CN116286357A - 一种3d打印类器官培养支架及类器官培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D打印类器官培养支架及类器官培养方法，其特征在于：包括主体，所述主体内具有微流道，所述主体的一端具有进口，另一端具有出口，所述进口及出口分别与所述微流道相连通；所述主体包括主枝干及支架，所述微流道设置于所述支架内，所述微流道经所述主枝干与所述进口及出口相连通；所述支架的外壁上间隔设有多组微孔，所述微孔与所述微流道相连通；所述支架由多组枝干相互连接组成，相邻所述枝干之间构成多组相互连通的培养孔；每组所述枝干的内部设有沿着所述枝干延伸的微流道，多组所述枝干内的微流道均相互连通；所述微孔间隔设置于所述枝干的外壁上，所述微孔将所述微流道与所述培养孔相连通。本发明提高了类器官的培养效果。

Description

一种3D打印类器官培养支架及类器官培养方法
技术领域
本发明涉及一种类器官培养领域，尤其涉及一种3D打印类器官培养支架及类器官培养方法。
背景技术
近十年来，干细胞研究领域取得了巨大进展，其中很重要的突破就是类器官(Organoids)体系的从无到有的快速发展。类器官培养属于3D细胞培养的高级阶段，其主要特征是细胞培养分化产生了不同功能的细胞群，可一定程度上模拟人体器官的相关功能。现今已在医疗领域展露头脚，如肿瘤药敏检测、高通量药筛等，具有广阔的研究和应用的潜力。类器官发展的终极目标是在体外培养人体器官，从而可以替代同种异体移植的市场，具有巨大的医学价值和市场前景。
但迄今为止，类器官培养到一定程度都会“死亡”，现今的科研进展还远达不到在体外培养器官的程度。简单来说，细胞在生长过程中因为不断的分化扩增，导致其产生坏死中心(necrotic core)，因为培养基等促生长物质无法深入到类器官中心进行物质交换，而人体内因有覆盖全身的血管网络，可供各种组织及内部进行营养供给及废物排放，从而很好的保持了人类的生理功能。
现在国际上主流的类器官的培养主要分为：常规培养板培养和高通量微流控(即类器官芯片，Organ-chip)两种培养方式，常规的培养板培养一般是采用matrigel基质胶和载有生长因子的专用培养基对细胞进行培养，此培养方式需要手动定期更换培养基；高通量微流控一般是把细胞定植在微流控流道中间的腔室(chamber)内，通过单个或数个进口和出口把载有类器官生长分化所需物质的培养基通过蠕动泵泵入微流控芯片内细胞生长的腔室内，实现了自动更换培养基。除了Matrigel基质胶外，在腔室内也可采用微球和其他水凝胶材料产生3D微环境，给细胞生长提供支持。
以上提到的不论哪种方式都存在一个很大的难点，那就是细胞在分化逐渐长成类器官的过程中，中心的细胞相比表面细胞得到的培养基(即物质交换)少，导致生长到一定程度细胞从中心开始凋零，最终导致类器官在分化到一定程度后很难继续生长，从而不能够进一步模拟人类器官的相关功能。
发明内容
本发明目的是提供一种3D打印类器官培养支架及类器官培养方法，通过使用该结构及方法，在细胞培养过程中能够增加中心的细胞与培养基的接触量，进而提高培养效果。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种3D打印类器官培养支架，包括主体，所述主体内具有微流道，所述主体的一端具有进口，另一端具有出口，所述进口及出口分别与所述微流道相连通；
所述主体包括主枝干及支架，所述主枝干为两组，所述微流道设置于所述支架内，所述支架的两端分别经两组所述主枝干与所述进口及出口相连，所述微流道经所述主枝干与所述进口及出口相连通；
所述支架的外壁上间隔设有多组微孔，所述微孔与所述微流道相连通；
所述支架由多组枝干连接组成，相邻所述枝干之间构成多组相互连通的培养孔；
每组所述枝干的内部设有沿着所述枝干延伸的微流道，多组所述枝干内的微流道均相互连通；
所述微孔间隔设置于所述枝干的外壁上，所述微孔将所述微流道与所述培养孔相连通。
上述技术方案中，所述主枝干内设有主流道，所述微流道经所述主流道分别与所述进口及出口相连通。
上述技术方案中，所述支架的外部还设有一外套，所述外套的内部设有空腔，所述支架的外端与空腔的内壁相连，所述主枝干设置于所述外套外部的两端；
所述外套的外壁上设有多组通孔与所述空腔相连通，且所述通孔直径大于所述枝干外径。
上述技术方案中，所述支架与所述外套连接处的枝干上均设有端部微孔，所述端部微孔与所述外套的外表面相连通。
上述技术方案中，所述支架包括多组平面架及多组立架，多组平面架相互间隔设置，每组所述立架将相邻所述平面架相连；
相邻所述平面架与相邻所述立架之间构成所述培养孔；
所述枝干包括第一枝干、第二枝干及第三枝干；
所述平面架包括多组相互交叉连接的第一枝干及第二枝干，每组所述第一枝干及第二枝干内均设有微流道，且所述第一枝干内的微流道与所述第二枝干内的微流道相连通；
所述立架包括多组第三枝干，所述第三枝干的端部与所述平面架相连，且所述第三枝干内的微流道与所述第一枝干和/或第二枝干内的微流道相连通。
上述技术方案中，所述培养孔的孔径为100微米～1000微米，所述微流道的直径为2微米～500微米，所述微孔的直径小于或等于所述微流道的直径。
上述技术方案中，所述外套为球形结构或类球形结构。
上述技术方案中，所述支架为平面架，所述平面架包括多组由上至下间隔设置的枝干，每组所述枝干的两端分别与两侧所述主枝干相连，所述枝干内的微流道分别经两侧所述主枝干与进口及出口相连通。
本发明还提供了一种类器官培养方法，包括以下步骤：
①用3D打印机打印出上述的3D打印类器官培养支架；
②将步骤①中制得的培养支架放入缓冲液中充分溶胀后，放入到微流控芯片的腔室内；
③用滴管通过微流控芯片进料口滴入需要培养的细胞和培养基至培养支架上，使得培养基充分浸没培养支架；
④将装有培养支架及细胞的微流控芯片放入二氧化碳培养箱内进行培养，并利用蠕动泵对微流控芯片内的培养基、促生长物质进行输送及更换；
所述步骤④中，培养支架的进口与微流控芯片的进口连接，培养支架的出口与微流控芯片的出口连接，微流控芯片将培养支架固定在腔室内；
培养基经过微流控芯片的进口流入培养支架的进口，进一步通过微流道及微孔送入培养孔，进而到培养支架的任意位置，供细胞吸收培养，并通过培养支架出口流出微流控芯片，实现培养支架的物质交换。
上述技术方案中，所述步骤①中，培养支架的生产工艺如下：
a、利用3D打印机将培养支架一体打印成型，得到预成型培养支架；
b、对预成型培养支架依次进行清理、干燥、灭菌处理，得到成型的培养支架。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明中支架采用多组相互连接的枝干组成，并且枝干内设有相互连通的微流道，枝干的外壁上面则设有与微流道连通的微孔，通过进口与出口进行培养基的输送交换，利用微流道以及微孔的设置，能够通过微流道以及微孔给予类器官中心的细胞供给培养基等促生长物质，能够尽可能的将类器官培养成长更久，尽可能的使得类器官的培养更加持久，提高培养效果；
2.本发明中相邻枝干之间构成多组相互连通的培养孔，这样给培养的细胞提供了理想的3D生长微环境，并且培养孔还能够相互连接，微流道及微孔起到毛细血管提供培养基的作用，使得类器官的各个位置均能够被培养基覆盖，有效提高培养效果。
附图说明
图1是本发明实施例一中的结构示意图；
图2是图1的剖视结构示意图；
图3是本发明实施例一中培养支架切开后的部分结构示意图；
图4是本发明实施例一中支架的局部结构示意图；
图5是本发明实施例二中的结构示意图。
其中：1、微流道；2、进口；3、出口；4、主枝干；5、支架；6、微孔；7、枝干；8、培养孔；9、主流道；10、外套；11、通孔；12、端部微孔；13、平面架；14、立架；15、第一枝干；16、第二枝干；17、第三枝干。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：参见图1～4所示，一种3D打印类器官培养支架，包括主体，所述主体内具有微流道1，所述主体的一端具有进口2，另一端具有出口3，所述进口及出口分别与所述微流道相连通；其中，进口及出口还会和微流控芯片通道连通，这样微流控芯片能够给予主体提供培养基等促生长物质。
所述主体包括主枝干4及支架5，所述主枝干为两组，所述微流道设置于所述支架内，所述支架的两端分别经两组所述主枝干与所述进口及出口相连，所述微流道经所述主枝干与所述进口及出口相连通；
所述支架的外壁上间隔设有多组微孔6，所述微孔与所述微流道相连通；
所述支架由多组枝干7相互连接组成，相邻所述枝干之间构成多组相互连通的培养孔8；
每组所述枝干的内部设有沿着所述枝干延伸的微流道，多组所述枝干内的微流道均相互连通；
所述微孔间隔设置于所述枝干的外壁上，所述微孔将所述微流道与所述培养孔相连通。
本发明还提供了一种类器官培养方法，包括以下步骤：
①用3D打印机打印出上述的3D打印类器官培养支架；
②将步骤①中制得的培养支架放入缓冲液中充分溶胀后，放入到微流控芯片的腔室内；其中，缓冲液是一种能在加入少量酸或碱和水时抵抗pH改变的溶液，pH缓冲系统对维持生物的正常pH值,正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动,而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化；溶胀是因为材料泡水后会变大，到一定程度后不会再膨胀，是为了其稳定后进行后续步骤。
③用滴管通过微流控芯片进料口滴入需要培养的细胞和培养基至培养支架上，使得培养基充分浸没培养支架；
④将装有培养支架及细胞的微流控芯片放入二氧化碳培养箱内进行培养，并利用蠕动泵对微流控芯片内的培养基、促生长物质进行输送及更换；
所述步骤④中，培养支架的进口与微流控芯片的进口连接，培养支架的出口与微流控芯片的出口连接，微流控芯片将培养支架固定在腔室内；
培养基经过微流控芯片的进口流入培养支架的进口，进一步通过微流道及微孔送入到培养支架的任意位置，供细胞吸收培养，并通过培养支架出口流出微流控芯片，实现培养支架的物质交换。
在本发明中，在实际进行类器官培养的时候，微流控芯片通过进口及出口给予腔室进行培养基的更换或者交换，这样就无需人工手动进行培养基的更换。其中，需要培养的细胞会在3D打印支架构建的三维微环境内，通过吸收培养基的促生长分化物质进行扩增、分化等，其中，常规状态下，微流控芯片的腔室内会充满有培养基，在初始细胞扩增的状态下，由于细胞的数量较少，基本上所有细胞都能够接触到培养基，因此，细胞能够正常的进行扩增、分化，进而进行类器官的培养。在细胞扩增的过程中，外部的细胞会包覆在内部的细胞外部，逐层的朝外分化，并且外层的细胞能够方便的对微流控芯片的腔室内培养基进行物质交换。在以往结构中，靠近中心的细胞，由于被外层的细胞所包覆，外部的培养基难以进入到内层，从而导致内层的细胞培养到一定程度后凋零，导致类器官生长到一定程度之后就无法继续生长。而在本发明中，本体由多组相互连接的枝干组成，并且枝干内具有和其他枝干相互连通的微流道，而且每组枝干上面间隔设有多组和微流道连通的微孔，这样能够通过微孔给予内层的细胞进行培养基的营养交换，同时，靠近微孔处的细胞也能够和培养基接触，这样培养基能够给予靠近微孔处的细胞提供营养。进一步的，在细胞扩增分化的过程中，进入到微孔、微流道，将部分微孔堵塞、微流道的部分路段堵塞，由于微孔数量多，且微流道都相互连通，这样也能够通过没有堵塞的微流道、微孔给予旁边的细胞提供培养基，尽可能的提高类器官的生长效果，使得该类器官能够便于后续的科研或者医学研究，使其具备更好的科研效果及医学研究效果。
参见图2所示，所述主枝干内设有主流道9，所述微流道经所述主流道分别与所述进口及出口相连通。主流道的设置，用于给予微流体培养基的交换。其中，主枝干外壁上具有和主流道连通的微流道，这样主流道内输送的培养基也能够通过主枝干上面的微流道送出到外部。
参见图1～3所示，所述支架的外部还设有一外套10，所述外套的内部设有空腔，所述支架的外端与空腔的内壁相连，所述主枝干设置于所述外套外部的两端；
所述外套的外壁上设有多组通孔11与所述空腔相连通，且所述通孔直径大于所述枝干外径。
在本实施例中，将需要培养的细胞从通孔处滴入到外套内部的支架上，这样能够利用外套对细胞的培养做一定的限制，使得细胞尽可能的粘附在支架内的培养孔内，并且尽可能的处在外套内，对类器官的发育空间进行一定的限位，同时，通孔的存在，外部的培养基又能够从通孔内进入到外套内与细胞接触，给予细胞提供营养及物质交换。同时，采用3D打印技术还可根据不同的类器官类型及所需的尺寸来确定3D打印支架的尺寸进行方便的打印，从而实现了针对不同类器官的个性化制备。
其中，所述外套为球形结构或类球形结构，这样类器官生长的时候，尽可能的在各个位置都能够和培养基进行接触，增大与培养基的接触面积，提高培养效果。其中，在本发明中，放置此培养支架的微流控芯片腔室的两端有固定培养支架进出口的结构，能够使其固定在腔室内，使其与微流控芯片上的进出口相连，微流控的进出口与蠕动泵的管道相连；微流控芯片上端有进料口与腔室相连，方便将细胞及培养基滴入至腔室内。
参见图1、3所示，所述支架与所述外套连接处的枝干上均设有端部微孔12，所述端部微孔与所述外套的外表面相连通。
在本实施例中，端部微孔和外套的外表面连通，这样在细胞扩增分化过程中，即使将某一些部位的微流道堵塞之后，培养基也能够从端部微孔进入到微流道内，给予能够流通的微流道提供培养基，从而保证微孔给予内层的细胞提供培养基进行营养的替换。
参见图2～4所示，所述支架包括多组平面架13及多组立架14，多组平面架相互间隔设置，每组所述立架将相邻所述平面架相连；
相邻所述平面架与相邻所述立架之间构成所述培养孔；
所述枝干包括第一枝干15、第二枝干16及第三枝干17；
所述平面架包括多组相互交叉连接的第一枝干及第二枝干，每组所述第一枝干及第二枝干内均设有微流道，且所述第一枝干内的微流道与所述第二枝干内的微流道相连通；其中，第一枝干内的微流道和第二枝干的微流道在两者的交叉处连通。
所述立架包括多组第三枝干，所述第三枝干的端部与所述平面架相连，且所述第三枝干内的微流道与所述第一枝干和/或第二枝干内的微流道相连通。在本实施例中，第三枝干的端部会和第一枝干、第二枝干的连接处连接，使得第一枝干、第二枝干及第三枝干内的微流道在三者的连接处进行连通。当然，第三枝干也可以只和第一枝干或者第二枝干连接，从而实现第三枝干的微流道和第一枝干的微流道或者第二枝干的微流道连通。
在本实施例中，利用立架将多组平面架连接，这样支架能够成为一个立体支架，并且第一枝干、第二枝干、第三枝干相互交错连接，并且内部的微流道相互连通，这样即使某些部位处的微孔、微流道被堵塞，其内还会存在很多没有被堵塞的通路，利用这些没有被堵塞的通路给予相应没有被堵塞的微孔提供培养基，提供营养交换的通道，进而使得类器官的发育更好。
同时，相邻所述平面架与相邻所述立架之间构成所述培养孔，这样处在培养孔内的细胞能够被相邻所述平面架与相邻所述立架上面的微孔提供培养基，也就是培养孔内的类器官组织的四周都具有培养基的输送通道，能够类似于毛细血管，给予内层细胞营养供给和物质交换，保证类器官能够更好的生长发育。同时，支架也给细胞提供了有支撑结构的3D生长微环境。
其中，所述培养孔的孔径为100微米～1000微米，所述微流道的直径为2微米～500微米，所述微孔的直径小于或等于所述微流道的直径。
培养孔的孔径适中，给细胞提供了支撑结构的3D培养微环境，而其四周又具有微孔提供培养基，能够尽可能的保证培养孔内的细胞都能够和培养基接触进行营养交换。其中，枝干采用中空的四面柱体结构，微孔至少会设置在主杆的相对侧的侧壁上，优选四个面上均具有微孔，这样通过四个面上的微孔，给予对应的培养孔内提供培养基，使得各个培养孔内的细胞能够进行均匀的营养供给和交换，保证类器官能够更好的生长。
其中，所述步骤①中，培养支架的生产工艺如下：
a、利用3D打印机将培养支架一体打印成型，得到预成型培养支架；
b、对预成型培养支架依次进行清理、干燥、灭菌处理，得到成型的培养支架。
在本发明中，主体与外套为3D打印一体成型，其可以采用可降解材料制作，也可以采用不可降解材料制作。
其中，不可降解材料优选采用：钛、钛合金、钽金属、不锈钢、钴基合金中的一种或多种。
可降解材料优选采用：聚乙二醇及其聚合物、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、胶原蛋白、甲基丙烯酸化胶原蛋白、甲基丙烯酸酰化明胶(Ge lMA)、聚乙烯醇、甲基丙烯酸酰化聚乙烯醇(PVAMA)、聚己内酯、甲基丙烯酸酰化聚己内酯(PCLMA)、甲基丙烯酸酰化壳聚糖(CSMA)、聚乳酸、羟基磷灰石、磷酸三钙、纳米粘土的一种或多种。
实施例二：参见图5所示，一种3D打印类器官培养支架，其结构与实施例一基本相似，不同点在于：所述支架为平面架，所述平面架包括三组由上至下间隔设置的枝干，每组所述枝干的两端分别与两侧所述主枝干相连，所述枝干内的微流道分别经两侧所述主枝干与进口及出口相连通。
在本实施例中，三组枝干的微流道，组成三流道的结构，类三层结构，其在空间上构成多孔网络，这样在枝干外表面上的微孔能够将培养基流出，给予细胞的营养吸收。这种结构与实施例一的结构相比，更利于构建类器官的血管化结构，对于不需要培养孔的悬浮细胞更好，因为悬浮细胞不需要支撑结构的3D微环境，适合采用平面架。
的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或者元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，比如，两者通过抵接、触接等形成机械的抵靠或抵触的连接方式，两者也可以是直接挂接或者通过中间媒介进行挂装连接等，也可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

Claims (10)

1.一种3D打印类器官培养支架，其特征在于：包括主体，所述主体内具有微流道，所述主体的一端具有进口，另一端具有出口，所述进口及出口分别与所述微流道相连通；
所述主体包括主枝干及支架，所述主枝干为两组，所述微流道设置于所述支架内，所述支架的两端分别经两组所述主枝干与所述进口及出口相连，所述微流道经所述主枝干与所述进口及出口相连通；
所述支架的外壁上间隔设有多组微孔，所述微孔与所述微流道相连通；
所述支架由多组枝干连接组成，相邻所述枝干之间构成多组相互连通的培养孔；
每组所述枝干的内部设有沿着所述枝干延伸的微流道，多组所述枝干内的微流道均相互连通；
所述微孔间隔设置于所述枝干的外壁上，所述微孔将所述微流道与所述培养孔相连通。
2.根据权利要求1所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述主枝干内设有主流道，所述微流道经所述主流道分别与所述进口及出口相连通。
3.根据权利要求1所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述支架的外部还设有一外套，所述外套的内部设有空腔，所述支架的外端与空腔的内壁相连，所述主枝干设置于所述外套外部的两端；
所述外套的外壁上设有多组通孔与所述空腔相连通，且所述通孔直径大于所述枝干外径。
4.根据权利要求3所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述支架与所述外套连接处的枝干上均设有端部微孔，所述端部微孔与所述外套的外表面相连通。
5.根据权利要求1所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述支架包括多组平面架及多组立架，多组平面架相互间隔设置，每组所述立架将相邻所述平面架相连；
相邻所述平面架与相邻所述立架之间构成所述培养孔；
所述枝干包括第一枝干、第二枝干及第三枝干；
所述平面架包括多组相互交叉连接的第一枝干及第二枝干，每组所述第一枝干及第二枝干内均设有微流道，且所述第一枝干内的微流道与所述第二枝干内的微流道相连通；
所述立架包括多组第三枝干，所述第三枝干的端部与所述平面架相连，且所述第三枝干内的微流道与所述第一枝干和/或第二枝干内的微流道相连通。
6.根据权利要求1所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述培养孔的孔径为100微米～1000微米，所述微流道的直径为2微米～500微米，所述微孔的直径小于或等于所述微流道的直径。
7.根据权利要求3所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述外套为球形结构或类球形结构。
8.根据权利要求1所述的3D打印类器官培养支架，其特征在于：所述支架为平面架，所述平面架包括多组由上至下间隔设置的枝干，每组所述枝干的两端分别与两侧所述主枝干相连，所述枝干内的微流道分别经两侧所述主枝干与进口及出口相连通。
9.一种类器官培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
①用3D打印机打印出如权利要求1-8任一项所述的3D打印类器官培养支架；
②将步骤①中制得的培养支架放入缓冲液中充分溶胀后，放入到微流控芯片的腔室内；
③用滴管通过微流控芯片进料口滴入需要培养的细胞和培养基至培养支架上，使得培养基充分浸没培养支架；
④将装有培养支架及细胞的微流控芯片放入二氧化碳培养箱内进行培养，并利用蠕动泵对微流控芯片内的培养基、促生长物质进行输送及更换；
所述步骤④中，培养支架的进口与微流控芯片的进口连接，培养支架的出口与微流控芯片的出口连接，微流控芯片将培养支架固定在腔室内；
培养基经过微流控芯片的进口流入培养支架的进口，进一步通过微流道及微孔送入到培养支架的任意位置，供细胞吸收培养，并通过培养支架出口流出微流控芯片，实现培养支架的物质交换。
10.根据权利要求9所述的类器官培养方法，其特征在于：所述步骤①中，培养支架的生产工艺如下：
a、利用3D打印机将培养支架一体打印成型，得到预成型培养支架；
b、对预成型培养支架依次进行清理、干燥、灭菌处理，得到成型的培养支架。
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