KR101228026B1 - 세포/조직 배양 장치, 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

생물반응기 및 발효기를 포함하는, 세포 및/또는 세포조직을 무균적으로 배양 및 수확하는 장치, 시스템 및 방법. 상기 장치는 바람직하게는 일회용이지만, 그래도 폐기 전에 복수의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 대규모 세포 및 조직 생산에 사용될 수 있는 상기와 같은 장치의 대열 (battery)에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 식물 세포 배양에 사용하기에 적합하다.

일회용 생물반응기, 식물 세포, 연속 사용, 재조합 단백질 발현

Description

세포/조직 배양 장치, 시스템 및 방법 {CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD}

본 발명은 세포/조직 배양을 위한 장치, 시스템 및 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 세포 배양을 위한 그러한 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다.

세포 및 조직 배양 기술은 수년간 이용 가능했고 당해 분야에 숙지되어 있는 기술이다. 그러한 배양 기술을 경제적으로 사용하는 데 대한 전망은, 약학적으로 활성인 화합물, 화장품에 사용될 각종 물질, 호르몬, 효소, 단백질, 항원, 식품 첨가물 및 천연 살충제와 같은 이차 대사산물을 배양된 세포 또는 조직의 수확물로부터 추출하는 것이다. 잠재적으로 소득에 유리한 이러한 전망은, 그럼에도 불구하고 느리게 성장하는 식물 및 동물 세포 배양을 사용하는 공업적 규모의 생물반응기 (bioreactor)로는 효과적으로 개발되지 못했는데, 그 이유는 자본 비용이 많이 들기 때문이다.

상기와 같은 물질의 생산에 사용되는 공업적 규모의 세포 및/또는 조직 배양의 생산을 위한 배경기술은 현재 유리 생물반응기 및 스테인리스 스틸 생물반응기에 의거하는데, 이들은 고가의 자본 항목들이다. 또한, 이러한 유형의, 공업용 생 물반응기는 고가의 복잡한 무균 밀폐를 통해 전력이 공급되는 임펠러 (impeller)와 같은 복잡하고 값비싼 혼합 기술을 포함하고; 일부 고가의 발효기는 복수의 부품이 공기 펌프로 이송되는 구조물을 포함한다. 이러한 생물반응기를 성공적으로 조작하는 데에는 종종 폭기 (aeration) 기술을 이용해야 할 필요가 있는데, 이 기술은 계속적으로 개선되어야 하는 것이다. 또한, 상기와 같은 생물반응기는 적시에 요구되는 최대 용적량에 따라 크기가 맞추어진다. 따라서 파일럿 공정 발효기로부터 대규모 발효기로 규모를 확장할 때나, 기존의 생물반응기의 용량을 초과하여 생산량을 증가시킬 필요가 생길 때 문제가 발생한다. 대용량 생물반응기에 대한 현재의 대안, 즉 복수의 소형 유리 또는 스테인리스 스틸 생물반응기를 마련하는 것은, 전체 용량을 증가시키거나 감소시키는 데 얼마간의 융통성을 제공하면서 총 용적량이 요구량과 일치하도록 하지만, 그래도 단일의 대형 생물반응기를 마련하는 것보다는 훨씬 더 비싸다. 더욱이, 대부분의 유리 및 스테인리스 스틸 생물반응기에 수반되는 작동비용 또한, 낮은 수율과 함께 매번의 배양 사이클 후에 생물반응기들을 살균해야 할 필요성으로 인해 비용이 많이 든다. 따라서 상기와 같은 생물반응기에서 성장시킨 세포 또는 조직으로부터 추출한 생성물은 고가이며, 기타 기술로 생산된 유사 생성물과는 현재 상업적으로 경쟁이 되지 않는다. 실제로, 한 일본 회사가 유일하게 상술한 스테인리스 스틸 생물반응기를 사용하는 세포/조직 배양 기술을 사용하는 것으로 알려져 있다. 이 회사는 일본에서 거의 독점적으로 사용되고 있는 화합물인 시코닌 (shikonin)을 생산한다.

공업적 규모 및 더 큰 규모의 생물반응기 장치들은 통상 영구적이거나 반영 구적인 구성요소이며, 대규모 세포/조직 배양 생산에 따른 상술한 문제점을 해결하기 위해 일회용 생물반응기 장치를 사용한다는 개념을 개시하거나 제안한 사례는 알려진 바 없다. 반면, 일회용 발효기 및 생물반응기 장치는 매우 작은 규모의 생산 용적, 예컨대 가정용 양조 (brewing) 및 실험실 작업용으로는 잘 알려져 있고, 또 여기에 집중되어 있다. 이들 생물반응기 장치는 일반적으로 세포/조직 산출물을 수확하기 위해 통상 절개되어 더 이상 쓸모가 없게 되는 일회용 봉지 (bag)를 포함한다. 그러한 공지의 일회용 생물반응기의 일례는 실험실 연구와 같은 소규모 용도를 위한 이스라엘의 Osmotec 사 (Agritech Israel, 제 1 권, 1997년 가을 호, 제 19 면)의 제품이다. 상기 생물반응기는 원추형 봉지를 포함하는데, 이 봉지에는 배지, 공기, 접종물 및 기타 선별적 첨가물이 도입될 수 있는 유입구가 있고, 상기 반응기의 용적은 약 1.5 리터 밖에 되지 않는다. 폭기 (aeration)는 매우 작은 공기방울을 유입시킴으로써 이루어지는데, 이는 많은 경우에 있어, 특히 식물 세포 배양의 경우에 세포에 손상을 초래한다. 특히, 상기 봉지는 단일 배양/수확 사이클을 위해서만 특정적으로 고안된 것이며, 봉지의 내용물은 봉지의 하부를 절단해서 꺼내게 된다. 따라서 이러한 봉지는 상술한 바와 같은, 배양물로부터 추출할 물질을 공업적 양으로 제공하는 문제에 대해 경제적인 해결책을 제시하지 못한다.

본원에서 사용되는 용어 "일회용 (disposable)"은 장치 (봉지, 생물반응기 등)가 사용 후에 손실이 거의 없이 폐기되도록 고안된 것임을 의미한다. 즉, 스테인리스 스틸 또는 유리로 이루어진 장치는 필연적으로 값비싼 장치이며, 이들 장치 의 작동자에게 미미한 손실을 끼치는 것은 아니다. 반면, 예를 들면 유연성 플라스틱과 같은 플라스틱으로 이루어진 장치는 비교적 저렴하고, 따라서 사용 후에 경제적 손실이 거의 없이 폐기될 수 있고, 또한 그렇게 폐기된다. 따라서 이러한 생물반응기 장치의 일회사용성 (disposability)은, 이들 물품의 사용, 보관의 용이함 및 기타 실제적 고려사항에 반해 차감되는 자본 비용도 적으므로, 일반적으로 사용자에게 경제적으로 불리함을 초래하지 않는다. 실제로, 이러한 장치에 연관된 소규모 생산 수준에서는 장치의 경제성이란, 상기와 같은 장치를 일회 이상의 배양/수확 사이클에 반복적으로 사용할 수 있도록 하기 위해 장치 또는 그의 작동의 복잡성을 증대시킬만한 동기가 전혀 없다는 것이다.

또한, 일회용 생물반응기 장치 외부의 살균 상태는 많은 경우 필요하지도 않고 가능하지도 않으므로, 수확가능한 산출물을 추출하기 위해 일단 개봉되면, 그 개구부를 살균 상태로 유지하는 것이 비용 효율적이지도 않고, 실용적이지도 않으며 가능하지도 않으므로, 봉지 및 내부에 남아 있을 수 있는 어떤 내용물이라도 오염되게 된다. 따라서 이러한 일회용 장치는 한 번의 배양 사이클 후에는 더 이상 사용할 수 없다.

그러므로 일회용 생물반응기 장치는 비공업적 규모의 사용자에 의해 통상 요구되는 양 및 생산 용적에 비해 비교적 저렴하며, 비전문적 인력에 의해서도 사용이 비교적 용이하다. 실제로, 일회용 생물반응기 장치의 주요 장점이기도 한 사용의 간편함 및 적은 경제적 비용이라는 측면은, 일회용 장치의 적은 생산 용적과도 관계가 있다. 따라서 선행기술의 일회용 생물반응기 장치는 구조면에서, 작업 면 에서 또는 규모의 경제성 면에서 공업적 규모의 생물반응기와 공통되는 부분이 매우 적으며, 실제로 공업적 규모의 생물반응기에 수반되는 문제점에 대해 해결책을 개시하거나 제시한다기보다는, 해결책 제공과는 거리가 있는 교시를 할 뿐이다.

실험용 또는 실험실 작업 차원에서는 몇 가지 발전이 있어왔으나 공업적 규모의 공정에는 아직 유용하지 못한 또 다른 분야가 식물 세포 배양이다. 약학적 용도를 위한 단백질은 통상 포유류 또는 세균류 발현 시스템에서 생산되어 왔다. 과거 10년 동안에 새로운 발현 시스템이 식물에서 개발되었다. 이 방법은 식물의 게놈에 단일 가닥의 DNA 분자 (T-DNA)를 삽입할 수 있는 박테리아인 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 활용한다. 단백질 및 펩타이드의 대량 생산을 위해 유전자를 도입하는 것이 비교적 간단하기 때문에, 이 방법은 대안적인 단백질 발현 시스템으로서 갈수록 각광받고 있다 (Ma, J.K.C., Drake, P.M.W., 및 Christou, P., (2003) Nature Reviews, 4, 794-805).

발명의 개요

배경기술은 일회용 장치를 사용하는, 식물 또는 동물 세포 배양을 통한 물질의 공업적 규모의 생산을 위한 장치, 시스템 또는 방법에 대해 교시하거나 제시하지 않는다. 배경기술은 또한 공업적 규모의 식물 세포 배양을 위한 그러한 장치, 시스템 또는 방법에 대해 교시하거나 제시하지도 않는다.

본 발명은, 생물반응기 및 발효기를 포함하는, 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양하고 수확하기 위한 장치, 시스템 및 방법을 제공함으로써, 이러한 배경기술의 단점을 극복한다. 상기 장치는 바람직하게는 일회용이나, 그럼에도 불구하고 상기 장치의 폐기 전에 복수의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 세포 및 조직의 대규모 생산을 위해 사용될 수 있는 상기와 같은 장치의 대열에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은, 예를 들면 가스 및/또는 액체의 적절한 흐름을 여전히 유지하면서, 및/또는 본 발명의 장치의 용기 내에 적절한 혼합 조건을 유지하면서, 낮은 전단력을 제공함으로써, 식물 세포 배양에 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 경우에 따라, 그리고 바람직하게, 세포는 현탁액 중에서 성장시키고, 폭기 (배지를 통한 공기의 흐름, 그러나 경우에 따라 임의의 기타 가스 또는 가스 조합물이 사용될 수도 있다)는 낮은 전단력이 존재하도록 수행한다. 낮은 전단력의 유지를 돕기 위해, 경우에 따라, 그리고 바람직하게, 세포 배양물을 담는 용기는 유연성 물질로 이루어지며, 또한 모양이 적어도 둥글고, 더욱 바람직하게는 모양이 원통형이고/이거나 구형이다. 이러한 특징은 또한 경우에 따라, 고른 흐름과 고른 전단력의 유지라는 상기 용기의 선별적이지만 바람직한 측면을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "식물 세포 배양"이란 구절은, 세포 또는 세포 내 발현되는 활성 성분의 대량 생산이 임상 (예를 들면, 치료용), 식품 산업 (예를 들면, 풍미, 향), 농업 (예를 들면, 살충제), 화장품 등에서의 사용을 위해 상업적으로 요망되는 임의 종류의 토종 (천연) 식물 세포 또는 유전자 변형된 식물 세포 (예를 들면, 배지 중에 성장하는 유전자 도입된 (transgenic) 및/또는 대안적으로는 유전자 조작된 (genetically engineered) 식물 세포)를 포함한다는 사실을 숙지해야 한다. 상기 유전자 조작은 경우에 따라 안정적이거나 일시적일 수 있다. 안정한 형질전환 (transformation)에서는 본 발명의 핵산 분자가 식물 게놈에 융합 (integration)되어, 안정하고 유전되는 특징을 나타내는 것과 같다. 일시적 형질전환에서는, 핵산 분자가 형질전환된 세포에 의해 발현되지만 게놈에 융합되지는 않아, 일시적인 특징을 나타내는 것과 같다.

바람직하게는, 상기 배양은, 식물의 하나 이상의 생물학적 구조가 존재하지 않도록, 세포가 완전한 식물을 형성하게 조립되지는 않는다는 것을 특징으로 한다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 배양은 복수의 다양한 종류의 식물 세포를 특징으로 할 수 있겠으나, 바람직하게는 상기 배양은 한 특정 종류의 식물 세포를 특징으로 한다. 경우에 따라, 한 특정 종류의 식물 세포를 특징으로 하는 식물 배양이 원래는 복수의 다양한 종류의 상기와 같은 식물 세포로부터 유래할 수 있다는 점을 숙지해야 한다.

식물 세포는 경우에 따라 임의 종류의 식물 세포일 수도 있지만, 경우에 따라 그리고 바람직하게는 식물 뿌리 (root) 세포 (즉, 식물 뿌리로부터 유래하거나 수득되거나 또는 본래 그를 기초로 하는 세포), 더욱 바람직하게는 셀러리 세포, 생강 세포, 고추냉이 (horseradish) 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선별되는 식물 뿌리 세포이다. 뿌리 이외의 구조물로부터 유래하는 식물 세포는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)로써 형질전환되어 잔뿌리 (hairy root) 세포로의 발전을 유도할 수 있음에 주목해야 한다 (예를 들면, Strobel 등에 허여된 미국 특허 제 4,588,693 호 참조). 따라서 상기에 기술하고 하기 실시예 란에 상세히 설명한 바와 같이, 식물 뿌리 세포는 아그로박테리움 라이조게네스로 형질전환된 뿌리 세포일 수 있다.

경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 식물 세포는 현탁액 중에서 성장시킨다. 상기 식물 세포는 경우에 따라 식물 잎 (leaf) 세포 또는 식물 새순 (shoot) 세포일 수도 있으며, 이들은 각각 식물의 잎이나 식물의 새순으로부터 유래하거나 수득되거나, 또는 본래 그를 기초로 하는 세포이다.

한 바람직한 구현예에서는, 상기 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 본 발명의 형질전환된 당근 세포는 바람직하게는 현탁액 중에서 성장시킨다는 점을 숙지해야 한다. 앞서 기술하고 실시예에 기술한 바와 같이, 이들 세포는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 세포로 형질전환되었다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 임의의 적당한 종류의 박테리아 세포가 경우에 따라 상기와 같은 형질전환에 사용될 수 있으나, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포가 하기하는 바람직한 식물 숙주 세포를 감염시키는 데 사용된다. 대안적으로는, 상기와 같은 형질전환 또는 트랜스펙션 (transfection)이 경우에 따라 바이러스, 예를 들면 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 감염에 의거할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물 세포의 배양을 위한 일회용 용기 (container)를 포함하는 식물 세포 배양용 장치가 제공된다. 상기 일회용 용기는 바람직하게는, "일회용"이란 단어가 상기 용기를 단일 배양/수확 사이클로만 제한하지 않으며, 일회 이상의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 장치는, 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 수확할 수 있게 하여, 상기 장치가 일회 이상의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 하는 흐름 제어기를 포함하는 재사용가능한 수확기 (harvester)를 포함한다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 흐름 제어기는 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔여분을 살균 상태로 유지하여, 이전에 수확된 사이클에서 남은 배지의 잔류분이 후속 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물 역할을 하도록 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 임의 종류의 세포 및/또는 조직의 배양에 적당한 장치, 시스템 및 방법이 제공된다. 바람직하게는, 본 발명은 숙주 세포의 배양에 사용된다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 경우에 따라 관심 대상인 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로써, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로써 형질전환되거나 트랜스펙션될 수 있다. 상기와 같은 핵산 분자는 관심 대상인 단백질을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함하며, 이는 경우에 따라 목적하는 단일 펩타이드 또는 펩타이드들을 코딩하는 하나 이상의 부가적 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게" 연결되었다는 것은 반드시 물리적 연결을 말하는 것은 아님을 숙지해야 한다.

"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 용어이다. 상기와 같은 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라, 상기와 같은 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 말하기도 하는 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변이 (modification)가 일어날 수도 있기 때문에, 상기와 같은 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있으나, 여전히 본원에서 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 있는 그대로의 DNA 또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 건조된 발현 벡터로써 재조합적으로 형질전환될 수 있는 세포를 가리킨다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트랜스펙션"은 핵산, 예를 들면 있는 그대로의 DNA 또는 발현 벡터를 핵산-매개된 유전자 전이에 의해 수용체 세포 내로 도입시키는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "형질전환"은, 외인성 DNA 또는 RNA의 세포내 흡수의 결과로 세포의 유전자형 (genotype)이 바뀌고, 예를 들면 형질전환된 세포가 재조합 형태의 목적하는 단백질을 발현하는 과정을 말한다.

단자엽 (monocotyledonous) 및 쌍자엽 (dicotyledonous) 식물 모두의 세포 배양이 본 발명의 방법 및 장치에 사용하기에 적당하다. 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에 외래 유전자를 도입하는 방법에는 여러 가지가 있다 (Potrykus, L., Annu. Rev. Plant Physiol., Plant Mol. Biol., (1991) 42:205-225; Shimamoto 등, Nature (1989) 338:274-276).

식물 게놈 DNA로 외인성 DNA를 안정하게 융합시키는 주요 방법은 다음의 두 가지 주요 접근법을 포함한다.

(i) 아그로박테리움-매개 유전자 전이: Klee 등 (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee 및 Rogers, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molcular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J. 및 Vasil, L.K. 편저, Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.2-25; Gatenby, Plant Biotechnology, Kung, S. 및 Arntzen, C.J. 편저, Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

(ii) 직접적인 DNA 흡수: Paszkowski 등, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J. 및 Vasil, L.K. 편저, Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989), p. 52-68; 원형질체 내로의 DNA의 직접적인 흡수 방법을 포함, Toriyama, K. 등 (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. 식물 세포의 순간적 전기 충격에 의해 유도되는 DNA 흡수: Zhang 등, Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm 등, Nature (1986) 319:791-793. 입자 폭격 (bombardment)에 의한 식물 세포 또는 조직 내로의 DNA 주입, Klein 등. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe 등. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; 마이크로피펫 시스템의 사용에 의한 DNA 주입: Neuhaus 등, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus 및 Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; 세포 배양물, 배아 또는 유합 조직 (callus)의 유리 섬유 또는 탄화규소 위스커 (whisker) 형질전환, 미국특허 제 5,464,765 호, 또는 발아 화분 (pollen)을 사용한 DNA의 직접적인 인큐베이션에 의한 주입, DeWet 등, Experimental Manipulation of Ovule Tissue, Chapman, G.P. 및 Mantell, S.H. 및 Daniels, W. 편저, Longman, London, (1985) p. 197-209; 및 Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

상기 아그로박테리움 시스템은, 식물 게놈 DNA 내로 융합되는 정의된 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 벡터의 사용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종 및 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 달라진다. 광범위하게 사용되는 접근법은 잎 절편 (leaf disc) 방법으로서, 전체 식물의 분화 (differentiation) 개시용으로 좋은 공급원을 제공하는 임의의 조직 외식편 (explant)을 이용하여 수행될 수 있다. [Horsch 등, Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9]. 보충적인 접근법은 아그로박테리움 전달 시스템을 진공 여과와 조합하여 채택한다. 상기 아그로박테리움 시스템은 특히 유전자 이식된 쌍자엽 식물의 생성에 이용가능하다.

식물 세포 내로 DNA를 직접 전이하는 방법이 다양하게 있다. 전기천공법 (electroporation)에서는 원형질체가 순간적으로 강한 전기장에 노출된다. 미세주입법 (microinjection)에서는, DNA가 매우 작은 마이크로피펫을 사용하여 기계적으로 직접 세포 내로 주입된다. 미세입자 폭격법 (microparticle bombardment)에서는 DNA가 황산마그네슘 결정 또는 텅스텐 입자와 같은 미세투사체 (microprojectile) 상에 흡착되고, 상기 미세투사체가 세포 또는 식물 조직 내로 물리적으로 가속화된다.

안정한 형질전환 후에는, 식물 증식 (propagation)이 실행될 수 있다. 식물 증식의 가장 흔한 방법은 종자에 의해, 또는 조직 배양, 조직 배양물 증가, 분화 및 식물 형성을 포함하는 미세증식 (micropropagation)에 의한 것이다.

현재로선 안정한 형질전환이 바람직하나, 잎 세포, 뿌리 세포, 분열 조직성 (meristematic) 세포 또는 기타 세포의 일시적 형질전환 또한 본 발명에 의해 암시된다.

일시적 형질전환은 상기 언급한 직접적인 DNA 전이 방법 중 어느 것에 의해서나, 또는 변이된 (modified) 식물 바이러스를 사용하는 바이러스 감염에 의해 실행될 수 있다.

식물 숙주의 형질전환에 유용한 것으로 나타난 바이러스에는 CaMV, TMV 및 BV가 포함된다. 식물 바이러스를 이용한 식물의 형질전환은 미국특허 제 4,855,237 호 (BGV), 유럽특허 EP-A 67,553 호 (TMV), 일본공개출원 제 63-14693 호 (TMV), 유럽특허 EPA 194,809 호 (VB), 유럽특허 EPA 278,667 호 (BV); 및 Gluzman, Y. 등, Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988)에 기술되어 있다. 식물을 포함한 다양한 숙주에서 외래 DNA를 발현하는 데 사용되는 슈도바이러스 (Pseudovirus) 입자는 국제특허 WO 87/06261 호에 기술되어 있다.

비-바이러스성 외인성 핵산 서열의 식물 내 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 구축이 상술한 참고문헌을 비롯하여, Dawson, W.O. 등, Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu 등, EMBO J. (1987) 6:307-311; French 등, Science (1986) 231:1294-1297; 및 Takamatsu 등, FEBS Letters (1990) 269:73-76 에도 입증되어 있다.

상기 바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 바이러스 자체에 적당한 변이가 이루어질 수 있다. 대안적으로는, 상기 바이러스가 외래 DNA를 이용하여 목적하는 바이러스 벡터를 구축하는 데에 대한 용이성을 위해 박테리아 플라스미드 내로 먼저 클론될 수 있다. 상기 바이러스는 이후 플라스미드로부터 절단된다. 상기 바이러스가 DNA 바이러스이면, 박테리아 복제원점 (origin of replication)이 바이러스의 DNA에 부착될 수도 있으며, 이는 이어서 박테리아에 의해 복제된다. 상기 DNA의 전사 및 번역은 바이러스 DNA를 둘러쌀 피막 단백질을 생산할 것이다. 상기 바이러스가 RNA 바이러스이면, 상기 바이러스는 일반적으로 cDNA로서 클론되어 플라스미드 내로 삽입된다. 상기 플라스미드는 이어서 모든 구축 작업에 사용된다. 그 후, RNA 바이러스는 상기 플라스미드의 바이러스 서열을 전사하고 바이러스 유전자를 번역함으로써 생성되어, 바이러스 RNA를 둘러쌀 피막 단백질을 생산한다.

본 발명의 구조체에 포함되는 것과 같은 비-바이러스성 외인성 핵산 서열의 식물 내 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 구축은 상기 참고문헌들 및 미국특허 제 5,316,931 호에 입증되어 있다.

바이러스 벡터는 재조합 식물 바이러스 핵산에 의해 코딩된 피막 단백질에 의해 둘러싸여져 재조합 식물 바이러스가 생성된다. 상기 재조합 식물 바이러스 핵산 또는 재조합 식물 바이러스는 적당한 숙주 식물을 감염시키는 데 사용된다. 재조합 식물 바이러스 핵산은 목적하는 단백질을 생산하가 위한 숙주 내 복제, 숙주 내 전신 분산, 및 숙주 내 외래 유전자(들) (단리된 핵산)의 전사 또는 발현이 가능하다.

폴리펩타이드는 유색체 (chromoplast)에서도 발현될 수 있다. 외인성 핵산 서열을 유색체의 게놈에 도입하는 기법이 공지되어 있다. 상기 기법은 하기의 절차를 포함한다. 먼저, 식물 세포를 화학적으로 처리하여 세포 당 유색체의 개수를 하나 정도로 감소시킨다. 이어서, 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 유색체 내로 도입할 목적으로, 외인성 핵산을 입자 폭격을 통해 세포 내로 도입시킨다. 상기 외인성 핵산은, 유색체에 고유한 효소에 의해 용이하게 실행될 수 있는 상동 재조합 (homologous recombination)을 통해 유색체의 게놈 내로 융합될 수 있는 것으로 선별된다. 이를 위해, 상기 외인성 핵산은 관심 대상인 유전자 외에도, 유색체의 게놈에서 유래하는 하나 이상의 핵산 스트렛치 (stretch)를 포함한다. 또한, 상기 외인성 핵산은 선별적인 표지 (marker)를 포함하는데, 이는 순차적인 선별 절차에 의해, 상기와 같은 선택 후에 유색체 게놈의 모든 또는 실질적으로 모든 복사본이 상기 외인성 핵산에 포함될 것이라는 것을 확실하게 하는 역할을 한다. 상기 기법에 관한 추가적 세부사항은 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허 제 4,945,050 호 및 제 5,693,507 호에 기재되어 있다. 따라서 폴리펩타이드는 유색체의 단백질 발현 시스템에 의해 생성되고 상기 유색체의 내막 (inner membrane) 내로 융합될 수 있다.

약물에 대한 내성 또는 기타 선택적 표지가 부분적으로는 형질전환체의 선택을 용이하게 하도록 의도된 것임에 주목해야 한다. 부가적으로는, 약물 내성 표지와 같은 선택적 표지의 존재는 배양물 중의 오염시키는 미생물의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있고, 및/또는 화학물질 또는 기타 요인에 대한 내성에 의거한 내성 표지의 경우에는, 선택 조건(들)이 또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 원치 않고/않거나 오염시키는 미생물이 배지 중에서 증식하는 것을 방지할 수도 있다. 상기와 같은 형질전환된 숙주 세포의 순수 배양물은 유도된 표현형 (phenotype)의 생존에 필요한 조건 하에서 세포를 배양함으로써 얻어진다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 숙주 세포는 핵산 분자로써 트랜스펙션되거나 형질전환될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 데옥시라이보핵산 (DNA) 및 적절한 경우, 라이보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다. 상기 용어는 또한 대등물로서 뉴클레오타이드 유사체로부터 생성된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하며, 기술되는 구현예에 적용가능한 바로는, (센스 또는 안티센스와 같은) 단일 가닥 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 구현예에서는, 본 발명의 숙주 세포는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로써 트랜스펙션되거나 형질전환될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "발현 벡터"는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 융합가능한 DNA 절편, 및 기타 운반체 (vehicle)와 같은, DNA 절편이 숙주의 게놈에 융합되는 것을 가능하게 하는 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 통상적으로는 목적하는 유전자 또는 그의 절편을 함유하는 자가복제 DNA 또는 RNA 구조체이며, 적당한 숙주 세포 내에서 인식되어 목적하는 유전자의 발현을 실행하는 작동가능하게 연결된 유전적 제어 요소 (genetic control element)이다. 이들 제어 요소는 적당한 숙주 내에서 발현을 실행할 수 있다. 일반적으로, 상기 유전적 제어 요소는 원핵생물의 프로모터 시스템 또는 진핵생물의 프로모터 발현 제어 시스템을 포함할 수 있다. 상기와 같은 시스템은 통상 전사 촉진자 (transcription promoter), 전사의 개시를 제어하는 선택적 작동자 (operator), RNA 발현 수준을 높이는 전사 증강자 (transcription enhancer), 적당한 라이보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, RNA 스플라이스 부위 (splice junction), 전사 및 번역을 종료시키는 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 보통 상기 벡터가 숙주 세포에 대해 독립적으로 복제할 수 있게 하는 복제원점을 함유한다.

플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 형태의 벡터이나, 대등한 기능을 갖고 당해 분야에서 공지되었거나 알려지고 있는 기타 형태의 벡터도 본원에서 사용하기에 적당하다. 예를 들면, 본원에 참고문헌으로서 인용된 Pouwels 등, Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 및 부록), Elsevier, N.Y.; 및 Rodriquez 등 (편저), Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988)를 참조한다.

일반적으로, 상기와 같은 벡터는 부가적으로 형질전환된 세포 내에서 표현형의 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자를 함유한다. 원핵생물 및 진핵생물의 바이러스 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시키는 것 또한 생각할 수 있다.

한 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 숙주 세포가 진핵생물 또는 원핵생물의 세포일 수 있다.

한 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 숙주 세포가 원핵생물의 세포, 바람직하게는 박테리아 세포이다. 또 다른 구현예에서는, 숙주 세포가 진핵생물의 세포, 예컨대 상기한 식물 세포 또는 포유류의 세포이다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 본원에서, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 상기 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있음을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들면, 촉진자가 코딩하는 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 상기 촉진자는 상기 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접 (예를 들면, 물리적으로 연결됨)해 있고, 필요한 경우 동일한 해독틀 (reading frame) 내에서 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결한다. 따라서 DNA 서열 및 조절 서열(들) (regulatory sequence(s))은, 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성자 단백질 (transcriptional activator protein))이 조절 서열(들)에 결합된 경우 유전자 발현을 허용하도록 연결되어 있다.

또 다른 구현예에서는, 이러한 재조합 핵산 분자가 경우에 따라, 식물 세포에서 기능적인 종결자와 같은, 바람직하게는 숙주 세포에서 기능적인, 작동가능하게 연결된 종결자를 추가로 포함한다. 본 발명의 재조합 핵산 분자는 경우에 따라 부가적인 제어, 촉진 및 조절 요소 및/또는 선택적 표지를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 상기 재조합 분자에 작동가능하게 연결되어 있음을 숙지해야 한다.

발현 구조체 (expression construct)에 사용될 수 있는 조절 요소는 숙주 세포, 바람직하게는 식물 세포에 이종 (heterologous) 또는 상동 (homologous)일 수 있는 촉진자를 포함한다. 상기 촉진자는 식물 촉진자이거나, 식물 세포 및 식물과 같은 숙주 세포 내에서 연결된 서열을 고수준으로 전사하게 할 수 있는 비-식물성 촉진자일 수 있다. 본 발명을 수행함에 있어 효과적으로 사용할 수 있는 식물 촉진자의 비제한적인 예에는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S, rbcS, 엽록소 a/b 결합 단백질을 위한 촉진자, AdhI, NOS 및 HMG2, 또는 그의 변이체 또는 유도체가 포함된다. 상기 촉진자는 구축되거나 (constitutive) 유도될 (inducible) 수 있다. 예를 들면, 그렇다고 제한적이지는 않지만, 유도성 촉진자는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포의 기계적 유전자 활성화 (MGA) 후의 라이소좀 효소 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 증가된 발현을 촉진하는 촉진자일 수 있다.

본 발명의 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터는 식물 및 식물 세포에서 이종 유전자 발현을 증강시키거나 최적화시키기 위해 당업자에게 공지된 방법에 따라 부가적으로 변이될 수 있다. 그러한 변이는 촉진자 강도를 증가시키거나 관심 대상인 단백질을 변경시키는 DNA 조절 요소를 돌연변이 시키는 것을 포함하나, 여기에 제한되지는 않는다.

따라서 본 발명은, 세포/조직 배양물의 대규모 생산을 위한 일회용 생물반응기 장치를 제공함으로써, 배경기술의 상술한 문제점에 대한 혁신적인 해결책을 제시한다. 본 발명의 장치는 본질적으로 일회용이면서, 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 일부를 수확할 수 있게 하는 재사용가능한 수확용 유출구를 포함함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 후속의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 하는 것을 특징으로 한다. 공업적 환경 하에서, 수확 도중 및 후의 수확용 유출구의 살균 상태는, 예를 들면 상기 장치와의 모든 필요한 작업의 연결 및 분리가 수행될 수 있는 살균 후드 (sterile hood)를 제공함으로써, 비교적 저렴하게 상당히 고도로 보장될 수 있다. 상기 장치가 마침내 오염되면, 비교적 적은 경제적 손실 하에 폐기될 수 있다. 상기와 같은 장치는 배양물의 생산 용적 50 또는 100 리터 이상에 대해서도 값싸게 제조될 수 있다. 또한, 배양/수확 사이클을 수차례 수행할 수 있는 상기 능력은 경제적으로 유리하여, 장치 당 유효 비용을 더욱 줄인다.

상기와 같은 장치는 대열로 경제적으로 배열될 수 있고, 상기 대열 내 장치의 개수는 생산량을 수요에 근접하게 맞추도록 조절될 수 있다. 따라서 파일럿 공정 생물반응기로부터 대규모 생산으로의 전환은, 상기 대열에 장치를 더 추가함으로써 비교적 단순하고 경제적인 방식으로 이루어질 수도 있다. 또한, 각 장치의 비교적 적은 생산 용적은 고체 혼합기의 부재와 더불어, 통상적인 스테인리스 스틸 생물반응기에 비해 비교적 더 높은 수율을 결과로 한다.

본 발명의 장치는 따라서 배경기술에 비해 다수의 장점을 가지며, 여기에는 일회용인 점; 제조하기에 경제적이고 사용하기에 간단한 점; 일회용이지만 또한 목적하는 세포 및/또는 조직의 배양 및 수확을 복수의 연속되는 사이클 중에 연속적으로 사용가능하다는 점; 그리고 경우에 따라, 접종물이 첫 번째 배양 사이클에 대해서만 제공되면 되고, 후속 사이클을 위한 접종물은 이전 사이클에서 배양액을 수확하고 난 후 장치 내에 남아있는 배양액의 일부에 의해 제공되는 방법에 따른 조작에 적당하다는 점이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따르면, 일 회 이상의 사이클에서 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양하고 수확하기 위한 일회용 장치로서, 상기 장치는 상단 (top end) 및 하단 (bottom end)을 갖는 살균가능한 일회용 용기를 포함하는데, 상기 용기는 적당한 살균된 생물학적 세포 및/또는 조직 배양 배지 및/또는 무균 접종물 및/또는 살균된 공기 및/또는 필요한 기타 살균된 첨가제로 적어도 부분적으로 채워질 수 있으며, 상기 용기는 (i) 용기로부터 과량의 공기 및/또는 폐가스를 제거하기 위한 가스 유출구; (ii) 용기로 접종물 및/또는 배지 및/또는 첨가제를 도입하기 위한 첨가제 유입구를 포함하며; 추가로 (iii) 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 수확할 수 있게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클을 연속적으로 사용할 수 있게 하는 흐름 제어기를 포함하는 재사용가능한 수확기를 포함하며, 이전의 수확된 사이클로부터 남아있는, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 다음의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물로서 사용될 수 있고, 배지 및/또는 필요한 첨가제가 제공되는 장치가 제공된다.

경우에 따라, 상기 일회용 용기는 투명 및/또는 반투명하다. 또한 경우에 따라, 상기 장치는 살균된 가스를 공기방울 형태로 제 1 유입구 개구부를 통해 배지 내로 도입하기 위한 공기 유입구를 추가로 포함하는데, 상기 공기 유입구는 적당한 가스 공급원에 연결가능하다. 바람직하게는, 상기 공기 유입구는 배양 중에 2회 이상 살균된 가스를 도입하기 위한 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 공기 유입구는 살균된 가스를 연속적으로 도입하기 위한 것이다. 경우에 따라, 복수의 다양한 가스가 다양한 시간 및/도는 농도로 상기 유입구를 통해 도입된다.

바람직하게는, 상기 수확기는 수확기를 통해 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 오염 방지기를 포함한다.

경우에 따라, 상기 용기는 비-강성 (non-rigid)이다. 바람직하게는, 상기 용기는 비-강성 플라스틱 물질로 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 상기 물질은 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌과 나일론의 공중합체, PVC 및 EVA를 포함하는 군에서 선택된다.

경우에 따라, 상기 용기는 상기 물질의 두 층 이상의 적층체로 이루어진다.

또한 경우에 따라, 상기 용기는 소정의 이음새 (seam)를 따라 상기 물질의 두 장의 적당한 시트를 융합 접합시킴으로써 형성된다.

바람직하게는, 상기 공기 유입구는 용기의 하단에 또는 그 근처에, 상기 유입구 개구부로부터 용기 내부의 한 지점까지 뻗어있는 공기 유입구 도관을 포함한다.

또한 바람직하게는, 상기 하나 이상의 공기 유입구는 적당한 공기 공급원에 연결가능하고, 복수의 이차 유입구 도관과 통하는 하나 이상의 공기 유입구 도관을 포함하는데, 상기 이차 유입구 도관은 각각 살균된 공기를 공기방울 형태로 배지 내로 도입하기 위해 적당한 유입구 개구부를 통해 상기 용기 내부의 한 지점으로 뻗어있다. 더욱 바람직하게는, 상기 장치는 전체 길이, 높이 및 폭을 갖는, 실질적으로 상자와 유사한 기하학적 형태를 갖는다. 가장 바람직하게는, 높이-대-길이 비율은 약 1 내지 약 3, 바람직하게는 약 1.85이다. 경우에 따라, 높이-대-폭 비율은 약 5 내지 약 30, 바람직하게는 약 13이다.

바람직하게는, 상기 장치는 실질적으로 상기 장치의 깊이에 걸쳐 있는 지지체 간극 (support aperture)을 포함하며, 상기 간극은 상기 장치가 적당한 막대 지지체 상에 지지되도록 하기에 적합하다.

경우에 따라, 상기 장치는 상기 장치를 지지하기 위한 지지체 구조물을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 지지체 구조물은 한 쌍의 마주보는 틀을 포함하는데, 각 틀은 상부 및 하부 지지체 부재를 포함하며, 이들 지지체 부재는 상기 상부 및 하부 지지체 부재에 적당하게 결합된, 실질적으로 평행인 복수의 수직 지지체 부재에 의해 간격을 두고 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 복수의 수직 지지체 부재는 상기 상부 및 하부 지지체 부재의 각 세로 선단에 존재하는 하나 이상의 수직 지지체 부재로 이루어져 있다.

또한 더욱 바람직하게는, 상기 틀은 상기 틀에 대해 떼어낼 수 있게 (releasably) 또는 일체형으로 (integrally) 결합된 복수의 간격 막대 (spacing bar)에 의해 서로 간격을 두고 있다.

또한 더욱 바람직하게는, 상기 간격 막대는 상기 장치가 지지체 구조물로부터 비교적 용이하게 삽입되고 제거될 수 있도록 전략적으로 배치되어 있다.

경우에 따라, 각 틀의 하부 지지체 부재는 상기 장치의 하단의 상응하는 부분을 수용하고 지지하기에 적합한 하나 이상의 하부 지지체를 포함한다.

바람직하게는 각 하부 지지체는 각각의 하부 지지체 부재로부터 맞은편 틀의 방향으로 튀어나온, 적당한 모양의 탭 (tab)의 형태를 갖는다.

경우에 따라, 상기 틀은 각각, 소정 위치에서 상기 장치의 측면 벽을 밀기 위한, 각 틀로부터 맞은편 틀의 방향으로 튀어나온 하나 이상의 상호분리대 (interpartitioner)를 포함하는데, 마주보는 쌍의 상호분리대는 상기 소정 위치에서 장치의 폭을 효과적으로 축소시키도록 되어 있다.

바람직하게는, 상기 상호분리대는 실질적으로 수직인 적당한 부재를, 상기 상부 및 하부 지지체 부재로부터 적당한 상부 및 하부 스트럿 (strut)에 의해 맞은편 틀을 향한 방향으로 간격을 두고 있게끔 포함한다.

경우에 따라, 상기 지지체 구조물은 상기 장치를 운송하기 위한 복수의 다리바퀴 (castor)를 포함할 수 있다.

경우에 따라 적어도 일부의 상기 공기방울은 평균 직경이 약 1 mm 내지 약 10 mm 이다.

또한 경우에 따라, 적어도 일부의 상기 공기방울은 평균 직경이 약 4 mm 이다.

경우에 따라, 상기 용기는 상기 가스 유출구를 통한 용기 내로의 오염물의 도입을 실질적으로 방지하기 위한, 가스 유출구 상에 장착된 적당한 필터를 포함한다.

바람직하게는, 상기 용기는 첨가제 유입구를 통한 용기 내로의 오염물의 도입을 실질적으로 방지하기 위한, 상기 첨가제 유입구 상에 장착된 적당한 필터를 포함한다.

또한 바람직하게는, U자 모양의 유체 트랩 (trap)을 포함하는 오염 방지기가 있는데, 이것의 한쪽 가지는 적당한 무균 연결기에 의해 수확기의 외부 유출기에 무균적으로 장착되어 있다.

바람직하게는, 상기 수확기는 상기 용기의 하단의 바닥에 위치하고 있다.

또한 바람직하게는, 상기 수확기는 상기 용기의 하단의 바닥 근처에 위치하고 있는데, 각 수확 사이클의 완료 시, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 자동적으로 상기 용기의 하단에 수확기의 수위에 못 미치는 일정 수위까지 남겨지도록 되어 있다.

경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분은 적어도 부분적으로 용기의 바닥으로부터 수확기까지의 거리 d2에 따라 결정된다.

바람직하게는, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 배지 및 접종물의 원래 용적의 약 2.5% 내지 약 45%를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 배지 및 접종물의 원래 용적의 약 10% 내지 약 20%를 포함한다.

경우에 따라, 상기 하단은 실질적으로 볼록형이다.

또한 경우에 따라, 상기 하단은 실질적으로 원추대 (frusta-conical) 형이다.

바람직하게는, 상기 용기는 내부 충진가능한 용적이 약 5 리터 내지 약 200 리터, 바람직하게는 약 50 리터 내지 약 150 리터이며, 바람직하게는 약 100 리터이다.

경우에 따라, 상기 장치는 적당한 지지체 구조물에 상기 장치를 부착하기 위한 적당한 부착기 (attacher)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 부착기는 바람직하게는 상기 용기의 상단에 일체형으로 부착된 적당한 물질로 된 루프 (loop)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 장치는 식물 세포 배양에 적합하다. 바람직하게는, 식물 세포 배양물은 식물의 뿌리로부터 수득한 식물 세포를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 식물 뿌리는 아그로박테리움 라이조게네스로 형질전환된 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택된다.

경우에 따라, 상기 기술한 바와 같은 일회용 장치를 두 개 이상 포함하는, 상기 장치 대열이 제공된다. 바람직하게는, 상기 장치는 각 장치의 부착기를 통해 적당한 지지체 구조물 상에 지지된다. 또한 바람직하게는, 각 장치의 가스 유출구는, 경우에 따라 오염물이 상기 장치로 흘러들어가는 것을 방지하기 위한 차단기 (blocker)를 포함하는 공동 가스 유출구 도관에 적당하게 연결되어 있다. 바람직하게는, 상기 차단기는 적당한 필터를 포함한다.

경우에 따라, 각 장치의 첨가제 유입구는, 경우에 따라 연결되지 않은 한쪽 말단에 적당한 무균 연결기 (connector)를 포함하는 공동 첨가제 유입구 도관에 적당하게 연결되어 있다.

경우에 따라, 상기 연결되지 않은 말단은 적당한 배지 및/또는 첨가제 공급원에 연결가능하다.

바람직하게는, 각 장치의 수확기는, 경우에 따라 연결되지 않은 한쪽 말단에 적당한 무균 연결기를 포함하는 공동 수확용 도관에 적당하게 연결되어 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 장치의 대열은, 오염물이 상기 공동 수확용 도관을 통해 용기 내로 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 오염 방지기를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 오염 방지기는 U자 모양의 유체 트랩을 포함하며, 이것의 한쪽 가지는 개구부를 가지며 연결되어 있지 않고, 다른 한쪽 말단은 적당한 무균 연결기를 통해 상기 공동 수확용 도관의 연결되지 않은 말단에 무균적으로 장착될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 U자 모양의 튜브의 연결되지 않은 말단은 적당한 수용 탱크에 연결가능하다.

경우에 따라, 각 장치의 공기 유입구는, 경우에 따라 연결되지 않은 한쪽 말단에 적당한 무균 연결기를 포함하는 공동 공기 유입구 도관에 적당하게 연결되어 있다. 바람직하게는, 상기 연결되지 않은 말단은 적당한 공기 공급원에 연결가능하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 일회용 장치에서 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양하고 수확하는 방법으로서: 상단 및 하단을 갖는 살균가능한 투명 및/또는 반투명 일회용 용기이며, 적어도 부분적으로 적당한 무균의 생물학적 세포 및/또는 조직 배양용 배지, 및/또는 무균 접종물, 및/또는 살균된 공기, 및/또는 기타 살균된 필요한 첨가제로 적어도 부분적으로 채워질 수 있고, (i) 과량의 공기 및/또는 폐가스를 용기로부터 제거하기 위한 가스 유출구; (ii) 접종물 및/또는 배지 및/또는 첨가제를 용기 내로 도입하기 위한 첨가제 유입구; 및 (iii) 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 일부분이라도 수확할 수 있게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적인 연속되는 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 하기 위한 적당한 흐름 제어기를 포함하는, 재사용가능한 수확기를 포함하는 용기를 포함하며, 여기서 이전의 수확된 사이클로부터 남겨진, 상기 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이, 배지 및/또는 필요한 첨가제가 제공된, 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 할 수도 있는 상기 장치를 제공하는 단계; 상기 수확기를 통해 무균 접종물을 제공하는 단계; 상기 첨가제 유입구를 통해 살균된 배지 및/또는 첨가제를 제공하는 단계; 경우에 따라 상기 용기를 외부광으로 조명하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 조직이 배지 중에서 목적하는 수율까지 성장하게 하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 방법은, 과량의 공기 및/또는 폐가스가 가스 유출구를 통해 연속적으로 상기 용기에서 빠져나가게 하는 단계를 추가로 포함한다.

더욱 바람직하게는, 상기 방법은, 용기 내에서 생산되는 오염물 및/또는 세포/조직의 품질을 확인하여: 만일 오염물이 발견되거나 생산된 세포/조직의 품질이 저하된 경우에는 상기 장치 및 그 내용물을 폐기하고; 만일 오염물이 발견되지 않으면, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 원하는 분량을 수확하는 단계를 추가로 포함한다.

가장 바람직하게는, 상기 원하는 분량을 수확하는 동안, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분을 상기 용기 내에 남겨서, 상기 배지의 잔류분이 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하게 한다. 또한 가장 바람직하게는, 상기 방법은, 상기 첨가제 유입구를 통해 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제를 제공하는 단계; 및 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 떨어져서 상기 장치 및 그 내용물을 폐기해야 할 때까지 성장 사이클을 반복하는 단계를 추가로 포함한다.

바람직하게는, 상기 장치는, 적당한 살균된 공기 공급원에 연결가능한 제 1의 유입구 개구부를 통해, 살균된 공기를 공기방울 형태로 배지에 도입하기 위한 공기 유입구를 추가로 포함하며, 상기 방법은 첫 번째 및 각각의 후속 사이클 중에 살균된 공기를 상기 공기 유입구에 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 살균된 공기는 일회 이상의 배양 사이클의 처음부터 끝까지 연속적으로 공급된다.

또한 더욱 바람직하게는, 상기 살균된 공기는 일회 이상의 배양 사이클 중에 펄스 방식으로 공급된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 일회용 장치의 대열 내에서 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양 및 수확하는 방법으로서: 상기한 바와 같은 장치의 대열을 제공하고, 하나 이상의 상기 장치에 있어서는: 공동 수확용 도관을 통해 무균 접종물을 상기 장치에 제공하는 단계; 공동 첨가제 유입구 도관을 통해 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제를 상기 장치에 제공하는 단계; 경우에 따라 상기 장치를 외부광으로 조명하는 단계; 및 상기 장치 내 세포 및/또는 조직이 배지 중에서 목적하는 수율로 성장하게 하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 방법은: 과량의 공기 및/또는 폐가스가 공동 가스 유출구 도관을 통해 연속적으로 상기 장치를 빠져나가게 하는 단계; 오염물 및/또는 장치 내에서 생산되는 세포/조직의 품질을 확인하여: 만일 상기 장치 내에서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 저하된 경우에는 상기 장치의 수확기를 닫아서 대열 내 다른 장치가 오염되는 것을 방지하고; 만일 대열 내 모든 장치에서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 저하된 경우에는 모든 장치 및 그 내용물을 폐기하고; 오염물이 발견되지 않고 생산된 세포/조직의 품질이 허용가능한 경우에는, 각 수확가능한 장치에 있어서 공동 수확용 도관 및 오염 방지기를 통해 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 원하는 분량을 적당한 수용 탱크로 수확하는 단계를 추가로 포함한다.

바람직하게는, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 용기 내에 남겨지고, 여기서 상기 잔류분은 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하며; 상기 방법은 첨가제 유입구를 통해 후속 배양/수확 사이클을 위한 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

또한 바람직하게는, 대열 내 모든 장치에 있어서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 떨어질 때까지 성장 사이클이 반복되는데, 이때 상기 오염 방지기는 공동 수확기로부터 단절되고, 상기 장치들 및 그 내용물은 폐기된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 일회용 장치의 대열 내에서 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양 및 수확하는 방법으로서: 상기와 같은 장치의 대열을 제공하고, 하나 이상의 상기 장치에 있어서는: 공동 수확용 도관을 통해 상기 장치에 무균 접종물을 제공하는 단계; 공동 첨가제 유입구 도관을 통해 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제를 상기 장치에 제공하는 단계; 공동 공기 유입구 도관을 통해 살균된 공기를 상기 장치에 제공하는 단계; 경우에 따라 상기 장치를 외부광으로 조명하는 단계; 및 상기 장치 내의 세포 및/또는 조직이 배지 중에서 목적하는 수율로 성장하게 하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 방법은: 과량의 공기 및/또는 폐가스가 공동 가스 유출구 도관을 통해 연속적으로 상기 장치를 빠져나가게 하는 단계; 및 장치 내 오염물 및/또는 생산되는 세포/조직의 품질을 확인하여: 만일 상기 장치 내에서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 저하된 경우에는 상기 장치의 수확기를 닫아서 대열 내 다른 장치가 오염되는 것을 방지하고; 만일 대열 내 모든 장치 내에서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 저하된 경우에는 모든 장치 및 그 내용물을 폐기하고; 만일 오염물이 발견되지 않고 생산된 세포/조직의 품질이 허용가능한 경우에는 상기 장치를 수확가능한 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함한다.

더욱 바람직하게는, 상기 방법은: 각각의 수확가능한 장치에 있어서 공동 수확용 도관 및 오염 방지기를 통해 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 적당한 수용 탱크로 수확하는 단계를 추가로 포함한다.

가장 바람직하게는, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분이 용기 내에 남겨져서, 상기 잔류분이 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하고; 상기 방법은: 첨가제 유입구를 통해 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

또한 가장 바람직하게는, 대열 내 모든 장치에 있어서 오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 떨어질 때까지 성장 사이클이 반복되는데, 이때 오염 방지기는 공동 수확기로부터 단절되고, 상기 장치들 및 그 내용물은 폐기된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 식물 세포 배양을 위한 장치로서, 식물 세포 배양을 위한 일회용 용기를 포함하는 장치가 제공된다. 바람직하게는, 상기 일회용 용기는 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클에서 연속적으로 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 장치는: 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 수확할 수 있게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클에 있어서 연속적으로 사용될 수 있게 하기 위한 흐름 제어기를 포함하는, 재사용가능한 수확기를 추가로 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 흐름 제어기는 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분의 무균성을 유지하여, 이전의 수확된 사이클로부터 남겨진 배지의 잔류분이 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하도록 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 식물 세포를 배양하는 방법으로서, 일회용 용기 내에서 식물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 일회용 용기는 살균된 가스 또는 가스의 조합을 도입하기 위한 공기 유입구를 포함한다.

더욱 바람직하게는, 상기 살균된 가스는 공기를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 살균된 가스의 조합은 공기 및 부가적 산소의 조합을 포함한다.

바람직하게는, 산소는 공기와 별도로 첨가된다.

더욱 바람직하게는, 산소는 세포 배양 개시 후 며칠 후에 첨가된다.

바람직하게는, 상기 살균된 가스 또는 가스의 조합은 배양 중에 2회 이상 첨가된다.

또한 바람직하게는, 상기 공기 유입구는 살균된 가스를 연속적으로 도입하기 위한 것이다.

또한 바람직하게는, 복수의 상이한 가스가 상기 공기 유입구를 통해 상이한 시간 및/또는 농도로 도입된다.

바람직하게는, 상기 방법은: 상기 유입구를 통해 세포에 폭기하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 폭기는 분 당 1.5 L 이상의 가스를 투여하는 것을 포함한다.

경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 방법은: 세포를 성장시키기에 충분한 배지를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 충분한 배지의 농도는 배지의 정상 농도의 약 125% 이상이다.

바람직하게는, 상기 방법은 세포의 성장 중에, 그러나 수확 전에 배지를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 방법은 세포를 배양하기 시작한 후 적어도 약 3일 후에 부가적 배지를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법은 세포를 배양하기 시작한 후 적어도 약 3일 후에 배지를 완전히 교체하는 단계를 추가로 포함한다.

또한 바람직하게는, 상기 배지는 당의 혼합물을 포함한다.

또한 바람직하게는, 상기 배지는 통상적인 세포 배양에서보다 더 많은 양의 수크로오스를 포함한다.

바람직하게는, 상기 식물 세포는 재조합 단백질을 생산한다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 생물반응기 및 발효기를 포함하는, 세포 및/또는 조직을 무균적으로 배양 및 수확하는 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상기 장치는 바람직하게는 일회용이나, 그래도 장치의 폐기 전에 복수의 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 세포 및 조직의 대규모 생산에 사용할 수 있는 상기와 같은 장치 대열 (battery)에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 언급한 바와 같이 식물 세포 배양에 사용하기에 적합하다.

바람직하게는, 상기 배양은, 식물의 하나 이상의 생물학적 구조가 존재하지 않도록, 세포가 완전한 식물을 형성하게 조립되지는 않는다는 것을 특징으로 한다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 배양은 복수의 다양한 종류의 식물 세포를 특징으로 할 수 있겠으나, 바람직하게는 상기 배양은 한 특정 종류의 식물 세포를 특징으로 한다. 경우에 따라, 한 특정 종류의 식물 세포를 특징으로 하는 식물 배양이 원래는 복수의 다양한 종류의 상기와 같은 식물 세포로부터 유래할 수 있다는 점을 숙지해야 한다. 본 발명의 장치 및 방법에 사용하기에 적당한 식물 세포 배양물은, 식물 뿌리 세포, 알팔파 세포, 담배 세포 및 담배세포주 세포로부터 유래한 식물 세포 배양을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 담배 세포주 세포는, 본 발명의 방법에 따라 배양되기 전의 세포로서 배양물 중에 성장시킨 담배 세포로 정의된다. 구축된 담배 세포주의 비제한적인 예에는 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) L. cv. 브라이트 옐로우-2 (BY-2) 및 니코티아나 타바쿰 L. cv. 프티 하바나 (Petit Havana)가 포함된다.

상기 식물 세포는 선택적으로 임의 종류의 식물 세포일 수 있으나, 경우에 따라 그리고 바람직하게는 식물 뿌리 세포 (즉, 식물 뿌리로부터 유래하거나 수득되거나, 본래 그를 기초로 한 세포), 더욱 바람직하게는 셀러리 세포, 생강 세포, 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택된 식물 뿌리 세포이다. 상기에 언급하고 하기 실시예에 기재된 바와 같은 식물 뿌리 세포는 아그로박테리움 라이조게네스로 형질전환된 뿌리 세포일 수 있다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 식물 세포는 현탁액 중에서 성장시킨다. 상기 식물 세포는 경우에 따라 또한 식물의 잎 세포 또는 식물의 새순 세포일 수도 있으며, 이들은 각각 식물의 잎 또는 식물의 새순으로부터 유래하거나 수득되거나, 또는 본래 그를 기초로 한 세포이다.

한 바람직한 구현예에서는, 상기 식물 뿌리 세포가 당근 세포이다. 본 발명의 형질전환된 당근 세포는 바람직하게는 현탁액 중에서 성장된다는 점에 주목해야 한다. 상기 언급하고 실시예에 기재된 바와 같이, 이들 세포는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포로 형질전환되었다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 임의의 적당한 종류의 박테리아 세포가 상기와 같은 형질전환에 선택적으로 사용될 수 있겠으나, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포가 하기한 바람직한 식물 숙주 세포를 감염시키는 데 사용된다.

당업자라면, 아그로박테리움 투메파시엔스 세포를 사용한 숙주 세포의 형질전환은, 본 발명의 장치 내에서 본 발명의 방법에 의해 배양되는 숙주 세포가 재조합 단백질을 발현할 수 있게 할 수 있다. 한 바람직한 구현예에서는, 상기 재조합 단백질은 이종 단백질이다. 또 다른 바람직한 구현예에서는, 상기 재조합 단백질은 바이러스, 진핵생물 및/또는 원핵생물의 단백질이다. 본 발명의 형질전환된 세포 배양은 키메라 (chimeric) 폴리펩타이드를 또한 발현할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 키메라 폴리펩타이드는 둘 이상의 개별적이고 동일하지 않은 유전자로부터 얻은 코딩 서열을 포함하는 융합된 코딩 서열(들)을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질로 정의된다. 상기 발현된 폴리펩타이드는 바람직하게는 진핵생물의 비-식물성 단백질, 특히 포유동물 유래의 단백질이며, 항체 분자, 인간 혈청 알부민 (Dugaiczyk 등 (1982) PNAS USA 79:71-75 (본원에 참고문헌으로 인용됨)), 에리트로포이에틴, 기타 치료적 분자 또는 대체 혈액, 영양가가 증강된 단백질에서 선택될 수 있으며, 이들 중에서 예를 들면 하나 이상의 아미노산이 일회 이상 삽입, 결실, 치환 및/또는 부가된, 변이된 형태일 수도 있다. (상기 코딩 서열은 바람직하게는 코돈 이용 원칙에 따라 숙주종에서 희귀한 코돈이 교환되도록 변이된다). 본 발명의 장치 내에서 본 발명의 방법에 의해 성장시킨 숙주 세포 내에서 발현될 수 있는 상기와 같은 이종 단백질의 예에는 글루코세레브로시데이즈와 같은 라이소좀 효소, 인간 인터페론β와 같은 사이토카인 및 성장인자, 혈액응고 인자, 예를 들면 인간 혈액응고 인자 X와 같은 혈청 단백질, VPII와 같은 박테리아 및 바이러스 단백질이 포함되나, 여기에 한정되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물 세포 배양을 위한 일회용 용기를 포함하는, 식물 세포 배양용 장치가 제공된다. 상기 일회용 용기는 바람직하게는 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있어서, "일회용"이란 용어가 상기 용기를 단일의 배양/수확 사이클로 제한하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 상기 장치는, 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 수확할 수 있게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 하는 흐름 제어기를 포함하는, 재사용가능한 수확기를 추가로 포함한다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 흐름 제어기는 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류분의 무균성을 유지하여, 이전의 수확된 사이클로부터 남겨진 상기 배지의 잔류분이 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하게 한다.

본 발명의 선택적 구현예에 따르면, 본 발명의 장치, 시스템 및 방법은 포유류 세포 배양, 바람직하게는 포유류 세포를 현탁액 중에 배양하는 데 적합하다. 당업자라면 본원에 제공된 프로토콜 및 장치 설명을 포유류 세포 배양에 용이하게 적용할 수 있을 것이다.

한 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 숙주 세포가 진핵생물 또는 원핵생물의 세포일 수 있다.

한 바람직한 구현예에서는, 본 발명의 숙주 세포가 원핵생물의 세포, 바람직하게는 박테리아 세포이다. 또 다른 구현예에서는, 상기 숙주 세포가 앞서 기술한 바와 같은 식물 세포, 또는 포유류 세포와 같은 진핵생물의 세포이다.

개시되고 기술된 본 발명은 본원에 개시된 특정 실시예, 공정단계 및 물질로 한정되지 않으며, 상기와 같은 공정 단계 및 물질이 어느 정도 변화될 수 있음을 숙지해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그의 대등물에 의해서만 제한되므로, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로 사용되었고, 제한하려는 의도는 아님을 숙지해야 한다.

본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전체를 통해, 다른 맥락으로 기술되지 않는 이상, "포함한다 (comprise)"라는 단어, 및 "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"와 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 군이 포함되는 것을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 군이 제외됨을 의미하는 것은 아님을 숙지해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 본문 맥락이 분명히 다르게 언급하고 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다.,

하기의 실시예는 본 발명자들이 본 발명의 양태를 실시하는 데 채택한 대표적인 기법이다. 이들 기법은 본 발명의 실행에 바람직한 구현예의 예시이며, 당업자는 본 개시에 있어 본 발명의 사상 및 의도된 범위로부터 벗어남이 없이 여러 변형예가 이루어질 수 있음을 인식해야 할 것이다.

본원에서는 단지 예시하는 목적으로 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명한다.

도 1a 내지 1c 는, 본 발명의 장치의 제 1 구현예의 주요 구성요소를, 도 1A 및 1B에서는 각각 전면도 및 측면 단면도로 도시하고, 도 1C에서는 본 발명에 따른 예시적 시스템을 도시한다.

도 2a 및 2b 는, 본 발명의 장치의 제 2 구현예의 주요 구성요소를 각각 전면도 및 측면 단면도로 도시한다.

도 3 은, 본 발명의 장치의 제 3 구현예의 주요 구성요소를 측면 단면도로 도시한다.

도 4 는, 본 발명의 장치의 제 1 구현예의 이음새 선을 전면도로 도시한다.

도 5a 및 5b 는, 본 발명의 장치의 제 4 구현예의 주요 구성요소를 각각 측면도 및 상부 단면도로 도시한다.

도 5c 및 5d 는, 상기 제 4 구현예를 도 5(a)의 B-B 선 및 C-C 선을 따라 절단한 가로 단면을 도시한다.

도 6a 및 6b 는, 본 발명의 제 5 구현예의 주요 구성요소를 각각 측면도 및 상부 단면도 로 도시한다.

도 6c 및 6d 는 상기 제 5 구현예를 도 6(a)의 B-B 선 및 C-C 선을 따라 절단한 가로 단면을 도시한다.

도 7 은 도 5의 구현예를 투시도로 도시한다.

도 8 은 도 6의 구현예를 투시도로 도시한다.

도 9 는 도 5 내지 8의 구현예에 사용하기 위한 지지체 구조물을 도시한다.

도 10 은, 도 1 내지 8 중 어느 하나의, 복수의 장치를 포함하는 본 발명의 대열의 바람직한 구현예의 주요 구성요소를 도시한다.

도 11a 및 11b 는 본 발명에 사용하기 위한 발현 카세트 (cassette) 및 벡터를 나타낸다.

도 12 는, 얼렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크에 반하여, 본 발명에 따른 장치 내에서의 형질전환된 (글루코세레브로시데이즈 (GCD)) 당근 세포 현탁액의 성장을 나타낸다.

도 13 은 얼렌마이어 플라스크에 반하여, 본 발명에 따른 장치에 의해 생산된 GCD의 상대적 양을 나타낸다.

도 14 는, 평행인 성장곡선에 대한 7% 및 15% 충전세포 용적의 출발점을 나타낸다.

도 15 는 이들 두 가지 성장 조건에 대한 정량적 웨스턴 블롯 (Western blot)으로 구해진 GCD 단백질의 양을 나타낸다.

도 16 은 정상점 (stationary point)을 찾기 위한 연장된 기간 (14일)에 걸친 성장을 나타낸다.

도 17 은, 형질전환된 세포에 의해 생산되는 GCD의 최대량 (다른 단백질에 상대적인 양)이 제 8일에 나타나며, 이 날 이후로는 생산된 GCD의 양이 감소하기 시작함을 나타낸다.

도 18 은 제 4 일째에 배지를 교환하고/하거나 새로운 배지를 첨가해주면, 제 8일이 지나서도 세포의 성장수준이 높게 유지됨을 나타낸다.

도 19 는 도 18에 대해 기재된 조건 하에 생산된 GCD의 양을 나타낸다.

도 20 은 도 18에 대해 기재된 조건 하에 생산된 GCD의 양을 나타낸다.

도 21 은 세포 성장에 대한 상이한 당 투여계획 (sugar regime)의 효과를 나타낸다.

도 22a 및 22b 는 GCD 생산에 대한 상이한 당 투여계획의 효과를 나타낸다.

도 23a 및 23b 는 본 발명에 따른 10 L 장치 내에서의 세포 성장에 대한 폭기율 (aeration rate)의 효과를 나타낸다.

도 24 는 본 발명에 따른 장치에 산소를 더 첨가하는 효과를 나타낸다.

도 25 는, 인간 X 인자 (Human Factor X) 코딩 서열 (화살표)을 PCR에 의해 증폭한 후 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다.

도 26 은, CaMV35S Omega와 OCS 종결자 서열 사이에 연결된 X 인자 서열을 포함하는, 연결된 CE-FX-KDEL 구조체를 나타낸다. 제한효소의 인식 부위의 위치가 표시되어 있다.

도 27 은, 연결된 카세트 CE-FX-KDEL이 도입된 pBluescript SK 벡터의 지도이다.

도 28 은, 카세트로 나타내어진 플라스미드 pzp-FX-ER 및 pGREEN nos-kana-FX-ER, 및 식물 세포에서 인간 X 인자의 클로닝 및 발현에 사용된 플라스미드로 형질전환된 클론의 제한 분석 결과이다. 1번 레인은 제한효소 절단 이전에 pzp-FX-ER 구조체로 형질전환된 클론 3이다. 2번 레인은 EcoR1 및 HindIII 절단 후의 클론 3이다. 3번 레인은 제한효소 절단 이전에 pzp-FX-ER 구조체로 형질전환된 클론 4이다. 4번 레인은 EcoR1 및 HindIII 절단 후의 클론 4이다. 5번 레인은 CaMV35S+omega-FX-ER 발현 카세트이다. 6번 레인은 제한효소 절단 이전에 pGREEN nos-kana-FX-ER로 형질전환된 클론 3이다. 7번 레인은 Asp718 및 XbaI 절단 후의 클론 3이다. 8번 레인은 제한효소 절단 이전에 pGREEN nos-kana-FX-ER로 형질전환된 클론 8이다. 9번 레인은 Asp718 및 XbaI 절단 후의 클론 8이다. 모든 형질전환된 클론에 CaMV35S+omega-FX-ER 발현 카세트의 띠가 있음에 주목한다. MW = 분자량 표준.

도 29 는, CaMV35S+Omega, OCS 종결자 및 NPTII 서열 사이에 연결된 X 인자 서열을 포함하는 pGREEN-nos-kana-FX-ER 구조체의 TDNA를 나타낸다. 제한효소의 인식 부위의 위치가 표시되어 있다.

도 30 은 몇 가지 형질전환된 당근 세포주의 세포 내용물의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. X 인자 발현이 정제된 토끼의 다클론 항-인간 X 인자 IgG (Affinity Biologicals 사, 캐나다 온타리오주 해밀턴)에 의해 웨스턴 블롯 상에서 검출되었다. pGREEN-nos-kana-FX-ER로 형질전환된 세포주 (1번 및 2번 레인)에서 X 인자가 강하게 발현되는 것에 주목한다. MW = 분자량 표준.

도 31 은 식물 세포에서 발현된 재조합 인간 X 인자의 정확한 절단을 나타낸다. 인간 X 인자의 프로펩타이드 (propeptide) 제거 및 단쇄 (single chain)의 경쇄/중쇄 (light/heavy chain)화 가공을 담당하는 엔도펩티데이즈 (endopeptidase)인 푸린 (furin)이 식물 세포에서 발현된 재조합 인간 X 인자를 활성 Xa의 크기로 정확히 절단하였다 (4번 및 5번 레인). MW = 분자량 표준.

도 32 는 식물 세포에서 발현된 재조합 인간 X 인자의 촉매 활성을 나타내는 그래프이다. 형질전환된 당근 세포 (●, ▲ 및 ■) 및 형질전환되지 않은 대조군 (+, * 및 ●)에서 얻은 세포 추출물을 발색기질 (chromogenic substrate)인 페파크롬 (Pefachrome)과 반응시키고, 그 생성물을 OD_405nm 에서 분광법으로 관찰하였다.

도 33 은 인간 Ifnβ 코딩 서열 (화살표)을 PCR에 의해 증폭한 후 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. 1번 레인은 ifnKDEL 서열 (ER을 목표로 함)이다. 2번 레인은 ifnSTOP 서열 (아포플라스트 (apoplast)를 목표로 함)이다. MW = 분자량 표준.

도 34 는, CE-K 발현 카세트를 사용하여 이. 콜라이 (E. coli) DH5α에 클론된, 증폭된 인간 Ifnβ 코딩 서열을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. CaMV35S 정방향 프라이머 (forward primer) 및 종결자 역방향 프라이머 (reverse primer)를 사용한 삽입단편의 PCR 분석에 의해 양성 클론을 선택하였다 (도 29 참조). 1번 내지 7번 레인은 CE-ifn-STOP 삽입단편을 나타내는 양성 클론이다. 레인 "fx"는 ifn 삽입단편이 없는 양성 대조물인 CE-fx-his 이다. 레인 "-DNA"는 DNA가 없는 음성 대조물 PCR 반응물이다.

도 35 는, CE-K 발현 카세트를 사용하여 이. 콜라이 DH5α에 클론된, 증폭된 인간 Ifnβ 코딩 서열을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. CaMV35S+Omega 정방향 프라이머 및 OCS 종결자 역방향 프라이머를 사용한 삽입단편의 PCR 분석에 의해 양성 클론을 선택하였다 (도 37 참조). 1번 내지 4번 및 6번 레인은 CE-ifn-KDEL 삽입단편을 나타내는 양성 클론이다. 5번 레인은 인간 Ifnβ을 발현하지 않는 클론이다. M = 분자량 표준.

도 36 은 ifn-양성 클론의 제한 분석 생성물을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. 왼쪽 패널은, 제한효소 EcoRI+SalI을 사용하여 CE-ifn-STOP 및 CE-ifn-KDEL 삽입단편 (화살표)을 포함하는 양성 클론의 제한 분석한 생성물을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다 (1번 내지 5번 레인). 1번 레인은 EcoRI+SalI 로 절단된 CE-ifn-KDEL-양성 클론 1 (도 35 참조)이다. 2번 레인은 EcoRI+SalI 로 절단된 CE-ifn-KDEL-양성 클론 2 (도 35 참조)이다. 3번 레인은 EcoRI+SalI 로 절단된 CE-ifn-STOP-양성 클론 1 (도 34 참조)이다. 4번 레인은 EcoRI+SalI 로 절단된 CE-ifn-STOP-양성 클론 2 (도 34 참조)이다. 5번 레인은 EcoRI+SalI 로 절단된 CE-Fx ("ifn" 삽입단편이 없음)이다. M = 분자량 표준. 오른쪽 패널은 제한효소 KpnI+XbaI를 사용하여 CE-ifn-STOP 및 CE-ifn-KDEL 삽입단편 (화살표)를 포함하는 양성 클론을 제한 분석한 생성물을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다 (6번 내지 9번 레인). 6번 레인은 KpnI+XbaI 로 절단된 CE-ifn-KDEL-양성 클론 1 (도 35 참조)이다. 7번 레인은 제한효소로 절단하지 않은 CE-ifn-KDEL-양성 클론 2 (도 35 참조)이다. 8번 레인은 제한효소로 절단하지 않은 CE-ifn-STOP-양성 클론 1 (도 34 참조)이다. 9번 레인은 KpnI+XbaI 로 절단된 CE-ifn-STOP-양성 클론 1 (도 34 참조)이다. M = 분자량 표준.

도 37 은, CaMV35S+Omega와 OCS 종결자 서열 사이에 연결된 인간 Ifnβ 코딩 서열을 포함하는, 연결된 CE-ifn-KDEL 구조체를 나타낸다. 제한효소의 인식 부위의 위치가 표시되어 있다.

도 38 은 제한효소 인식 부위가 표시된, pzp-ifn-KDEL 및 pzp-ifn-STOP 플라 스미드의 제조에 사용되는 pzp 111 이중 벡터 (binary vector)의 맵이다.

도 39 는, pzp-ifn-KDEL 및 pzp-ifn-STOP 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 LB4404로 형질전환된 당근 세포 클론에서 발현된 재조합 인간 Ifnβ 의 면역 검출을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다. 캘러스 (callus)를 항생제 선택물이 함유된 한천 (agar) 중에서 형질전환된 세포로부터 증식시킨 후, 개별 플레이트로 이전시켜 3 개월 동안 두었다. 형질전환된 캘러스의 세포 내용물 (1번 내지 10번 레인)을 추출하고, PAGE로 분리하고, 블롯팅하고, 재조합 인간 infβ를 친화 정제된 (affinity purified) 토끼의 항-인터페론 β 항체로 검출하였다. MW = 분자량 표준. St = 양성 대조: CHO 세포에서 발현된 3 ng의 재조합 인간 인터페론 β.

도 40 은, 전염성 F낭병 (infectious bursal disease) 바이러스의 바이러스성 단백질 2 (VPII) 코딩 서열 (화살표)를 PCR에 의해 증폭시킨 후 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. 1번, 2번 및 3번 레인은 VPII 서열이다. 4번 및 5번 레인은 각각 DNA 또는 중합효소가 없는 음성 대조 PCR 반응이다. MW1 은 λHE 분자량 표준이며, MW2 는 사다리의 분자량 표준이다.

도 41 은, CE-K 발현 카세트를 사용하여 이. 콜라이 DH5α로 클론된, 증폭된 VPII 코딩 서열을 전기영동으로 분리한 것을 나타낸다. CaMV35S+Omega 정방향 프라이머 및 OCS 종결인잔 역방향 프라이머를 사용한 삽입단편의 PCF 분석에 의해 양성 클론을 선택하였다 (도 37 참조). 1번 내지 6번 레인은 시험한 클론이다. 2번, 3번 및 5번 레인은 VPII 삽입단편을 갖는 양성 클론을 나타낸다. 7번 레인은 양성 대조물인 VPIII의 PCR 생성물이다. 8번 레인은 공 (empty) CE 카세트의 DNA 를 갖는 PCR 생성물이다. 9번 및 10번 레인은 각각 DNA 또는 중합효소가 없는, 음성 대조 PCR 반응물이다. M = 분자량 표준.

도 42 는 제한효소 인식 부위가 표시된, CE-VPII 플라스미드의 제조에 사용된 CE 이중 벡터의 맵이다.

도 43a 및 43b 는, pGA492-CE-VPII 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 LB4404으로 형질전환된 당근 세포 클론에서 발현된 재조합 VPII의 전기영동 분리 및 면역 검출을 나타내는 PAGE 분석 (43A) 및 웨스턴 블롯 (43B) 결과이다. 캘러스를 항생제 선택물이 함유된 한천 중에서 형질전환된 세포로부터 증식시킨 후, 개별 플레이트로 이전시켜 3 개월 동안 두었다. 형질전환된 캘러스의 세포 내용물 (2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13, 14 및 15번 레인)을 추출하고, PAGE로 분리하고, 블롯팅하고, 재조합 VPII를 닭의 항-IBDV 항체로 검출하였다 (도 43b). + = 양성 대조물 (VPII 단백질). 1번 및 9번 레인은 VPII 세포 현탁액 (전환품종계통 (transformation event)의 혼합물)이다. 4번 12번 레인은 "공"벡터 (empty vector)만으로 형질전환된 음성 대조 세포이며, 8번 및 16번 레인은 형질전환되지 않은 당근 세포의 내용물이다.

실시예 1

장치의 실례

본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 수반된 설명을 참조로 하면 더욱 잘 이해될 것이다. 도 1 내지 9는 본 발명에 따른 장치의 다양한 예시적 구현예를 도식적 으로 도시한 것이다.

하기에 더욱 상세히 설명할 본 발명에 따른 장치는 경우에 따라 제작 중에 및/또는 사용 전에 모든 구성요소를 갖추고 있을 수 있다. 대안적으로는, 상기 구성요소들은 이들 구성요소를 편리하게 조합함으로써 사용시점에서 생성될 수도 있다. 예를 들면, 임의의 하나 이상의 구성요소가 경우에 따라 상기 장치에 부가되어 사용시점에서 완전한 장치를 생성할 수도 있다.

도면을 참조하면, 도 1, 2 및 3은 각각 상기 장치의 제 1, 제 2 및 제 3 구현예에 상응하고, 일반적으로 (10)으로 표시되는 상기 장치는, 상단 (top end; 26) 및 하단 (bottom end; 28)을 갖는 투명 및/또는 반투명 용기 (20)을 포함한다. 상기 용기 (20)은, 바람직하게는 실질적으로 원통형인 측면 벽 (22)을 포함하거나, 적어도 둥근 모양을 특징으로 하나, 예를 들면 직사각형 또는 다각형과 같은 기타 모양도 적당할 수 있다. 바람직하게는, 상기 하단 (28)이 침강 (sedimentation)을 최소화하기에 적당한 모양을 갖는다. 예를 들면, 제 1 구현예에서는, 상기 하단 (28)이 실질적으로 원추대형이거나, 적어도 위쪽으로 경사진 벽 (29)을 포함한다. 제 2 구현예에서는, 상기 하단 (28)이 하나의 위쪽으로 경사진 벽 (29)을 포함한다. 제 3 구현예에서는, 상기 하단 (28)이 실질적으로 원통형이거나 또는 볼록형이다. 상술한 하단 (28)의 형태는 하단 (28) 근처의 유출구 (76) (이후에 기술됨)의 위치와 더불어, 유출구 (76)를 통해 공급된 공기가 하단에서 용기의 내용물이 혼합되게 움직이게 하여, 침강을 효과적으로 최소화시킨다. 그러나 상기 하단은 본 발명의 다른 구현예에서는 실질적으로 편평할 수도 있다. 상기 용기 (20)는 충 진가능한 내부 용적 (30)이 통상 5 내지 50 리터인데, 장치 (10)는 이와 달리 내부 용적이 50 리터 초과이거나 5 리터 미만일 수도 있다. 내부 용적 (30)은 이하에 기술하는 바와 같이, 적당한 살균된 생물학적 세포 및/또는 조직 배양 배지 (65) 및/또는 무균 접종물 (60) 및/또는 살균된 공기 및/또는 예를 들면 항생제 또는 살진균제와 같은 필요한 기타 살균된 첨가제로 채워질 수 있다. 전술한 구현예에서는, 상기 용기 (20)가 실질적으로 비-강성 (non-rigid)이고, 바람직하게는 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌과 나일론의 공중합체, PVC 및 EVA를 포함하는 군에서 선택된 비-강성 플라스틱 물질로 이루어진다. 경우에 따라, 상기 용기 (20)는 두 층 이상의 물질의 적층체로 이루어질 수 있다.

도 3 의 제 3 구현예에 나타난 바와 같이, 상기 용기 (20)는 경우에 따라 두 개의 동심원적 외부 벽 (24)을 포함하여, 기계적 강도를 증대시키고 용기 벽을 통한 내용물 오염의 위험성을 최소화할 수 있다.

제 1, 제 2 및 제 3 구현예에서는, 장치 (10)가 호기성 용도를 위한 것이다. 따라서 상기 용기 (20)는 공기방울 형태의 살균된 공기 (70)를 하나 이상의 공기 유입구 개구부 (72)를 통해 배지 (65) 중에 도입하기 위한 하나 이상의 공기 유입구를 추가로 포함한다. 상술한 구현예에서는, 공기 유입구가, 적당한 공기 공급원 (도시하지 않음)에 연결가능하고, 유입구 개구부 (72)로부터 용기 (20) 내부의 한 지점에까지, 하단 (28)의 바닥으로부터 d1의 거리를 두고 뻗어 있는 하나 이상의 도관 (74)을 포함하는데, d1 은 통상 1 cm 정도일 수 있으나, 1 cm 보다 크거나 작을 수도 있다. 상기 도관 (74)은 실리콘 또는 기타 적당한 플라스틱 물질로 이루 어질 수 있으며, 바람직하게는 유연하다. 따라서 상기 도관 (74)은 적당한 직경의 공기 유입구 (76)를 포함하여, 요구되는 평균 직경의 공기방울 (70)을 생성한다. 이들 공기방울은 배지 (65)를 폭기할 뿐만 아니라, 용기의 내용물을 혼합하는 역할을 하기도 하여, 앞서 기술한 바와 같이 하단 (28)에서의 침강을 최소화하기도 한다. 공기 유입구를 통해 전달되는 공기방울의 크기는 장치의 용도에 따라 달라지며, 직경이 1 mm에 훨씬 못 미치거나 10 mm를 초과한다. 일부 경우에서는, 특히 식물 세포에 대한 경우에는, 작은 공기방울들이 실제로 세포벽을 손상시킬 수도 있으며, 평균 직경 4 mm 이상의 공기방울은 이러한 잠재적인 문제를 실질적으로 극복한다. 다른 경우에서는, 훨씬 더 작은 공기방울이 유익하여, 살포기 (sparger)를 공기 유출구 (76)에 사용하여 공기방울의 크기를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에서는, 직경 10 mm 또는 그 이상의 공기방울이 최적일 수 있다. 경우에 따라, 유출구 (76)는 사슬 (tether; 도시하지 않음) 또는 당해 분야에 공지된 기타 수단을 통해 하단 (28)에 위치 고정될 수 있다.

또 다른 구현예에서는, 장치 (10)는 혐기성 용도를 위한 것이어서, 공기 유입구를 포함하지 않는다.

본 발명의 제 4 및 제 5 구현예에서는, 또한 도 5 및 6을 참조하면, 상기 장치 (10)는 또한 상단 (26) 및 하단 (28)을 갖는 투명 및/또는 반투명 용기 (20)를 포함한다. 상기 용기 (20)는, 본 발명의 제 4 구현예 (도 5)에 나타난 바와 같이, 바람직하게는 단면이 실질적으로 직사각형이며, 길이 대폭의 종횡비 (aspect ratio)가 크다. 따라서 제 4 구현예의 용기 (20)는 실질적으로 상자와 유사하며, 전형적인 높이-길이-폭의 치수가 각각 130 cm, 70 cm, 10 cm이다. 상기 장치의 높이 대 길이 비는 통상, 예를 들면 약 1 내지 약 3이며, 바람직하게는 약 1.85이다. 상기 장치의 높이-대-폭 비는 통상 5 내지 약 30이며, 바람직하게는 약 13이다.

대안적으로는, 본 발명의 제 5 구현예에 대한 도 6에 나타나 있는 바와 같이, 측면 벽 (22)은 실질적으로 아코디언 모양의 수평 단면을 포함하며, 용기 (20)의 길이를 따라 일련의 평행한 마루 (crest; 221)와 골 (trough; 222)이 번갈아 끼어있어서, 유체의 상호 소통에 있어서 일련의 인접한 챔버 (223)를 형성한다. 경우에 따라, 제 5 구현예의 측면 벽 (22)은 복수의 수직 웹 (web; 224)을 추가로 포함할 수 있는데, 각각은 마주보는 골의 한 쌍씩 내부적으로 결합하여, 각 챔버 (223)의 적어도 수직적 일부를 인접한 챔버 (223)로부터 분리시킨다. 상기 웹 (224)은 상기 용기 (20)로의 구조적 일체성을 증가시킬 뿐만 아니라, 용기 (20)를 더 작은 용적으로 효과적으로 분리하여, 순환 증대의 장점을 제공하기도 한다. 다시 말하면, 세포 순환을 촉진시키는 공기방울의 효용성은 더 큰 대등 용적에서보다 더 작은 에워싼 용적에서 훨씬 더 높다. 실제로, 복수의 더 작은 용적이 조합된 총 배지 용적에서보다, 큰 단일 용적 중에서 공기 순환을 촉진시키는 데에, 공기방울의 용적 유속이 비례적으로 더 커야 한다. 제 4 및 제 5 구현예에서는, 하단 (28)이 실질적으로 반-원통형이거나, 다르게는 볼록형이거나, 실질적으로 편평하거나 임의의 다른 적당한 모양을 가질 수 있다. 제 4 및 제 5 구현예에서는, 상기 용기 (20)는 충진가능한 내부 용적 (30)이 통상 10 내지 100 리터이나, 장치 (10)는 이와 달리 내부 용적이 100 리터 초과이거나 200 리터 초과일 수도 있다. 내부 용적 (30)은, 이하에 기술하는 바와 같은 적당한 살균된 생물학적 세포 및/또는 조직 배양 배지 (65) 및/또는 무균 접종물 (60) 및/또는 살균된 공기 및/또는 예를 들면 항생제 또는 살진균제와 같은 필요한 기타 살균된 첨가제로 채워질 수 있다. 전술한 제 4 및 제 5 구현예에서는, 상기 용기 (20)가 실질적으로 비-강성이고, 바람직하게는 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌과 나일론의 공중합체, PVC 및 EVA를 포함하는 군에서 선택된 비-강성 플라스틱 물질로 이루어진다. 경우에 따라, 상기 용기 (20)는 두 층 이상의 물질의 적층체로 이루어질 수 있다.

제 1, 제 2 및 제 3 구현예에서와 같이, 제 4 및 제 5 구현예의 장치 (10) 또한 호기성 용도를 위한 것이다. 제 4 및 제 5 구현예에서는, 상기 용기 (20)가 공기방울 형태의 살균된 공기 (70)를 복수의 공기 유입구 개구부 (72)를 통해 배지 (65) 중에 도입하기 위한 하나 이상의 공기 유입구를 추가로 포함한다. 제 4 및 제 5 구현예에서는, 공기 유입구가, 적당한 공기 공급원 (도시하지 않음)에 연결가능하고, 복수의 이차 유입구 도관 (741)와 소통하고 있는 하나 이상의 공기 유입구 도관 (74)을 포함하는데, 각각의 이차 유입구 도관 (741)은 유입구 개구부 (72)로부터 용기 (20) 내부의 한 지점에까지, 하단 (28)의 바닥으로부터 d1의 거리를 두고 뻗어 있고, d1 은 통상 1 cm 정도일 수 있으나, 1 cm 보다 크거나 작을 수도 있다. 상기 복수의 유입구 개구부 (72)는 적당한 거리 d5 를 두고 서로 수평적으로 배치되며, d5 는 약 5 cm 내지 약 25 cm, 바람직하게는 약 10 cm 이다. 상기 하나 이상의 공기 유입구 도관 (74) 및 이차 유입구 도관 (741)은 실리콘 또는 기타 적당한 플라스틱 물질로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유연하다. 따라서 각각 의 이차 유입구 도관 (741)은 적당한 직경의 공기 유입구 (76)를 포함하여, 요구되는 평균 직경의 공기방울 (70)을 생성한다. 이들 공기방울은 배지 (65)를 폭기할 뿐만 아니라, 용기의 내용물을 혼합하는 역할을 하기도 하여, 앞서 기술한 바와 같이 하단 (28)에서의 침강을 최소화하기도 한다. 공기 유입구를 통해 전달되는 공기방울의 크기는 장치의 용도에 따라 달라지며, 직경이 1 mm에 훨씬 못 미치거나 10 mm를 초과한다. 일부 경우에서는, 특히 식물 세포에 대한 경우에는, 작은 공기방울들이 실제로 세포벽을 손상시킬 수도 있으며, 평균 직경 4 mm 이상의 공기방울은 이러한 잠재적인 문제를 실질적으로 극복한다. 다른 경우에서는, 훨씬 더 작은 공기방울이 유익하여, 살포기 (sparger)를 하나 이상의 공기 유출구 (76)에 사용하여 공기방울의 크기를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에서는, 직경 10 mm 또는 그 이상의 공기방울이 최적일 수 있다. 경우에 따라, 각각의 유출구 (76)는 사슬 (도시하지 않음) 또는 당해 분야에 공지된 기타 수단을 통해 하단 (28)에 위치 고정될 수 있다.

본 발명의 제 4 및 제 5 구현예는 비교적 큰 용적의 접종물을 처리하기에 특히 적합하다.

상술한 모든 구현예에서, 상기 공기 유입구는 경우에 따라 용기 (20) 내의 공기압을 모니터링하기 위한 적당한 압력 게이지를 포함한다. 바람직하게는, 압력 게이지는 적당한 셧-오프 밸브 (shut-off valve)에 작동가능하게 연결되거나 또는 포함하며, 상기 밸브는 용기 (20) 내의 압력이 소정의 값을 초과하는 경우 용기로의 공기 공급을 차단하도록 설정될 수 있다. 상기와 같은 시스템은, 예를 들어 폐 가스의 배출을 차단하는 경우에 유용한데, 이는 용기 (20) 내부의 압력이 누적되어 마침내 용기가 폭발할 수 있기 때문이다.

상기 용기 (20)는 용기 (20)로부터 과량의 공기 및/또는 폐가스를 제거하기 위한 하나 이상의 가스 유출구를 추가로 포함한다. 이들 가스는 용기 (20)의 상단 (26)에 모인다. 상기 가스 유출구는 상기 상단 (26)에 또는 그 근처에, 하단 (28)의 바닥으로부터 거리 d4 를 두고 유입구 (96)를 갖는 도관 (90)을 포함할 수 있는데, d4 는 예를 들면 제 1, 제 2 및 제 3 구현예에서는 통상 90 cm이다. 상기 도관 (90)은 실리콘 또는 기타 적당한 플라스틱 물질로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유연하다. 도관 (90)은 공지된 메커니즘에 의한 적당한 배기장치 (도시되지 않음)에 연결가능하다. 상기 배기장치는 추가로 상기 가스 유출구를 통해 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 차단기 (blocker), 예컨대 적당한 한방향 밸브 (one-way valve) 또는 필터 (통상 0.2 마이크로미터 필터)를 추가로 포함한다. 상기 상단 (26)의 적어도 일부는 폐가스가 유입구 (96)를 통해 제거되기 전에 모이기에 용이하도록 적당한 형태를 갖출 수 있다. 따라서 제 1 및 제 2 구현예에서는, 상기 상단 (26)의 윗부분이 점차 좁아져서 상기 유입구 (96) 지점 근처의 단면적이 최소값이 된다. 대안적으로는, 상기 상단 (26)의 적어도 윗부분이 상응하게 실질적으로 원추대형이거나 볼록형일 수 있다. 제 4 및 제 5 구현예에서는, 상기 상단 (26)이 예를 들면 볼록형이거나 비교적 편평할 수 있으며, 상기 유입구 (96)는 상단 (26)의 수평 말단에 또는 그 근처에 편리하게 위치할 수 있다.

상기 용기 (20)는 접종물 및/또는 배지 및/또는 첨가제를 용기 내로 도입하기 위한 첨가제 유입구를 추가로 포함할 수 있다. 상술한 구현예에서는, 상기 첨가제 유입구가 유출구 (86)를 갖는 적당한 도관 (80)을 포함하며, 이는 바람직하게는 상단 (26)에 또는 그 근처에, 하단 (28)의 바닥으로부터 d3의 거리를 두고 위치하는데, 예를 들면 제 1 구현예에서는 d3이 통상 대략 68 cm이다. 상기 도관 (80)은 실리콘 또는 기타 적당한 플라스틱 물질로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유연하다. 도관 (80)은 공지된 연결기 (connector)에 의해 적당한 살균된 접종물 및/또는 배지 및/또는 첨가제의 공급원에 연결가능하다. 상기 첨가제 유입구는 첨가제 유입구를 통해 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 차단기를 추가로 포함하며, 이들 구현예에서는 적당한 한방향 밸브 또는 필터 (84)를 포함한다. 통상, 상기 용기 (20)의 내용물의 수위는 유출구 (86)의 수위 아래에 머무른다.

상기 용기 (20)는, 원하는 경우 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 적어도 목적하는 첫 번째 분량을 수확하기 위한, 재사용가능한 수확기를 추가로 포함함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 후속 배양 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 한다. 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 남은 두 번째 분량은, 배지 및/또는 필요한 첨가제가 제공되는, 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 한다. 상기 수확기는 또한 원래 용적의 접종물을 용기 내로 도입하는 데 사용될 수도 있으며, 수확된 물질이 용기를 통해 밖으로 흘러나갈 수 있게 하기도 한다.

상술한 구현예에서는, 상기 수확기가 내부 용적 (30)과 소통하는 유입구 (52), 및 용기 (20) 외부의 유출구 (56)를 갖는 도관 (50)을 포함한다. 상기 도관 (50)은 실리콘 또는 기타 적당한 플라스틱 물질로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유연하다. 상기 도관 (50)은, 이를 통해 흐르는 수확된 세포 및/또는 조직이 좁은 도관을 막아버릴 수도 있는 세포 입자 덩어리를 함유할 수 있기 때문에, 직경이 비교적 크며, 통상 약 2 cm이다. 바람직하게는, 유입구 (52)는, 유입구 (52) 위에 있는 용기 내용물만 수확되도록, 용기 (20)의 하단 (28) 근처에 위치한다. 따라서 각 수확 사이클의 완료 시, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 두 번째 분량이 자동적으로 용기 (20)의 하단 (28)에 남는데, 하단 (28)의 바닥으로부터 d2의 거리를 두고 있는, 유입구 (52)의 수위 (51) 아래의 일정 수위까지 남는다. d2 는 통상적으로 제 1 구현예에서는 약 25 cm이나, 반드시 그렇지는 않다.

경우에 따라 그리고 바람직하게는, d2 는 용기 (20)의 용적에 따라 선택되는데, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 잔류하는 분량이 용기 (20) 용적의 목적하는 분획이 되도록 선택된다. 또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 샘플을 취하기 위한 부가적 샘플링 포트가 제공될 수 있다 (도시되지 않음). 상기 샘플링 포트는 바람직하게는 수확기와 같이 유입구 및 도관을 갖는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 수확기 위쪽에 위치한다. 다른 포트(들) 또한 경우에 따라 제공될 수도 있다.

대안적으로, 유입구 (52)는 용기 (20)의 가장 낮은 지점에 위치할 수 있는데, 세포 및/또는 조직 및 배지를 원하는 분량만큼 수확한 후에 상기 용기 (20)에 적당한 분량의 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지가 남아있을 수 있도록, 경우에 따라 작동자가 수동으로 조절할 수 있게 하기 위해서이다. 대안적으로는, 경우에 따라 배지가 한꺼번에 제거될 수도 있다. 수확기는, 수확기를 통해 용기 (20) 안팎으로 물질이 흐르는 것을 차폐시키거나 허용하기 위해, 적당한 밸브 (54) 및/또는 무균 연결기 (55)와 같은 흐름 제어기를 추가로 포함한다. 통상, 무균 연결기 (55)는 스테인리스 스틸로 이루어지며, 이의 다양한 예가 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 상기 수확기는 수확 후에 수확기를 통해 오염물이 용기 내로 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 오염 방지기를 추가로 포함한다.

제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 구현예에서는, 오염 방지기가 유체 트랩 (300)을 포함한다. 상기 유체 트랩 (300)은 바람직하게는 실질적으로 U자 모양의 중공형 튜브 형태이며, 예를 들면 도 1의 제 1 구현예에서와 같이, 상기 유체 트랩의 한쪽 가지는 수확기의 유출구 (56)에 장착되며, 다른 쪽 가지는 외부 개구부 (58)를 갖는다. 수확된 세포/조직은 수확기, 유체 트랩 (300) 및 개구부 (58)를 통해 장치 (10) 밖으로 흘러나가, 그 후 이하에 기술하는 바와 같은 적당한 수용 탱크에 수집될 수 있다. 수확이 끝난 다음에는, 수확된 물질의 부분적인 역류와 함께 공기가 개구부 (56)를 통해 수확기 내로 도입됨으로써, 잠재적으로 장치 내로 오염물이 도입될 수 있다. 상기 U자형 튜브 (300)는, 일부 수확된 물질, 즉 세포/조직을 개구부 (56) 하류쪽에 잡아두어, 공기 및 가능한 오염물이 수확기로 들어가는 것을 방지함으로써, 이와 같은 잠재적 문제점을 실질적으로 극복한다. 일단 수확기가 밸브를 통해 차폐되면, 상기 U자형 튜브 (300)는 제거되고 통상 다음번 사 용을 위해 살균되거나 폐기된다. 상기 U자형 튜브 (300)는 스테인리스 스틸 또는 기타 적당한 강성 플라스틱 물질로 이루어질 수 있다. 상술한 구현예에서, 세포 및/또는 조직을 함유하는 배지의 나머지 두 번째 분량은 배지 및 접종물의 원래 용적의 10% 내지 20%를 포함하나, 원하는 경우, 두 번째 분량은 원래 용적의 20% 초과, 45% 이상까지이거나, 또는 10% 미만, 2.5% 이하까지일 수 있다.

장치 (10)는 경우에 따라, 장치를 매달린 지지체 구조물에 부착시키기 위한 부착기 (attacher)를 추가로 포함한다. 상술한 구현예에서, 지지체 구조물은 막대기 (100) (도 1, 2, 5) 또는 고리 (도시되지 않음)를 포함할 수 있다. 제 3 구현예에서는, 상기 부착기가 바람직하게는 용기 (20)의 상단 (26)에 일체형으로 부착된 후크 (25)를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 그리고 도 1 및 2의 제 1 및 제 2 구현예에서 각각 나타난 바와 같이, 상기 부착기는 바람직하게는 유연성이고 실질적으로 원통형이며, 적당한 물질, 통상 용기 (20)에 사용된 것과 동일한 물질로 이루어진 루프 (27)를, 상기 장치의 상단 (26)에 일체형이거나 거기에 적절히 부착되게 (예를 들면 융합 용접을 통해) 포함할 수 있다. 대안적으로는, 그리고 도 5의 제 4 구현예에 나타난 바와 같이, 부착기는 용기 (20)의 측면 벽 (22)에 용기의 깊이 전체에 뻗어 있게 만들어진, 바람직하게는 유연성이고 실질적으로 원통형인 간극 (227)을 포함할 수 있다. 상기 제 5 구현예는 경우에 따라, 바람직하게는 상기 장치 (10)의 상단 (26)에 일체형으로 또는 적절하게 부착된 일련의 후크 (도시되지 않음)에 의해 지지될 수 있다.

경우에 따라, 상기 용기는 적당한 지지체 재킷 (support jacket)으로 지지될 수 있다. 예를 들면, 제 4 구현예에서는, 상기 장치 (10)가, 아주 약간 부풀어 있는 경우에, 적어도 장치의 측면벽 (22) 및 하단 (28)의 기준이 되는 외부 형상을 보완하는 크기 및 모양을 가진, 내부 용적을 포함하는 적당한 외부 지지체 구조물로 구성된 지지체 재킷으로 지지될 수 있다. 상기 외부 지지체 구조물은 실질적으로 연속적이고, 상기 장치 (10)의 유입구 및 유출구로 통하도록 하는 개구부를 가질 수 있으며, 장치 (10)가 지지체 재킷 내부로 삽입되거나 제거되게 하는 적당한 문 또는 개구부를 측면, 꼭대기 또는 바닥에 추가로 포함한다. 상기 장치의 기준 도형은 상기 장치가 고안된 용량으로 부풀어 있을 때의 장치 (10)의 모양으로 정의될 수 있다. 이 시점에서, 그 모양은 명목상의 고안된 모양이며, 따라서 그 내부 용적은 명목상의 고안된 용적량이다. 그러나 상기와 같은 유연한 벽을 가진 장치가 실제로 액상 매체로 채워져 있을 때에는, 상기 장치의 형상이 기준 도형과 어긋나게 되는 경향이 있어서, 압력이 가장 높은 장치의 바닥이 우선적으로 불룩해지고, 벽 물질에 대해 응력이 상당히 증가는 경향이 있다. 예를 들면 상기한 바와 같고 필요한 구조적 공헌을 하는 지지체 재킷은 또한 장치의 형상을 유지하도록 도우며, 벽의 응력을 감소시켜, 예를 들면 측면 벽 (22)의 파열 위험성을 최소화하고, 따라서 각 장치의 작업 수명을 연장시킨다.

대안적으로는, 상기 용기는 적당한 지지체 구조물로 지지될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 제 4 및 제 5 구현예에서는, 상기 장치 (10)가, 예를 들면 도 9에 도시한 바와 같은 마주보는 틀 (405) 한 쌍을 포함하는 지지체 구조물 (400)로 지지될 수 있다. 각 틀 (405), (406)은 통상 실질적으로 평행하고 수평적인 상부 및 하부 각각의 하중된 (load-carrying) 부재 (410) 및 (420)을 포함하는 직사각형인데, 이들 부재는 적어도 하중된 부재 (410), (420)의 각 세로 방향 극단에서 복수의 실질적으로 평행인 수직 지지체 부재 (430)에 의해 간격을 두고 있고, 상기 수직 지지체 부재는 상기 상부 및 하부의 하중된 부재 (410) 및 (420) 각각에 일체형으로 또는 달리 적당하게 결합되어 있다. 각 틀 (405) 및 (406)의 하부 지지체 부재 (420)는, 용기 (20)의 하단 (28)의 상응하는 부분을 수용하고 지지하기에 적합한, 적당한 모양의 하부 지지체를 포함한다. 통상, 상기 하부 지지체는 각각의 하부 지지체 부재 (420)로부터 마주보는 틀의 방향으로 튀어나온 적당한 모양의 플랫폼의 형태를 취할 수 있다. 다르게는, 상기 하부 지지체는 각각의 하부 지지체 부재 (420)로부터 마주보는 틀의 방향으로 튀어나온, 복수의 적당한 모양을 가진 탭 (tab; 460) 형태를 취할 수도 있다. 상기 틀 (405), (406)은 서로에 대해 전략적으로 배치된 간격 막대 (450)에 의해 간격을 두고 있는데, 상기 용기 (20)가 지지체 구조물 (400)로부터 비교적 쉽게 제거되고 새로운 용기 (20)가 제 위치로 이동할 수 있도록, 즉 지지체 틀 (400)을 분해할 필요가 없도록 되어있다. 상기 간격 막대 (450)는 예를 들면 용접되어 상기 틀 (405), (406)에 일체형으로 연결될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 상기 간격 막대 (450)는, 상기 틀 (405), (406)이 서로 분리될 수 있고, 또한 다양한 크기의 간격 막대를 사용하여 상기 틀 (405), (406)을 연결할 수 있게 함으로써, 상기 지지체 구조물 (400)이 다양한 폭 범위의 용기 (20)와 함께 사용될 수 있도록, 상기 틀 (405), (406)에 떼어낼 수 있게 연결된다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 틀 (405), (406)은 각각 하나 이상 의 상호분리대 (interpartitioner; 470)를 포함한다. 상호분리대 (470)는 각 틀 (405), (406)로부터 마주보는 틀의 방향으로 튀어나온 수직 웹의 형태를 취할 수 있으며, 소정의 위치에서 측면 벽 (22)을 미는 역할을 하여, 마주보는 쌍의 상호분리대 (470)가 상기 소정의 위치에서 용기 (20)의 폭을 효과적으로 축소시킴으로써, 인접한 마주보는 쌍의 상호분리대 (470) 사이에, 예를 들면 용기 (20)의 내부 공간 (30)의 구획 또는 반-구획을 생성하도록 한다. 따라서 상기 상호분리대 (470)는 통상 제 4 구현예 (도 5 참조)에 따른 용기 (20)의 측면 벽 (22)을, 제 5 구현예 (도 6 참조)의 측면 벽 (22)의 모양을 닮은 모양으로 변형시킬 수 있다. 물론, 본 발명의 제 5 구현예에 따른 용기 (20)를 사용하는 경우에는, 상기 상호분리대 (470)는 상기 틀 (405), (406) 상에 측면 벽 (22)의 골 (222)과 맞물리도록 배치되어, 용기 (20)의 모양을 유지하는 데 특히 유용하다. 따라서 각 틀 상의 인접한 상호분리대 (470)는 서로 거리 (d5)를 두고 유리하게 배치되어 있다. 바람직하게는, 상호분리대 (470)는 적당한, 실질적으로 수직인 부재 (472)를 포함하는데, 이들 수직 부재는 상기 상부 및 하구의 지지체 부재 (410), (420)로부터, 각각 적당한 상부 및 하부의 스트럿 (476), (474)으로써 마주보는 틀을 향한 방향으로 간격을 두고 있다. 상기 지지체 구조물 F (400)는 따라서, 특히 제 4 및 제 5 구현예의 용기 (20)를 위한 구조적 지지체를 제공할 뿐만 아니라, 각각의 하중된 부재 사이에 열린 공간을 많이 제공하여, 공기 유입구, 가스 유출구, 수확기 및 첨가제 유입구가 각각 그곳을 통과할 수 있게 하기도 한다. 경우에 따라, 지지체 구조물 (400)은, 예를 들면 공장 환경 내에서 용기 (20)의 이송을 용이하게 하는 롤러 또 는 다리 바퀴 (caster; 480)를 포함할 수 있다.

상기 용기 (20)는 경우에 따라 앞에서 예시한 바와 같이, 소정의 이음새를 따라 두 장의 적당한 재료의 시트를 융합 접합시켜 형성할 수 있다. 예를 들어 제 1 및 제 2 구현예를 참조하면, 두 장 (200)의 재료 시트를 대략 길게 늘인 직사각형 모양으로 절단하여, 도 4에서처럼 서로 겹쳐 포갤 수 있다. 상기 시트는 이어서 당해 분야에 공지된 방식으로 함께 융합 접합시켜, 두 개의 더 긴 모서리의 둘레 (205) 및 (206)를 따라, 그리고 더 짧은 끝 (210) 중 하나의 둘레를 따라 이음새를 형성하고, 다시 평행하게 안쪽으로 대체하여 용기 (20)의 상단에서 이음새 (220)를 형성한다. 긴 쪽을 따라, 상기 평행한 짧은 끝의 이음새 (210) 및 (220) 상에 위치한 융합 용접 이음새 (207) 및 (208)는 절단하거나, 또는 제거하여, 효과적으로 물질 (27)의 루프를 남긴다. 용기 (20)의 하단은 두 개의 경사진 이음새 선 (230) 및 (240)을 따라 상기 시트의 남은 짧은 끝을 융합 접합하고, 긴 쪽의 이음새 (205) 및 (206)으로부터 서로 한 점으로 모이도록 하여 형성된다. 경우에 따라, 두 개의 경사진 이음새 선 (230) 및 (240)이 상기 정점 위에서 또 다른 융합 용접된 이음새 선 (260)에 의해, 대략 상기 긴 쪽의 이음새 (205) 및 (206)에 직각이 되도록 결합될 수도 있다. 상기 두 장의 시트를 함께 융합 용접하기 전에, 강성인 플라스틱 돌기 (boss) (270), (290), (280) 및 (250)이 각각 공기 유입구, 가스 유출구, 첨가제 유입구 및 수확기에 해당하는 위치에서 융합 용접될 수도 있다. 이들 돌기는 각각의 상응하는 유입 및 유출에 대해 적당한 기계적 부착점을 제공한다. 본 발명의 제 3, 제 4 및 제 5 구현예는 실질적으로 상기한 바와 같이, 필요 에 따라 변경을 가하여, 제 1 및 제 2 구현예와 유사한 방식으로 제조될 수 있다.

모든 구현예에서, 상기 장치 (10)는 생물학적으로 적합하고 상기 용기가 첫 번째 사용 전에 살균될 수 있게 하는 물질 또는 물질들로 이루어진다.

실시예 2

시스템의 실례

본 발명은 또한, 세포 및/또는 조직을 순환적으로 무균 배양 및 수확하기 위한 일회용 장치의 대열 (battery)로서, 복수의 이러한 장치는 각각 앞서 제 1 내지 제 5 구현예를 참조로 하여 정의되고 기술된 장치 (10)과 구조적으로 또 작동 측면에서 유사하다.

도 10 을 참조하면, 대열 (500)은, 제 1 내지 제 5 구현예 중 어느 하나에 대해 앞서 기술한 바와 같은 장치 (10)를 복수 개 포함하며, 이들 장치는 예를 들면 부착기 또는 지지체 구조물 (400)로써 하나 또는 여러 개의 틀 (도시되지 않음) 상에 수용된다. 통상, 상기 대열 (500)은 몇 개의 군으로 나뉠 수 있으며, 각 군은 몇 개의 장치 (10)를 포함한다.

상기 대열 (500)의 바람직한 구현예에서는, 각 군 내 장치 (10)의 공기 유입구들이 상호연결되어 있다. 따라서 상기 군의 각 장치의 공기 유입구 도관 (74)은 연결되지 않은 말단 (170)을 갖는 공동의 도관 (174)에 연결되어 있으며, 상기 말단에는 무균 연결기 (175)가 제공된다. 살균된 공기는 하나 이상의 필터와 같은 적당한 살균기 (sterilizer) 또는 차단기 (110)를 갖는 적당한 공기 압축기 (air compressor; 130)에 의해 제공된다. 상기 압축기 (130)는 무균 연결기 (176)를 갖 는 전달 도관 (delivery pipe; 101)을 포함하며, 상기 전달 도관의 연결되지 않은 말단은 통상 공동 도관 (174)의 연결되지 않은 말단에 위치한 무균 연결기 (175)에 연결가능하다. 이러한 연결은 각 성장/수확 사이클의 수행 시작 시에, 상기 연결 중에 살균 조건이 확실히 유지되도록 이동성 살균 후드 (380)에서 이루어진다. 상기 살균 후드 (380)는 실질적으로 살균된 조건 하에서 상기 장치 (10) 군에 대해 공기, 배지, 접종물 및 수확된 세포와 같은 다양한 서비스를 연결하기 위한, 간단하고 비교적 저렴한 시스템을 제공한다. 마찬가지로, 각 성장/수확 사이클의 완료 시에는, 상기 연결기 (175) 및 (176)이 살균 후드 (380) 내에서 단절되며, 사용된 장치는 폐기되고, 상기 압축기 말단의 연결기 (175)는 새로운 장치 군의 연결기 (176)에 연결되도록 한다. 살균된 공기는 각 배양 사이클 중에 통상 연속적으로 제공되거나, 다르게는 소정의 펄스 방식으로 제공된다.

상기 대열 (500)의 바람직한 구현예에서는, 각 장치 (10)로부터의 과량의 공기 및/또는 폐가스가 각각 상응하는 가스 유출구 (90)에 적당히 연결된 공동 도관 (290)을 통해 대기 중으로 제거된다. 공동 도관 (290)에는, 오염물이 장치 (10) 내로 흘러들어오는 것을 방지하기 위한, 하나 이상의 필터와 같은 적당한 오염 방지기 (210)가 제공된다. 다르게는, 각 장치 (10)의 가스 유출구 (90)는, 바람직하게는 오염물이 장치 (10) 내로 흘러들어오는 것을 실질적으로 방지하는 적당한 필터를 통해, 개별적으로 대기 중으로 통풍될 수도 있다.

배지 및 첨가제는 하나 이상의 수용 탱크 (340)에 담겨져 있다. 예를 들면, 미량원소, 다량원소 및 비타민이 상이한 탱크에 수용될 수 있는 반면, 항생제 및 살진균제와 같은 첨가제도 또 다른 별도의 탱크 내에 수용될 수 있다. 각 탱크에 수반된 펌프 (345)는 배지 및/또는 첨가제의 각 성분이 원하는 상대적 비율로, 소정의 제어가능한 유속으로 고정 혼합기 (350)에 전달되도록 하며, 상기 고정 혼합기를 통해 물 (증류되거나, 적당히 여과 및 정제된 것)이 적당한 공급원 (360)으로부터, 바람직하게는 적당한 펌프 (365)의 도움 하에 흘러들어온다 (도 10). 예를 들면, 펌프 (345) 및 (365)의 유속을 조절함으로써, 장치 (10) 내로 전달될 이용가능한 배지 및 첨가제의 농도가 제어될 수 있다. 물과 혼합된 배지 및/또는 첨가제는 이어서 살균 조건 하에 필터 (310), 및 연결되지 않은 말단 (390)에 무균 연결기 (375)를 갖는 전달 도관 (370)을 통해 상기 고정 혼합기 (350)로부터 전달될 수 있다.

상기 대열 (500)의 바람직한 구현예에서는, 장치 군 내에서 각각의 상응하는 장치 (10)의 첨가제 도관 (80)의 유입구는 공동 도관 (180)을 통해 상호연결되는데, 상기 공동 도관은 연결되지 않은 말단에 공동 무균 연결기 (376)를 포함한다. 공동 무균 연결기 (376)는 또 살균 후드 (380) 내에서, 배지 및 첨가제 도관 (370)의 연결되지 않은 말단 (390)에 있는 무균 연결기 (375)에 연결되어, 상기 대열 또는 상기 군의 각 장치 (10)에 배지 및 첨가제가 공급되게 할 수 있다. 상기 장치 (10)의 수명이 다한 후, 그리고 이를 폐기하기 전에, 상기 무균 연결기 (375) 및 (376)은 살균 후드 내에서 단절된다. 무균 연결기 (375)는 이제, 다음 회의 배양/수확 사이클을 위해 준비된, 상기 대열 중 후속의 새로운 살균된 장치 (10) 군의 새로운 무균 연결기 (376)에 연결될 준비가 된다.

상기 살균 후드 (380)는 또한 경우에 따라, 대열 내 복수 개의 장치 (10) 군 중 각각에, 이들 군의 장치의 유효 수명 중에, 배지/첨가제 탱크 (350)를 연결하는 데 사용될 수 있다. 따라서 한 장치 군이 배지/첨가제로 공급받았을 때, 이 군의 무균 연결기 (376)는 살균 후드 (380) 내에서 일시적으로 무균 밀폐된 후, 다음 장치 군으로 옮겨져서, 이 군의 공동 무균 연결기 (376)가 상기 도관 (370)의 무균 연결기 (375)에 연결되어, 이 장치 군에 배지/첨가제가 공급되게 한다.

상기 대열 (500)의 다른 구현예에서는, 이동성 살균 후드 (380)가, 고정 혼합 탱크 (350)에 연결된, 바람직하게는 유연성인 전달 도관의 연결되지 않은 말단 (390)과 각 장치 (10)의 첨가제 유입구를 함께 연결하는 데 사용될 수도 있다. 상기 살균 후드 (380)는 이어서 한 장치 (10)로부터 다음 장치로 이동될 수 있고, 매번 상기 말단 (390)이 상응하는 도관 (80)의 유입구 말단에 연결되어, 각 장치에 배지가 제공될 수 있게 한다. 바람직하게는 스테인리스 스틸로 이루어진 상기 살균 후드 (380)는, 무균 연결기와 함께, 각각 상응하는 장치 (10)의 도관 (80)의 말단 (390) 및 유입구에서, 각 장치 (10)가 살균 조건 하에서 상기 말단 (390)에, 따라서 배지 공급원에 용이하게 연결되고 또 단절될 수 있게 한다. 두 개의 도관을 연결하는 적당한 연결기의 많은 다른 예가 당해 분야에 잘 알려져 있다. 적당한 필터가 상기 말단 (390)에, 그리고 상기 도관 (80)에 각각 제공되어 용기 내용물의 잠재적 오염을 방지하거나, 적어도 최소화한다. 상기 살균 후드 (380)는 따라서 자동으로 또는 수동으로 장치 (10)에서 장치 (10)로 이동될 수 있으며, 각 장치에서는 작동자가 살균 후드 (380)를 사용하여 상기 장치 (10)를 배지 공급원에 연결 하고, 장치를 적당한 양의 배지 및/또는 첨가제로 채운 후, 장치로부터 살균 후드 (380)를 단절시킨 다음, 다음 장치로 이동시킬 수 있다. 물론, 상기 말단 (390)은 단 하나의 살균된 연결기 (375)보다는 복수의 연결기 (375)를 포함하도록 개조되어, 하나보다는, 상응하는 연결기 (376)를 갖는 유사한 복수의 장치 (10)가 트롤리 (trolley; 380)를 통해 배지 공급원에 한꺼번에 연결될 수 있게 할 수 있다.

매번, 말단 (390)을 각 장치 또는 장치 세트 또는 군에 연결하기 전에, 상응하는 연결기 (375) 및 (376)는 통상, 예를 들면 오토클레이브를 통해 살균된다.

상기 대열 (500)의 또 다른 구현예에서는, 단일 도관 또는 한 세트의 도관 (도시되지 않음)이 고정 혼합기 (350)를 각각 하나의 장치 (10) 또는 상응하는 장치 (10)의 세트에 한꺼번에 연결하며, 여기서 컨베이어 (conveyor) 시스템이 상기 장치 (10) 또는 장치 (10) 세트를 각각 단일 도관 또는 도관 세트로 운반하거나, 그 반대로 한다. 상기 장치 (10) 또는 장치 (10)의 세트를 충진한 후, 상기 컨베이어는 또 다른 장치 (10) 또는 또 다른 장치 (10) 세트를 각각 단일 도관 또는 도관 세트를 통해 고정 혼합기 (350)에 연결될 수 있게 한다.

상기 대열 (500)의 바람직한 구현예에서는, 상기 군의 각 장치 (10)의 수확기가 상호연결된다. 따라서 각 장치 (10)의 수확용 도관 (50)은, 무균 연결기 (155)가 제공된, 연결되지 않은 말단 (150)을 갖는 공동 수확용 도관 (154)에 연결된다. 바람직하게는, 각각의 수확용 도관 (50)은 상기 기술한 바와 같은 밸브 (54)를 포함하여, 각 상응하는 장치 (10)로부터 수확된 세포의 흐름을 차단시키거나 허용할 수 있게 한다. 따라서 예를 들어 특정 군의 장치 몇 개가 오염되고 다 른 장치는 오염되지 않았다고 판단되는 경우, 상기 오염된 장치의 밸브 (54)가 닫혀있는 한, 상기 오염되지 않은 장치 내의 세포는 오염된 장치로부터의 오염을 염려하지 않고도 수확될 수 있다. 바람직하게는, 공동 도관은 무균 연결기 (155)의 상류쪽에 공동 셧-오프 밸브 (259)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 수확 후에 수확기를 통해 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위해 오염 방지기가 제공된다.

상기 바람직한 구현예에서는, 상기 오염 방지기는 실질적으로 U자 모양의 유체 트랩 (400)을 포함하는데, 이 유체 트랩은 한쪽 가지에는 무균 연결기 (156)를 가지고, 다른 쪽 가지에는 수용 탱크 (590)와 유체가 소통하는 개구부 (158)를 갖는다. 상기 무균 연결기 (155) 및 (156)은 이제 살균 조건 하에서 상기 이동성 살균 후드 (380) 내에서 상호연결된다. 다음에는, 장치 군 내 오염되지 않은 모든 장치의 밸브 (54), 및 공동 밸브 (259)를 열어서 수확을 실시한다. 상기 군으로부터 얻은 세포는 이어서 수용 탱크 (590)로, 바람직하게는 중력 하에 유입되나, 일부 경우에는 적당한 펌프가 사용될 수도 있다. 수확이 완료된 후에는, 상기 무균 연결기 (155) 및 (156)이 살균 후드 (380) 내에서 단절될 수 있으며, 상기 살균 후드는 이어서 다음 장치 (10) 군으로 이동될 수 있다. 이 군의 상응하는 무균 연결기 (155)는 이어서 상기 U자형 튜브 (400)의 무균 연결기 (156)에 상호연결되어, 상기 장치 군의 세포가 수확될 수 있게 한다.

상기 대열 (500)의 또 다른 구현예에서는, 단일 도관 또는 한 세트의 도관 (도시되지 않음)이 공동 수용 탱크를 각각 하나의 장치 (10) 또는 상응하는 장치 (10)의 세트에 한꺼번에 연결할 수 있고, 여기서 컨베이어 시스템이 상기 장치 (10) 또는 장치 (10)의 세트를 각각 상기 단일 도관 또는 도관 세트로 이송하거나, 그 반대로 한다. 상기 장치 (10) 또는 장치 (10)의 세트로부터 수확한 후에는, 상기 컨베이어는 또 다른 장치 (10) 또는 장치 (10)의 세트가 각각 단일 도관 또는 도관 세트를 통해 상기 공동 수용 탱크에 연결될 수 있게 한다.

상기 대열 (500)의 또 다른 구현예에서는, 각 장치 (10)가 개별적으로 수확될 수 있으며, 여기서 각 장치의 수확기는 수확 후에 수확기를 통해 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 오염 방지기를 포함한다. 본 구현예에서는, 상기 오염 방지기가 상기 언급한 바와 같은 U자 모양의 유체 트랩 (400)을 포함하며, 상기 유체 트랩은 한쪽 가지에 무균 연결기 (156)를 가지고, 다른 쪽 가지에는 수용 탱크 (590)와 유체 소통하는 개구부 (158)를 갖는다. 상기 수확기는, 살균 조건 하에서 이동 살균 후드 (380) 내에서 상기 유체 트랩 (400)의 무균 연결기 (156)에 연결될 수 있는 무균 연결기 (55)를 포함한다. 이어서, 수확은 상기 장치의 밸브 (54)를 열어서 실행되며, 여기서 세포는 바람직하게는 중력 하에서 수용 탱크 내로 흘러들어갈 것이나, 일부 경우에는 적당한 펌프가 사용될 수도 있다. 수확이 완료된 후에는, 이들 무균 연결기 (55) 및 (156)은 살균 후드 (380) 내에서 단절될 수 있으며, 상기 살균 후드는 이어서 다음 장치 (10)로 이동될 수 있다. 상기 장치의 수확기의 상응하는 무균 연결기 (55)는 이어서 상기 U자형 튜브 (400)의 무균 연결기 (156)와 상호연결되어, 다음 장치의 세포가 수확될 수 있게 한다.

상기 대열 (500)의 바람직한 구현예에서는, 상기 수확기가 또한 새로운 성장/수확 사이클의 실행 시작 시에 접종물을 초기 제공하는 데 사용될 수도 있다. 따라서 접종물은, 연결되지 않은 말단에 무균 연결기를 포함하는 전달 도관을 갖는 적당한 탱크 내에서 살균된 배지와 혼합될 수 있으며, 상기 무균 연결기는 살균 후드 (380) 내에서 공동 수확용 도관 (154)의 무균 연결기 (155)에 연결된다. 접종물은 이어서 중력 하에, 또는 적당한 펌프의 도움으로, 공동 수확용 도관 (154)을 통해 장치 군 내 각 장치 (10)로 흘러들어갈 수 있으며, 그 후 상기 무균 연결기는 살균 후드 내에서 단절된다.

대안적으로, 상기 접종물은, 상기 수확기 및 공동 수확용 도관 (155)에 대해 앞서 언급한 것과 유사한 방식으로, 경우에 따라 변경을 가하여, 첨가제 유입구, 특히 공동 첨가제 도관 (180)을 통해 장치로 도입될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이전에 기술한 개별 장치 및/또는 대열의 작동은 도 1C에서 나타낸 바와 같이, 컴퓨터 (600)에 의해 제어된다. 상기 컴퓨터는 경우에 따라, 그리고 바람직하게는, 본 발명에 따른 대열 및/또는 장치의 작동에 있어, 온도, 용기에 들어가는 가스 또는 가스 조합물의 양 및 시간, 용기를 빠져나가도록 허용된 가스의 양 및 시간, 하나 이상의 물질 (예컨대 영양분, 배지 등)의 첨가량 및 시간, 및/또는 빛의 양 중 하나 이상과 같은 파라미터를 제어할 수 있다. 상기 컴퓨터는 경우에 따라 생성되는 폐기물의 양을 검출할 수도 있다.

상기 컴퓨터는 바람직하게는, 본 발명의 작동을 자동화 또는 반자동화하는 시스템의 한 예로서, 본 발명의 작동과 관련하여 존재하는 각종 측정기기에, 연결 된다. 예를 들면, 컴퓨터 (600)는 바람직하게는 가스 또는 가스 조합물의 흐름을 제어하기 위한 게이지 (602) 또는 게이지들에 연결된다. 게이지 (602)는 바람직하게는 적당한 공기 공급원 (604)에 연결가능한 도관 (74)에 연결되어, 공기 또는 다른 가스(들)의 도관으로의 흐름을 제어한다.

상기 컴퓨터 (600)는 또한 바람직하게는 온도 게이지 (606)에 연결되며, 상기 온도 게이지는 더욱 바람직하게는 용기 (20)의 주위에 존재하나, 더욱 바람직하게는 용기 (20) 내부는 아니다. 상기 컴퓨터 (600)는 또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 예를 들면 가열기 및/또는 냉각기와 같은, 온도 조절을 위한 기계장치 (608)를 제어할 수도 있다.

상기 컴퓨터 (600)는 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 본 발명의 도관 (80)을 통한 영양분/배지 용기 (612; 이하 포괄적으로 영양분 용기라 한다)로부터 용기 (20)로의 배지 및/또는 기타 영양분의 흐름을 제어하기 위한 게이지 (610)에 연결된다. 컴퓨터 (600)는 또한 경우에 따라, 부가적으로 또는 대안적으로, 밸브 (84)를 제어할 수도 있다. 또한 경우에 따라, 단 하나의 밸브 (84) 또는 게이지 (610)가 존재한다.

상기 컴퓨터 (600)는 바람직하게는 용기의 하나 이상의 포트에 연결되며, 더욱 바람직하게는 (도시된 바와 같이) 적어도 수확 포트 (도관 (50)으로 나타남) 및 선택적으로, 나타난 바와 같이 샘플 포트 (612)에 연결된다. 경우에 따라, 상기 샘플 포트 및 수확 포트는 조합될 수 있다. 상기 컴퓨터는 경우에 따라, 용기의 내용물의 일부를 제거하기 위하거나, 시험 및/또는 수확을 위한 (도시되지 않음) 자동화된 샘플 채집기 (sampler) 및/또는 수확기를 제어할 수도 있다. 상기 컴퓨터는 또한 경우에 따라, 예를 들면 컴퓨터 작동을 위한 피드백을 제공하기 위해, 이러한 내용물의 일부를 분석하기 위한 분석기 (614)에 연결될 수도 있다.

실시예 3

식물 세포 배양 방법의 실례

본 발명은 또한 다중-사용 일회용 장치 내에서 식물 세포를 배양 및 수확하는 방법에 관한 것이다. 상기 장치는 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 실시예 1 및 2의 장치 및/또는 시스템에 따른 형태를 갖춘다. 본 방법에서는, 식물 세포가 바람직하게는 본 발명에 따른 장치의 용기 내에 위치한다. 상기 용기는 바람직하게는 플라스틱으로 제조되며, 경우에 따라 반투명 및/또는 투명할 수 있으며, 경우에 따라 강성이거나 유연할 수 있거나, 경우에 따라 강성과 유연성 사이의 일정 정도의 강성을 띌 수 있다 (예를 들면, 반-강성). 이어서 다른 임의의 부가적 물질(들), 예컨대 살균된 가스 또는 가스 조합물, 및/또는 살균된 액체 또는 액체 조합물, 또는 임의의 기타 적당한 첨가제가 제공된다. 바람직하게는 상기 장치는, 하나 이상의 부가적 세포 배양/수확 사이클이 실시되는 동안에도 물질 (식물 세포 및/또는 앞서 언급한 부가적 물질 중 하나)이 제거될 수 있도록, 재사용가능한 수확기를 갖는 것을 특징으로 하도록 구축된다. 경우에 따라 그리고 더욱 바람직하게는, 상기 식물 세포는 현탁액 중에서 배양된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 식물 세포는 액상 배지의 현탁액 중에서 배양되며, 하나 이상의 살균된 가스 또는 가스 조합물 (복수의 가스)이 필 요에 따라 첨가된다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 살균된 가스는 살균된 가스 조합물을 포함하며, 이는 더욱 바람직하게는 살균된 공기를 포함한다. 상기 살균된 가스 및/또는 가스 조합물은 바람직하게는 각 사이클 중에, 앞서 기술한 바와 같이 연속적으로 또는 펄스 방식으로, 공기 유입구를 통해 용기에 첨가된다.

살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제는 바람직하게는 앞서 기술한 바와 같이 첨가제 유입구를 통해 용기 내로 투입된다.

상기 식물 세포 (무균 접종물의 한 예로서)는 경우에 따라 그리고 바람직하게는 수확기를 통해 첨가된다. 경우에 따라 바람직하게는 상기 용기 내의 상기 식물 세포는, 예를 들면 외부광 (용기 외부의 조명광원)을 통해, 특히 상기 용기가 투명 및/또는 반투명한 경우에, 빛에 노출된다.

세포는, 세포 및/또는 예를 들면 단백질과 같은 세포에 의해 생산되는 물질이 목적하는 수율에 이르기까지 성장하게 된다.

바람직한 구현예에 따르면, 과량의 공기 및/또는 폐가스는 경우에 따라 그리고 더욱 바람직하게는 연속적으로 및/또는 간헐적으로, 바람직하게는 가스 유출구를 통해 용기를 빠져나가게 된다.

또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 용기 내 물질 (예컨대 세포 배양 배지)은 하나 이상의 오염물 및/또는 용기 내에서 생산되는 세포 및/또는 세포 생성물(들)의 양에 대해 검사받는다. 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 오염물이 존재하는 것으로 발견되거나, 생산되는 세포 및/또는 세포 생성물(들)의 품질이 저하된 경우, 상기 장치 및 그 내용물이 폐기된다.

적절한 시점에, 특히 오염물(들) 및/또는 저하된 품질의 세포 및/또는 세포 생성물(들)이 발견되지 않는 경우에는, 세포 및/또는 세포 생성물(들)을 함유하는 배지와 같은 용기 내 물질의 적어도 첫 번째 분량이 수확되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 세포 및/또는 세포 생성물(들)을 함유하는 배지와 같은 물질의 나머지 두 번째 분량은 용기 내에 남겨지고, 여기서 이 두 번째 분량은 경우에 따라 다음 회의 배양/수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 할 수 있다. 다음으로는, 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제가 첨가제 유입구를 통해 다음 회의 배양/수확 사이클을 위해 제공된다.

상기 언급한 사이클은 경우에 따라 1회를 초과하여 수행된다. 또한, 상기 언급한 사이클은 경우에 따라 실시예 2와 관련하여 기술한 바와 같은 장치의 대열 (시스템)을 이용하여 수행될 수도 있다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 방법은 세포가 혐기적으로 배양 및/또는 수확될 수 있게 한다.

상기 혐기성 구현예에 있어서는, 하나 이상의 장치 (10) 군의 대열 (500)이 제공되며, 여기서 상기 장치는 공기 유입구를 포함하지 않는다. 하나 이상의 상기 장치 (10)에 대해서는, 다음의 공정이 수행된다. 무균 접종물이 공동 수확용 도관을 통해 장치 (10)에 도입된다. 그 후, 살균된 배지 및/또는 살균된 첨가제가 공동 첨가제 유입구 도관을 통해 상기 장치에 첨가된다. 경우에 따라, 상기 장치는 앞서 기술된 바와 같이 조명된다.

상기 장치 내의 세포는 배지 중에서 세포 및/또는 세포의 생성물(들)의 목적하는 수율에 이르기까지 성장하게 된다. 경우에 따라 그리고 바람직하게는, 과량 의 공기 및/또는 폐가스가 공동 가스 유출구 도관을 통해, 더욱 바람직하게는 연속적으로, 상기 장치를 빠져나가게 된다.

이전의 방법에서처럼, 상기 용기 내의 물질은 하나 이상의 오염물(들)의 존재 및/또는 저하된 품질의 세포 및/또는 저하된 품질의 세포 생성물(들)에 대해 모니터링되는데, 이 경우 상기 용기 및 그 내용물은 바람직하게는 폐기된다. 또한 이전의 방법에서처럼, 세포 및/또는 세포 생성물(들)은 바람직하게는 적당한 시점에서, 예를 들면 목적하는 양의 세포 생성물(들)이 생산되었을 때 수확된다.

상기 방법은 또한 경우에 따라 일회용 장치의 대열 내에서 호기적으로 수행될 수도 있으며, 살균된 공기와 같은 살균된 가스 및/또는 가스의 조합물이 공동 공기 유입구 도관을 통해 장치에 제공된다.

통상적으로, 정수 시스템이 탈이온화되고 발열물질 (pyrogen)이 없는 물을 농축된 배지를 포함하는 탱크에 공급하고, 이어서 희석된 배지가 첨가제 유입구를 통해 상기 장치 (10)로 펌핑된다. 통상 0.2 마이크로미터의 필터가 공급용 도관에, 또한 첨가제 유입구의 상류 쪽에만 설치되어, 각 장치 (10) 내 용기 내용물의 오염 위험성을 최소화한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 한방향 밸브가 또한 상기 위험성을 최소화하기 위해 사용될 수도 있다.

각 장치 (10)의 첫 번째 배양 사이클에 있어서, 통상적으로 장치 (10)에서 수확해야 하는 종류의 세포의 샘플인 접종물이 증기로 살균된 용기 내에서 배지 또는 물과 예비혼합되고, 수확기를 통해 장치 (10) 내로 도입된다. 이어서 배지는 첨가제 유입구를 통해 장치 (10) 내로 도입된다. 후속의 사이클에 있어서는, 이전 에 기술한 바와 같이, 배지 및/또는 첨가제만이 도입된다.

통상적으로, 공기 압축기가 여러 개의 하기와 같은 필터를 통해 각 장치 (10)로 실질적으로 살균된 공기를 제공한다: 입자 제거를 위한 거친 필터, 습기 제거를 위한 건조기 및 습기 필터, 및 오염물 제거를 위한, 통상 0.2 마이크로미터의 미세 필터. 바람직하게는, 공기 유입구의 바로 전에 있는 또 다른 필터가 용기 내용물의 오염 위험성을 추가로 최소화한다.

각 장치 (10)에 있어서, 모든 용기 (20)로의 연결, 즉 공기 유입구로, 첨가제 유입구로, 또한 바람직하게는 가스 유출구로, 그리고 수확기로의 연결은 사용 전에 오토클레이브로 살균되며, 무균성은 예를 들면 공기 공급원 및 배출구를 포함한 주변 장치로의 연결 중에, 상기 기술한 바와 같이 살균 후드 내에서 연결을 수행함으로써 유지된다.

각 장치 (10)를 위한 온도 제어는 바람직하게는 적당한 에어컨디셔너에 의해 제공된다. 상기 장치의 선택적 조명은 세포 성장에 필요한 경우, 상기 장치 (10) 주위에 적당히 배치된 적당한 형광등에 의해 제공된다.

각 장치 (10)의 각 배양 사이클 중에, 각 상응하는 용기 (20)의 내용물은 통상 약 7 내지 약 14 일간, 또는 그 이상, 제어된 온도 및 조명 조건 하에서 폭기되고 혼합된다.

각 장치 (10)에 있어 배양 사이클의 완료 시에는, 상응하는 수확기가 통상 적당한 연결기를 갖춘 예비살균된 환경에 연결되며, 상기 연결기는 상기 기술한 바와 같이 연결 전에 그리고 도중에 살균된다. 이어서 수확이 실시되어, 약 2.5% 내 지 약 45% 넘게, 통상적으로는 약 10% 내지 약 20%의 세포 및/또는 조직을 남겨두어 다음 사이클을 위한 접종물의 역할을 하게 한다.

상기 수확된 세포/조직 및/또는 세포 생성물(들)은 이어서 경우에 따라 건조되거나, 필요에 따라 추출될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세포 배양 공정은 경우에 따라 하기 중 하나 이상에 따라 조절될 수 있다. 이러한 조절은 바람직하게는 식물 세포 배양을 위해 수행된다. 첫 번째 조절에 따르면, 배지 현탁액 중에 성장시킨 세포에 대해, 용기에 초기 투입되는 (즉, 0일째에) 배지의 양은 바람직하게는 권장량의 약 125% 이상이고, 더욱 바람직하게는 배지 권장량의 약 200% 이하이다.

또 다른 선택적이나 바람직한 조절은 세포의 성장 도중에, 그러나 수확 전에 배지를 첨가하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기와 같은 배지는 배양 공정 시작 후 3일 또는 4일째에 첨가된다. 경우에 따라 그리고 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 농축된 배지를 포함하는데, 약 1 내지 약 10 배로 농축되어 고농도의 영양분을 제공한다. 바람직하게는 충분한 배지가 제공되고, 더욱 바람직하게는 배지의 정상 농도의 약 125% 이상의 농도로 제공됨을 숙지해야 한다. 배지의 첨가는 용기 내의 기존의 배지에 새로운 배지가 첨가됨을 의미한다. 농축 용액으로서 첨가되는 경우, 수득되는 배지 농도가 정상 또는 초기 농도에 가까운 것이 바람직하다. 대안적으로, 상기 용기 내의 배지는 경우에 따라 성장 중에, 더욱 바람직하게는 배양 공정 시작 후 3일 또는 4일째에, 완전히 새로운 배지로 교체될 수도 있다.

또 다른 선택적인 그러나 바람직한 조절은, 예를 들면 배지 중의 수크로오스 농도가 선택적으로 30 g/l 보다는 40 g/l 가 될 수 있도록 수크로오스를 첨가함으로써, 식물 세포 배양에 보통 권장되는 것보다 높은 수크로오스 수준을 사용하는 것이다. 하나 이상의 기타 당, 예컨대 글루코오스, 프럭토오스 또는 기타 당이 경우에 따라 수크로오스를 보충하기 위해 첨가될 수도 있다. 수크로오스 (및/또는 하나 이상의 기타 당)는 또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는 세포 배양 공정 중에, 더욱 바람직하게는 배양 공정 시작 후 3일 또는 4일째에 첨가된다.

또 다른 선택적 조절은 세포 배양 공정 중에, 더욱 바람직하게는 배양 공정 시작 후 3일 또는 4일째에 순수 산소를 첨가하는 것이다.

또 다른 선택적 조절은 폭기 (가스 교환)를 증가시켜 사용하는 것으로서, 하기에 더욱 상세히 나타나는 바와 같이 본 발명에 따른 장치 내 세포 성장률의 증가를 초래하기도 한다.

실시예 4

빈카 로제아 ( Vinca rosea ) 세포를 사용한 실험예

본 실험은 일일초 꽃 (rose periwinkle)으로도 알려진 빈카 로제아 (Vinca rosea)의 세포를 사용하여 수행되었다.

10 개의 생물반응기 (각각 본 발명에 따른 장치)의 군이 사용되었는데, 각 생물반응기는 폴리에틸렌-나일론 공중합체로 이루어진 용기 (벽 두께 0.1 mm, 직경 20 cm, 높이 1.2 m)로서, 바닥으로부터 5 cm (공기 유입구용), 25 cm (수확기용), 68 cm (첨가제 유입구), 및 90 cm (가스 유출구)에 30 mm 포트가 갖춰지고, 충진가능한 유효 용적이 약 10 리터인 용기를 가졌다. 상기 생물반응기는 그 부속품과 함께 감마 방사선 (2.5 mRad)으로 살균되었다.

9 리터의 Schenk & Hildebrandt 미네랄/비타민 배지, 2 mg/l 씩의 클로로페녹시아세트산 및 2,4-다이클로로페녹시아세트산, 0.2 mg/l의 키네틴, 3% 수크로오스, 및 V24 카타란투스 로제우스 (Catharanthus roseus; 빈카) 세포주의 초기 접종물의 충진 용적 900 ml를 각 생물반응기에 도입하였다. 배지 표면 위의 공기 용적은 3 리터였다. 상기 용기의 바닥으로부터 1 cm 지점에 위치한 4 mm 개구 (orifice; 공기 유입구)를 통해 1.5 리터/분의 유속으로 제공된 살균된 공기를 사용하여, 폭기를 수행하였다.

상기 생물반응기를 항온실 (25℃)에 장착하고, 충진 용적이 약 7.5 리터 (총 용적의 75%; 대수기 중의 배증률 (doubling rate)은 2일)로 증가할 때까지 배양을 10일간 계속하였다. 이 시점에서, 수확기를 통해 9 리터의 배지 및 세포를 회수함으로써 세포를 수확하고, 9 리터의 새로운 살균된 배지를 동일한 첨가제와 함께 첨가제 유입구를 통해 첨가하였다. 10일 간격으로, 6회의 부가적 사이클 동안 상기와 같이 세포를 다시 수확하였고, 6회 사이클 후에는 배양이 완료되었다.

총중량 6.5 kg의 새로운 세포 (건중량 0.5 kg)를, 7일, 10일 또는 14일 간격과 같이 다양한 기간에 걸쳐, 10 리터 용량 생물반응기 각각으로부터 수집하였다. 이들 세포는 총 알칼로이드 함량이 0.6%였고, 이는 출발선과 동일하였다. 따라서 본 발명의 장치는, 출발선의 세포와 유사하거나 동일한 세포 특징을 유지하면서, 배양되는 세포를 건강하고 생산적인 상태로 유지하고 성장시킬 수 있음이 분명하였다.

실시예 5

식물 세포를 사용한 실험예

실시예 5a: 당근 세포 현탁액 중 인간 글루코세레브로시데이즈의 클로닝 및 대규모 발현

본 실시예는, 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 장치 내에서 배양된, 형질전환된 식물 세포를 사용하여 수행된 실험의 기재를 제공한다.

물질 및 실험 절차:

플라스미드 벡터: 플라스미드 CE -T

Galili 교수로부터 얻은 플라스미드 CE [미국특허 제 5,367,110 호, 1994년 11월 22일]로부터 플라스미드 CE-T를 구축하였다.

플라스미드 CE를 SalI 로 절단하였다.

SalI 의 접착성 말단 (cohesive end)을, DNA 중합효소 I의 큰 절편을 사용하여 평활 말단화 하였다. 이어서 상기 플라스미드를 PstI 로 절단하고, 기본적 엔도키티네이즈 (endochitinase) 유전자: [아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)] ATGAAGACTA ATCTTTTTCT CTTTCTCATC TTTTCACTTC TCCTATCATT ATCCTCGGCC GAATTC (서열번호 10)으로부터의 ER 표적화 신호, 및 SmaI 및 PstI 로 절단된 담배 키티네이즈 A: GATCTTTTAG TCTATACTAT G (서열번호 11)로부터의 액포 (vacuolar) 표적화 신호를 코딩하는 DNA 절편에 연결하였다.

상기 SalI 접착성 말단을, DNA 중합효소 I의 큰 절편을 사용하여 평활 말단화 하였다. 이어서, 상기 플라스미드를 PstI 로 절단하고, 관계없는 유전자인 ER 표적화 신호 (서열번호 1), 및 SmaI 및 PstI 로 절단된 액포 표적화 신호 (서열번호 2)를 코딩하는 DNA 절편에 연결하였다.

P. Mullineaux 박사로부터 pGREENII 를 얻었다 [Roger P. Hellens 등, (2000) Plant Mol. Biol., 42:819-832]. pGREENII 벡터로부터의 발현은 콜리플라워 모자이크 바이러스 (서열번호 9)로부터의 35S 촉진자, TMV (담배 모자이크 바이러스) omega 번역 증강자 구성요소, 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 옥토파인 (octopine) 합성효소 종결자 서열에 의해 제어된다.

CDNA: Sorge 등 (PNAS USA 1985; 82:7289-7293)에 의해 기술된 바와 같은, 인간 GCD cDNA 서열을 함유하는 이. 콜라이 (E. coli) (GenBank 수탁번호 M16328) (ATCC 수탁번호 65696) 로부터 얻은 hGCD, 글루코시데이즈 베타 산 [글루코세레브로시데이즈]을 함유하는 GC-2.2 [GCS-2kb; lambda-EZZ-gamma3 호모 사피엔스 (Homo sapiens)]. 삽입단편 길이 (kb): 2.20; 조직: 섬유아세포 WI-38 세포.

발현 플라스미드의 구축

hGCD (서열번호 7 및 8)를 코딩하는 cDNA를, 정방향 프라이머: 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (서열번호 3) 및 역방향 프라이머: 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' (서열번호 4)를 사용하여 증폭시켰다. 정제된 PCR DNA 생성물을 엔도뉴클리에이즈인 EcoRI 및 BglII (프라이머에서 밀줄친 인식 서열을 참조)로 절단하고, 동일 효소로 절단된 발현 카세트 E-T를 갖는 중간 벡터 내에 연결하였다. 상기 발현 카세트를 상기 중간 벡터로부터 절단 및 용출하고, 제한효소인 SmaI 및 XbaI 를 사용하여 이중 벡터인 pGREENII 에 연결하여, 최종 발현 벡터 를 형성하였다. pGREEN 벡터와 함께 수득된 nos 촉진자에 의해 작동되는 NPTII 유전자 (도 11B)에 의해 카나마이신 내성이 부여된다. 수득된 발현 카세트 (서열번호 13)를 도 11A 에 나타내었다.

수득된 플라스미드는 하기의 시퀀싱 프라이머를 사용하여 신호의 바른 프레임내 (in-frame) 융합을 보장하도록 서열화된다: 5' 35S 촉진자: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3' (서열번호 5), 및 3' 종결자: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3' (서열번호 6).

당근 캘러스의 구축 및 세포 현탁액 배양

당근 캘러스 (즉, 분화되지 않은 당근 세포)의 구축 및 세포 현탁액 배양을, Torres K.C. (원예 작물을 위한 조직 배양 기법 (Tissue culture techniques for horticular crops), pp. 111, 169)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다.

당근 세포의 형질전환 및 형질전환된 세포의 단리

당근 세포의 형질전환은, 이전에 기술된 방법 [Wurtele, E.S. 및 Bulka, K. Plant Sci. 61:253-262 (1989)]을 변경하여, 아그로박테리움 형질전환을 이용하여 수행하였다. 캘러스 대신에 액상 배지 중에 성장하는 세포를 공정 내내 사용하였다. 인큐베이션 및 성장 시간은 액상 배양물 중의 세포의 형질전환에 맞게 변경하였다. 간단하게는, 아그로박테리아를 전기천공 (electroporation) [den Dulk-Ra, A. 및 Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]에 의해 pGREEN II 벡터로써 형질전환한 후, 30 mg/ml의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다. 당근 세포는 아그로박테리아로써 형질전환시키고, 액상 배지 중의 60 mg/ml 의 파 로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다.

고수준의 GCD 를 발현하는 캘러스의 단리를 위한 형질전환된 당근 세포의 선별

형질전환 후 14일 후에, 세포의 개별적 덩어리로부터 캘러스의 형성을 위해, 배양물의 세포를 고체 배지 상에 3% 충전세포 용적의 희석률로 평판배양 하였다. 개별 캘러스가 직경이 1-2 cm에 이르렀을 때, 세포를 SDS 샘플 완충액에서 균질화하였고, 수득된 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분리하고 [Laemmli U., (1970) Nature 227:680-685], 하기에 더 상세히 기술하는 바와 같이 나이트로셀룰로오스 막으로 이전하였다 (hybond C nitrocellulose, 0.45 마이크론, 카탈로그 번호: RPN203C, Amersham Life Science 사 제). 다클론성 항-hGCD 항체 (본원에는 하기에 기술됨)를 사용하여, GCD 검출을 위한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 상당한 수준의 GCD를 발현하는 캘러스를 확장하여, 규모 확장, 단백질 정체 및 분석을 위해 액상 배지 중에 성장하도록 이전하였다.

본 발명에 따른 장치 내에서의 대규모 배양 성장

rh-GCD 유전자 (서열번호 13 및 14)를 함유하는 유전자 변이된 당근 세포의 약 1 cm 정도되는 캘러스를, 4.4 g/l의 MSD 배지 (Duchefa 사), 9.9 mg/l의 티아민 HCl (Duchefa 사), 0.5 mg의 엽산 (Sigma 사), 0.5 mg/l의 바이오틴 (Duchefa 사), 0.8 g/l의 카제인 가수분해물 (Duchefa 사), 당 30 g/l, 및 호르몬 2-4 D (Sigma 사)를 함유하는 Murashige 및 Skoog (MS) 9 cm 직경의 한천 배지 플레이트 상에 평판배양 하였다. 상기 캘러스를 14일간 25℃에서 성장시켰다.

당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 형질전환된 캘러스를 MSD [0.2 mg/l의 2,4-다이클로로아세트산을 함유하는 Murashige & Skoog (1962)] 액상 배지 중에 게대 배양 (sub-culturing)함으로써, 현탁액 세포 배양물을 제조하였다. 상기 현탁액 세포는 250 ml 얼렌마이어 플라스크 (작업 용적 (working volume)은 25 ml 로 시작하나, 7일 후에 50 ml 로 증가함) 내에서 25℃에서 진탕 속도 60 rpm 으로 배양하였다. 이어서, 동일한 조건 하에서 작업 용적을 300 ml 까지 부가하여, 세포 배양물 용적을 1 L 얼렌마이어 플라스크로 증가시켰다. 7일간 배양한 두 개의 1 L 얼렌마이어 플라스크로부터 유래한 400 ml의 현탁액 세포를 첨가함으로써, 4 L의 MSD 배지를 함유하는 소형 생물반응기 (10 L)의 접종물 [WO 98/13469 참조]을 수득하였다. 25℃에서 분 당 1 리터의 공기 유속 하에 일주일 간 배양한 후, MSD 배지를 10 L 까지 첨가하고, 배양을 동일한 조건 하에서 계속하였다. 배양을 5일 더 실시한 후, 세포 배지를 80 μ 그물을 통과시킴으로써, 대부분의 세포를 수확 및 수집하였다. 과량의 배지는 짜내었고, 충전된 (packed) 세포 케이크는 -70℃에서 보관하였다.

첫 번째 실험에서, 형질변환된 (글루코세레브로시데이즈 (GCD)) 당근 세포 현탁액의 성장은 얼렌마이어 플라스크에 반하는, 본 발명에 따른 장치 내에서 측정하였다. 성장은 충전세포 용적 (packed cell volume) (4000 rpm)으로서, 그리고 건중량으로서 측정하였다. 얼렌마이어 플라스크 내에서의 성장 측정은 21 개의 플라스크로부터 시작하여 매일 3 개의 플라스크를 수확함으로써 실시하였다. 수확된 플라스크는 습중량, 건중량 및 GCD 함량을 측정하였다. 반응기 수확은, 수확 포트 (수확기)를 사용하여 실시되었고; 매일 50 ml 의 현탁액을 수확하여 습중량 및 건중량을 측정하였다.

도 12 는, 플라스크에서 성장한 세포는 아마도 폭기 정도로 인해 초기에 더 높은 성장률을 보이는 것을 나타낸다; 그러나 장치 및 플라스크에서 성장한 세포의 성장률은 궁극적으로 매우 유사한 것으로 밝혀졌고, 하기 실험에서 수득한 실험 결과 또한 매우 유사한 것으로 밝혀졌다.

이어서 트랜스펙션된 식물 세포 내 단백질 양을 측정하였다. GCD를 인산염 완충액 [0.5 M, pH 7.2, 10% w/w PVPP (폴리비닐 폴리피롤리돈) 및 1% Triton X-100 함유]에서 추출하였다. 플라스크에서 성장시킨 현탁액의 샘플 및/또는 본 발명의 장치에서 성장시킨 세포 배양물에서 취한 샘플의 GCD 함량을, 정량적 웨스턴 블롯을 이용하여 측정하였다. 웨스턴 블롯은 다음과 같이 실시하였다.

본 분석에 있어서, 수득된 샘플로부터의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리하고 나이트로셀룰로오스로 이전하였다. 상기 목적을 위해, SDS 폴리아크릴아마이드 젤은 다음과 같이 제조하였다. SDS 젤은 농축 젤 (stacking gel) 및 분해 젤 (resolvign gel)로 이루어진다 (Laemmli, UK 1970, "Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227, 680-685). 분해 젤의 조성은 다음과 같다: 12% 아크릴아마이드 (Bio-Rad 사), 젤 용액 10 ml 당 4 마이크로리터의 TEMED (N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌다이아민; Sigma 카탈로그 번호 T9281), 0.1% SDS, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 및 0.1% 과황산암모늄 (APS). TEMED 및 과황산암모늄은 본 맥락에서 중합을 위한 자유 라디칼 개시제로서 사용하였다. 중합 개시 후 약 20 분 후에, 농축 젤 (3% 아크릴아마이드, 0.1% SDS, 126 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.1% APS, 및 농축 젤 용액 5 ml 당 5 마이크로리터의 TEMED)을 분해 젤 위에 붓고, 12 또는 18 간격 콤 (space comb)을 삽입하여 샘플의 웰 (well)을 생성하였다.

애노드 및 캐소드 챔버를 동일한 완충용액으로 채웠다: SDS (BioRad 사, 카탈로그 번호 161-0772)를 함유하는 Tris-글라이신 완충액, pH 8.3. 항원-함유 물질을 0.5 부피의 샘플 부하 완충액 (30 ml 글리세롤 (Sigma 사, 카탈로그 번호 G9012), 9% SDS, 15 ml 머캡토에탄올 (Sigma 사, 카탈로그 번호 M6250), 187.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 500 마이크로리터의 브로모페놀 블루, 모든 부피는 100 ml 샘플 완충액 기준임)로 처리하였고, 그 혼합물은 이어서 100℃에서 5 분간 가열하고 농축 젤 상에 부하하였다.

전기영동은, 13×9 cm 크기의 젤에 대해, 실온에서 적당한 시간 동안, 예를 들면 45 내지 60 분 동안, 50 내지 70 볼트로, 그 후 45 내지 60 분 동안 180 내지 200 볼트의 일정한 전류 세기를 사용하여 수행하였다. 이어서 항원을 나이트로셀룰로오스 (Schleicher and Schuell 사, Dassel)로 이전하였다.

단백질 이전은 실질적으로 본원에 기술한 바와 같이 수행하였다. 젤을 인접한 나이트로셀룰로오스와 함께, Whatmann 3 MM 필터지, 전도성의 0.5 cm 두께 발포 물질, 및 전류를 백금 전극의 방식으로 도전하는 와이어 전극 사이에 위치시켰다. 상기 필터지, 발포 물질 및 나이트로셀룰로오스를 이전용 완충액 (transfer buffer; Biorad 사의 TG 완충액, 카탈로그 번호 161-0771, 메탄올과 물 완충액 (20% 메탄올)로 10 배 희석됨)으로 철저히 적셨다. 상기 이전은 4℃에서 100 볼트로 90 분간 수행하였다.

상기 이전 후, 나이트로셀룰로오스의 자유 결합 부위를, 1%의 건조 우유 (Dairy America 사)를 함유하는 차단용 완충액 (blocking buffer), 및 인산염 완충액 (Riedel deHaen 사, 카탈로그 번호 30435)으로 희석된 0.1% Tween 20 (Sigma 사, 카탈로그 번호 P1379)으로 4℃에서 밤새 포화시켰다. 블롯 스트립을 항체 (상기와 같은 1% 건조 우유 및 0.ㅇ% Tween 20을 함유하는 인산염 완충액으로 1:6500으로 희석, pH 7.5)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다.

항체와의 인큐베이션 후에, 상기 블롯을 PBS (인산염 완충된 인산나트륨 완충액 (Riedel deHaen, 카탈로그 번호 30435))로 세 번, 매 회 10 분간 세척하였다. 이어서 블롯 스트립을 실온에서 1 시간 동안, 적당한 이차 항체 (염소의 항-토끼 (전체 분자) HRP (Sigma 사, 카탈로그 번호 A-4914)), 1% 건조 우유 (Dairy America 사) 및 인산염 완충액 (Riedel deHaen 사, 카탈로그 번호 30435)로 희석된 0.1% Tween 20 (Sigma 사, 카탈로그 번호 P1379)을 함유하는 완충액으로 1:3000으로 희석)아 함께 인큐베이션 하였다. PBS로 몇 차례 세척한 후, 상기 블롯 스트립을 ECL 현상 시약 (Amersham 사, RPN 2209)으로 염색하였다.

상기 블롯을 ECL 시약 중에 침지시킨 후, 블롯을 X-선 필름 FUJI Super RX 18x24 에 노출시키고, FUJI-ANATOMIX 현상제 (developer) 및 고정제 (fixer; FUJI-X fix, 카탈로그 번호 FIXRTU 두 개 중 1)를 사용하여 현상하였다. 상기 항체에 결합된 단백질을 특징으로 하는 밴드는 상기 처리 후에 육안으로 보이게 되었다.

도 13 은 그 결과를 나타내는데, 총 단백질 (식물 세포 및 GCD)에 대한 GCD 단백질의 양은 제 3 및 제 4 일째 가장 높았고, 이후에는 GCD의 상대적 수준이 다시 저하되었음을 나타낸다. 결과는 플라스크 내에서, 또는 본 발명의 장치 내에서 성장한 세포에 있어 유사하였다.

다음은, 7% 및 15% 충전세포 용적의 시작점을 비교하였다 (또다시 결과는 플라스크 내에서, 또는 본 발명의 장치 내에서 성장한 세포에 있어 유사하였다). "충전세포 용적 (packed cell volume)"이란, 배지의 폭기와 같은 모든 교란 인자가 제거된 후, 본 발명의 장치 내에 침강하는 세포의 용적을 의미한다. 도 14는 평행인 성장곡선을 나타낸다. 도 15는 정량적 웨스턴 블롯으로 구한 GCD 단백질의 양을 나타내는데, 총 단백질 (식물 세포 및 GCD)에 대한 GCD 단백질의 양은 제 5 및 제 6 일째 가장 높았고, 그 후 GCD의 상대적 수준을 다시 저하되었음 (샘플이 15% 충전세포 용적으로부터 성장한 세포에서 취한 것임을 숙지해야 한다)을 나타낸다.

성장은 정상점 (stationary point)을 찾기 위해 연장된 기간에 걸쳐 (14일) 측정하였으며, 상기 정상점에서는 성장률이 수평을 이룬다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 상기 정상점은 제 8 일째 도달하고, 그 후에는 성장이 어느 정도 감소된다. 따라서 GCD를 발현하는 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙션 된 세포가 성장할 수 있게 하려면, 세포는 적어도 정상점까지는 성장시키는 것이 바람직하며, 본 실시예에서는 바람직하게는 성장이 제8일까지 이루어진다 (또는 그 이후 잠시 동안).

도 17은 GCD의 최대량 (기타 단백질에 비해)이 제 8 일 중에 형질변환된 세포에 의해 생산되며, 그 후 생산된 GCD의 양은 저하되기 시작한다.

적어도 일부의 새로운 배지를 용기에 첨가하는 것은 세포 성장 및 세포에 의해 생산되는 GCD의 양을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 도 18에 나타난 바와 같이, 제 4 일째의 새로운 (농축된) 배지의 첨가 (배지 첨가) 및/또는 배지 교체 (배지 교환)는 제8일 이후에도 세포의 성장 수준을 높이 유지시킨다. 또한, 제 4 일째에 배지를 새로운 배지로 교체하는 것은 명백히 더 많은 양의 GCD가 생산될 수 있게 한다 (정량적 웨스턴 블롯에 대해 도 19 참조; "배지 보충 (refreshing media)"이란 모든 배지를 새로운 배지로 교체함을 말한다). 제 4 일째에 농축된 새로운 배지를 첨가하는 것 또한 더 많은 양의 GCD가 생산되게 한다 (정량적 웨스턴 블롯에 대해 도 20을 참조).

세포 성장에 대한 다양한 당 투여계획의 효과는 도 21에 나타내었으며, GCD의 생산에 대한 상기 효과는 도 22에 나타내었다. 상기 언급한 바와 같이, 경우에 따라 그러나 바람직하게는, 예를 들면 배지 중 농도가 경우에 따라 30 g/l 보다는 40 g/l 가 될 수 있도록 수크로오스를 첨가함으로써, 식물 세포 배양에 보통 권장되는 것보다 더 높은 수크로오스 수준이 사용된다. 수크로오스를 보완하기 위해, 글루코오스, 프럭토오스 또는 기타 당과 같은 하나 이상의 다른 당이 경우에 따라 사용될 수도 있다. 수크로오스 (및/또는 하나 이상의 기타 당)은 또한 경우에 따라 그리고 바람직하게는 세포 배양 공정 중에, 더욱 바람직하게는 배양 공정을 시작한 후 제 3 일 또는 제 4 일째에 첨가된다. 이러한 세포 배양 공정에 대한 변경의 효과는 하기에 더욱 상세히 기술된다.

도 21에서는, 40 g 수크로오스란 표시는 40 g의 수크로오스가 세포 성장 시 작시에 첨가되었음을 의미하고; "30 g 수크로오스+10 g 글루코오스"란 표시는 상기 당의 조합이 세포 성장 시작 시에 존재하였음을 의미하고; "부가적 (extra) 수크로오스"란 표시는 30 g/l의 수크로오스가 제 0 일째 (세포 성장 시작)에 존재하였고, 30 g/l의 수크로오스가 제 4 일째에 배지에 첨가되었음을 의미하고; "부가적 MSD"란 표시는 MSD 배지가 첨가되었음을 의미하고; "대조"란 표시는 30 g/l의 수크로오스가 제 0 일째 (세포 성장 시작)에 존재하였음을 의미한다. 나타난 바와 같이, 부가적 MSD의 존재가 제 7 일에 가장 큰 효과를 나타내었고, 그 다음으로 더 많은 양의 수크로오스 (40 g/l)를 사용한 것, 그 다음으로는 성장 사이클을 통해 수크로오스를 중간에 첨가한 것이었다.

도 22는, 도 22A의 더 많은 양의 수크로오스 (40 g/l)를 사용하는 것, 및 제 4 일째에 수크로오스를 첨가하는 것 (도 22B) 모두 생산된 GCD의 양을 증가시킨 것을 나타낸다; 그러나 후자의 조건은 제 5 일째에 GCD 생산의 급속한 상승을 초래한 반면, 전자의 조건은 며칠 동안 전체적으로 더 많은 양의 GCD 생산을 제공하였다.

일반적으로 증가된 폭기 (즉, 더 빠른 가스 교환의 존재), 및 구체적으로 증가된 산소는 모두 GCD로 형질전환된 식물 세포의 성장률을 증가시켰다. 이들 실험에 있어서, 배양물을 초기에 분 당 1 리터의 속도로 폭기하였다. 증가된 폭기는 도 23에 나타난 바와 같이, 공기 흐름의 속도를 분 당 1.5 또는 2 리터로 증가시킴으로써 수행하였다. 산소를 제4일째부터 첨가하여, 도 24에 나타난 바와 같이 300%까지 산소가 첨가된다 (기호 없는 실선은 산소 압력을 나타낸다). 다른 조건은 동일하였다.

도 23은 본 발명에 따른 10 L 장치 내 세포 성장에 대한 폭기 속도의 효과를 나타낸다. 나타난 바와 같이, 증가된 폭기 (분 당 1 L의 공기 교환인 기본치를 초과)는 분 당 1.5 L (도 23A) 또는 분 당 2 L (도 23B)로서 제공되어, 세포 성장의 수준 증가를 초래하였다.

도 24는 본 발명에 따른 장치에 산소를 더 첨가한 효과를 나타낸다. 산소는 제4일째부터 첨가하였고; 부가적 산소의 압력은 기호 없는 검은 실선으로 나타난다. 세포 배양 배지는 세포가 성장하고 증식할수록 점점 더 점성을 띠게 되므로, 산소의 흐름을 일정한 수준으로 유지했더라도, 산소 압력의 측정치는 어느 정도 가변적일 수 있다. 나타난 바와 같이, 부가적 산소를 받는 세포는 명백히 더 높은 성장률을, 특히 제 7 일 이후에 나타내었는데, 산소를 받지 못한 세포에 대해 나타난 바와 같이, 이때부터 성장률은 통상 수평적으로 되기 시작한다.

실시예 5b: 당근 캘러스에서의 생물학적으로 활성인 인간 혈액응고인자 X의 클로닝 및 발현

물질 및 실험 절차

플라스미드 벡터

CE -K 플라스미드: CE-K 플라스미드의 골격은 Bluescript SK+ 플라스미드 (Stratagene 사, 캘리포니아 주, 라 호야) (서열번호 15)이고, 폴리클로닝 부위의 부가적 카세트는 식물 세포의 소포체 (endoplasmic reticulum) 내의 고수준의 발현 및 잔류를 위한 모든 필요한 요소를 함유한다. 상기 카세트는 하기를 포함한다 (서열 (서열번호 16) 및 맵, 도 26 참조): CaMV35S 촉진자, 오메가 증강자, 기본 엔도키티네이즈 유전자 [아라비돕시스 탈리아나]로부터의 ER 표적화 신호를 코딩하는 DNA 절편, 재조합 유전자의 융합을 위한 EcoRI 및 SalI 제한 부위, KDEL ER 잔류 시그널 (retention signal), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 합성효소 (OCS) 유전자의 전사 종료 및 폴리아데닐화 (polyadenylation) 신호.

pGreen 벡터: 플라스미드 이중벡터 (binary plasmid)는 조작된 DNA를 식물의 게놈에 융합시키도록 고안되어 있다. pGREEN 은 식물 형질전환을 위한 2세대 이중벡터이며, 더 작고 더 유연한 플라스미드이다.

pGREEN 벡터에서 트랜스 (trans)로 작용할 수 있는 분리 기능의 개념이 한 단계 더 나아갔다. RepA 유전자는 상기 클로닝 벡터 상에 존재하지 않으나, 상용성 (compatible) 플라스미드 상에 제공되며, 이는 형질전환된 아그로박테리움 세포 내에 공동잔류한다. RepA 기능 및 기타 불필요한 컨쥬게이션 기능을 제거함으로써, 전체적인 플라스미드 크기가 급속히 축소되었다 (Hellens 등, Plant Mol. Bio. 2000; 42:819-832).

인간 X 인자 유전자의 클로닝: 인간 혈액응고 인자 X (HSFACX, GenBank 수탁번호 M57285)의 cDNA (서열번호 17 및 18)이 플라스미드 Sig-CEXGLY-FX-HDEL로부터 제조되었고, X 인자의 완전한 cDNA를 포함한다. 코딩 영역을 증폭시켰고, 당해 분야에서 인정된 프로토콜에 따른 서브-클로닝 (sub-cloning)을 위해 EcoRI 및 SalI 의 제한 부위를 첨가하였다. 간단하게는, 잘 발달한 인간 X 인자의 코딩 서열은 하기의 정방향 프라이머:

Fx 시작 EcoRI: 5' CCGAATTCCGCGTAAGCTCTGCAGCC 3' (서열번호 19), 및

하기의 역방향 프라이머: Fx 종료 SalI kdel: 5' GCGTCGACGAAGTAGGCTTG 3' (서열번호 20)를 사용하여 증폭시켰고;

또한 편입된 제한 부위, EcoRI 및 SalI 을 통해 상기 유전자의 N- 및 C-말단의 신호를 융합시켰다.

증폭 반응은 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche-Applied-Science 사, 카탈로그 번호 1732650)을 사용하여, 제조사의 지시사항에 따라 수행하였다. PCR 생성물은 X 인자 서열의 동정을 위해 1% 아가로오스 젤에서 분리하였다. 도 25는 현저한 증폭된 HSFACX 밴드 (화살표로 표시)를 나타낸다. 상기 밴드를 용출시키고, 제한효소 EcoRI 및 SalI 로 절단하고, 제조사의 지시사항에 따라 정제된 CE-K 발현 카세트 내로 연결하였다.

상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α 를 형질전환하고, 형질전환된 박테리아는 100 ㎍/ml 앰피실린이 포함된 한천 플레이트에서 선택하였다. 양성 클론은 FX 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 분석에 의해 선택하였고, 또한 SmaI+XbaI, HindIII 및 NotI 를 사용한 제한 분석에 의해 확인하였다.

상기 발현 카세트는 제한효소 Asp718 및 XbaI 을 사용하여 CEK-FX-ER 플라스미드로부터 절단하였다. 이중벡터 pGREEN nos-kana 를 동일한 효소를 가지고 절단하고, 탈인산화시키고, 1% 아가로오스 젤로 용출시켰다. 상기 이중벡터 및 FX-ER 발현 카세트를 연결하여, 이. 콜라이 DH5α 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용하였다. 형질전환, 성장 및 플라스미드 추출 후에, 양성 클론을 PCR, 및 HindIII 및 BglII 를 사용한 제한 분석에 의해 확인하였다. 선택된 클론 pGREEN nos-kana-FX- ER (도 28)은 서열화에 의해 추가로 확인하였다.

식물 형질전환: 당근 세포의 형질전환은 이전에 기술된 방법 [Wurtele, E.S. 및 Bulka, K. Plant Sci., 61:253-262 (1989)]을 개조한 방법에 의해 아그로박테리움 형질전환을 이용하여 수행하였다. 공정 전체를 통해 캘러스 대신에 액상 배지 중에 성장하는 세포를 사용하였다. 인큐베이션 및 성장 시간은 액상 배양물 중의 세포의 형질전환에 맞추어졌다. 간단하게, 아그로박테리아 LB4404 를 전기천공 [den Dulk-Ra, A. 및 Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]에 의해 pGREEN nos-kana FX-ER 벡터로써 형질전환시키고, 이어서 30 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다. 당근 세포 (다우커스 카로타 (Daucus carota))를 아그로박테리아로써 형질전환하고, 액상 배지 중 60 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다.

결과

배양된 당근 세포 내 활성 재조합 인간 X 인자의 발현

당근 세포 내 발현 및 분석: 형질전환된 당근 세포를, 상기 GCD에 대해 기술한 바와 같은, 0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로메톡시아세트산으로 보충된 Murashige & Skoog 배지 (Physiol. Plant, 15, 473, 1962)의 배양물에서 성장시켰다. 세포는 7일 동안 성장시켰고, 이후 세포를 수확하였다. 과량의 액체는 100 메쉬 필터로 분리하였다. 세포 내용물은 단백질 함량의 평가를 위해, 상기 상세히 기술한 바와 같이 추출하였다. FX cDNA로써 형질전환된 당근 세포는, Affinity Biologicals 사 (캐나다, 온타리오 주, 해밀튼)의 토끼의 항-인간 X 인자 정제된 IgG 를 사용한 웨 스턴 블롯 분석에 의해 FX 발현에 대해 분석하였다. 다수의 상이한 세포주를 분석하였다 (도 30). 도 30 (1번 및 2번 레인)은 당근 세포 내 인간 X 인자의 강한 발현을 입증한다. 재조합 인간 X 인자 프로단백질의 부분적 가공으로 인해 다양한 크기가 관찰된다.

재조합 단백질의 동정을 확인하기 위해, 푸린 (furin)에 의한 절단가능성을 시험하였다. 푸린은 칼슘 의존성 세린 단백질분해효소이며, 분비 경로의 주요 가공효소이다. 푸린은 X 인자뿐만 아니라 기타 혈액응고 인자 및 성장 인자를 절단한다. 푸린은 New England Biolabs 사에서 구입하였고, 절단 분석은 제조사의 권장사항에 따라 수행하였다. 도 31은 푸린에 의한 재조합 X 인자의 정확한 절단을 나타낸다 (6번 레인에 비교하여 레인 5를 참조).

당근 세포 내 활성 분석: 재조합 X 인자의 활성 분석은, Xa 인자를 위한 유색체 펩타이드 기질인 페파크롬 (Pefachrome) FXa (Pefa-5523, Chromogenix 사, 이탈리아, 밀라노)를 사용하여 수행하였다. 도 32 (점선에 비교하여 실선을 참조)는, 대규모 배양물에서 성장시킨 재조합 FX를 발현하는 당근 세포로부터의 추출물 내 정확한 X 인자의 활성을 명백히 나타낸다.

본 발명에 따른 장치 내 대규모 배양 성장

재조합 인간 FX 유전자 (서열번호 16 및 21)를 함유하는 유전자 변이된 당근 세포의, 1 cm 정도의 캘러스를, 4.4 g/l 의 MSD 배지 (Duchefa 사), 9.9 mg/l 의 티아민 HCl (Duchefa 사), 0.5 mg 의 엽산 (Sigma 사), 0.5 mg/l 의 바이오틴 (Duchefa 사), 0.8 g/l 의 카제인 가수분해물 (Duchefa 사), 30 g/l 의 당 및 호르 몬 2-4 D (Sigma 사, 미주리 주, 세인트 루이스)를 함유하는 Murashige 및 Skoog (MS) 9 cm 직경 한천 배지 플레이트 상에 평판배양한다. 상기 캘러스는 25℃에서 14일간 성장된다.

현탁액 세포 배양물은, 상기 형질전환된 캘러스를 당해 분야에 잘 알려진 바와 같은 MSD (0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로아세트산을 함유하는 Murashige & Skoog (1962)) 액상 배지 중에서 게대배양함으로써 제조한다. 상기 현탁액 세포는 250 ml 얼렌마이어 플라스크 (작업 용적은 25 ml 로 시작하고, 7일 후에는 50 ml 로 증가한다) 내에서, 25℃에서 진탕 속도 60 rpm으로 배양된다. 이어서, 세포 배양물 용적은 동일한 조건 하에서 작업 용적을 300 ml 까지 부가하여, 세포 배양물 용적을 1 L 얼렌마이어 플라스크로 증가시켰다. 7일간 배양한 두 개의 1 L 얼렌마이어 플라스크에서 유래한 400 ml의 현탁액 세포를 첨가함으로써, 4 L의 MSD 배지를 함유하는 소형 생물반응기 (10 L)의 접종물 [WO 98/13469 참조]을 수득한다. 25℃에서 분 당 1 리터의 공기 유속 하에 일주일 간 배양한 후, MSD 배지를 10 L 까지 첨가하고, 배양을 동일한 조건 하에서 계속하였다. 배양을 5일 더 실시한 후, 세포 배지를 80 μ 그물을 통과시킴으로써, 대부분의 세포를 수확 및 수집하였다. 과량의 배지는 짜내었고, 충전된 (packed) 세포 케이크는 -70℃에서 보관하였다.

실시예 5c: 당근 캘러스의 인간 인터페론 β의 클로닝 및 발현

물질 및 실험 절차

CE -K 플라스미드: CE-K 플라스미드의 골격은 Bluescript SK+ 플라스미드 (Stratagene, 캘리포니아 주, 라 호야) (서열번호 15)이며, 폴리클로닝 부위 내 부 가적 카세트가 식물 세포의 소포체 내 고수준 발현 및 잔류를 위한 모든 필요한 요소를 함유한다. 상기 카세트는 하기를 포함한다 (서열 (서열번호 27) 및 맵, 도 37 을 참조): CaMV35S 촉진자, 오메가 증강자, 기본 엔도키티네이즈 유전자 [아라비돕시스 탈리아나]로부터의 ER 표적화 신호를 코딩하는 DNA 절편, 재조합 유전자의 융합을 위한 EcoRI 및 SalI 제한 부위, KDEL ER 잔류 시그널, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 합성효소 (OCS) 유전자의 전사 종료 및 폴리아데닐화 (polyadenylation) 신호.

pPZP111: 이중벡터는 조작된 DNA를 식물의 게놈에 융합하도록 고안되어 있다. Ti 이중벡터인 pPZP111 (Hajdukiewicz 등, Plant Mol. Biol. 1994; 25:989-994)은 카나마이신 내성을 위한 유전자를, 이전된 영역의 좌측 경계 (LB)에 인접하게 갖고 있다. pUC18 다중 클로닝 부위 (MCS)를 갖는 lacZ 알파-펩타이드가 식물 표지 유전자와 우측 경계 (RB) 사이에 자리한다. 따라서 RB가 먼저 이전되므로, 약물 내성은, 패신저 유전자 (passenger gene)가 유전자 도입된 (transgenic) 식물에 존재하는 경우에만 수득된다.

인간 인터페론 β 유전자의 클로닝: 인간 인터페론 β (Ifnβ, HUMIFNB1, GenBank 수탁번호 M28622, 서열번호 22 및 23)의 cDNA 유전자를 Haki (Peprotech Inc. 사, 뉴저지 주, 프린스턴)로부터 수득하였다. 코딩 영역을 증폭시키고, 제한 부위인 EcoRI 및 SalI 를 서브-클로닝을 위해 첨가하였다. 잘 발달한 인간 인터페론 β 서열의 코딩 영역의 두 부분을 증폭시켰고, 대안적으로는 소포체 (프라이머 1 및 2를 사용) 또는 아포플라스트 (프라이머 1 및 3을 사용)에 표적화시켰다:

1. 정방향 프라이머: Ifnβ 시작 EcoRI: 5' CAGAATTCATGAGCTATAATC 3' (서열번호 24)

2. 역방향 프라이머: Ifnβ 종료 SalI kdel: 5' GGATGTCGACTTACGCAGGTAG 3' (서열Q번호 25)

3. 역방향 프라이머 II: Ifnβ 종료 SalI STOP 5' GTGTCGACTTAGTTAGTTACGCAGGTAG 3' (서열번호 26)

또한 편입된 제한 부위, EcoRI 및 SalI 을 통해 상기 유전자의 N- 및 C-말단의 신호를 융합시켰다.

증폭 반응은 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche-Applied-Science 사, 카탈로그 번호 1732650)을 사용하여, 제조사의 지시사항에 따라 수행하였다. PCR 생성물은 인간 인터페론 β 서열의 동정을 위해 1% 아가로오스 젤에서 분리하였다. PCR 생성물 밴드를 상기 기술한 바와 같이 용출시키고, 10%의 용출된 DNA를 확인 및 정제를 위해 1% 아가로오스 젤에서 다시 분리하였다. 도 33은 정제된 클론된 인간 인터페론 β 서열 (화살표가 PCR 생성물을 표시한다)을 나타낸다.

상기 PCR 생성물을 용출시키고, 제한효소 EcoRI 및 SalI 로써 절단하고, 제조사의 지시사항에 따라 CE-K 발현 카세트에 연결하였다.

상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α 를 형질전환하고, 형질전환된 박테리아는 100 ㎍/ml 앰피실린이 포함된 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 양성 클론은 35S 정방향 (서열번호 5) 및 종결자 역방향 (서열번호 6) 프라이머 (도 34 및 35)를 사용하여, PCR 분석에 의해 선택하였다. 클로닝은 또한 EcoRI+SalI, 및 KpnI+XbaI (도 36) 를 사용한 제한 분석에 의해 확인하였다.

발현 카세트를, 제한효소 KpnI 및 XbaI 를 사용하여 CEK-ifn-ER (도 37) 및 CEK-ifn-STOP 플라스미드로부터 절단하였다. 이중벡터 pPZP111 (도 38)도 KpnI 및 XbaI 로써 절단하고, 탈인산화하고, 1% 아가로오스 젤로 용출시켰다. 상기 이중벡터 및 인터페론 발현 카세트를 연결하였다. 이. 콜라이 DH5α 로의 형질전환 및 플라스미드 추출 후, 양성 클론을 PCR 및 제한 분석에 의해 확인하였다.

식물 형질전환: 당근 세포의 형질전환을 이전에 기술된 방법 [Wurtele, E.S. 및 Bulka, K. Plant Sci., 61:253-262 (1989)]을 개조한 방법에 의해 아그로박테리움 형질전환을 이용하여 수행하였다. 공정 전체를 통해 캘러스 대신에 액상 배지 중에 성장하는 세포를 사용하였다. 인큐베이션 및 성장 시간은 액상 배양물 중의 세포의 형질전환에 맞추어졌다. 간단하게, 아그로박테리아 LB4404 를 전기천공 [den Dulk-Ra, A. 및 Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]에 의해 "pzp-ifn-KDEL" 및 "pzp-ifn-STOP" 벡터로써 형질전환시키고, 이어서 30 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다. 당근 세포 (다우커스 카로타)를 아그로박테리아로써 형질전환하고, 액상 배지 중 60 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다.

결과

배양된 당근 세포 내 활성 재조합 인간 인터페론 β의 발현

당근 세포 내 발현 및 분석: 초기 분석: 형질전환된 당근 세포를, 상기 GCD에 대해 기술한 바와 같은, 0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로메톡시아세트산으로 보충된 Murashige & Skoog 배지 (Physiol. Plant, 15, 473, 1962)의 배양물에서 성장시켰다. 세포는 7일 동안 성장시켰고, 이후 세포를 수확하였다. 과량의 액체는 100 메쉬 필터로 분리하였다. 형질전환 후 2주 후에, 마우스의 단클론 항-인간 인터페론 베타 항체 및 친화 정제된 토끼의 항-인터페론 베타 항체 (Calbiochem 사, 캘리포니아 주, 라 호야)를 사용한 돗 블롯 (dot blot) 분석을 이용하는 인터페론 발현의 예비분석을 위해, 형질전환된 세포 샘플을 수집하였다. 양 항체 모두 인터페론 β 형질전환된 세포에서 강하고 특정한 신호를 내었고, 비-형질전환된 세포에서는 신호를 내지 않았다.

가장 잘 발현하는 캘러스의 선택: 형질전환 후 2주 후에, 인간 인터페론 β 발현 세포를 항생제 선택물 (카나마이신 및 세포탁심)과 함께 고체 한천 상에 부어, 개별 형질전환 내역 (transformation event)을 나타내는 캘러스를 단리하였다. 캘러스가 형성되면, 이들은 개별 플레이트로 이전되어 3개월 동안 성장시켰다. 개별 캘러스 내 발현 수준을 분석하고, 가장 강한 발현을 하는 캘러스를 동정하기 위해 수득한 캘러스로부터 충분한 물질을 회수하였다. 도 40은 인간 인터페론 β의 가장 강한 발현 (예를 들면, 1번 및 2번 레인)을 하는 형질전환된 캘러스를 선별하기 위한 샘플 웨스턴 블롯을 나타낸다.

당근 세포 내 활성 분석: 당근 세포에서 생산된 재조합 인간 인터페론 β의 생물학적 활성을 분석하기 위해, 상기 재조합 발현 단백질을 바이러스 세포변성 (cytopathic) 억제 효과 (Rubinstein 등, J. Virol. 1981; 37:755-758)에 대해 분석하였다. 간단하게, 재조합 인간 인터페론 β 샘플을 예비희석시키고, WISH 세포 (인간의 양막 표피 세포주)의 예비형성된 단분자층에 적용하였다. 상기 WISH 세포는 수포성 구내염 (vesicular stomatitis) 바이러스 (VSV)에 대한 면역시험을 하였고, 세포 생존가능성을 모니터링 하였다. NIH 표준 인간 인터페론 β에 대한 적정량 (titer; U/ml 로 표기됨)을 단백질 상이한 유전자 도입된 당근 세포주로부터 구하였다. 표 1 에서는 다양한 유전자 도입된 당근 세포주로부터 제조된 단백질 추출물을 사용하는 바이러스 세포변병 억제 분석의 결과를 나타낸다.

[표 1]

당근 캘러스 내 발현된 재조합 인간 인터페론 β
샘플 번호	활성 (U/ml)
1	6,000
2	12,000
3	16,000
4	12,000
5	16,000

따라서 이들 결과의 관점에서는, 당근 캘러스에서 발현된 재조합 인간 인터페론 β는 모든 인간 인터페론 β와 항원 및 기능적으로 동정을 명백히 입증한다.

본 발명에 따른 장치 내의 대규모 배양 성장

재조합 인간 인터페론 β 유전자 (서열번호 27 및 28)를 함유하는 유전자 변이된 당근 세포의, 1 cm 정도의 캘러스를, 4.4 g/l 의 MSD 배지 (Duchefa 사), 9.9 mg/l 의 티아민 HCl (Duchefa 사), 0.5 mg 의 엽산 (Sigma 사), 0.5 mg/l 의 바이오틴 (Duchefa 사), 0.8 g/l 의 카제인 가수분해물 (Duchefa 사), 30 g/l 의 당, 및 호르몬 2-4 D (Sigma 사, 미주리 주, 세인트 루이스)를 함유하는 Murashige 및 Skoog (MS) 9 cm 직경 한천 배지 플레이트 상에 평판배양한다. 상기 캘러스는 25℃에서 14일간 성장된다.

현탁액 세포 배양물은, 상기 형질전환된 캘러스를 당해 분야에 잘 알려진 바와 같은 MSD (0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로아세트산을 함유하는 Murashige & Skoog (1962)) 액상 배지 중에서 게대배양함으로써 제조한다. 상기 현탁액 세포는 250 ml 얼렌마이어 플라스크 (작업 용적은 25 ml 로 시작하고, 7일 후에는 50 ml 로 증가한다) 내에서, 25℃에서 진탕 속도 60 rpm으로 배양된다. 이어서, 세포 배양물 용적은 동일한 조건 하에서 작업 용적을 300 ml 까지 부가하여, 세포 배양물 용적을 1 L 얼렌마이어 플라스크로 증가시켰다. 7일간 배양한 두 개의 1 L 얼렌마이어 플라스크에서 유래한 400 ml의 현탁액 세포를 첨가함으로써, 4 L의 MSD 배지를 함유하는 소형 생물반응기 (10 L)의 접종물 [WO 98/13469 참조]을 수득한다. 25℃에서 분 당 1 리터의 공기 유속 하에 일주일 간 배양한 후, MSD 배지를 10 L 까지 첨가하고, 배양을 동일한 조건 하에서 계속하였다. 배양을 5일 더 실시한 후, 세포 배지를 80 μ 그물을 통과시킴으로써, 대부분의 세포를 수확 및 수집하였다. 과량의 배지는 짜내었고, 충전된 세포 케이크는 -70℃에서 보관하였다.

실시예 5d: 당근 캘러스 내 전염성 F 낭병 ( infectious bursal disease ) 바이러스의 바이러스 단백질 2 ( VPII )의 클로닝 및 발현

물질 및 실험절차

CE 플라스미드: CE-K 플라스미드의 골격은 Bluescript SK+ 플라스미드 (Stratagene, 캘리포니아 주, 라 호야) (서열번호 15)이며, 폴리클로닝 부위 내 부가적 카세트가 식물 세포의 소포체 내 고수준 발현 및 잔류를 위한 모든 필요한 요소를 함유한다. 상기 카세트는 하기를 포함한다 (서열 (서열번호 32) 및 맵, 도 XXX 을 참조): CaMV35S 촉진자, 오메가 증강자, 기본 엔도키티네이즈 유전자 [아라비돕시스 탈리아나]로부터의 ER 표적화 신호를 코딩하는 DNA 절편, 재조합 유전자의 융합을 위한 EcoRI 및 SalI 제한 부위, KDEL ER 잔류 시그널, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 합성효소 (OCS) 유전자의 전사 종료 및 폴리아데닐화 (polyadenylation) 신호.

pGA492: 이중벡터는 조작된 DNA를 식물의 게놈에 융합하도록 고안되어 있다. Ti 이중벡터인 pGA492 (An. Methods in Enzymol. 1987, 153:292-305)은 카나마이신 내성을 위한 유전자를 갖고 있다.

전염성 F 낭병 바이러스의 바이러스 단백질 2 ( VPII ) 유전자의 클로닝: 전염성 F낭병 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VPII) 유전자 (GenBank 수탁번호 L42284) (서열번호 29)의 cDNA 서열을 J. Pitkovski 박사 (MIGAL 사, 이스라엘, 키리얏 쉐모나)로부터 얻었다. 상기 바이러스 게놈은 이중가닥 RNA의 단편 두 개로 이루어져 있다. 단편 A (3.2kb)는 두 개의 열린 해독틀 (open reading frame; ORF), A1 및 A2 를 함유한다. ORF A1 은, 단백질 분해 가공 후에 세 개의 잘 발달한 폴리펩타이드: VP2 (VPII) (37 내지 40 kDa), VP3 (30 내지 32 kDa) 및 VP4 (22 kDa)를 산출하는 108 kDa의 다단백질 (polyprotein)을 코딩한다. VPII 및 VP3 는 바이러스 껍데기 (capsid)를 형성하고, VP4 는 다단백질의 절단을 담당한다.

VPII를 코딩하는 cDNA를 프라이머로 증폭시켜 클로닝 및 신호 융합을 용이하게 하였다. 간단하게, VPII 의 코딩 서열을, 하기의 정방향 프라이머:

VPII-(서열번호 30)

5' GCCTTCTGATGGCGCATGCAAATGGCAAACCTGCAAGATCAAACC 3'

및 하기의 역방향 프라이머:

VPII-(서열번호 31)

5' GCCGGTGGTCTCTGCCATAAGGAGGATAGCTGTGTAATAGGAATTCGC 3'

를 사용하여 증폭시켰고, 또한 편입된 제한 부위, SphI 를 통해 상기 유전자의 N-말단의 신호를 융합시켰다.

증폭 반응은 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche-Applied-Science 사, 카탈로그 번호 1732650)을 사용하여, 제조사의 지시사항에 따라 수행하였다. PCR 생성물은 VPII 서열의 동정을 위해 1% 아가로오스 젤에서 분리하였다. 도 40은 우세한 VPII 밴드 (화살표로 표시됨)를 나타낸다. 상기 밴드를 용출시키고, 제한효소 EcoRI 및 SphI 로써 절단하고, 제조사의 지시사항에 따라 정제된 CE 발현 카세트에 연결하였다.

상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α 를 형질전환하고, 형질전환된 박테리아는 100 ㎍/ml 앰피실린이 포함된 한천 플레이트 상에서 선택하였다.

35S 촉진자로부터의 정방향 프라이머: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGCT 3' (서열번호 5)

종결자로부터의 역방향 프라이머: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3' (서열번호 6).

발현 카세트를, 제한효소 BamHI 및 XbaI 를 사용하여 CE-VPII 플라스미드로부터 절단하였다. pGA492 벡터를 BglII 및 XbaI (BglII 및 BamHI 는 상용성 부착성 말단을 갖는다)로써 절단하고, 1% 아가로오스 젤로부터 용출시켰다. 상기 이중 벡터 및 VPII 발현 카세트를 연결하여 이. 콜라이 DH5α 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용하였다. 형질전환, 성장 및 플라스미드 추출 후에, 양성 클론을 PCR 및 제한 분석에 의해 확인하였다.

식물 형질전환: 당근 세포의 형질전환을 이전에 기술된 방법 [Wurtele, E.S. 및 Bulka, K. Plant Sci., 61:253-262 (1989)]을 개조한 방법에 의해 아그로박테리움 형질전환을 이용하여 수행하였다. 공정 전체를 통해 캘러스 대신에 액상 배지 중에 성장하는 세포를 사용하였다. 인큐베이션 및 성장 시간은 액상 배양물 중의 세포의 형질전환에 맞추어졌다. 간단하게, 아그로박테리아 LB4404 를 전기천공 [den Dulk-Ra, A. 및 Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72]에 의해 "pGA492-CE-VPII" 벡터로써 형질전환시키고, 이어서 30 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다. 당근 세포 (다우커스 카로타)를 아그로박테리아로써 형질전환하고, 액상 배지 중 60 mg/ml 의 파로모마이신 항생제를 사용하여 선택하였다.

결과

배양된 당근 세포 내 재조합 VPII 의 발현

당근 세포 내 발현 및 분석: 초기 분석: 형질전환된 당근 세포를, 상기 GCD에 대해 기술한 바와 같은, 0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로메톡시아세트산으로 보충된 Murashige & Skoog 배지 (Physiol. Plant, 15, 473, 1962)의 배양물에서 성장시켰다. 세포는 7일 동안 성장시켰고, 이후 세포를 수확하였다. 과량의 액체는 100 메쉬 필터로 분리하였다. 형질전환 후 2주 후에, 닭의 항-IBDV 및 토끼의 항-IBDV 항체를 사용한 돗 블롯 (dot blot) 분석을 이용하는 VPII 발현의 예비분석을 위해, 형질전환된 세포 샘플을 수집하였다. 양 항체 모두 VPII 형질전환된 세포에서 강하고 특정한 신호를 내었고, 비-형질전환된 세포에서는 신호를 내지 않았다.

가장 잘 발현하는 캘러스의 선택: 형질전환 후 2주 후에, 인간 인터페론 β 발현 세포를 항생제 선택물 (카나마이신 및 세포탁심)과 함께 고체 한천 상에 부어, 개별 형질전환 내역을 나타내는 캘러스를 단리하였다. 캘러스가 형성되면, 이들은 개별 플레이트로 이전되어 3개월 동안 성장시켰다. 개별 캘러스 내 발현 수준을 분석하고, 가장 강한 발현을 하는 캘러스를 동정하기 위해 수득한 캘러스로부터 충분한 물질을 회수하였다. 도 44는 VPII 의 가장 강한 발현 (예를 들면, 2번 및 11번 레인)을 하는 형질전환된 캘러스를 선별하기 위한 샘플 웨스턴 블롯을 나타낸다. 상기 선별 후에는, 가장 잘 발현하는 캘러스 (vp2R21)를 선택하고, 확장을 위해 액상 배지로 이전하였다.

재조합 VPII - 닭 백신접종 분석:

재조합 VPII 를, 닭의 전염성 F낭병에 대한 백신으로서의 유효성에 대해 분석하였다. 총 단백질 추출물을 세포주 vp2R21 의 캘러스로부터 제조하였고, 주사 (1 mg)에 의해 또는 경구적으로 (3×100 ㎍) 투여하였다 (각 군의 10 마리의 생후 4주된 닭에게 투여). 경구 투여는 닭 한 마리 당 2 그램의 여과된 세포 현탁액을 3일 연속 먹임으로써 수행하였다. 재조합 VPII 을 이용한 백신접종의 보호 효과를 표 2에 나타내었다:

[표 2]

당근 세포에서 발현된 VPII 를 이용한 백신접종
처리	항체 생성 %	포낭 반응 %	바이러스에 노출 후 사망률
경구 투여된 추출물 (vp2R21)	0	11	1/10
근육내 주사된 추출물 (vp2R21)	80	90	0/10
상업용 백신 1	90	100	0/10
상업용 백신 2	60	100	0/10
미처리	0	0	2/10

두 번째 실험에서는 800 ㎍의 VPII 를 경구 투여하여, 17%의 닭이 면역된 결과를 가져왔다 (결과는 나타내지 않음). 따라서 당근 세포에서 발현된 재조합 VPII 는 주사제 백신으로서 효과가 있다.

본 발명에 따른 장치 내에서의 대규모 배양 성장

재조합 VPII (서열번호 32 및 33)를 함유하는 유전자 변이된 당근 세포의, 1 cm 정도의 캘러스를, 4.4 g/l 의 MSD 배지 (Duchefa 사), 9.9 mg/l 의 티아민 HCl (Duchefa 사), 0.5 mg 의 엽산 (Sigma 사), 0.5 mg/l 의 바이오틴 (Duchefa 사), 0.8 g/l 의 카제인 가수분해물 (Duchefa 사), 30 g/l 의 당, 및 호르몬 2-4 D (Sigma 사, 미주리 주, 세인트 루이스)를 함유하는 Murashige 및 Skoog (MS) 9 cm 직경 한천 배지 플레이트 상에 평판배양한다. 상기 캘러스는 25℃에서 14일간 성장된다.

현탁액 세포 배양물은, 상기 형질전환된 캘러스를 당해 분야에 잘 알려진 바와 같은 MSD (0.2 mg/l 의 2,4-다이클로로아세트산을 함유하는 Murashige & Skoog (1962)) 액상 배지 중에서 게대 배양함으로써 제조한다. 상기 현탁액 세포는 250 ml 얼렌마이어 플라스크 (작업 용적은 25 ml로 시작하고, 7일 후에는 50 ml 로 증가한다) 내에서, 25℃에서 진탕 속도 60 rpm으로 배양된다. 이어서, 세포 배양물 용적은 동일한 조건 하에서 작업 용적을 300 ml 까지 부가하여, 세포 배양물 용적을 1 L 얼렌마이어 플라스크로 증가시켰다. 7일간 배양한 두 개의 1 L 얼렌마이어 플라스크에서 유래한 400 ml의 현탁액 세포를 첨가함으로써, 4 L의 MSD 배지를 함유하는 소형 생물반응기 (10 L)의 접종물 [WO 98/13469 참조]을 수득한다. 25℃에서 분 당 1 리터의 공기 유속 하에 일주일 간 배양한 후, MSD 배지를 10 L 까지 첨가하고, 배양을 동일한 조건 하에서 계속하였다. 배양을 5일 더 실시한 후, 세포 배지를 80 μ 그물을 통과시킴으로써, 대부분의 세포를 수확 및 수집하였다. 과량의 배지는 짜내었고, 충전된 세포 케이크는 -70℃에서 보관하였다.

명확성을 위해 별도의 구현예의 형태로 기술한 본 발명의 특정한 특징은 조합되어 단일 구현예로 제공될 수도 있다는 점에 유의해야 한다. 역으로, 단순성을 위해 단일 구현예의 형태로 기술한 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로, 또는 임의의 적당한 하위조합으로 제공될 수도 있다.

본 발명을 특정 구현예와 함께 기술하였으나, 많은 대안예, 변경예 및 변화예가 당업자에게 명백할 것은 당연하다. 따라서 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범위에 속하는 모든 그러한 대안예, 변경예 및 변화예를 포함하는 것으로 의도된다. 각 개별 문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 또한 개별적으로 본원에 참고문헌으로 도입된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에서 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본원에 참고문헌으로서 도입된다. 또한, 본 출원에서 임의의 참고문헌의 인용 또는 식별은 그러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행기술로 존재한다는 것을 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. <120> CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD <130> <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Signal Peptide for the ER <400> 1 Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Glu Phe 20 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Vacuolar targeting signal from Tobacco chitinase A <400> 2 Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 1 5 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 cagaattcgc ccgcccctgc a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 ctcagatctt ggcgatgcca ca 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 ctcagaagac cagagggct 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 caaagcggcc atcgtgc 17 <210> 7 <211> 1491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300 caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420 gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480 attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcatcgcca g 1491 <210> 8 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp His Arg 485 490 495 Gln <210> 9 <211> 338 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CaMV 35S Promoter nucleic acid sequence <400> 9 ttttcacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 60 ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa 120 ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctacc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 180 acgaggaaca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 240 tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct 300 tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggac 338 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the ER signal peptide <400> 10 atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60 gaattc 66 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the vacuolar targeting sequence <400> 11 gatcttttag tcgatactat g 21 <210> 12 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence for terminator <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 taatttcatg atctgttttg ttgtattccc ttgcaatgca gggcctaggg ctatgaataa 60 agttaatgtg tgaatgtgtg aatgtgtgat tgtgacctga agggatcacg actataatcg 120 tttataataa acaaagactt tgtcccaaaa accccccccc cngcaga 167 <210> 13 <211> 2186 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid encoding recombinant GCD fused to signal peptides <220> <221> misc_feature <222> (2181)..(2181) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 ttttcacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 60 ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa 120 ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctacc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 180 acgaggaaca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 240 tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct 300 tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggacag gcttcttgag atccttcaac 360 aattaccaac aacaacaaac aacaaacaac attacaatta ctatttacaa ttacagtcga 420 gggatccaag gagatataac aatgaagact aatctttttc tctttctcat cttttcactt 480 ctcctatcat tatcctcggc cgaattcgcc cgcccctgca tccctaaaag cttcggctac 540 agctcggtgg tgtgtgtctg caatgccaca tactgtgact cctttgaccc cccgaccttt 600 cctgcccttg gtaccttcag ccgctatgag agtacacgca gtgggcgacg gatggagctg 660 agtatggggc ccatccaggc taatcacacg ggcacaggcc tgctactgac cctgcagcca 720 gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctc 780 aacatccttg ccctgtcacc ccctgcccaa aatttgctac ttaaatcgta cttctctgaa 840 gaaggaatcg gatataacat catccgggta cccatggcca gctgtgactt ctccatccgc 900 acctacacct atgcagacac ccctgatgat ttccagttgc acaacttcag cctcccagag 960 gaagatacca agctcaagat acccctgatt caccgagccc tgcagttggc ccagcgtccc 1020 gtttcactcc ttgccagccc ctggacatca cccacttggc tcaagaccaa tggagcggtg 1080 aatgggaagg ggtcactcaa gggacagccc ggagacatct accaccagac ctgggccaga 1140 tactttgtga agttcctgga tgcctatgct gagcacaagt tacagttctg ggcagtgaca 1200 gctgaaaatg agccttctgc tgggctgttg agtggatacc ccttccagtg cctgggcttc 1260 acccctgaac atcagcgaga cttcattgcc cgtgacctag gtcctaccct cgccaacagt 1320 actcaccaca atgtccgcct actcatgctg gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg 1380 gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat 1440 tggtacctgg actttctggc tccagccaaa gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc 1500 cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt 1560 gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc 1620 ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc 1680 aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt 1740 tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc cacttcagca agttcattcc tgagggctcc 1800 cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat 1860 cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc 1920 atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag acaatctcac ctggctactc cattcacacc 1980 tacctgtggc atcgccaaga tcttttagtc gatactatgt aatttcatga tctgttttgt 2040 tgtattccct tgcaatgcag ggcctagggc tatgaataaa gttaatgtgt gaatgtgtga 2100 atgtgtgatt gtgacctgaa gggatcacga ctataatcgt ttataataaa caaagacttt 2160 gtcccaaaaa cccccccccc ngcaga 2186 <210> 14 <211> 526 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant GCD fused to signal peptides <400> 14 Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Glu Phe Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly 20 25 30 Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe 35 40 45 Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser 50 55 60 Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala 65 70 75 80 Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys 85 90 95 Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys 115 120 125 Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro 130 135 140 Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr 145 150 155 160 Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr 165 170 175 Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg 180 185 190 Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys 195 200 205 Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly 210 215 220 Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp 225 230 235 240 Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn 245 250 255 Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly 260 265 270 Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro 275 280 285 Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp 290 295 300 Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp 305 310 315 320 Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu 325 330 335 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu 340 345 350 Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys 355 360 365 Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln 370 375 380 Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp 385 390 395 400 Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val 405 410 415 Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr 420 425 430 Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe 435 440 445 Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn 450 455 460 Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val 465 470 475 480 Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp 485 490 495 Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His 500 505 510 Thr Tyr Leu Trp His Arg Gln Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 515 520 525

Claims (159)

1. (a) 일회 이상의 사이클에서 세포를 무균적으로 배양 및 수확하기 위한 하나 이상의 일회용 장치로서,

   상기 장치는, 원하는 경우 세포를 함유하는 배지의 적어도 원하는 분량을 수확할 수 있게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적인 연속되는 배양/수확 사이클에 연속적으로 사용될 수 있게 하는 흐름 제어기를 포함하는, 재사용가능한 수확기를 포함하는 살균가능한 일회용 용기를 포함하는데, 이때 이전의 수확된 사이클로부터 남겨진 상기 세포를 함유하는 배지의 잔류분이 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하며,

   상기 장치는 그의 하단에 또는 그 근처에 하나 이상의 공기 유입구를 포함하고, 상기 장치의 상기 하단은 원추대 (frusta-conical) 형이고, 상기 공기 유입구는 평균 직경 1 내지 10 mm의 공기방울을 생성시키도록 설계되는 것인 일회용 장치; 및

   (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 글루코세레브로시데이즈로 이루어진 인간 재조합 단백질을 발현하는 당근 세포의 현탁액 배양액

   을 포함하는, 식물 세포 배양에서 재조합 단백질을 발현하는 시스템.
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11. 제1항에 있어서, 상기 수확기가 상기 용기의 하단의 바닥에 위치한 시스템.
12. 제1항에 있어서, 상기 수확기가 상기 용기의 하단의 바닥 근처에 위치하여, 각 수확 사이클의 완료시에 상기 세포를 함유하는 배지의 상기 잔류분이 상기 용기의 하단에, 자동적으로 상기 수확기의 수위보다 아래의 일정 수위까지 남겨지도록 된 시스템.
13. 제1항에 있어서, 상기 세포를 함유하는 배지의 상기 잔류분이 상기 배지 및 상기 접종물의 원래 용적의 2.5% 내지 45%를 포함하는 것인 시스템.
14. 제1항에 있어서, 상기 세포를 함유하는 배지의 상기 잔류분이 상기 배지 및 상기 접종물의 원래 용적의 5% 내지 30%를 포함하는 것인 시스템.
15. 제14항에 있어서, 상기 세포를 함유하는 배지의 상기 잔류분이 상기 배지 및 상기 접종물의 원래 용적의 10% 내지 20%를 포함하는 것인 시스템.
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18. 제1항에 있어서, 상기 용기의 충진가능한 내부 용적이 5 리터 내지 1000 리터인 시스템.
19. 제18항에 있어서, 상기 충진가능한 내부 용적이 20 리터 내지 800 리터인 시스템.
20. 제19항에 있어서, 상기 충진가능한 내부 용적이 50 리터 내지 200 리터인 시스템.
21. 제1항에 있어서, 상기 장치가 상기 장치를 지지체 구조물에 부착시키기 위한 부착기를 추가로 포함하는 것인 시스템.
22. 제21항에 있어서, 상기 부착기가 상기 용기의 상단에 일체형으로 (integrally) 부착된 적당한 물질의 루프 (loop)를 포함하는 것인 시스템.
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24. 하나 이상의 일회용 장치 내에서 무균적으로 배양된 식물 세포에서 재조합 인간 글루코세레브로시데이즈 단백질을 생산하는 방법으로서:

    제1항, 제11항 내지 제15항 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 시스템을 제공하는 단계;

    상기 수확기를 통해 무균 접종물을 제공하는 단계;

    살균된 상기 배지 및 살균된 첨가제를 제공하는 단계;

    상기 당근 세포가 상기 배지 중에서 목적하는 수율까지 성장하도록 하는 단계; 및

    상기 재조합 인간 글루코세레브로시데이즈 단백질을 발현하는 상기 당근 세포를 상기 세포 또는 배지로부터 수확하는 단계

    를 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 원하는 부분을 수확하는 중에, 상기 용기 내에 세포를 함유하는 배지의 잔류분을 남기고, 상기 배지의 잔류분은 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물의 역할을 하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 첨가제 유입구를 통해 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위해 살균된 상기 배지 및 살균된 첨가제를 제공하는 단계; 및

    오염물이 발견되거나 생산되는 세포/조직의 품질이 떨어져서 상기 장치 및 그 내용물을 폐기해야 할 때까지 성장 사이클을 반복하는 단계를 추가를 포함하는 방법.
27. 제24항의 방법에 따라 재조합 글루코세레브로시데이즈 단백질을 발현하도록 유전자 변이된 식물 세포의 무균 배양물.
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29. 제24항에 있어서, 상기 용기를 외부광으로 조명하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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