KR100500324B1

KR100500324B1 - 식물세포배양에서 삼투압을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법

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Publication number: KR100500324B1
Application number: KR10-2002-0011951A
Authority: KR
Inventors: 양문식; 권태호; 이재화
Original assignee: 양문식; 권태호; 이재화
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2005-07-11
Also published as: KR20030072764A

Abstract

본 발명은 식물세포배양에서 삼투압을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 당 및 무기염으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 단백질 생산 증강용 조성물 및 이를 이용한 단백질 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 현탁세포를 1 내지 15 중량%의 만니톨 또는 10 내지 200 mM의 Nacl을 포함하는 배지상에 배양하여 다량의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하는 방법을 확립하여 저가의 비용으로 생물학적 활성이 높은 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

식물세포배양에서 삼투압을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법 {OVEREXPRESSION METHOD OF RECOMBINANT PROTEIN USING OSMOTIC PRESSURE IN PLANT CELL SUSPENSION CULTURE}

본 발명은 식물세포배양에서 삼투압을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물세포를 현탁배양할 때 만니톨 또는 NaCl을 슈크로즈와 함께 첨가함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질의 생산은 미생물과 동물세포 시스템을 이용하여 주로 이루어져 왔으나, 최근 식물과 식물세포배양을 통하여 재조합 단백질을 생산하고자하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

식물을 이용한 외래 유전자의 형질전환은 아그로박테리움을 매개로 한 형질전환방법이 주로 이용되어지고 있다. 식물발현시스템은 미생물발현시스템이 가지고 있는 해독후수식과정의 단점을 극복할 수 있어, 생산된 재조합 단백질의 활용가치를 높일 수 있다. 또한 식물세포의 배지나 배양조건이 동물세포에 비해 간단하고 저렴하며 동물 바이러스나 독소(toxin)등의 감염 위험이 적은 장점이 있다(Doran, P. M. (2000), Foreign protein production in plant tissue cultures, Current Opinion in Biotechnology, 11, 199-204).

최근 식물세포배양을 이용하여 외래 단백질을 발현하고자 하는 연구가 많이 수행되고 있으며, 모델 시스템으로는 β-glucuronidase(Kurata, H., T. Takemura, S. Furusaki, and C. I. Kado, (1998) J Ferment Bioeng, 86, 317-323), 항체 (LaCount, W., G. An, J. M. Lee, (1997) Biotechnology Letters. 19, 93-96), 인터루킨(Magnuson, N. S., P. M. Linzmaier, R. Reeves, G. An, K. HayGlasee, and J. M. Lee, (1998) Protein Expre Purif, 13, 45-52), ricin(Sehnki, P. C. and R. J. Ferl, (1999) Protein Expr Purif, 15, 188-195), α₁-antitrypsin(Terashima, M., Y. Murai, M. Kawamura, S. Nakanishi, T. Stoltz, L. Chen, W. Drohan, R. L. Rodriguez, and S. Katoh, (1999) Appl Microbiol Biotechnol, 52, 516-523) 등이 있다.

식물발현시스템의 숙주세포로는 형질전환이 용이하고 배양이 비교적 쉬우며 성장속도가 빠른 담배현탁세포가 많이 이용하고 있으며, 캘러스에서 유기된 현탁세포 또는 뿌리털을 유기하여 사용하고 있다.(Wongsamuth, R., P. M. Doran, (1997) Biotechnol Bioeng, 54, 401-415) 또한 재조합 단백질 발현에 관여하는 프로모터에 따라 다양한 식물종이 숙주세포로 이용될 수 있으며, 그 한예로 슈크로즈의 고갈을 신호로 하여 재조합 단백질 발현을 유도하는 프로모터를 이용하기 위한 벼세포배양이 있다.(Terashima, M., Y. Murai, M. Kawamura, S. Nakanishi, T. Stoltz, L. Chen, W. Drohan, R. L. Rodriguez, and S. Katoh, (1999) Appl Microbiol Biotechnol, 52, 516-523)

또한 식물발현시스템은 사용하는 배지의 조성물이 간단한 이온과 호르몬, 당으로 이루어져 있기 때문에 생산된 재조합 단백질을 배지로 분비 시키면 분리정제가 매우 간단하다. 그래서 식물발현시스템의 대부분이 재조합 단백질의 효율적인 분비에 집중되고 있으며, 재조합 단백질의 세포외 분비시 안정성을 증대시키기 위한 방안이 연구중에 있다.

따라서, 본 발명은 식물발현시스템에서 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식물발현시스템에서 세포외로 발현된 재조합 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 조건을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식물발현시스템에서 재조합 단백질의 세포외 분비를 촉진시킬 수 있는 조건을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 당 및 무기염으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 단백질 생산 증강용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 조성물을 배양배지에 첨가하고, 배양배지에 식물 현탁세포를 접종하여 현탁배양하고, 현탁배양한 배양물로부터 재조합 단백질을 분리하는 것을 포함하는 재조합 단백질 생산방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 식물세포 현탁배양에서 재조합 단백질의 생산효율을 증가시킬 수 있는 방법을 연구하였고, 당 또는 무기염을 배양배지내에 첨가함으로써 재조합 단백질의 생산량을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

식물발현시스템에서 발현되는 재조합 단백질은 통상적으로 세포외로 분비되도록 고안되어있다. 따라서 세포외로 분비된 재조합 단백질은 배양액에 장기간 노출된 후 정제, 분리되어진다. 재조합 단백질의 생산효율은 세포내 외래 유전자의 발현기작, 발현된 재조합 단백질의 분비효율, 또는 세포외 재조합 단백질의 안정성에 의하여 결정된다.

본 발명에서는 재조합 단백질의 생산 증강용 조성물로 당 또는 무기염을 제공한다. 바람직한 증강제는 슈크로즈, 만니톨 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함한다.

상기 당 또는 무기염을 단독 또는 혼합물 형태로 식물세포 배양배지에 포함시켜 형질전환체 식물세포를 배양한다. 당 또는 무기염의 혼합비, 또는 식물세포 배양방법은 식물세포의 종류나 증강제 종류에 따라 최적의 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는 1 내지 15 중량%의 당 또는 10 내지 200 mM의 NaCl을 식물세포 배양배지에 첨가하고, 형질전환체 식물세포를 3 내지 6 일간 현탁배양하는 것이 좋다. 이때 배양배지, 배양온도, 배양방법(교반) 등은 현탁배양하는 식물세포 종류에 맞게 조절한다.

본 발명의 단백질 생산 증강용 조성물의 단백질 생산 증가효과는 형질전환체 담배세포를 이용하여 확인하였다. 상기 형질전환체 담배세포는 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor; 이하 ' hGM-CSF' 라 함)를 발현하는 것으로, 기존에 제조되어진 형질전환체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 0670BP)이다.

니코티아나 타바쿰 pMYO64를 MS 배지상에서 현탁배양할 경우, 당 또는 NaCl를 첨가함에 따라 식물세포의 증식 및 성장(세포크기)이 억제되었으나 재조합 단백질의 발현 및 분비는 더욱 증가되었다.

하기 표 1은 니코티아나 타바쿰 pMYO64를 3 중량 %의 슈크로즈를 포함하는 배지에 만니톨 또는 NaCl을 첨가한 상태에서 12일간 배양하였을 때 측정한 세포생중량, 건조중량, 총단백질양 및 재조합 hGM-CSF 단백질양을 나타낸 것이다.

	세포생중량(g/L)	세포건조중량(g/L)	세포외로 분배된 최대 총단백질 양(ug/L)	최대 재조합 hGM-CSF 단백질 양(ug/L)	재조합 hGM-CSF 단백질/총단백질 (%)
대조구	475.0	14.7	125.0	334.7	0.96
3 중량%의 만니톨	279.0	14.5	131.1	655.2	1.39
6 중량%의 만니톨	227.8	13.4	106.1	793.8	1.84
9 중량%의 만니톨	158.6	11.8	87.3	980.1	2.63
50 mM의 NaCl	457.5	14.5	135.0	602.2	1.29
100 mM의 NaCl	380.2	14.8	154.4	630.2	1.12
150 mM의 NaCl	192.3	11.2	162.4	776.2	0.10

특히, 니코티아나 타바쿰 pMYO64는 MS 배양배지에 9 중량%의 만니톨 및 3 중량%의 슈크로즈를 첨가하여 5 일간 배양하였을 980.1 ㎍/L의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였다. 또한 MS 배양배지에 150 mM의 NaCl 및 3 중량%의 슈크로즈를 첨가하여 5일간 배양하였을 때 최대 776.2 ㎍/l의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였다.

따라서, 본 발명은 식물세포 현탁배양시 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 방법으로 당 또는 NaCl를 사용하는 방법을 확립하였고, 특히 이를 니코티아나 타바쿰 pMYO64에 적용하여 다량의 재조합 hGM-CSF를 생산하였다. 상기 재조합 hGM-CSF 단백질은 식물발현시스템을 이용하여 저가의 비용으로 대량으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라 생물활성도 매우 높아 의학적 용도로 제공되어질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 재조합 벡터 제조

hGM-CSF 유전자를 발현하는 재조합벡터의 제조모식도는 도 1에 간략하게 도시하였다.

hGM-CSF cDNA는 PHA(phytohemagglutinin)로부터 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 RT-PCR하여 합성하였다. PCR은 94 ℃, 3분간 전변성단계(pre-denaturation) 1회, 94 ℃ 1분간(denaturation), 55 ℃ 1분간(annealing) 및 72 ℃ 3분간(extension)으로 이루어진 반응을 30회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 hGM-CSF 유전자의 ORF(open reading frame, Lee, F., Yokota, T., Otsuka, T., Gemmell, L., Larson, N., Lhu, J., Arai, K. and Rennick, D. (1985) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4360-4364)을 포함하는 471 bp의 절편이다.

상기 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(Promega, WI, USA)에 삽입하여 pMYO62 벡터를 제조하고, 디디옥시뉴클레오티드 연쇄 종결방법(dideoxynucleotide chain termination method)으로 분석하여 hGM-CSF임을 확인하였다.

pMYO62 벡터상의 hGM-CSF cDNA를 제한효소 BamHI/KpnI으로 절단하여 동일 제한효소를 포함하는 pMY27발현벡터에 삽입하여 pMYO64 벡터를 제조하였다. 즉, hGM-CSF cDNA는 담배 모자이크 바이러스의 CaMV35S 프로모터와 전사종결시그널 사이에 클로닝되어진 것이다.

[실시예 2] 재조합 식물세포 제조

담배(Nicotiana tabacum L. cv Havana SR)에 hGM-CSF를 도입시키기 위하여 아그로박테리움에 의한 형질전환방법(Agrobacterium mediated transformation method)을 사용하였다.(An, G., Watson, B.D. and Chiang, C.C. (1986) Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system. Plant Physiol. 81, 301-305) pMYO64은 헬퍼로 pRK2013을 포함하는 E. coli HB101를 이용한 트리페렌탈 접합(riparental mating)으로 E. coli HB101에서 아그로박테리아 투메팍시엔스(A. tumefaciens) LBA4404로 이동시켰다.(Figurski, J.J. and Helinski, D.R. (1979) Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648-1652)

pMYO64 벡터는 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈(neomycin phosphotransferase II; NPTII) 유전자를 포함하고 있으므로, pMYO64를 포함하는 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404는 카나마이신(kanamycin)에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서, 300 g/ml의 카나마이신을 포함하는 배지(MS 배지(Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15, 473-497), 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산, 1 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 300 mg/L의 카나마이신, 및 선별마크인 셀포탁신(cefotaxin) 500 mg/L)에서 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404를 배양하였다.

배양한 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404를 표면멸균된 어린 담배잎 디스크에 접종하였다. 외식편은 배지(MS배지, 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산, 1 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 300 mg/L의 카나마이신, 및 선별마크인 셀포탁신(cefotaxin) 500 mg/L)에 이동시키고 2 내지 3주 후 신선한 배지로 옮겨주었으며, 25 ℃, 3,000 lux의 조건에서 배양하였다.

형성된 슈트(shoot)는 호르몬이 없는 MS 배지상에서 500 mg/ml의 셀포탁신과 300 mg/L의 카나마이신을 첨가하여 배양하여 뿌리 형성을 유도하였다. 뿌리가 형성되고 생육이 왕성한 8개체의 형질전환식물을 줄기의 길이가 8 cm 정도 생육되었을 때 화분에 이식하여 온실에서 원숙시켰다.

[실시예 3] 현탁배양

상기 실시예 2의 형질전환체의 현탁세포 유도를 위하여, 형질전환된 담배잎에서 캘러스를 유도하였고, 300 ml의 플라스크에서 현탁배양(1 mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.05 mg/L 키네틴 및 3 % 슈크로즈를 포함하는 50 mL의 MS 배지)을 실시하였다. 배양조건은 25 ℃, 110 rpm이다. 현탁세포의 성장이 이루어지면 대략 10일 간격으로 계대배양하면서 성장이 안정적으로 이루어지는 세포주를 확립하였다. 이후에는 7일 간격으로 계대배양하면서 성장실험 및 hGM-CSF 분비실험을 실시하였다.

성장호르몬(2 mg/l의 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.02 mg/L의 kinetin, 300 mg/L의 kanamycin, 3 %의 sucrose)을 포함하는 MS 배지는 pH 5.8로 적정하여 배양배지로 준비하였다. 250 ml의 플라스크에 50 ml의 배양배지를 넣은 후 7일 동안 배양한 배양액 10 ml을 접종하여 11일간 세포의 성장정도와 재조합 hGM-CSF 발현량을 측정하였다.

세포의 성장정도는 세포 생체중량(fresh cell weight, FCW), 세포 건조중량(dry cell weight, DCW)과 SCV(sedemented cell volume)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 생체중량은 Buchner funnel을 이용하여 배양액을 Whatman No.1 여과지로 거른 후 증류수로 수회 세포 후 다시 여과하여 얻은 세포를 측정한 중량이며, 세포 건조중량은 상기한 생체중량 측정과정을 거친 세포를 60 ℃의 건조오븐에 둔 다음, 시간에 따른 무게변화가 없을 때까지 건조시켜 측정한 중량이다.

또한 재조합 hGM-CSF 단백질의 정량은 하기의 방법으로 측정하였다. 현탁세포 배양액을 10,000 rpm로 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 상등액을 희석하여 ELISA분석(PharMingen, Inc., USA)으로 정량하였다. 이때 기준물질로 효모유래의 hGM-CSF(LG(주))를 사용하였다.

상기 실시예 2의 형질전환체를 현탁배양하였을 때 측정된 세포성장정도 및 재조합 hGM-CSF 단백질 발현량을 도 2에 그래프로 나타내었다. 형질전환체의 현탁배양에서 현탁세포의 생중량을 측정한 결과 배양 2일째까지 성장이 거의 일어나지가 않았고, 배양 8일까지 1 g/L에서 12 g/L로 성장하여 양호한 결과를 나타내었다.

또한 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량은 배양 4일후 180 ㎍/L로 최고치를 나타내었고, 5일 이후에는 재조합 hGM-CSF 단백질이 분해되는 양상을 나타내었다. 상기 분해되는 양상의 원인은 알 수 없으나 프로테이즈에 의한 것으로 추정되었다.

(2) 형질전환체에 대한 슈크로즈 영향

250 ml 플라스크에 배양배지 50 ml을 분주하고, 현탁세포를 필터로 걸러 20 g, 50 g, 80 g 및 110 g 씩 각각 배양배지에 접종하였다. 또한 배양배지에 슈크로즈를 30 g, 60 g, 90 g으로 첨가하여 형질전환체를 배양하였다. 배양 후 1일 간격으로 배양액내의 재조합 hGM-CSF 단백질량을 측정하였고, 도 3의 그래프로 나타내었다.

도 3은 배지내 슈크로즈의 농도에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질 발현량을 나타낸 것으로, (a)는 현탁세포 20 g을 배양하였을 때 슈크로즈의 영향을 도시한 것이고, (b)는 현탁세포 50 g을 배양하였을 때 슈크로즈의 영향을 도시한 것이고, (c)는 현탁세포 80 g을 배양하였을 때 슈크로즈의 영향을 도시한 것이고, (d)는 현탁세포 110 g을 배양하였을 때 슈크로즈의 영향을 도시한 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 접종한 현탁세포의 생중량(fresh cell weight) 20 g/L은 배양배지의 슈크로즈 농도에 관계없이 비슷한 수준의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였고, 배양후 7일째에 약 550-584 ㎍/L의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였다. 배양 7일 이후에는 재조합 단백질의 양이 감소하였으며, 배지내 슈크로즈의 농도가 높을수록 감소정도는 낮았다. 따라서, 고농도의 당이 hGM-CSF의 안정성에 영향을 미치는 것으로 판단되었다. 또한 접종시 배양액과 세포를 함께 접종하는 것보다 세포만 수거하여 접종하는 것이 hGM-CSF의 생산량을 높이는 요인으로 작용하여 최대 발현기간이 이틀정도 지연되었지만 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량은 3배 정도 증가하였다.

세포접종농도를 증가시키면 hGM-CSF의 생산량이 최대치에 도달하는 기간이 단축되는 효과가 있으며 재조합 단백질의 생산량에는 차이가 없을 것으로 예상하였다. 그러나 세포접종농도가 50 g/L이고, 슈크로즈의 농도가 90 g/L일 때, 배양 7일째에 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량이 649 ㎍/L로 가장 높은 값을 나타내었지만, 30 g/L의 당을 사용할 때에는 배양 5일에서 7일까지 약 310 ㎍/L을 생산하여 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량이 절반으로 감소하였다. 이것은 세포접종농도의 증가에 따른 배양배지중의 슈크로즈 고갈로 인하여, hGM-CSF의 생산량이 계속 증가하지 않은 것으로 생각되어진다.

즉, 당의 농도가 30 g/L의 경우 세포접종농도를 80 g(도 3의 c), 110 g(도 3의 d)로 더욱 증가시키면 재조합 hGM-CSF단백질의 생산량이 최대치로 도달하는 시간은 5일에서 3일로 더욱 빨라지고, 발현량은 270, 187 ㎍/L으로 각각 감소하는 경향을 나타내었다. 슈크로즈의 농도를 60 g/L로 하였을 때에도 세포접종농도 20 g/L이나 세포접종농도 50 g/L에서, 별 차이가 없었으나, 세포접종농도를 80 g, 110 g으로 올렸을 때에는 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량이 469 ㎍/L로 낮아졌다. 슈크로즈의 농도를 90 g/L로 충분하게 사용하였을 때에는 세포접종농도에 따라 배양 7일째에 580, 649, 638, 720 ㎍/L으로 증가하였다. 하지만 낮은 슈크로즈의 농도에서는 세포의 초기 접종농도를 증가시키면 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산이 오히려 감소하였다. 이것은 세포의 초기 접종농도가 높아지면 슈크로즈의 소비가 빨라지고, 또한 세포의 농도가 높아지면 그자체로 점도의 증가로 인하여 재조합 hGM-CSF 단백질의 분비가 원활해지지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 외래 단백질의 분비를 촉진하기 위해서는 배양액의 삼투압을 증가시키고 배양액의 점도는 낮추어야 함을 알 수 있었다.

[실시예 4] 만니톨을 이용한 재조합 단백질의 발현량 확인

삼투압에 의한 스트레스를 유발하여 최적의 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산조건을 확립하였다. 당농도 증가로 인하여 세포내 삼투압을 증가시킬 경우 이화생성물 억제(catabolite repression)로 세포증식이 억제될 수 있으므로 식물세포가 이용하지 않는 만니톨(mannitol)을 삼투압 증진제로 사용하였다.

MS배지에 30 g/L 슈크로즈와 30, 60, 90 g/L의 만니톨을 각각 첨가한 다음 각 배지에 형질전환체를 접종하여 배양하였다. 대조군으로 배지에 30 g/l의 슈크로즈를 단독으로만 처리하여 배양하였다.

(1) 세포성장

배양 시간별 배양액을 수득하여 세포 생중량(wet cell weight; WCW) 및 건조중량(dry cell weight; DCW)을 측정하였고, 생중량을 건조중량으로 나누어 세포크기를 환산하였다.

도 4는 본 발명의 형질전환체를 만니톨을 포함하는 조건에서 배양하였을 때 측정된 세포건조중량 및 세포크기를 나타낸 그래프이다. ●은 만니톨 무첨가구이고, ■은 30 g/L 만니톨을 첨가한 것이고, ▲은 60 g/L 만니톨을 첨가한 것이고, ○은 90 g/L 만니톨을 첨가한 것이고, a는 세포건조중량이고, b는 세포크기를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 만니톨 무첨가구는 배양 12일째에 건조중량 475 g/L로 최대의 성장을 나타난 반면, 만니톨 첨가구는 세포성장이 지연됨을 확인할 수 있었다. 또한 만니톨의 조건하에서 식물세포의 세포성장은 감소되어 고농도의 세포배양이 가능할 것이다.

(2) 총단백질 생산량

세포외로 분비된 총 단백질의 양을 브래드포드 분석(bradford assay)하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5의 (a)는 총 단백질의 생산량을 나타낸 그래프로, 총 단백질의 양이 세포의 성장과 비슷한 양상을 나타내었고, 도 5의 (b)는 단위세포당 분비되는 총단백질의 양을 나타낸 그래프이다. ●은 만니톨 무첨가구이고, ■은 30 g/L 만니톨을 첨가한 것이고, ▲은 60 g/L 만니톨을 첨가한 것이고, ○은 90 g/L 만니톨을 첨가한 것이다.

만니톨 0 내지 90 g/L를 첨가함에 따라 총단백질 생산량은 125에서 87.2 mg/L로 감소하였지만 만니톨 90 g/L를 사용하였을 때 세포 1g 당 생산되는 총단백질량은 증가하였다. 이는 대조군에 비하여 2배 정도 높게 나타났다.

따라서, 삼투압 조절제인 만니톨은 식물세포의 현탁배양시 세포외로 분비되는 총단백질의 양을 증대시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

(3) 재조합 hGM-CSF 생산량

상기 총 단백질 중 재조합 hGM-CSF 단백질의 함량을 측정하였다.

배양액을 5분간 10,000 rpm으로 원심분리한 다음 상층액을 수득하여 ELISA 분석(PharMingen, Inc.)을 실시하였다.

도 6은 본 발명의 형질전환체의 삼투압 스트레스조건에서 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 측정한 것으로, (a)는 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 그래프로 나타낸 것이고, (b)는 총단백질에 포함된 재조합 hGM-CSF 단백질의 함량을 나타낸 것이다.

재조합 hGM-CSF 단백질은 만니톨을 첨가한 경우 다량 검출되었으며, 90 g/L의 만니톨을 사용하였을 때 배양 5일에 최대 980.1 ug/L의 hGM-CSF 단백질을 확인할 수 있었다. 이는 대조구에 비하여 2.9배 증가한 수치이다. 또한 총단백질내 재조합 hGM-CSF 단백질의 함량을 확인한 결과 90 g/L의 만니톨을 첨가하고, 5일간 배양하였을 때 최대로 나타났으며 이는 대조구의 4배 정도로 나타났다.

따라서 현탁배양시 만니톨을 첨가는 세포중량당 총 단백질의 생산량 뿐만 아니라 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 증가시킨다.

[실시예 5] NaCl를 이용한 재조합 단백질 생산량 증가효과

NaCl을 50, 100, 150 mM로 배지에 첨가하여 실시예 2의 형질전환주를 현탁배양하였고, 세포증식 정도, 총단백질 생산량 및 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량을 측정하였다.

(1) 세포성장

도 7은 NaCl을 첨가하여 현탁배양하였을 때 세포성장정도(a) 및 세포크기(b)를 측정한 그래프로, ●은 NaCl 무첨가구이고, ■은 50 mM NaCl를 첨가한 것이고, ▲은 100 mM의 NaCl를 첨가한 것이고, ○은 150 mM의 NaCl을 첨가한 것이다. NaCl는 세포성장을 억제하였으며 세포크기 성장 역시 대조구에 비하여 억제되었다.

(2) 총단백질 생산량

Nacl을 첨가하였을 때 총단백질의 생산량을 농도별로 측정하였다. 도 8에 도시한 그래프는 총단백질 생산량(8a) 및 세포 g 당 단백질 생산량(8b)를 나타낸 것이고, ●은 NaCl 무첨가구이고, ■은 50 mM NaCl를 첨가한 것이고, ▲은 100 mM의 NaCl를 첨가한 것이고, ○은 150 mM의 NaCl을 첨가한 것이다.

NaCl을 첨가한 현탁배양에서 총단백질의 생산량 및 세포 g당 단백질 생산량이 대조구에 비하여 증가하였고, NaCl 150 mM에서 5일간 배양하였을 때 세포 g당 단백질 생산량이 최대로 측정되었다. 이 최대치는 대조구와 비교하였을 때 4.8배 높은 것이다.

(3) 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량 측정

Nacl을 첨가하여 현탁배양한 다음 재조합 hGM-CSF 단백질 양을 측정하였다.

도 9에 도시한 바와 같이, NaCl의 농도에 따라 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량이 증가되었으며(도 9a), 특히 총단백질내의 재조합 hGM-CSF 단백질 함량 역시 증가하였다(도 9b).

150 mM의 NaCl을 첨가하여 5일간 배양하였을 때 최대 776.2 ug/L의 재조합 hGM-CSF 단백질이 생산되었고, 5일 이후 감소하는 것으로 나타났다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 단백질 생산 증강용 조성물은 식물세포를 현탁배양할 경우 단백질의 생산을 현저히 증가시킨다. 또한 상기 조성물을 이용하여 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 생물학적 활성이 높은 형태로 생산하는 시스템을 확립하므로써 저가의 비용으로 생물학적 활성이 높은 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 pMYO64 벡터의 지도이고,

도 2는 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈를 포함하는 배지에서 현탁배양하였을 때 측정된 세포성장정도 및 재조합 hGM-CSF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이고,

도 3은 본 발명의 형질전환체를 다양한 농도의 슈크로즈를 포함하는 배지에서 배양하였을 때 생산되는 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량을 나타낸 그래프이고,

도 4는 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 만니톨을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 형질전환체의 건조중량을 배양시간별로 측정한 그래프이고,

도 5는 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 만니톨을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 생산되는 총 단백질 양을 나타낸 그래프이고,

도 6은 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 만니톨을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량을 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 NaCl을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 형질전환체의 건조중량을 배양시간별로 측정한 그래프이고,

도 8은 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 NaCl을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 생산되는 총 단백질 양을 나타낸 그래프이고,

도 9는 본 발명의 형질전환체를 슈크로즈 및 NaCl을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량을 나타낸 그래프이다.

<110> LEE, Jae Hwa KWON, Tae-Ho YANG, Moon-Sik <120> OVEREXPRESSION METHOD OF RECOMBINANT PROTEIN USING PLANT CELL <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 1 gcggatccgt tctctggagg atgt 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 2 ttggtaccat ctggccggtc tca 23

Claims

(a) 1 내지 15 중량%의 만니톨, 10 내지 200 mM의 NaCl 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 생산 증강용 조성물; 및

(b) MS(Murashige and Skoog) 배지;

를 포함하는 재조합 단백질 생산 증강용 배지.
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(a) 1 내지 15 중량%의 만니톨, 10 내지 200 mM 의 NaCl 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 생산 증강용 조성물을 MS(Murashige and Skoog) 배지에 첨가하고;

(b) 상기 배지에 식물 세포를 접종하여 현탁배양하고;

(c) 현탁배양한 배양물로부터 재조합 단백질을 분리하는

것을 포함하는 재조합 단백질 생산방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물 현탁세포는 니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 0670BP)인 재조합 단백질 생산방법.