JP6294206B2 - 細胞培養バッグおよび細胞培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養バッグおよび細胞培養方法に関する。
従来、細胞の拡大培養には、主にステンレス製の培養槽が使用されていたが、洗浄バリデーションなどの負担が軽減できるプラスチック製の細胞培養バッグの導入が進んでいる。
例えば、特許文献１には、ガス透過性を有するプラスチックからなり、培養時に容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかに形成される細胞の培養容器が記載されている。
例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、１×１０９個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられており、これを実現するためには、多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠となる。
細胞の培養スケールの拡大を図るには、細胞培養バッグの容積を大きくする必要がある。しかしながら、細胞培養バッグの容積を単純に大きくしただけでは、細胞懸濁液や培養液を細胞培養バッグ内部に収容したときに、細胞培養バッグの底部が膨張し、細胞培養バッグの中心部へのガス供給が不十分となる。また、大量の培養液を収容した場合には細胞培養バッグの強度不足が問題となる。これらの問題を解消する方法として、細胞培養バッグの収容空間を複数の領域に分割することが考えられる。しかしながら、この場合には、分割された複数の領域相互間での細胞懸濁液および培養液の流通が阻害され、分割された複数の領域間で細胞の培養環境が不均一となるおそれがある。その結果、同じ細胞培養バッグ内で培養されたにもかかわらず、培養された細胞の品質が不均一となるおそれがある。例えば、特許文献１に記載の培養容器によれば、ヒートシールにより形成された複数の円筒間で細胞の培養環境は不均一となり易い。このように、従来の細胞培養バッグにおいては、細胞移植による治療の実現に必要とされる、均一な品質であることが保証された大量の同一ロット細胞を培養することが困難であった。
本発明は、上記した点に鑑みてなされたものであり、細胞培養スケールを拡大した場合でも培養する細胞の培養環境の均一性を確保することができる細胞培養バッグおよび細胞培養方法を提供することを目的とする。
本発明に係る細胞培養バッグは、管軸方向が第１の方向に向けられるとともに第１の方向と交差する第２の方向に並置され且つ互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部と、複数の管状部のうち、互いに隣接する２つの管状部の各々を、管状部の一端と他端との間の中間領域において連通させるガス透過性を有する連通部と、を備える。
本発明に係る細胞培養バッグにおいて、複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、第１の方向に沿って連通部が２以上設けられていてもよい。
本発明に係る細胞培養バッグにおいて、連通部の第１の方向における位置が、互いに隣接する２つの管状部の各々の間で揃えられていてもよい。また、管状部の径は各々同じであってもよい。また、複数の管状部の径と、連通部の径が同じであってもよい。
本発明の細胞培養バッグは、ガス透過性を有するプラスチックフィルムを貼り合わせて形成され得る。この場合、プラスチックフィルムに形成された複数のシール部によって隔壁が形成され得る。また、複数のシール部のうちの少なくとも１つに貫通孔を有していてもよい。貫通孔の幅は、第１の方向に沿って変化していてもよい。複数のプラスチックフィルムの製膜時の製膜流れ方向が第２の方向と一致していることが好ましい。また、複数のプラスチックフィルムは、可視光を透過するものであってもよい。
本発明に係る細胞培養バッグにおいて、複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、第１の方向に沿って連通部が３以上設けられていてもよい。複数の管状部の各々の径は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下であることが好ましく、複数の管状部の各々の管軸方向の長さは、１０００ｍｍ以下であることが好ましい。
本発明に係る細胞培養バッグは、複数の管状部の各々の第１の方向における少なくとも一端側において、複数の管状部の各々と連通するポートを更に含み得る。また、本発明に係る細胞培養バッグは、複数の管状部の各々の第１の方向における一端側および他端側のそれぞれにおいて、複数の管状部の各々と連通する複数のポートを更に含み得る。
本発明に係る細胞培養方法においては、複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に沿い且つ少なくとも１つのポートが鉛直方向下側に位置するように細胞培養バッグを支持し、細胞懸濁液または培養液を、鉛直方向下側に位置するポートから注入して細胞の培養を行う。
本発明の細胞培養方法においては、鉛直方向下側に位置するポートから培養液を注入することにより培養液の追加を行ってもよい。この場合において、追加後の培養液の液面が、連通部の高さ位置に達するように培養液の追加を行ってもよい。
本発明に係る細胞培養方法においては、複数の管状部が環状に連なるように複数の管状部の管軸方向と交差する方向に細胞培養バッグを湾曲させた状態で前記細胞培養バッグを支持して細胞の培養を行ってもよい。
本発明に係る細胞培養方法においては、周方向および軸方向の複数箇所にフックを備え且つ軸方向が鉛直方向に向けられた支柱の外周を、複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に向けられた細胞培養バッグで囲み、貫通孔にフックを挿通させることにより、細胞培養バッグを支柱で支持して細胞の培養を行ってもよい。
本発明に係る細胞培養方法においては、細胞培養バッグを密閉容器内に収容して細胞の培養を行ってもよい。
本発明に係る培養方法においては、培養期間中、細胞培養バッグを静置状態に維持して細胞の培養を行ってもよい。
本発明に係る細胞培養バッグおよび細胞培養方法によれば、培養スケールの拡大に伴う細胞の均質性の低下を抑制することが可能となる。
以下、本発明の実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０の構成を示す平面図である。細胞培養バッグ１０は、一例として、可撓性およびガス透過性を有する２枚のプラスチックフィルムを、ヒートシール（熱圧着）などの手法により貼り合せることにより形成される。なお、１枚のプラスチックフィルムを折り返して、貼り合せてもよい。また、プラスチックフィルムは、細胞培養バッグ１０内で培養される細胞の目視による観察を可能とするために、可視光を透過することが好ましい。細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムとして、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなどを好適に用いることができる。
細胞培養バッグ１０は、シール部１３、１４により形成される隔壁によって互いに隔てられた複数の管状部１１を有する。ここで、シール部とは複数枚のフィルム同士が貼り合わされている部分のことをいう。複数の管状部１１は、管軸方向が互いに平行となるように、管軸方向と交差する方向に並置されている。なお、管軸方向とは、管状を呈する管状部１１の伸長方向をいう。図１において、管状部１１の各々の管軸方向は、Ｙ軸方向に向けられており、複数の管状部１１は、Ｙ軸方向と直交するＸ軸方向に並置されている。なお、図１において、細胞培養バッグ１０が６つの管状部１１を有する構成が例示されているが、管状部１１の数は、培養スケールに応じて適宜増減することが可能である。
なお、管状部１１の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
なお、管状部１１の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
細胞培養バッグ１０は、複数の管状部１１のうち、互いに隣接する２つの管状部１１の各々を、管状部１１の中間領域Ｒにおいて連通させる複数の連通部１２を有する。なお、中間領域Ｒは、管状部１１の管軸方向における一端と他端との間の領域である。より具体的には、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペア毎に、互いに隣接する２つの管状部１１の間に、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って複数の連通部１２が設けられている。なお、図１に示す例では、互いに隣接する２つの管状部１１の間の、Ｙ軸方向における異なる位置に、３つの連通部１２が設けられているが、互いに隣接する２つの管状部１１の間には、管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って少なくとも１つの連通部１２が設けられていればよい。
なお、連通部１２の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
なお、連通部１２の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
本実施形態において、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペアの各々において、互いに隣接する２つの管状部１１の間に、Ｙ軸方向に沿って設けられた３つの連通部１２のＹ軸方向における位置が、ペア間で揃えられている。すなわち、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されている。また、本実施形態において、複数の管状部１１の径Ｄ１は各々同じとされ、更に、連通部１２の各々の径Ｄ２は、管状部１１の径Ｄ１と同一とされている。管状部１１の径Ｄ１および連通部１２の径Ｄ２は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下であることが好ましい。管状部１１の径Ｄ１および連通部１２のＤ２が５０ｍｍ以下であれば、管状部１１および連通部１２の径方向中心部へのガスの供給を十分にすることができる。一方、管状部１１の径Ｄ１および連通部１２の径Ｄ２を５ｍｍ以上にすれば、細胞培養バッグ１０内に収容される培養液および細胞懸濁液の流通が確保され、細胞培養バッグ１０内における培養環境の均一性を保つことができる。また、プラスチックフィルムをヒートシールによって貼り合わせて細胞培養バッグ１０を形成する際に、５ｍｍ以上の径を有する管状部１１および連通部１２を安定的に形成することができる。
なお、管状部および連通部の径とは、管状部および連通部が円形である場合はその円の直径であり、楕円形である場合には、その楕円の長径（最も大きい径）と短径（最も小さい径）の平均値とする。また、管状部および連通部が完全な円形でない場合にはその全周方向での径の平均値とする。さらに、管状部および連通部の径が軸方向で変化する場合はその全長における平均値とする。
なお、管状部および連通部の径とは、管状部および連通部が円形である場合はその円の直径であり、楕円形である場合には、その楕円の長径（最も大きい径）と短径（最も小さい径）の平均値とする。また、管状部および連通部が完全な円形でない場合にはその全周方向での径の平均値とする。さらに、管状部および連通部の径が軸方向で変化する場合はその全長における平均値とする。
細胞培養バッグ１０の外形は、例えば、矩形状とされ、矩形の外縁に沿って、シール部１３が形成されている。また、細胞培養バッグ１０は、シール部１３の内側において、格子状に配列された複数のシール部１４を有する。複数の管状部１１および複数の連通部１２は、シール部１３および１４によって領域が区画されている。すなわち、シール部１３および１４によって管状部１１および連通部１２の隔壁が形成されている。シール部１３および１４は、例えばヒートシールなどの手法を用いて形成され得る。
シール部１３には、貫通孔１５が設けられ、貫通孔１５は、細胞培養バッグ１０の支持に使用されてもよい。
細胞培養バッグ１０は、管状部１１の管軸方向における一端側および他端側に設けられたポート１６Ａおよび１６Ｂを有する。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、細胞培養バッグ１０の内部と外部とを連通させる貫通孔（図示せず）を有する。例えば、細胞懸濁液や培養液の注入および排出、細胞培養バッグ１０内のエア抜き、培養中の細胞の抜き取りなどは、ポート１６Ａおよび１６Ｂを介して行うことが可能である。本実施形態において、ポート１６Ａおよび１６Ｂは、Ｘ軸方向の一端側からシール部１３を貫くようにしてバッグ本体に挿入されている。ポート１６Ａは、その先端部分が、細胞培養バッグ１０の端部領域１７Ａに入り込むように挿入されている。同様に、ポート１６Ｂは、その先端部分が、細胞培養バッグ１０の端部領域１７Ｂに入り込むように挿入されている。なお、端部領域１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）の一端側および他端側において管状部１１の各々と連通する領域である。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、例えば、細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムの貼り合せを行う際に、プラスチックフィルムの間に配置され、ヒートシールなどによるプラスチックフィルムの貼り合せにおいてバッグ本体に溶着される。なお、図１に示すように、ポート１６Ａおよび１６Ｂが挿入される側の辺におけるシール部１３の幅は、他の辺におけるシール部１３の幅よりも広いことが好ましい。これにより、シール部１３の強度が確保されるとともに、ポート１６Ａおよび１６Ｂの脱落を防止することができる。
細胞培養バッグ１０は、上記したように、可撓性およびガス透過性を有するプラスチックフィルムを用いて製造することができる。プラスチックフィルムは、溶液流延法や溶融押出成型法などの公知の製法によって製造され得る。ここで、細胞培養バッグ１０の複数の管状部１１が並ぶ方向（Ｘ軸方向）は、プラスチックフィルムの製膜時における製膜流れ方向（ＭＤ：Ｍａｃｈｉｎｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）と一致していることが好ましい。一般的に、プラスチックフィルムの製膜流れ方向（ＭＤ）における膜質は、これと直交する幅方向（ＴＤ：Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）における膜質と比較して均一性が高い。従って、複数の管状部１１が並ぶ方向（Ｘ軸方向）を、プラスチックフィルムの製膜流れ方向と一致させることで、ガス透過性やその他の性質を複数の管状部１１間で均一とすることが可能となる。すなわち、プラスチックフィルムの膜質に起因する培養環境を複数の管状部１１間で均一とすることができる。
細胞培養バッグ１０は、例えば１×１０１０個オーダの細胞の培養に適用可能な大容量の培養空間を形成し得るものであり、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）における長さは、例えば５００ｍｍ〜７００ｍｍとされる。細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムの製造適性や、細胞培養バッグ１０を後述する「縦置き」で使用した場合のシール部１３および１４の耐圧を考慮すると、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）における長さは１０００ｍｍ以下であることが好ましい。１０００ｍｍ以下であれば、細胞培養バッグ１０を管軸方向に対して継ぎ合わせることなく製作でき、培養液の圧力に対するフィルムの耐圧が不足しないように製作できる。一方、管状部１１の管軸方向と直交する方向（Ｘ軸方向）、すなわち複数の管状部１１が並ぶ方向における長さは、細胞の培養スケールに応じて適宜設定することが可能であり、例えば、１０００ｍｍ〜１５００ｍｍ程度とすることができる。
以下において、細胞培養バッグ１０を用いた本発明の実施形態に係る細胞培養方法の一例について説明する。
本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、特に制限されず、あらゆる培養液を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium）、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。
本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び／又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培養液に添加される高分子化合物は、例えば、培養液の比重を調整する高分子化合物、培養液の粘度を調整する高分子化合物、培養液中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子、である。このような高分子としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；などが挙げられる。
本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。
本発明の実施形態に係る細胞培養方法において、培養の対象となる細胞は、特に制限されず、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。
培養対象となる細胞の一例は、幹細胞である。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。
多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）などが挙げられる。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）などが挙げられる。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
培養対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞、及びその前駆細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。
培養対象となる細胞の他の例は、CHO、COS、HeLa、HepG2、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞；酵母、アスペルギルス等の真菌細胞；大腸菌、枯草菌等の細菌細胞；植物細胞、カルス；などである。これらの細胞は、タンパク質の大量発現を目的にタンパク質発現ベクターが導入された細胞であってもよい。
ディッシュ、フラスコ等の少量培養用の培養容器を用いて培養された初代培養または継代培養の細胞を、培養容器から回収し、培養液に懸濁し、所定の細胞密度となるように、細胞懸濁液を調製する。この細胞懸濁液を、本発明の細胞培養バッグ１０に所定量注入して細胞の培養を行う。
細胞培養バッグ１０は、細胞培養時において、例えば、管状部１１の管軸方向が鉛直方向に沿うように支持される。すなわち、本実施形態に係る培養方法において、細胞培養バッグ１０は、所謂「縦置き」状態で使用される。このとき、例えば、ポート１６Ａ、端部領域１７Ａが鉛直方向上側、ポート１６Ｂおよび端部領域１７Ｂが鉛直方向下側となるように配置される。細胞培養バッグ１０は、培養時において、例えば、図２に示すように、図示しない支柱に設けられたフック３２をシール部１３に設けられた貫通孔１５に挿通させることにより、上記支柱に吊り下げられた状態で支持される。なお、細胞培養バッグ１０を支持する方法は、上記の方法に限定されるものではなく、細胞培養バッグ１０に貫通孔１５が設けられていない場合には、他の支持部材等を用いて細胞培養バッグ１０を支持してもよい。
細胞培養バッグ１０は、細胞培養時において、図２に示すように、縦置きとなるように支持された状態で、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ４０内に収容される。本実施形態に係る細胞培養方法においては、培養液を段階的に追加しながら細胞の培養を行う。培養期間中、例えば１２時間毎あるいは２４時間毎に、培養液を所定量ずつ細胞培養バッグ１０に追加する。培養期間中、細胞培養バッグ１０は、静置状態に維持される。
本実施形態に係る細胞培養方法においては、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入が行われる。鉛直方向上側に配置されたポート１６Ａを介して細胞懸濁液の注入を行った場合には、細胞懸濁液の注入後における液面よりも上方部分において、管状部１１または連通部１２の壁面に培養液成分や細胞が付着し、培養効率が低下してしまうおそれがある。鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入を行った場合には、細胞懸濁液の注入後における液面よりも上方部分において、管状部１１または連通部１２の壁面に培養液成分や細胞が付着することはなく、培養効率の低下を防止できる。なお、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入を行う場合には、ポンプ等を用いて細胞懸濁液を加圧することが想定されるが、加圧による細胞へのダメージが問題となる場合には、鉛直方向上側に配置されたポート１６Ａを介して細胞懸濁液の注入を行ってもよい。この場合には、ポンプ等による加圧を行うことなく細胞懸濁液を細胞培養バッグ１０内に導入することが可能である。
本実施形態に係る細胞培養方法においては、培養液を細胞培養バッグ１０に段階的に追加する際にも、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して培養液の注入が行われる。ポート１６Ｂを介して培養液の追加を行うことにより、培養液の追加後における液面よりも上方部分において、培養液成分の壁面への付着を防止することが可能となる。また、浮遊培養法により細胞の培養を行う場合において、細胞の比重が培養液の比重よりも大きい場合には、鉛直方向下側から培養液を追加注入することで、細胞と培養液との混合を促進させることが可能となる。
本実施形態に係る細胞培養方法においては、細胞懸濁液を最初に細胞培養バッグ１０に注入する際および培養液を段階的に追加する際に、液面が上位の連通部１２に達するように、細胞懸濁液または培養液の注入が行われる。
例えば、細胞培養バッグ１０に細胞懸濁液を最初に注入する際には、図３Ａに示すように、液面Ｓの高さが、Ｙ軸方向における位置Ｙ３に配置された各連通部１２に達するように細胞懸濁液を注入する。これにより、各管状部１１内に収容された細胞懸濁液は、位置Ｙ３に配置された各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。
次に、培養を開始してから、所定時間が経過した後に、図３Ｂに示すように、液面Ｓの高さが、Ｙ軸方向における位置Ｙ２に配置された各連通部１２に達するように培養液を追加する。その後、更に所定時間が経過した後に、図３Ｃに示すように、液面Ｓの高さがＹ軸方向における位置Ｙ１に配置された各連通部１２に達するように培養液を更に追加する。このように、液面Ｓの高さが、上位の連通部１２に達するように、培養液の追加を行うことで、追加された培養液は、各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。
このように、細胞懸濁液を最初に細胞培養バッグ１０に注入する際および培養液を段階的に追加する際に、液面が上位の連通部１２に達するように、細胞懸濁液または培養液の注入を行うことで、細胞懸濁液および培養液は、各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。これにより、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制することができる。
以上の説明から明らかなように、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０は、互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部１１を有する。このように細胞培養バッグ１０内部の収容空間を複数の管状の空間に分割することで、細胞懸濁液や培養液を細胞培養バッグ１０内部に収容したときに、細胞培養バッグ１０の底部の膨張を防止することができる。これにより、細胞培養バッグ１０内部の全域に亘り均一にガスを供給することが可能となる。
また、細胞培養バッグ１０内部の収容空間を複数の管状の空間に分割することで、シール部１３および１４への加圧が分散される。また、培養スケールを拡大する場合には、管状部１１の数を増やすことで対応することが可能である。すなわち、本実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、培養スケールを拡大する場合に、細胞培養バッグの耐圧不足が問題となることはないので、細胞の大量培養に好適に用いることができる。
また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペアの各々において、互いに隣接する２つの管状部１１の間の中間領域Ｒに連通部１２が設けられている。これにより、複数の管状部１１間で細胞懸濁液および培養液が相互に流通することが可能となり、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制することができる。すなわち、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、細胞培養バッグの収容空間を複数の領域に分割した場合における培養環境の均一性の低下を抑制することができる。また、互いに隣接する２つの管状部からなるペアの各々において、管状部１１の管軸方向に沿って設けられる連通部１２の数を２以上とすることで、段階的に培養液を追加する培養方法を適用する場合に、追加された培養液の管状部１１間での相互流通を促進させることができる。
本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、管状部１１間で培養環境を均一とすることができるため、細胞培養バッグ１０を用いて培養された細胞の均一な品質が担保され、これらの細胞を同一ロットとみなすことができる。つまり、同一ロットとみなすことができる細胞を、例えば、１×１０１０個オーダで培養することで可能となる。従って、均一な品質であることが保証された大量の同一ロット細胞を必要とする、例えば細胞移植による治療の実現に寄与することができる。
また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、複数の管状部１１の各々の径Ｄ１は同一とされ、更に、各連通部１２の径Ｄ２は、管状部１１の径Ｄ１と同一とされている。このように、複数の管状部１１の各々の径を同一とすることで、複数の管状部１１間での培養環境を均一とすることができる。また、管状部１１と連通部１２の径を同一とすることにより、管状部１１および連通部１２の径方向中心部におけるガス供給量を等しくすることができる。細胞培養バッグ１０内で培養される細胞は、管状部１１のみならず連通部１２にも分布することが想定される。管状部１１と連通部１２の径を同一とすることにより、管状部１１と連通部１２との間での培養環境の相違をなくすことができる。これにより、細胞培養バッグ１０全体に亘り均質な細胞を得る効果が促進される。
また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されている。このような構成によれば、段階的に培養液を追加する細胞培養方法を適用する場合において、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制する効果が促進される。
また、本発明の実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞培養時において細胞培養バッグ１０は「縦置き」で使用される。細胞培養バッグ１０を「縦置き」で使用することにより、細胞培養バッグ１０の外表面と、細胞培養バッグ１０内部に導入されるガスとの接触面積を最大化させることができ、細胞培養バッグ１０内部へのガスの導入が促進される。
また、本実施形態に係る細胞培養方法においては、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入が行われる。これにより、細胞培養バッグ１０の、細胞懸濁液および培養液の注入後における液面よりも上方部分における、培養液成分や細胞の付着を防止することができ、培養効率の低下を抑制することができる。
図４は、本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグ１０Ａの構成を示す平面図である。なお、図４において、上記の細胞培養バッグ１０（図１参照）と同一または対応する構成部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。細胞培養バッグ１０Ａにおいて、シール部１４の各々には貫通孔１８が設けられている。貫通孔１８の形状は、例えば、図４に示すように、管状部１１および連通部１２の壁面に沿った矩形状とすることができるが、これに限定されるものではなく、例えば円形であってもよい。貫通孔１８の各々は、後述するように、細胞培養バッグ１０Ａの支持に使用することができる。
図５は、細胞培養時における細胞培養バッグ１０Ａの支持状態の一例を示す斜視図である。図６は、細胞培養時において細胞培養バッグ１０Ａを支持する支柱３０の構成の一例を示す斜視図である。
支柱３０は、円柱状の柱部３１と、柱部３１の周方向および軸方向（長手方向）に沿って設けられた複数のフック３２を有する。細胞培養時において、支柱３０は、柱部３１の軸方向が鉛直方向に沿うように配置される。細胞培養時において、細胞培養バッグ１０Ａは、管状部１１の管軸方向が鉛直方向に向けられた状態で、支柱３０の外周を囲むように配置される。このとき、複数のフック３２が、細胞培養バッグ１０Ａのシール部１４に形成された貫通孔１８の全部または一部に挿通される。すなわち、細胞培養バッグ１０Ａは、貫通孔１８の形成部においてフック３２に引っ掛けられることにより支柱３０に固定される。細胞培養バッグ１０Ａは、複数の管状部１１が、支柱３０を中心として環状に連なるように、複数の管状部１１の管軸方向と交差する方向に湾曲した状態で支持される。
図７は、支柱３０によって支持された細胞培養バッグ１０Ａの水平断面図である。細胞培養バッグ１０Ａにおいて、フック３２を挿通させる箇所を複数とすることで、フック３２の挿通部１箇所あたりの加重を小さくすることができる。また、フック３２の挿通部における加重を均一とするために、フック３２の挿通部が、管状部１１の管軸方向およびこれと交差する方向（すなわち、複数の管状部１１が並ぶ方向）において偏りなく配置されていることが好ましい。
このように、細胞培養バッグ１０Ａを環状に湾曲させることにより、複数の管状部１１を直線状に連ねる場合と比較して、省スペース化を実現することができる。また、細胞培養バッグ１０Ａを支柱３０を用いて縦置きで支持することにより、細胞培養バッグ１０Ａの外表面と、細胞培養バッグ１０Ａ内部に導入されるガスとの接触面積を最大化させることができ、細胞培養バッグ１０Ａ内部へのガスの導入が促進される。また、貫通孔１８を複数とすることで、フック３２の挿通部１箇所あたりの加重を小さくすることができるので、培養スケールの拡大に対応することが可能となる。
図８〜図１４は、本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。なお、図８〜図１４において、上記の細胞培養バッグ１０（図１参照）と同一または対応する構成部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）において、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されているが、この態様に限定されるものではない。例えば、図８および図９に示す細胞培養バッグ１０Ｂおよび１０Ｃのように、連通部１２のＹ軸方向における位置が、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペア間で揃っていなくてもよい。この場合においても、複数の管状部１１間で細胞懸濁液および培養液を相互に流通させることが可能であり、培養環境の均一性を確保することが可能である。また、図９に示す細胞培養バッグ１０Ｃのように、連通部１２の各々の径Ｄ２を、管状部１１の各々の径Ｄ１よりも大きくすることで、細胞懸濁液および培養液の、複数の管状部１１間での相互流通が促進されるとともに細胞培養バッグの容量を細胞培養バッグ１０よりも大きくすることができる。
また、上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）は、管状部１１の管軸方向の一端側と他端側の双方に、ポート１６Ａ、１６Ｂを有するが、この態様に限定されるものではない。図１０に示す細胞培養バッグ１０Ｄのように、管状部１１の管軸方向の一端側にのみポート１６Ｂが設けられていてもよい。細胞培養時において、細胞培養バッグ１０Ｄは、ポート１６Ｂが鉛直方向下側となるように設置され、ポート１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入および排出等が行われる。このように、管状部１１の管軸方向の一端側にのみポート１６Ｂを設けることで、上記した細胞培養バッグ１０と比較して構成を簡略化することができる。一方、細胞培養バッグ１０によれば、鉛直方向上側および鉛直方向下側のポート１６Ａおよび１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入および排出等を行うことができるので、細胞懸濁液および培養液の注入・排出の経路の設計自由度を高めることができる。なお、ポート１６Ｂを、管状部１１の一端と他端の間の中間領域に配置してもよい。
また、上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）は、ポート１６Ａおよび１６Ｂが、Ｘ軸方向の一端側からバッグ本体に挿入されているが、この態様に限定されるものではない。例えば、図１１に示す細胞培養バッグ１０Ｅのように、ポート１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆを、Ｙ軸方向の一端側からバッグ本体に挿入するとともに、ポート１６Ｇ、１６Ｈおよび１６Ｉを、Ｙ軸方向の他端側からバッグ本体に挿入してもよい。また、例えば、図１２に示す細胞培養バッグ１０Ｆのように、Ｙ軸方向の一端側および他端側、Ｘ軸方向の一端側および他端側、細胞培養バッグ１０Ｆのコーナ部から複数のポート１６Ａ〜１６Ｌをバッグ本体に挿入してもよい。ポート１６Ａ〜１６Ｌは、例えば、細胞懸濁液および培養液の注入、排出、細胞培養バッグ１０内のエア抜き、培養中の細胞の抜き取り等の用途に適宜使用され得る。図１１および図１２に示す細胞培養バッグ１０Ｅおよび１０Ｆのように、複数のポート１６Ａ〜１６Ｌを設け、それぞれに特定の用途を割り当てることにより、コンタミネーションのリスクを低減することができる。
また、図１３および図１４に示す細胞培養バッグ１０Ｇおよび１０Ｈのように、貫通孔１８の幅（Ｘ軸方向の長さ）を、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って変化させてもよい。換言すれば、鉛直方向下側に位置するシール部１４のＸ軸方向における幅を、鉛直方向上側に位置するシール部１４のＸ軸方向における幅よりも広くしてもよい。例えば、図１３に示すように、最下部に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の形状を逆三角形とすることにより、最下部に位置するシール部１４の幅を、鉛直方向下方に向けて拡大してもよい。また、図１４に示すように、最下部に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の幅を、上方に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の幅よりも狭くしてもよい。細胞培養時においてシール部１４に印加される圧力は、鉛直方向下方に向けて大きくなるため、鉛直方向下側に位置するシール部１４の幅を拡大することで、鉛直方向下側に位置するシール部１４の耐圧を高めることができる。なお、図１３および図１４では、最下部に位置するシール部１４のみ幅を拡大しているが、最下部よりも上方のシール部１４についても同様に幅の拡大を行ってもよい。
なお、細胞培養バッグ１０、１０Ａ〜１０Ｈは、本発明における細胞培養バッグの一例である。管状部１１は、本発明における管状部の一例である。連通部１２は、本発明における連通部の一例である。シール部１３および１４は、本発明におけるシール部の一例である。貫通孔１５および１８は、本発明における貫通孔の一例である。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、本発明におけるポートの一例である。インキュベータ４０は、本発明における密閉容器の一例である。支柱３０は本発明における支柱の一例である。
１０、１０Ａ〜１０Ｈ 細胞培養バッグ
１１ 管状部
１２ 連通部
１３、１４ シール部
１５、１８ 貫通孔
１６Ａ、１６Ｂ ポート
３０ 支柱
３２ フック
４０ インキュベータ
１１ 管状部
１２ 連通部
１３、１４ シール部
１５、１８ 貫通孔
１６Ａ、１６Ｂ ポート
３０ 支柱
３２ フック
４０ インキュベータ
Claims (23)
- 管軸方向が第１の方向に向けられるとともに前記第１の方向と交差する第２の方向に並置され且つ互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部と、
前記複数の管状部のうち、互いに隣接する２つの管状部の各々を、前記管状部の一端と他端との間の中間領域において連通させるガス透過性を有する連通部と、
を備える細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、前記第１の方向に沿って前記連通部が２以上設けられている
請求項１に記載の細胞培養バッグ。 - 前記連通部の前記第１の方向における位置が、前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々の間で揃えられている
請求項２に記載の細胞培養バッグ。 - 前記管状部の径は各々同じである
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部の径と、前記連通部の径が同じである
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - ガス透過性を有するプラスチックフィルムを貼り合わせて形成された
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記プラスチックフィルムに形成された複数のシール部によって前記隔壁が形成されている
請求項６に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数のシール部のうちの少なくとも１つに貫通孔を有する
請求項７に記載の細胞培養バッグ。 - 前記貫通孔の幅は、前記第１の方向に沿って変化している
請求項８に記載の細胞培養バッグ。 - 前記プラスチックフィルムの製膜時の製膜流れ方向が前記第２の方向と一致している
請求項６から請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記プラスチックフィルムは、可視光を透過する
請求項６から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、前記第１の方向に沿って前記連通部が３以上設けられている
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部の各々の径は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下である
請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部の各々の管軸方向の長さは、１０００ｍｍ以下である
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部の各々の前記第１の方向における少なくとも一端側において、前記複数の管状部の各々と連通するポートを更に含む
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 前記複数の管状部の各々の前記第１の方向における一端側および他端側のそれぞれにおいて、前記複数の管状部の各々と連通する複数のポートを更に含む
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。 - 請求項１５または請求項１６に記載の細胞培養バッグを用いた細胞培養方法であって、
前記複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に沿い且つ少なくとも１つの前記ポートが鉛直方向下側に位置するように前記細胞培養バッグを支持し、
細胞懸濁液または培養液を鉛直方向下側に位置する前記ポートから注入して細胞の培養を行う
細胞培養方法。 - 培養液を鉛直方向下側に位置する前記ポートから注入して培養液の追加を行う
請求項１７に記載の細胞培養方法。 - 追加後の培養液の液面が、前記連通部の高さ位置に達するように培養液の追加を行う
請求項１８に記載の細胞培養方法。 - 前記複数の管状部が環状に連なるように前記複数の管状部の管軸方向と交差する方向に前記細胞培養バッグを湾曲させた状態で前記細胞培養バッグを支持して細胞の培養を行う
請求項１７から請求項１９のいずれか１項に記載の細胞培養方法。 - 請求項８に記載の細胞培養バッグを用いた細胞培養方法であって、
周方向および軸方向の複数箇所にフックを備え且つ軸方向が鉛直方向に向けられた支柱の外周を、前記複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に向けられた前記細胞培養バッグで囲み、前記貫通孔に前記フックを挿通させることにより、前記細胞培養バッグを前記支柱で支持して細胞の培養を行う
細胞培養方法。 - 前記細胞培養バッグを密閉容器内に収容して細胞の培養を行う
請求項１７から請求項２１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。 - 培養期間中、前記細胞培養バッグを静置状態に維持して細胞の培養を行う
請求項１７から請求項２１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
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