JP2007522824A - 細胞/組織培養デバイス、システム、および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入:Klee ら.,(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38:467−486;Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6巻,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,編,Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2−25;Gatenby,in Plant Biotechnology,編,Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93−112。
図1a〜cには、本発明のデバイスの第1の実施形態の主な構成部材が、正面図および断面側面図として、それぞれ図1Aおよび1Bに示され、図1Cには本発明の例示的なシステムが示される。
図2aおよび2bには、それぞれ、本発明のデバイスの第2の実施形態の主な構成部材が、それぞれ、正面図および断面側面図として示される。
図3には、本発明のデバイスの第3の実施形態の主な構成部材が断面側面図として示される。
図4には、本発明のデバイスの第1の実施形態の継目線が正面図として示される。
図5aおよび5bには、本発明のデバイスの第4の実施形態の主な構成部材が、それぞれ、側面図および断面の上方視点図として示される。図5cおよび5dには、図5(a)の線B−BおよびC−Cに沿った、第4の実施形態の横方向の断面図が示される。
図6aおよび6bには、本発明のデバイスの第5の実施形態の主な構成部材が、それぞれ、側面図および断面の上方視点図として示される。図6cおよび6dには、図6(a)の線B−BおよびC−Cに沿った、第5の実施形態の横方向の断面図が示される。
図7には、図5の実施態様が透視図として示される。
図8には、図6の実施態様が透視図として示される。
図9には、図5〜8の実施形態を使用するための支持構造体が示される。
図10には、図1〜8のいずれか1つのデバイスを複数個含む、本発明のバッテリーの好ましい実施形態の主な構成部材が示される。
図11aおよび11bでは、本発明とともに使用される発現カセットとベクターが示される。
図12には、三角フラスコに対して向かい合わせた本発明のデバイスの中での、形質転換された(グルコセレブロシダーゼ(GCD))ニンジン細胞懸濁物の増殖が示される。
図13には、三角フラスコに対して向かい合わせた本発明のデバイスによって生産されたGCDの相対的な量が示される。
図14には、平行である増殖曲線に関して、7%および15%の充填細胞容量の開始点が示される。
図15には、これらの2つの増殖条件についての定量的ウェスタンブロットによるGCDタンパク質の量が示される。
図16には、定常点を見つけるための、さらに長い期間(14日間)にわたる増殖が示される。
図17には、最大量のGCD(他のタンパク質と比較して)は形質転換された細胞によって8日目までに生産され、その後、生産されたGCDの量は減少し始めたことが示される。
図18には、4日目に培地を交換し、および/または新しい培地を添加することにより、8日目を越えても細胞の高い増殖レベルが維持されることが示される。
図19には、図18に記載される条件下で生産されたGCDの量が示される。
図20には、図18に記載される条件下で生産されたGCDの量が示される。
図21には、細胞増殖に対する種々の糖レジュメの効果が示される。
図22aおよび22bには、GCDの生産に対する種々の糖レジュメの効果が示される。
図23aおよび23bには、本発明の10Lのデバイスの中での細胞増殖に対するエアレーション速度の効果が示される。
図24には、本発明のデバイスに対するさらなる酸素の添加の効果が示される。
図25には、PCRによる増幅後の、ヒト第X因子をコードする配列(矢印)の電気泳動による分離が示される。
図26には、CaMV35SΩとOCSターミネーター配列の間に第X因子の配列が連結されている、連結されたCE−FX−KDEL構築物が示される。制限酵素の認識部位の位置が示される。
図27は、中に連結カセットCE−FX−KDELが導入されているpBluescript SKベクターのマップである。
図28は、プラスミドpzp−FX−ERおよびpGREEN nos−kana−FX−ERで形質転換したクローンの制限分析であり、これにより、植物細胞中でのヒト第X因子のクローニングおよび発現に使用したカセット、およびプラスミドが示される。レーン1は、構築物pzp−FX−ERで形質転換され、その後、制限酵素で消化されたクローン3である。レーン2は、EcoR1とHindIIIで消化された後のクローン3である。レーン3は、構築物pzp−FX−ERで形質転換され、その後、制限酵素で消化されたクローン4である。レーン4は、EcoR1とHindIIIで消化された後のクローン4である。レーン5は、CaMV35S+ΩFX−ER発現カセットである。レーン6は、pGREEN nos−kana−FX−ERで形質転換され、その後、制限酵素で消化されたクローン3である。レーン7は、Asp718とXbaIで消化されたクローン3である。レーン8は、pGREEN nos−kana−FX−ERで形質転換され、その後、制限酵素で消化されたクローン8である。レーン9は、Asp718とXbaIで消化されたクローン8である。全ての形質転換されたクローンのCaMV35S+ΩFX−ER発現カセットのバンドに注目されたい。MW=分子量標準物。
図29には、CaMV35S+Ω、OCSターミネーターと、NPTII配列の間に第X因子配列が連結されている、pGREEN nos−kana−FX−ER構築物のTDNAが示される。制限酵素の認識部位の位置が示される。
図30には、多数の形質転換されたニンジン細胞株の細胞内容物のウェスタンブロット分析が示される。第X因子の発現は、精製されたポリクローナルウサギ抗ヒト第X因子IgG(Affinity Biologicals,Hamilton,Ontario,Canada)によってウェスタンブロット上で検出された。pGREEN−nos−kana−FX−ERで形質転換された株の中での第X因子の強い発現に留意されたい(レーン1および2)。MW=分子量標準物。
図31には、植物細胞中で発現させられた組み換え体ヒト第X因子の的確な切断が示される。エンドペプチダーゼであるフリン(これは、ヒト第X因子の軽鎖/重鎖のプロセシングのためのプロペプチドと一本鎖の除去に応答する)によって、活性なXaの大きさになるように植物細胞中で発現させられた組み換え体ヒト第X因子が的確に消化される(レーン4および5を参照のこと)。MW=分子量標準物。
図32は、植物細胞中で発現させられた組み換え体ヒト第X因子の触媒活性を示すグラフである。形質転換されたニンジン細胞に由来する細胞抽出物(●、▲、および■)と、形質転換されていない対照(+、*、および●)は、色素形成性物質であるペファクロム(Pefachrome)と反応させられ、生成物が分光光度計によってOD450nmでモニターされた。
図33には、PCRによる増幅後の、ヒトIfnβコード配列(矢印)の電気泳動による分離が示される。レーン1はifnKDEL配列(ERを標的とする)である。レーン2はifnSTOP配列である(アポプラストを標的とする)。MW=分子量標準物。
図34には、CE−K発現カセットを使用して大腸菌(E.coli)DH5αにクローニングされた、増幅されたヒトIfnβコード配列の電気泳動による分離が示される。ポジティブクローンが、CaMV35S正方向プライマーとターミネーター逆方向プライマーを使用する挿入断片のPCR分析によって選択された(図29を参照のこと)。レーン1〜7はポジティブクローンであり、CE−ifn−STOP挿入断片を示している。レーン「fx」はポジティブ対照のCE−fx−hisであり、これにはifn挿入断片は含まれていない。レーン「−DNA」はネガティブ対照のPCR反応であり、これにはDNAは含まれていない。
図35には、CE−K発現カセットを使用して大腸菌(E.coli)DH5αにクローニングされた、増幅されたヒトIfnβコード配列の電気泳動による分離が示される。ポジティブクローンが、CaMV35S+Ω正方向プライマーとOCSターミネーター逆方向プライマーを使用する挿入断片のPCR分析によって選択された(図37を参照のこと)。レーン1〜4および6はポジティブクローンであり、CE−ifn−KDEL挿入断片を示している。レーン5はヒトIfnβを発現しないクローンである。MW=分子量標準物。
図36には、ifnポジティブクローンの制限分析産物の電気泳動による分離が示される。左側のパネルには、CE−ifn−STOP挿入断片およびCE−ifn−KDEL挿入断片(矢印)を有しているポジティブクローンの、制限酵素EcoRI+SalIを使用した制限分析産物の電気泳動による分離が示される(レーン1〜5)。レーン1は、EcoRI+SalIで消化したCE−ifn−KDELポジティブクローン1である(図35を参照のこと)。レーン2は、EcoRI+SalIで消化したCE−ifn−KDELポジティブクローン2である(図35を参照のこと)。レーン3は、EcoRI+SalIで消化したCE−ifn−STOPポジティブクローン1である(図34を参照のこと)。レーン4は、EcoRI+SalIで消化したCE−ifn−STOPポジティブクローン2である(図34を参照のこと)。レーン5は、EcoRI+SalIで消化したCE−Fx(「ifn」挿入断片を含まない)である。MW=分子量標準物。右側のパネルには、CE−ifn−STOP挿入断片およびCE−ifn−KDEL挿入断片(矢印)を有しているポジティブクローンの、制限酵素KpnI+XbaIを使用した制限分析産物の電気泳動による分離が示される(レーン6〜9)。レーン6は、KpnI+XbaIで消化したCE−ifn−KDELポジティブクローン1である(図35を参照のこと)。レーン7は、制限酵素消化をしていないCE−ifn−KDELポジティブクローン2である(図35を参照のこと)。レーン8は、制限酵素消化をしていないCE−ifn−STOPポジティブクローン1である(図34を参照のこと)。レーン9は、KpnI+XbaIで消化したCE−ifn−STOPポジティブクローン1である(図34を参照のこと)。MW=分子量標準物。
図37には、CaMV35S+ΩとOCSターミネーター配列の間にヒトIfnβのコード配列が連結されている、連結させられたCE−ifn−KDEL構築物が示される。制限酵素の認識部位の位置が示される。
図38は、pzp−ifn−KDELプラスミドとpzp−ifn−STOPプラスミドの調製に使用されたpzp 111バイナリーベクターのマップであり、制限酵素認識部位が示される。
図39は、pzp−ifn−KDELプラスミドとpzp−ifn−STOPプラスミドを有しているアグロバクテリウムLB4404で形質転換されたニンジン細胞のクローンの中で発現させられた組み換え体ヒトIfnβの免疫検出を示すウェスタンブロットである。カルスが、抗生物質での選択によって寒天中の形質転換された細胞から増殖させられ、その後、数ヶ月間かけてそれぞれのプレートに移された。形質転換されたカルスの細胞内容物(レーン1〜10)が抽出され、PAGE上で分離させられ、ブロットされ、組み換え体ヒトinfβが、親和性によって精製されたウサギ抗インターフェロンβ抗体で検出された。MW=分子量標準物。St=ポジティブ対照:CHO細胞中で発現させられた3ngの組み換え体ヒトインターフェロンβ。
図40には、PCRによる増幅後の、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質2(VPII)をコードする配列(矢印)の電気泳動による分離が示される。レーン1、2、および3はVPII配列である。レーン4および5はネガティブ対照のPCR反応であり、それぞれ、DNAが含まれないもの、およびポリメラーゼが含まれないものである。MW1はλHEの分子量標準物であり、MW2は1bpのラダーの分子量標準物である。
図41には、CE−K発現カセットを使用して大腸菌(E.coli)DH5αにクローニングされた、増幅されたVPIIコード配列の電気泳動による分離が示される。ポジティブクローンが、CaMV35S+Ω正方向プライマーとOCSターミネーター逆方向プライマーを使用する挿入断片のPCR分析によって選択された(図37を参照のこと)。レーン1〜6は試験したクローンである。レーン2、3、および5は、VPII挿入断片を有しているポジティブクローンを示す。レーン7は、VPIIIのPCR産物であるポジティブ対照である。レーン8は、空のCEカセットのDNAを有しているPCR産物である。レーン9および10はネガティブ対照のPCR反応であり、それぞれ、DNAが含まれないもの、およびポリメラーゼが含まれないものである。M=分子量標準物。
図42は、CE−VPIIの調製に使用されたCEバイナリーベクターのマップであり、制限酵素認識部位が示される。
図43aおよび43bは、PAGE分析(43A)とウェスタンブロット(43B)であり、これらによって、pGA492−CE−VPIIプラスミドを有しているアグロバクテリウムLB4404で形質転換されたニンジン細胞のクローンの中で発現させられた組み換え体VPIIの電気泳動による分離と免疫検出が示される。カルスが、抗生物質での選択によって寒天中で形質転換された細胞から増殖させられ、その後、数ヶ月間かけてそれぞれのプレートに移された。形質転換されたカルスの細胞内容物(レーン2、3、5、6、7、10、11、13、14、および15)が抽出され、PAGE上で分離され、ブロットされ、組み換え体であるVPIIが、ニワトリ抗IBDV抗体で検出された(図43)。+=ポジティブ対照(VPIIタンパク質)。レーン1およびレーン9はVPII細胞懸濁物(形質転換事象の混合物)である。レーン4および12は、「空の」ベクターだけで形質転換されたネガティブ対照細胞であり、そしてレーン8および16は、形質転換されていないニンジン細胞の内容物である。
本発明の原理および操作は、図面と添付される記載を参照してさらに理解され得る。図1〜9は、本発明のデバイスの種々の例示的な実施形態の模式図を示す。
本発明はまた、細胞および/または組織を純培養し、回収するための使い捨てのデバイスのバッテリーにも関する。ここでは、複数のこれらのデバイスのそれぞれは、本明細書中で上記に定義され、その第1から第5の実施形態を参照して記載された、デバイス(10)と構造的に、また操作上も類似している。
本発明はまた、複数回使用される使い捨てのデバイス中で植物細胞を培養し、回収するための方法にも関する。このデバイスは、所望により、そして好ましくは、上記の実施例1および2のデバイスおよび/またはシステムにしたがって設定される。この方法では、植物細胞は、好ましくは、本発明のデバイスの容器に入れられる。この容器は、好ましくはプラスチック製であり、これは所望により、透明であっても、および/または半透明であってもよく、所望により硬質であっても、または弾力性があってもよく、また、所望により、硬質と柔軟性の間の硬度の程度を有してもよい(例えば、半硬質)。次いで、任意の他のさらなる材料、例えば、滅菌の気体もしくは混合気体、および/または滅菌の液体もしくは液体混合物、あるいは任意の他の適切な添加物が提供される。好ましくは、デバイスは、再利用することができる回収装置を特徴とするように構成される。その結果、材料(植物細胞、および/または上記のさらなる材料の1つ)を回収することができ、少なくとも1回のさらなる細胞培養/回収サイクルをなおも行うことができる。所望により、そしてより好ましくは、植物細胞は懸濁液の中で培養される。
本実験は、ツルニチニチソウ(rose periwinkle)としても知られているビンカ・ロゼア(Vinca rosea)由来の細胞を用いて行った。
実施例5a:ニンジンの細胞懸濁液の中でのヒトグルコセレブロシダーゼのクローニングおよび大量発現
本実施例により、本発明の方法にしたがって本発明のデバイスの中で培養され、形質転換された植物細胞を用いて行われた実験の記述が提供される。
プラスミドベクター:プラスミドCE−T
プラスミドCE−Tを、Galili博士から入手したプラスミドCEから構築した(米国特許第5367110号、1994年11月22日)。
hGCDをコードするcDNA(配列番号7および8)を、正方向プライマー:5’CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA3’(配列番号3)と逆方向プライマー:5’CTCAGATCTTGGCGATGCCACA3’(配列番号4)を使用して増幅した。精製したPCR DNA産物をエンドヌクレアーゼEcoRIとBglIIで消化し(プライマーの中の下線を付けた認識配列を参照のこと)、同じ酵素で消化した発現カセットE−Tを有している中間体ベクターに連結させた。発現カセットを切断し、中間体ベクターから溶離させて、制限酵素SmaIとXbaIを使用してバイナリーベクターpGREENIIに連結させて、最終的な発現ベクターとした。カナマイシン耐性を、pGREENベクターと共に入手したnosプロモーターによって駆動されるNPTII遺伝子によって与えた(図11B)。得られた発現カセット(配列番号13)を図11Aに示す。
ニンジンカルス(すなわち、未分化のニンジン細胞)と細胞懸濁培養物の確立を、Torres K.C.(Tissue culture techniques for horticular crops,p.p.111,169)に以前に記載されているように行った。
ニンジン細胞の形質転換を、以前に記載された方法(Wurtele,E.S.and Bulka,K.Plant Sci.61:253−262(1989))の適応によってアグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換を使用して行った。液体培地中の増殖中の細胞を、カルスの代わりにこのプロセスの全体を通じて使用した。接種材料および増殖時間は、液体培養物中での細胞の形質転換に適応させた。簡単に説明すると、アグロバクテリウム(Agrobacterium)をエレクトロポレーションによってpGREEN IIベクターで形質転換し(den Dulk−Ra,A.and Hooykaas,P.J.(1995)Methods Mol.Biol.55:63−72)、その後、30mg/mlのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム(Agrobacteria)で形質転換し、液体培地中の60mg/mlのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。
形質転換の14日後、培養物に由来する細胞を、細胞のそれぞれのクラスターからカルスを形成させるために、3%の充填細胞容量の稀釈率で固形培地上にプレートした。以下に詳細に記載されるように、それぞれのカルスが1〜2cmの直径に達した時点で、細胞をSDS試料緩衝液中でホモジナイズし、得られたタンパク質抽出物をSDS−PAGEで分離させ(Laemmli U.,(1970)Nature 227:680−685)、ニトロセルロース膜(Hybond Cニトロセルロース、0.45マイクロン、カタログ番号:RPN203C、Amersham Life Science社製)に移した。GCDを検出するためのウェスタンブロットを、ポリクローナル抗hGCD抗体(以下に記載される)を使用して行った。有意なレベルのGCDを発現するカルスを増殖させ、スケールアップ、タンパク質の精製および分析のために液体培地に移して増殖させた。
rh−GCD遺伝子(配列番号13および14)を含む遺伝子修飾されたニンジン細胞の約1cmのカルスを、4.4gr/lのMSD培地(Duchefa)、9.9mg/lのチアミンHCl(Duchefa)、0.5mgの葉酸(Sigma)、0.5mg/lのビオチン(Duchefa)、0.8g/lのカゼイン加水分解物(Duchefa)、糖30g/l、およびホルモン2−4D(Sigma)を含む9cmの直径のMurashige and Skoog(MS)寒天培地プレート上にプレートした。カルスを25℃で14日間増殖させた。
材料および実験手順
プラスミドベクター:
CE−Kプラスミド:CE−Kプラスミドの骨格は、植物細胞の小胞体での高いレベルでの発現および保持に不可欠なエレメントを全て含むさらなるカセットをポリクローニング部位の中に有しているBluescript SK+プラスミド(Stratagene,La Jolla CA)(配列番号15)である。このカセット(配列番号16およびマップ、図26を参照のこと)には、CaMV35Sプロモーター、Ωエンハンサー、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))に由来するER標的化シグナルをコードするDNA断片、組み換え遺伝子の融合のためのEcoRIとSalI制限部位、KDEL ER保持シグナル、ならびに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオクトピン合成酵素(OCS)遺伝子の転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルの配列が含まれている。
培養されたニンジン細胞中での活性な組み換え体ヒト第X因子の発現
ニンジン細胞の中での発現および分析:形質転換されたニンジン細胞を、GCDについて本明細書中で上記に記載したように、0.2mg/lの2,4ジクロロメトキシ酢酸を加えたMurashige & Skoog培地(Physiol.Plant,15:473,1962)の中の培養物中で増殖させた。細胞を7日間増殖させ、その後、細胞を回収した。過剰な液体を100メッシュのフィルター上で分離した。細胞内容物を、タンパク質内容物の評価のために、本明細書中で上記に詳細に記載したように抽出した。FX cDNAで形質転換したニンジン細胞を、Affinity Biologicals(Hamilton Ontario,Canada)によるウサギ抗ヒト第X因子精製IgGを使用してウェスタンブロットによってFXの発現について分析した。多数の種々の細胞株を分析した(図30)。図30(レーン1および2)は、ニンジン細胞の中でのヒト第X因子の強い発現を示している。種々の大きさのものが観察された原因は、組み換え体ヒト第X因子プロタンパク質の部分的なプロセシングである。
組み換え体ヒトFX遺伝子(配列番号16および21)を含む遺伝子修飾されたニンジン細胞の約1cmのカルスを、4.4gr/lのMSD培地(Duchefa)、9.9mg/lのチアミンHCl(Duchefa)、0.5mgの葉酸(Sigma)、0.5mg/lのビオチン(Duchefa)、0.8g/lのカゼイン加水分解物(Duchefa)、糖30g/l、およびホルモン2−4D(Sigma,St Louis,MO)を含む9cmの直径のMurashige and Skoog(MS)寒天培地プレート上にプレートした。カルスを25℃で14日間増殖させた。
材料および実験手順
CE−Kプラスミド:CE−Kプラスミドの骨格は、植物細胞の小胞体での高いレベルでの発現および保持に不可欠なエレメントを全て含むさらなるカセットをポリクローニング部位の中に有しているBluescript SK+プラスミド(Stratagene,La Jolla CA)(配列番号15)である。このカセット(配列番号27およびマップ、図37を参照のこと)には、CaMV35Sプロモーター、Ωエンハンサー、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))に由来するER標的化シグナルをコードするDNA断片、組み換え遺伝子の融合のためのEcoRIとSalI制限部位、KDEL ER保持シグナル、ならびに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオクトピン合成酵素(OCS)遺伝子の転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルの配列が含まれている。
1.正方向プライマー:Ifnβ開始EcoRI:5’CAGAATTCATGAGCTATAATC3’(配列番号24)、
2.逆方向プライマーII:Ifnβ末端SalI kdel:5’GGATGTCGACTTACGCAGGTAG3’(配列番号25)、
3.逆方向プライマーII:Ifnβ末端SalI STOP:5’GTGTCGACTTAGTTACGCAGGTAG3’(配列番号26)。
培養されたニンジン細胞中での活性な組み換え体ヒトインターフェロンβの発現
ニンジン細胞の中での発現および分析:最初の分析:形質転換されたニンジン細胞を、GCDについて本明細書中で上記に記載したように、0.2mg/lの2,4ジクロロメトキシ酢酸を加えたMurashige & Skoog培地(Physiol.Plant,15:473,1962)の中の培養物中で増殖させた。細胞を7日間増殖させ、その後、細胞を回収した。過剰な液体を100メッシュのフィルター上で分離した。2週間後、形質転換細胞の試料を、モノクローナルマウス抗ヒトインターフェロンβ抗体と、親和性によって精製されたウサギ抗インターフェロンβ抗体(Calbiochem,La Jolla,CA)を使用するドットブロットアッセイを使用して、インターフェロンの発現の事前の分析のために回収した。両方の抗体によって、インターフェロンβで形質転換された細胞の中で強い特異的なシグナルが生じた。形質転換されていない細胞においてはシグナルは生じなかった。
組み換え体ヒト遺伝子インターフェロンβ(配列番号27および28)を含む遺伝子修飾されたニンジン細胞の約1cmのカルスを、4.4gr/lのMSD培地(Duchefa)、9.9mg/lのチアミンHCl(Duchefa)、0.5mgの葉酸(Sigma)、0.5mg/lのビオチン(Duchefa)、0.8g/lのカゼイン加水分解物(Duchefa)、糖30g/l、およびホルモン2−4D(Sigma St Louis,MO)を含む9cmの直径のMurashige and Skoog(MS)寒天培地プレート上にプレートした。カルスを25℃で14日間増殖させた。
材料および実験手順
CEプラスミド:CEプラスミドの骨格は、植物細胞の小胞体での高いレベルでの発現および保持に不可欠なエレメントを全て含むさらなるカセットをポリクローニング部位の中に有しているBluescript SK+プラスミド(Stratagene,La Jolla CA)(配列番号15)である。このカセット(配列番号32およびマップ、図XXXを参照のこと)には、CaMV35Sプロモーター、Ωエンハンサー、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))に由来するER標的化シグナルをコードするDNA断片、組み換え遺伝子の融合のためのEcoRIとSalI制限部位、KDEL ER保持シグナル、ならびに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオクトピン合成酵素(OCS)遺伝子の転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルの配列が含まれている。
35Sプロモーター由来の正方向プライマー:5’CTCAGAAGACCAGAGGGC3’(配列番号5)
ターミネーター由来の後方プライマー:5’CAAAGCGGCCATCGTGC3’(配列番号6)。
培養されたニンジン細胞中での組み換え体VPIIの発現
ニンジン細胞の中での発現および分析:最初の分析:形質転換されたニンジン細胞を、GCDについて本明細書中で上記に記載したように、0.2mg/lの2,4ジクロロメトキシ酢酸を加えたMurashige & Skoog培地(Physiol.Plant,15:473,1962)の中の培養物中で増殖させた。細胞を7日間増殖させ、その後、細胞を回収した。過剰な液体を100メッシュのフィルター上で分離した。2週間後に、形質転換細胞の試料を、ニワトリ抗IBDVおよびウサギ抗IBDV抗体を使用するドットブロットアッセイを使用してVPIIの発現を予備的に分析するために回収した。いずれの抗体も、VBIIで形質転換された細胞の中で強い特異的なシグナルを生じた。形質転換されていない細胞においてはシグナルは生じなかった。
組み換え体VP11を伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスに対するワクチンとしての有効性について、ニワトリにおいてアッセイした。全タンパク質抽出物をvp2R21株由来のカルスから調製し、注射によって(1mg)または経口で(3×100μg)、(各グループにおいて10匹の4週齢のニワトリに)投与した。経口投与は、連続する3日間、1匹のニワトリについて2グラムの濾過した細胞懸濁液を与えることによって行った。組み換え体VPIIでのワクチン接種の防御効果を表2に示す。
組み換え体VPII(配列番号32および33)を含む遺伝子修飾されたニンジン細胞の約1cmのカルスを、4.4gr/lのMSD培地(Duchefa)、9.9mg/lのチアミンHCl(Duchefa)、0.5mgの葉酸(Sigma)、0.5mg/lのビオチン(Duchefa)、0.8g/lのカゼイン加水分解物(Duchefa)、糖30g/l、およびホルモン2−4D(Sigma St Louis,MO)を含む9cmの直径のMurashige and Skoog(MS)寒天培地プレート上にプレートした。カルスを25℃で14日間増殖させた。
配列番号2はタバコキチナーゼAからの液胞標的化シグナルである。
配列番号3〜6は一本鎖DNAオリゴヌクレオチドである。
配列番号9はCaMV 35Sプロモーター核酸配列である。
配列番号10はERシグナルペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号11は液胞標的化配列をコードする核酸配列である。
配列番号12はターミネーター用配列である。
配列番号13はシグナルペプチドに融合された組換えGCDをコードする核酸である。
配列番号14はシグナルペプチドに融合された組換えGCDである。
Claims (159)
- 少なくとも1回のサイクルにおいて細胞および/または組織を純培養し、回収するための使い捨てのデバイスであって、前記デバイスには、上端と下端を有する滅菌可能な使い捨ての容器が含まれており、前記容器は、適切な滅菌の生物学的細胞、および/または組織培養培地、および/または純培養の接種材料、および/または滅菌された空気、および/または必要とされる他の滅菌の添加物で少なくとも一部が満たされることができ、前記容器には、:(i)前記容器から過剰な空気および/または排ガスを除去するための気体吹き出し口;(ii)前記接種材料、および/または前記培養培地、および/または前記添加物を前記容器内に導入するための添加物入口が含まれる場合において、前記容器には、(iii)所望の場合には、細胞および/または組織を含む前記培地の少なくとも所望の部分の回収を可能にし、それによって、前記デバイスを少なくとも1回のさらなる連続する培養/回収サイクルに連続して使用できるようにするための流量調整器を含む再利用可能な回収装置がさらに含まれ、この場合、先の回収されたサイクルから残っている、細胞および/または組織を含む前記培地の残りを、次の培養および回収サイクルのための接種材料とすることができ、この場合、前記培養培地および/または前記必要な添加物は提供されることを特徴とするデバイス。
- 前記使い捨ての容器は透明であるか、および/または半透明である請求項1に記載のデバイス。
- 滅菌の気体を気泡の形態で、第1吸入口開口部から前記培養培地に導入するための空気吸入口がさらに含まれ、この場合、前記空気吸入口は、適切な気体供給源に接続することができる請求項1に記載のデバイス。
- 前記空気吸入口は、培養の間に1回より多く滅菌の気体を導入するためのものである請求項3に記載のデバイス。
- 前記空気吸入口は滅菌の気体を連続して導入するためのものである請求項4に記載のデバイス。
- 複数の様々な気体が、前記空気吸入口から種々の時間および/または濃度で導入される請求項4に記載のデバイス。
- 前記回収装置には、前記回収装置から前記容器への汚染物質の導入を実質的に防ぐための汚染防止装置が含まれる請求項1に記載のデバイス。
- 前記容器は剛体ではない請求項1に記載のデバイス。
- 前記容器は剛体ではないプラスチック材料製である請求項8に記載のデバイス。
- 前記材料は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンとナイロン、PVCとEVAの共重合体からなる群より選択される請求項9に記載のデバイス。
- 前記容器は、前記材料の1層より多い積層体から作られる請求項9に記載のデバイス。
- 前記容器は、あらかじめ決定された継目に沿った、前記材料の2枚の適切なシートの溶融結合によって形成される請求項9に記載のデバイス。
- 前記空気吸入口には、前記吸入口開口部から、その底部または底部に近い前記容器の内側の位置に向かって伸びる空気吸入口吸気管が含まれる請求項3に記載のデバイス。
- 前記少なくとも1つの空気吸入口には、空気の適切な供給源に接続することができ、かつ複数の第2の吸気管と繋げられた、少なくとも1つの空気吸入口吸気管が含まれ、それぞれの前記第2の吸気管は、前記培養培地の中に気泡の形態で滅菌の空気を導入するために、前記容器内の位置に向かって、その中の適切な吸入口開口部を通じて伸びている請求項3に記載のデバイス。
- 前記デバイスには、実質的には箱のような幾何学的立体構造が含まれ、これが、全体の長さ、高さ、および幅を有している請求項14に記載のデバイス。
- 長さに対する高さの比は約1から約3であり、好ましくは約1.85である請求項15に記載のデバイス。
- 幅に対する高さの比は、約5から約30であり、好ましくは約13である請求項15に記載のデバイス。
- 前記デバイスには、前記デバイスの深さに実質的に及ぶ支持開口が含まれ、前記開口は、適切な棒支持体の上に前記デバイスを支持できるように適合される請求項16に記載のデバイス。
- デバイスを支持するための支持構造体がさらに含まれる請求項14に記載のデバイス。
- 前記支持構造体には、一対の向かい合わせられたフレームが含まれ、前記フレームのそれぞれには、上部および下部の支持部材に対して適切に取り付けられた実質的に平行な垂直方向の複数の支持部材によって間隔を隔てられた前記上部支持部材と下部支持部材が含まれる請求項19に記載のデバイス。
- 前記複数の垂直方向の支持部材は、前記上部支持部材と下部支持部材のそれぞれの縦方向の先端にある少なくとも1つの前記垂直方向の支持部材から構成される請求項20に記載のデバイス。
- 前記フレームは、前記フレームに対して除去可能であるように、または前記フレームに対して一体として取り付けられた複数の間隔を隔てるための棒によって互いに間隔を隔てられている請求項20に記載のデバイス。
- 前記間隔を隔てるための棒は、前記デバイスを前記支持構造体に容易に挿入することができ、かつ前記支持構造体から比較的容易に取り外せるように、戦略的に配置される請求項21に記載のデバイス。
- それぞれの前記フレームの前記下部支持部材には、前記デバイスの前記下方の末端の対応する部分を受け止め、そして支持するように適応させられた、少なくとも1つの下部支持部材が含まれる請求項20に記載のデバイス。
- それぞれの前記下部支持部材は、向かい合ったフレームの方向に下部支持部材のそれぞれから突出する、適切な形状のタブの形態である請求項24に記載のデバイス。
- 前記フレームにはそれぞれ、予め決定された位置に前記デバイスの側壁に対して押し付けるための、向かい合うフレームの方向に向かう、それぞれのフレームから突出する少なくとも1つの内部仕切りが含まれ、その結果、向かい合わせられた前記内部仕切りの対によって、前記デバイスの幅が前記予め決定された位置に効果的に狭められる請求項20に記載のデバイス。
- 前記内部仕切りには、適切な上部および下部の支柱を有する向かい合わせられたフレームに向かう方向で、前記上部および下部の支持部材から間隔を隔てられている適切な実質的に垂直方向の部材が含まれる請求項26に記載のデバイス。
- 前記支持構造体には、前記デバイスの運搬のための複数のキャスターが含まれる請求項19に記載のデバイス。
- 少なくとも幾つかの前記気泡は、約1mmから約10mmの平均直径を有する請求項3に記載のデバイス。
- 少なくとも幾つかの前記気泡は、約4mmの平均直径を有する請求項3に記載のデバイス。
- 前記容器には、前記気体吹き出し口からの容器内への汚染物質の導入を実質的に防ぐために前記気体吹き出し口に取り付けられた適切なフィルターが含まれる請求項1に記載のデバイス。
- 前記容器にはさらに、前記添加物入口からの容器内への汚染物質の導入を実質的に防ぐために前記添加物入口に取り付けられた適切なフィルターが含まれる請求項1に記載のデバイス。
- U型の流体トラップを含む汚染防止装置がさらに含まれ、前記U型流体トラップの一方のアームは、適切な無菌の連結装置を介して前記回収装置の外部出口に無菌的に取り付けられる請求項1に記載のデバイス。
- 前記回収装置は、前記容器の前記下端の底部に取り付けられる請求項1に記載のデバイス。
- 前記回収装置は、前記容器の前記下端の底部付近に配置され、その結果、各回収サイクルの最後に、細胞および/または組織を含む前記培地の前記残りが、前記回収装置のレベルよりも下のレベルまでの前記容器の前記下端に自動的に残る請求項1に記載のデバイス。
- 細胞および/または組織を含む前記培地の前記残りは、前記容器の底部から前記回収装置までの距離d2に、少なくとも部分的にしたがって決定される請求項1に記載のデバイス。
- 細胞および/または組織を含む前記培地の前記残りは、前記培養培地と前記接種材料のもとの容量の約2.5%から約45%を占める請求項1に記載のデバイス。
- 細胞および/または組織を含む前記培地の前記残りは、前記培養培地および前記接種材料のもとの容量の約10%から約20%を占める請求項37に記載のデバイス。
- 前記下端は実質的には凸状である請求項1に記載のデバイス。
- 前記下端は実質的には円錐台状である請求項1に記載のデバイス。
- 前記容器は、約5リットルから約200リットルの間、好ましくは、約50リットルから150リットルの間、好ましくは、約100リットルの内部充填容量を有する請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスには、適切な支持構造体に対して前記デバイスを取り付けるための適切な取り付け器具がさらに含まれる請求項1に記載のデバイス。
- 前記取り付け器具には、前記容器の前記上端に一体として取り付けられることが好ましい、適切な材質の輪が含まれる請求項42に記載のデバイス。
- 植物細胞培養物に適応されている請求項1に記載のデバイス。
- 前記植物細胞培養物には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項44に記載のデバイス。
- 前記植物細胞は、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項45に記載のデバイス。
- 前記植物細胞培養物には、植物の根から得られた植物細胞が含まれる請求項44に記載のデバイス。
- 前記植物の根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根細胞、セロリー細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、およびニンジン細胞からなる群より選択される請求項47に記載のデバイス。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項45に記載のデバイス。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項49に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項49に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項49に記載のデバイス。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項52に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項49に記載のデバイス。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項54に記載のデバイス。
- 少なくとも2つの請求項3の前記使い捨てのデバイスが含まれる前記デバイスのバッテリー。
- 前記デバイスは、それぞれの前記デバイスの取り付け器具を介して適切な支持構造体によって支持される請求項56に記載のバッテリー。
- それぞれの前記デバイスの前記気体吹き出し口は、汚染物質が前記デバイスへ流れることを防ぐための遮断装置を任意に含む共通の気体吹き出し口管に適切に繋げられる請求項56に記載のバッテリー。
- 前記遮断装置には適切なフィルターが含まれる請求項58に記載のバッテリー。
- それぞれの前記デバイスの前記添加物入口は、自由末端に適切な無菌の連結装置を任意に含む、自由末端を有する、共通の添加物入口管に適切に接続される請求項56に記載のバッテリー。
- 前記自由末端は、培地および/または添加物の適切な供給源に接続することができる請求項60に記載のバッテリー。
- それぞれの前記デバイスの前記回収装置は、自由末端に適切な無菌の連結装置を任意に含む、自由末端を有する共通の回収管に適切に接続される請求項56に記載のバッテリー。
- 前記共通の回収管からの前記容器内への汚染物質の導入を実質的に防ぐための汚染防止装置がさらに含まれる請求項62に記載のバッテリー。
- 前記汚染防止装置には、U型の流体トラップが含まれ、U型流体トラップの一方のアームは、開口部を有する自由末端であり、そのもう一方の末端は、適切な無菌の連結装置を介して前記共通の回収管の前記自由末端に無菌的に取り付けられる請求項63に記載のバッテリー。
- 前記U型管の前記自由末端は、適切な貯蔵タンクに接続することができる請求項64に記載のバッテリー。
- それぞれの前記デバイスの前記空気吸入口は、自由末端その場所に適切な無菌の連結装置を任意に含む、自由末端を有する共通の空気吸入口吸気管に対して適切に接続される請求項56に記載のバッテリー。
- 前記自由末端は、適切な空気供給源に接続することができる請求項66に記載のバッテリー。
- 以下のことを含む、使い捨てのデバイスにおいて細胞および/または組織を純培養し、そして回収するための方法:
上端と下端を有する、滅菌可能な透明および/または半透明の使い捨ての容器を含むデバイスを提供すること、但しこの容器は、適切な滅菌の生物学的細胞、および/または組織培養培地、および/または純培養接種物、および/または滅菌の空気、および/または他の滅菌の必要とされる添加物で少なくとも一部を満たすことができ、前記容器には、
(i)前記容器から過剰な空気および/または排ガスを除去するための気体吹き出し口;
(ii)前記接種材料、および/または前記培養培地、および/または前記添加物を前記容器内に導入するための添加物入口;ならびに、
(iii)所望の場合には、細胞および/または組織を含む前記培地の少なくとも一部を回収できるようにし、それによって、前記デバイスを少なくとも1回のさらなる連続するサイクルに連続して使用できるようにするための適切な流量調整器を含む再利用可能な回収装置が含まれ、但し先に回収されたサイクルから残っている、細胞および/または組織を含む前記培地の残りを次の培養および回収サイクルのための接種材料とすることができ、この場合、培養培地および/または必要とされる添加物は提供される;
前記回収装置から純培養の接種材料を提供すること;
滅菌の前記培養培地および/または滅菌の前記添加物を前記添加物入口から提供すること;
所望により、外部照明を用いて前記容器を照らすこと;ならびに、
所望の収量が得られるまで、前記細胞および/または組織を前記培地の中で増殖させること。 - 過剰な空気および/または排ガスを、前記気体吹き出し口を通じて連続的に前記容器から外に出すことがさらに含まれる請求項68に記載の方法。
- 前記容器内で生産された細胞/組織の汚染および/または品質をチェックすることがさらに含まれ、汚染が認められるか、または生産された細胞/組織の品質が低い場合には、デバイスとその内容物は廃棄され、汚染が認められない場合には、細胞および/または組織を含む前記培地の前記所望の部分が回収される請求項69に記載の方法。
- 前記所望の部分は回収されるが、細胞および/または組織を含む培地の残りは前記容器の中に残され、培地の前記残りは、次の培養/回収サイクルのための接種材料となる請求項70に記載の方法。
- 次の培養/回収サイクルのための滅菌の前記培養培地および/または滅菌の前記添加物を前記添加物入口から提供すること;ならびに、
前記汚染が認められるか、または生産された細胞/組織の品質が低くなるまで、増殖サイクルを繰り返し、その後デバイスとその内容物は廃棄される
ことをさらに含む請求項71に記載の方法。 - 前記デバイスには、適切な滅菌空気の供給源に接続することができる第1の吸入口開口部から前記培養培地の中に気泡の形態で滅菌空気を導入するための空気吸入口がさらに含まれ、前記方法には、最初のサイクルと、それに続くそれぞれのサイクルの間に滅菌空気を前記空気吸入口に提供する工程がさらに含まれる請求項68に記載の方法。
- 前記滅菌空気は、少なくとも1回の培養サイクルの間中、連続して供給される請求項73に記載の方法。
- 前記滅菌空気は、少なくとも1回の培養サイクルの間、パルスで供給される請求項73に記載の方法。
- 前記細胞には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項68に記載の方法。
- 前記植物細胞には、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項76に記載のデバイス。
- 前記細胞には、植物の根から得られた植物細胞が含まれる請求項68に記載の方法。
- 前記植物の根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根細胞、セロリー細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、およびニンジン細胞からなる群より選択される請求項78に記載の方法。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項76に記載の方法。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項80に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項80に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項80に記載の方法。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項83に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項84に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項80に記載の方法。
- 以下のことを含む、使い捨てのデバイスのバッテリーの中で、細胞および/または組織を純培養し、回収するための方法:
請求項64に記載のデバイスのバッテリーと、その少なくとも1つの前記デバイスを提供すること;
共通の回収管を通じて前記デバイスに純培養の接種材料を提供すること;
共通の添加物入口管を通じて、前記デバイスに前記滅菌の培養培地および/または滅菌の添加物を提供すること;
所望により、外部照明を用いて前記デバイスを照らすこと;ならびに、
前記デバイスの中の前記細胞および/または組織を前記培地の中で所望の収量まで増殖させること。 - 過剰な空気および/または排ガスを、共通の空気吹き出し口管を通じて連続して前記デバイスから外に出すこと;
前記デバイスの中で生産された細胞/組織の汚染および/または品質をチェックすることがさらに含まれ:
前記デバイスの中で汚染が認められるか、または生産された細胞/組織の品質が低い場合には、前記デバイスの前記回収装置は、前記バッテリーの他の前記デバイスの汚染を防ぐために閉じられ;
前記バッテリーの全ての前記デバイスにおいて汚染が認められるか、またはその中で生産された細胞/組織の品質が低い場合、全てのデバイスとそれらの内容物は廃棄され;
汚染が認められず、生産された細胞/組織の品質が許容される場合、それぞれの回収可能なデバイスについて共通の回収管と、前記の汚染防止装置を通じて細胞および/または組織を含む前記培地の所望の部分が適切な貯蔵タンクへ回収される請求項87に記載の方法。 - 細胞および/または組織を含む培地の残りは前記容器内に残っており、前記残りは次の培養/回収サイクルのための接種材料となり、前記方法には、次の培養/回収サイクルのための滅菌の前記培養培地および/または滅菌の前記添加物を、前記添加物入口から提供して増殖サイクルを形成することがさらに含まれる請求項88に記載の方法。
- 前記増殖サイクルは、前記汚染が認められるか、または前記バッテリーの全ての前記デバイスについて生産された細胞/組織の品質が低くなるまで繰り返され、その後、前記汚染防止装置が共通の回収装置と前記デバイスから取り外され、それらの内容物が廃棄される請求項89に記載の方法。
- 前記細胞には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項87に記載の方法。
- 前記植物細胞は、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項91に記載の方法。
- 前記細胞には、植物の根から得られた植物細胞が含まれる請求項87に記載の方法。
- 前記植物の根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根細胞、セロリー細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、およびニンジン細胞からなる群より選択される請求項93に記載の方法。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項91に記載の方法。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項95に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項95に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項95に記載の方法。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項98に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項99に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項100に記載の方法。
- 以下のことを含む、使い捨てのデバイスのバッテリーの中で、細胞および/または組織を純培養し、回収するための方法:
請求項67に記載のデバイスのバッテリーと、前記デバイスの少なくとも1つを提供すること;
共通の回収管を通じて前記デバイスに純培養の接種材料を提供すること;
共通の添加物入口管を通じて、前記デバイスに滅菌の前記培養培地および/または滅菌の添加物を提供すること;
共通の空気吸入口吸気管を通じて、前記デバイスに滅菌空気を提供すること;
所望により、外部照明を用いて前記デバイスを照らすこと;ならびに、
前記デバイスの中の細胞および/または組織を前記培地の中で所望の収量まで増殖させること。 - 過剰な空気および/または排ガスを、共通の空気吹き出し口管を通じて連続して前記デバイスから外に出すこと;ならびに、
前記デバイスの中で生産された細胞/組織の汚染および/または品質をチェックすることがさらに含まれ:
前記デバイスの中で汚染が認められるか、または生産された細胞/組織の品質が低い場合には、前記デバイスの前記回収装置は、前記バッテリーの他の前記デバイスの汚染を防ぐために閉じられ;前記バッテリーの全ての前記デバイスにおいて汚染が認められるか、またはその中で生産された細胞/組織の品質が低い場合には、全てのデバイスとそれらの内容物は廃棄され;汚染が認められず、生産された細胞/組織の品質が許容される場合には、デバイスは回収可能と見なされる請求項102に記載の方法。 - 共通の回収管と、前記汚染防止装置を通じて、それぞれの回収可能なデバイスについて、細胞および/または組織を含む前記培地の少なくとも所望の部分を適切な貯蔵タンクへ回収することがさらに含まれる請求項103に記載の方法。
- 細胞および/または組織を含む培地の残りは前記容器内に残っており、前記残りは次の培養/回収サイクルの接種材料となり、前記方法には、次の培養/回収サイクルのための滅菌の前記培養培地および/または滅菌の前記添加物を、添加物入口から提供して増殖サイクルを形成することがさらに含まれる請求項104に記載の方法。
- 前記増殖サイクルは、前記バッテリーの全ての前記デバイスについて前記汚染が認められるか、または生産された細胞/組織の品質が低くなるまで繰り返され、その後、前記汚染防止装置が共通の回収装置と前記デバイスから取り外され、それらの内容物が廃棄される請求項105に記載の方法。
- 前記細胞には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項102に記載の方法。
- 前記植物細胞は、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項107に記載の方法。
- 前記細胞には、植物の根から得られた植物細胞が含まれる請求項102に記載の方法。
- 前記植物の根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根細胞、セロリー細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、およびニンジン細胞からなる群より選択される請求項109に記載の方法。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項107に記載の方法。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項111に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項111に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項111に記載の方法。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項114に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項111に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項116に記載の方法。
- 植物細胞を培養するための使い捨ての容器を含む、植物細胞の培養のためのデバイス。
- 前記使い捨ての容器は、少なくとも1回のさらなる連続する培養/回収サイクルに連続して使用することができる請求項118に記載のデバイス。
- 所望の場合には、細胞および/または組織を含む培地の少なくとも所望の部分を回収できるようにし、それによって、前記デバイスを、少なくとも1回のさらに連続する培養/回収サイクルに連続して使用できるようにする流量調整器を含む再利用可能な回収装置がさらに含まれる請求項119に記載のデバイス。
- 前記流量調整器は、細胞および/または組織を含む前記培地の残りの滅菌性を維持し、その結果、先に回収されたサイクルから残っている前記培地の残りは、次の培養および回収サイクルのための接種材料となる請求項120に記載のデバイス。
- 前記細胞には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項118に記載のデバイス。
- 前記植物細胞は、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項122に記載のデバイス。
- 前記植物細胞には、植物の根から得られた植物細胞が含まれる請求項118に記載のデバイス。
- 前記植物の根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根細胞、セロリー細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞、およびニンジン細胞からなる群より選択される請求項124に記載のデバイス。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項122に記載のデバイス。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項126に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項126に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項126に記載のデバイス。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項129に記載のデバイス。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項126に記載のデバイス。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項126に記載のデバイス。
- 使い捨ての容器の中で植物細胞を培養することが含まれる、植物細胞を培養するための方法。
- 前記使い捨ての容器には、滅菌の気体または混合気体を導入するための空気吸入口が含まれる請求項133に記載の方法。
- 前記滅菌の気体には空気が含まれる請求項134に記載の方法。
- 前記滅菌の混合気体には、空気と追加の酸素の混合気体が含まれる請求項135に記載の方法。
- 前記追加の酸素は前記空気とは別に添加される請求項136に記載の方法。
- 前記追加の酸素は、細胞培養の開始後、複数日添加される請求項137に記載の方法。
- 前記滅菌の気体または混合気体は、培養の間に1回より多く添加される請求項134に記載の方法。
- 前記空気吸入口は滅菌の気体を連続して導入するためのものである請求項134に記載の方法。
- 複数の異なる気体が、前記空気吸入口から様々な時間および/または濃度で導入される請求項134に記載の方法。
- 前記吸入口から細胞をエアレーションすることがさらに含まれる請求項134に記載の方法。
- 前記エアレーションには、1分あたり少なくとも1.5リットルの気体を投与することが含まれる請求項142に記載の方法。
- 前記細胞を増殖させるために十分な培地を提供することがさらに含まれる請求項133に記載の方法。
- 十分な培地は、通常の培地の濃度の少なくとも約125%の濃度である請求項144に記載の方法。
- 細胞の増殖の間に、しかし回収の前に、培地を添加することがさらに含まれる請求項144に記載の方法。
- 追加の培地を、前記細胞の培養の開始後少なくとも約3日添加することがさらに含まれる請求項146に記載の方法。
- 前記細胞の培養の開始後、少なくとも約3日、完全に培地を交換することがさらに含まれる請求項146に記載の方法。
- 前記培地には糖の混合物が含まれる請求項144に記載の方法。
- 前記培地には細胞培養のための通常の量よりも多量のスクロースが含まれる請求項144に記載の方法。
- 前記細胞には、組換え体タンパク質を発現することができる植物細胞が含まれる請求項133に記載の方法。
- 前記植物細胞は、アルファルファ細胞、タバコ細胞、およびタバコ細胞株細胞からなる群より選択される請求項151に記載の方法。
- 前記組換え体タンパク質は、原核生物タンパク質、ウイスルタンパク質、真核生物タンパク質、およびキメラタンパク質からなる群より選択される請求項151に記載の方法。
- 前記ウイスルタンパク質は、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスタンパク質VPIIである請求項152に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトインターフェロンβである請求項153に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒト凝固因子である請求項155に記載の方法。
- 前記凝固因子はヒト凝固因子Xである請求項156に記載の方法。
- 前記真核生物タンパク質はヒトリソソーム酵素である請求項152に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシターゼである請求項158に記載の方法。
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