KR20030014976A - 식물세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법 - Google Patents

식물세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 형질전환체를 현탁배양할 때 고분자 화합물인 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리비닐피롤리딘을 첨가함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 현탁세포(형질전환체 니코티아나 타바쿰 pMYO64 (기탁번호 : KCTC 0670BP)를 고분자화합물을 포함하는 MS 배지상에서 배양하여 다량의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하는 방법을 확립하여, 저가의 비용으로 생물학적 활성이 높은 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

식물세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법{OVEREXPRESSION METHOD OF RECOMBINANT PROTEIN USING PLANT CELL}
본 발명은 식물세포를 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물세포를 현탁배양할 때 고분자 화합물인 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine)을 첨가함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor; 이하 ' hGM-CSF' 라 함)는 과식구 대식세포 원시세포를 과식구, 대식세포, 백혈구로의 발생을 촉진시키는 인자이다.(Metcalf, D., 1985.Science229, 16-22) 특히 hGM-CSF은 중성구결핍(neutropenia)과 무형성빈혈(aplastic anaemia)의 치료에 의학적 사용이 증가되고 있고 호중성구백혈구(neutrophil)의 분비를 촉진시켜 골수이식과 관련된 감염위험을 크게 감소시킬 수 있다.(Dale, D. C. Liles, W. C., Summer, W. R., 1995.Journal of Infectious Diseases, 172, 1061-1075)
과거 15년 내지 20년동안 미생물 및 동물세포 배양에 집중적인 연구가 수행되었으나, 현재에는 식물세포를 단백질의 대량으로 생산할 수 있는 발현시스템으로 연구되고 있다. 식물세포 배양은 동물세포 및 미생물과 비교하였을 때 여러 가지 장점을 가지고 있다. 이에 식물발현시스템은 미생물발현시스템이 가지고 있는 해독 후 수식과정의 단점을 극복하고, 생산된 재조합 단백질의 생물학적 활성을 천연형과 유사하게 유지시킨다. 또한 식물세포의 배지나 배양조건이 동물세포에 비해 간단하고 저렴하며, 동물 바이러스나 독소(toxin)등의 감염 위험이 적은 장점이 있다(Doran, P. M. (2000), Foreign protein production in plant tissue cultures,Current Opinion in Biotechnology, 11, 199-204).
최근 식물세포배양을 이용하여 외래 단백질을 발현하고자 하는 연구가 많이 수행되고 있으며, 모델 시스템으로는 β-glucuronidase(Kurata, H., T. Takemura, S. Furusaki, and C. I. Kado, (1998)J Ferment Bioeng, 86, 317-323), 항체 (LaCount, W., G. An, J. M. Lee, (1997) Biotechnology Letters. 19, 93-96), 인터루킨(Magnuson, N. S., P. M. Linzmaier, R. Reeves, G. An, K. HayGlasee, and J. M. Lee, (1998)Protein Expre Purif, 13, 45-52), ricin(Sehnki, P. C. and R. J. Ferl, (1999)Protein Expr Purif, 15, 188-195), α1-antitrypsin(Terashima, M., Y. Murai, M. Kawamura, S. Nakanishi, T. Stoltz, L. Chen, W. Drohan, R. L. Rodriguez, and S. Katoh, (1999)Appl Microbiol Biotechnol, 52, 516-523) 등이 있다.
식물발현시스템의 숙주세포로는 형질전환이 용이하고 배양이 비교적 쉬우며 성장속도가 빠른 담배현탁세포가 많이 이용하고 있으며, 캘러스에서 유기된 현탁세포 또는 뿌리털을 유기하여 사용하고 있다.(Wongsamuth, R., P. M. Doran, (1997)Biotechnol Bioeng, 54, 401-415) 또한 재조합 단백질 발현에 관여하는 프로모터에 따라 다양한 식물종이 숙주세포로 이용될 수 있으며, 그 한예로 슈크로즈의 고갈을 신호로 하여 재조합 단백질 발현을 유도하는 프로모터를 이용하기 위한 벼세포배양이 있다.(Terashima, M., Y. Murai, M. Kawamura, S. Nakanishi, T. Stoltz, L. Chen, W. Drohan, R. L. Rodriguez, and S. Katoh, (1999)Appl Microbiol Biotechnol, 52, 516-523)
또한 식물발현시스템은 사용하는 배지의 조성물이 간단한 이온과 호르몬, 당으로 이루어져 있기 때문에 생산된 재조합 단백질을 배지로 분비 시키면 분리정제가 매우 간단하다. 그래서 식물발현시스템의 대부분이 재조합 단백질의 효율적인 분비에 집중되고 있으며, 재조합 단백질의 세포외 분비시 안정성을 증대시키기 위한 방안이 연구중에 있다.
따라서, 본 발명은 식물발현시스템에서 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식물발현시스템에서 세포외로 발현된 재조합 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식물발현시스템에서 세포외로 발현된 재조합 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 hGM-CSF 유전자를 발현하는 재조합벡터의 제조모식도이고,
도 2는 형질전환체를 현탁배양하였을 때 측정된 세포성장정도 및 재조합 hGM-CSF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이고,
도 3은 PEG 첨가에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 나타낸 그래프이고,
도 4는 PVP 첨가에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 나타낸 그래프이고,
도 5는 젤라틴 첨가에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 형질전환체를 2 %의 젤라틴을 포함하는 배지에서 현탁배양하였을 때 세포성장정도 및 재조합 단백질 발현량을 나타낸 그래프이고,
도 7은 형질전환체 배양배지에 젤라틴을 첨가하는 시기에 따른 단백질 생산량을 나타낸 그래프이고,
도 8은 배지내 젤라틴(2 %), PVP(0.05 %) 또는 PEG(2 %)를 넣어 배양하면서 배양액상의 재조합 hGM-CSF 단백질의 안정성변화를 나타낸 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 형질전환체를 현탁배양하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG), 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine: PVP)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 고분자화합물을 배양배지에 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다. 바람직하게는 형질전환체 니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 670BP)를 0.5 % 내지 5 중량%의 젤라틴을 포함하는 배지상에서 12일간 현탁배양하여 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 생산하는 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 식물세포 현탁배양에서 재조합 단백질의 생산효율을 증가시킬 수 있는 방법을 연구하였고, 고분자를 배양배지내에 첨가함으로써 재조합 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
식물발현시스템에서 발현되는 재조합 단백질은 통상적으로 세포외로 분비되도록 고안되어있다. 따라서 세포외로 분비된 재조합 단백질은 배양액에 장기간 노출된 후 정제, 분리되어진다. 재조합 단백질의 생산효율은 세포내 외래 유전자의 발현기작, 발현된 재조합 단백질의 분비효율, 또는 세포외 재조합 단백질의 안정성에 의하여 결정된다.
본 발명에서는 세포외 재조합 단백질의 안정제로 고분자화합물을 제공한다. 고분자화합물은 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG) 또는 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine: PVP)이고, 가장 바람직하게는 젤라틴이다.
상기 고분자화합물을 단독 또는 혼합물 형태로 식물세포 배양배지에 포함시켜 형질전환체 식물세포를 배양한다. 고분자화합물의 혼합비 또는 식물세포 배양방법은 고분자화합물에 따라 최적의 조건으로 실시하는 것이 바람직하다. 또한 고분자화합물을 배양초기에 첨가하여 현탁배양할 수 있으며, 식물세포배양 후 6일 이내에 고분자화합물을 첨가하여 현탁배양할 수 있다.
더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%의 고분자화합물을 식물세포 배양배지에 첨가하고, 형질전환체 식물세포를 3 내지 6 일간 현탁배양하는 것이 좋다. 이때 배양배지, 배양온도, 배양방법(교반) 등은 현탁배양하는 식물세포 종류에 맞게 조절한다. 가장 바람직하게는 1 내지 3 중량%의 젤라틴, 1 내지 2 중량%의 PEG, 또는 0.5 내지 0.75 g/L의 PVP를 배지에 첨가하는 것이다.
고분자화합물의 재조합 단백질 안정화효과는 형질전환체 담배세포를 이용하여 확인하였다. 상기 형질전환체 담배세포는 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor; 이하 ' hGM-CSF' 라 함)를 발현하는 것으로, 기존에 제조되어진 형질전환체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 0670BP)이다.
니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 0670BP)는 MS 배양배지에 2 중량%의 젤라틴을 첨가하여 5 일간 배양하였을 때 최대 783 ㎍/L의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였다. 또한 MS 배양배지에 2 중량%의 PEG를 첨가하여 4일간 배양하였을 때 최대 239 ㎍/l의 재조합 hGM-CSF 단백질을, MS 배양배지에 0.5 g/l의 PVP를 첨가하여 4일간 배양하였을 때 최대 237㎍/l의 재조합 hGM-CSF 단백질을 생산하였다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 생산된 재조합 단백질을 제공한다. 상기 재조합 단백질은 통상의 현탁세포에서 발현된 재조합 단백질 정제방법으로 정제하여 수득할 수 있으며, 재조합 단백질의 종류에 따라 정제방법을 달리하여 수득할수 있다. 바람직한 정제방법은 컬럼 크로마토그래피이다.
따라서, 본 발명의 고분자화합물을 이용하여 식물세포에서 발현되는 재조합 단백질을 안정하게 유지시켜, 대량의 재조합 단백질을 쉽게 수득할 수 있으며, 재조합 단백질의 안정성을 유지시키는 물질을 이용하므로 형질전환체의 종류에 구애없이 적용할 수 있다. 또한 분리된 재조합 단백질은 배양 중 안정성이 유지되었기에 생물학적 활성이 유지되어있어, 의약적인 용도로 사용가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 재조합 벡터 제조
hGM-CSF 유전자를 발현하는 재조합벡터의 제조모식도는 도 1에 간략하게 도시하였다. hGM-CSF cDNA는 PHA(phytohemagglutinin)로부터 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 RT-PCR하여 합성하였다. PCR은 94 ℃, 3분간 전변성단계(pre-denaturation) 1회, 94 ℃ 1분간(denaturation), 55 ℃ 1분간(annealing) 및 72 ℃ 3분간(extension)으로 이루어진 반응을 30회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 hGM-CSF 유전자의 ORF(open reading frame, Lee, F., Yokota, T., Otsuka, T., Gemmell, L., Larson, N., Lhu, J., Arai, K. and Rennick, D. (1985)Pro. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4360-4364)을 포함하는 471 bp의 절편이다.
상기 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(Promega, WI, USA)에 삽입하여 pMYO62 벡터를 제조하고, 디디옥시뉴클레오티드 연쇄 종결방법(dideoxynucleotide chaintermination method)으로 분석하여 hGM-CSF임을 확인하였다.
pMYO62 벡터상의 hGM-CSF cDNA를 제한효소BamHI/KpnI으로 절단하여 동일 제한효소를 포함하는 pMY27발현벡터에 삽입하여 pMYO64 벡터를 제조하였다. 즉, hGM-CSF cDNA는 담배 모자이크 바이러스의 CaMV35S 프로모터와 전사종결시그널 사이에 클로닝되어진 것이다.
[실시예 2] 재조합 식물세포 제조
담배(Nicotiana tabacum L. cv Havana SR)에 hGM-CSF를 도입시키기 위하여 아그로박테리움에 의한 형질전환방법(Agrobacterium mediated transformation method)을 사용하였다.(An, G., Watson, B.D. and Chiang, C.C. (1986) Transformation of tobacco, tomato, potato, andArabidopsis thalianausing a binary Ti vector system. Plant Physiol. 81, 301-305) pMYO64은 헬퍼로 pRK2013을 포함하는E. coliHB101를 이용한 트리페렌탈 접합(riparental mating)으로E. coliHB101에서 아그로박테리아 투메팍시엔스(A. tumefaciens) LBA4404로 이동시켰다.(Figurski, J.J. and Helinski, D.R. (1979) Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648-1652)
pMYO64 벡터는 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈(neomycin phosphotransferase II; NPTII) 유전자를 포함하고 있으므로, pMYO64를 포함하는 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404는 카나마이신(kanamycin)에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서, 300 g/ml의 카나마이신을 포함하는 배지(MS 배지(Murashige,T. and Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15, 473-497), 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산, 1 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 300 mg/L의 카나마이신, 및 선별마크인 셀포탁신(cefotaxin) 500 mg/L)에서 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404를 배양하였다.
배양한 아그로박테리아 투메팍시엔스 LBA4404를 표면멸균된 어린 담배잎 디스크에 접종하였다. 외식편은 배지(MS배지, 0.1 mg/L의 α-나프탈렌 아세트산, 1 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 300 mg/L의 카나마이신, 및 선별마크인 셀포탁신(cefotaxin) 500 mg/L)에 이동시키고 2 내지 3주 후 신선한 배지로 옮겨주었으며, 25 ℃, 3,000 lux의 조건에서 배양하였다.
형성된 슈트(shoot)는 호르몬이 없는 MS 배지상에서 500 mg/ml의 셀포탁신과 300 mg/L의 카나마이신을 첨가하여 배양하여 뿌리 형성을 유도하였다. 뿌리가 형성되고 생육이 왕성한 8개체의 형질전환식물을 줄기의 길이가 8 cm 정도 생육되었을 때 화분에 이식하여 온실에서 원숙시켰다.
[실시예 3] 현탁배양
상기 실시예 2의 형질전환체의 현탁세포 유도를 위하여, 형질전환된 담배잎에서 캘러스를 유도하였고, 250 ml의 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. 현탁세포의 성장이 이루어지면 대략 10일 간격으로 계대배양하면서 성장이 안정적으로 이루어지는 세포주를 확립하였다. 이후에는 7일 간격으로 계대배양하면서 성장실험 및 hGM-CSF 분비실험을 실시하였다.
성장호르몬(2 mg/l의 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 0.02 mg/L의kinetin, 100 mg/L의 kanamycin, 3 %의 sucrose)을 포함하는 MS 배지는 pH 5.8로 적정하여 배양배지로 준비하였다. 250 ml의 플라스크에 50 ml의 배양배지를 넣은 후 7일 동안 배양한 배양액 10 ml을 접종하여 11일간 세포의 성장정도와 재조합 hGM-CSF 발현량을 측정하였다.
세포의 성장정도는 세포 생체중량(fresh cell weight, FCW), 세포 건조중량(dry cell weight, DCW)과 SCV(sedemented cell volume)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 생체중량은 Buchner funnel을 이용하여 배양액을 여과지(Whatman No.1)로 거른 후 증류수로 수회 세포 후 다시 여과하여 얻은 세포를 측정한 중량이며, 세포 건조중량은 상기한 생체중량 측정과정을 거친 세포를 60 ℃의 건조오븐에 둔 다음, 시간에 따른 무게변화가 없을 때까지 건조시켜 측정한 중량이다.
또한 재조합 hGM-CSF 단백질의 정량은 하기의 방법으로 측정하였다. 현탁세포 배양액을 10,000 rpm로 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 상등액을 희석하여 ELISA분석(PharMingen, Inc., USA)으로 정량하였다. 이때 기준물질로 효모유래의 hGM-CSF(LG(주))를 사용하였다.
상기 실시예 2의 식물세포를 현탁배양하였을 때 측정된 세포성장정도 및 재조합 hGM-CSF 단백질 발현량을 도 2에 그래프로 나타내었다. (a)는 세포생중량(●) 및 건중량(○)을 나타낸 것이고, (b)는 생산된 재조합 hGM-CSF 단백질 및 세포크기를 나타낸 것이다. 그 결과 현탁세포는 배양 2일째까지 성장이 거의 일어나지가 않았고, 배양 8일까지 1 g/L에서 12 g/L로 성장하여 양호한 결과를 나타내었다. 또한 재조합 hGM-CSF 단백질은 배양 4일에 최고 180 ㎍/l를 생산하였고, 5일 이후에는 분해되는 양상을 나타내었으며, 세포크기지수(생중량/건중량)는 배양 7일째에 최대 33을 나타내었다.
[실시예 4]
담배세포배양을 이용하여 hGM-CSF를 생산할 때에 안정제로 효과적인 고분자화합물을 찾기 위해서 폴리에티렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG, MW 3,350)을 1 %에서 5 %까지, 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine : PVP, MW 360,000)을 1.5 g/L까지, 또는 젤라틴(gelatin, type B, bovine serum albumin 유래)을 5 %까지 첨가하여 재조합 hGM-CSF 단백질 생산량을 확인하였다. 단백질 안정제를 추가하는 것 외의 배양조건은 실시예 3의 현탁배양의 조건과 동일하게 실시한다.
도 3은 PEG 첨가에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 도시한 것이고, 도 4는 PVP 첨가에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 도시한 것이다. 또한 도 5는 본 발명의 형질전환체를 현탁배양시 배양배지내 젤라틴을 첨가하여 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 확인한 것으로, 젤라틴 첨가량(0 %, 0.5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 5 %)에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 생산량을 나타내었다. 도 3, 도 4, 및 도 5에 나타난 바와 같이, 0.2 %의 PEG, 0.5 g/L PVP, 또는 5 % 젤라틴을 첨가하였을 때 재조합단백질의 생산령을 증가시켰다. 또한 가장 효과적인 5 %의 젤라틴을 첨가한 경우 783 ㎍/L의 재조합 hGM-CSF 단백질은 생산하였으며, 무첨가군(대조군)에 비하여 4.6배 증가되었다.
또한, 배양배지에 젤라틴을 첨가하였을 때 배양 5일 까지는 성장에 큰 영향을 미치지는 않았지만, 이후에는 젤라틴의 농도가 증가될수록 배양액이 갈변화되면서 세포의 성장이 많이 둔화되었다.
도 6은 본 발명의 형질전환체를 2 %의 젤라틴을 포함하는 배지에서 현탁배양하였을 때 세포성장정도 및 재조합 단백질 발현량을 나타낸 것이다. (a)는 젤라틴 무첨가군(대조군)과 2 % 젤라틴 첨가군의 세포생중량과 건조중량을 나타낸 것이고, (b)는 2 % 젤라틴 첨가군의 재조합 단백질의 생산량 및 세포크기변호를 나타낸 것이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 2 %의 젤라틴 첨가군에서 배양하였을 때 배양 9일에 대조군에 비하여 세포생중량은 40 %, 건조중량은 70 %감소된 것으로 나타났다. 또한 세포크기는 배양 5일째까지 대조군과 비슷한 양상을 나타내지만 그 이후에 급격히 감소하였다. 이때에 생산된 재조합 hGM-CSF 단백질 역시 급격히 감소하였다. 이는 생산된 재조합 hGM-CSF 단백질이 급격하게 분해되었음을 의미하는 것으로, 세포가 파괴되어 단백질의 안정성에 영향을 미치는 물질이나 효소가 배양액중으로 나와 재조합 hGM-CSF 단백질을 분해시킨 것으로 생각된다. 따라서, 배양배지내 젤라틴의 첨가는 재조합 단백질의 생산을 증가시키는 효과를 나타내지만 배양 5일 후에는 세포 성장 및 재조합 단백질 생산조건에 악영향을 미침을 알 수 있었다.
[실시예 5]
젤라틴을 첨가하는 시기에 따른 단백질 안정화 효과를 실시예 4와 동일한 방법으로 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 1 %의 젤라틴 첨가는 세포가 한창 성장하면서 hGM-CSF의 생산이 왕성한 4일째에 첨가하는 것이 재조합 단백질 발현을 가장 증가시켰다. 이때 첨가 이틀 후에 hGM-CSF의 농도가 495 ㎍/L였으며, 초기배양배지에 1 % 젤라틴을 첨가한 도 5에 비하여 증가된 재조합 단백질 생산량을 나타내었다. 그러나, 배양배지내 젤라틴 첨가시기를 길게 하여도 배양시간에 따른 재조합 hGM-CSF 단백질의 안정화를 유지시키지 못하였다.
[실시예 6]
hGM-CSF가 함유된 배양액(7일간 배양한것)만을 수거하고, 여기에 hGM-CSF를 생산하지 못하는 담배세포를 1 g/l 넣어주고. 배지내 젤라틴(2 %), PVP(0.05 %) 또는 PEG(2 %)를 넣어 배양하면서 배양액상의 재조합 hGM-CSF 단백질의 감소정도를 관찰하여 도 8에 나타내었다. 2 % 젤라틴(●), 0.05 % PVP(○) 또는 2 % PEG(■)를 포함하는 배지상에서 재조합 hGM-CSF 단백질양 변화를 무첨가한 대조군과 비교한 결과, 대조군에 비하여PVP, PEG, 젤라틴은 재조합 단백질을 안정화시키는 효과를 나타내었으며, 젤라틴이 가장 우수한 단백질 안정화효과를 나타내었다. 또한 젤라틴을 2 %로 첨가한 경우, 90 %이상의 hGM-CSF가 분해되지 않고 유지되었으나, 배양 5일 후에는 급격히 파괴되었다.
따라서, 젤라틴은 hGM-CSF를 안정화시키는 효과가 있음을 확인하였고, 하지만 배양말기에 세포에 좋지 않은 효과를 나타낸다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 식물발현시스템에서 재조합 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 물질인 젤라틴을 이용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 체계를 구축하였다. 또한 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 생물학적 활성이 높은 형태로 생산하는 시스템을 확립하였고, 이로 인하여 저가의 비용으로 생물학적 활성이 높은 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (5)

  1. 형질전환체를 현탁배양하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG), 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine: PVP)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 고분자화합물을 배양배지에 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환체는 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 발현하는 재조합 단백질의 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서, 배양배지에 고분자화합물을 0.5 내지 5 중량%로 첨가하는 재조합 단백질의 생산방법.
  4. 제 1항에 있어서, 고분자화합물을 현탁배양 후 6일이내에 배양배지에 첨가하는 재조합 단백질의 생산방법.
  5. 제 1항에 있어서, 니코티아나 타바쿰 pMYO64(KCTC 0670BP)를 0.5 내지 5 %의 젤라틴을 포함하는 배지상에서 현탁배양하여 사람 과식구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 생산하는 재조합 단백질 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100500324B1 (ko) * 2002-03-06 2005-07-11 양문식 식물세포배양에서 삼투압을 이용한 재조합 단백질의 대량생산방법
KR101228026B1 (ko) * 2004-02-24 2013-01-30 프로탈릭스 리미티드 세포/조직 배양 장치, 시스템 및 방법
CN110205338A (zh) * 2019-06-24 2019-09-06 王跃驹 植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用

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