을 이용한 담배의 형질전환 및 형질전환식물체의 육성으로 툼스타틴의 제조

실시예 3과 같은 방법으로 pKH1-TG가 삽입된 재조합 아그로박테리움을 제작하고 이를 이용하여 담배를 형질전환시켰다. 담배의 형질전환은 실시예 4에 개시되어 있는 바와 같이 수행하였다. 이후, 실시예 6과 같이 웨스턴 블럿에 의해 GFP-툼스타틴 융합단백질이 성공적으로 발현되는 것을 확인하였으며 상기 융합단백질의 분자량은 약 58kDa이었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물체에서 발현가능한 제미 니바이러스 레플리콘 사이에 엔도스타틴 유전자 또는 툼스타틴 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 상기의 플라스미드로 형질전환한 식물체에서 엔도스타틴과 툼스타틴을 과발현 시키는 것이 가능하다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

<110> CHUNG, In Sik <120> Method for preparing a recombinant protein inhibiting angiogenesis using geminivirus expression system <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 agatctatgc atactcatca ggactttcag cc 32 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggtacctcac acgtggtggt gg 22 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ccaggtttga aaggaaaacg tggagac 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tcagtgtctt ttcttcatgc acacctg 27

Claims (4)

1. 두 개의 T-DNA 보더 사이에 2개의 제미니바이러스 레플리콘을 가지고, 상기 두 레플리콘 사이에 엔도스타틴 유전자 또는 툼스타틴 유전자가 삽입되어 있으며, 식물발현용 이중벡터(binary vector)인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
3. 제2항의 미생물로 형질감염된 식물조직 또는 식물체.
4. 제3항의 형질감염된 식물조직 또는 식물체를 배양하는 것을 특징으로 하는 엔도스타틴 또는 툼스타틴의 제조방법.

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