CN115093967A - 细胞培养板及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了细胞培养板及其使用方法，细胞培养板包括：基板，所述基板的一侧表面上设有非贯穿的开孔，所述开孔包括第一开孔部和第二开孔部，所述第一开孔部与所述第二开孔部相连，所述第一开孔部位于所述第二开孔部远离所述表面的一侧，其中，所述第一开孔部的孔径小于所述第二开孔部的孔径。由此，可以对少量的细胞和较低密度的细胞悬液进行高密度细胞培养，还可以使得培养的微组织或者类器官形状更加规则和均一，结合表面修饰处理，可以起到低吸附培养细胞的效果。

Description

细胞培养板及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及细胞培养板及其使用方法，更具体地，涉及细胞培养板在少量细胞的高密度培养和扩增，微组织培养和扩增，类器官培养和扩增，药物筛选中的应用。

背景技术

相关技术中，少量细胞的高密度扩增在干细胞挑克隆，原代细胞培养等领域有较强需求。由于技术限制，通过基因编辑得到的细胞或者通过原代分离手段得到的原代干细胞，但是原代肿瘤细胞等细胞数非常有限，无法满足较大规模的实验需求。体外的微组织和类器官的培养和扩增也是常用的生物技术手段。在微组织培养中，可以通过给细胞外加生物材料，起到支持细胞的作用。细胞在生物材料中培养后，还会收缩生物材料的整体面积，通过面积变化的定量可以作为表征细胞收缩力的手段，辅助药物筛选或者表征细胞状态。但是目前的体外的微组织和类器官的培养和扩增存在实验不稳定性较高，生物材料消耗较大等问题。

因此，目前的细胞培养板及其使用方法仍有待改进。

发明内容

在本发明的一个方面，本发明提出了一种细胞培养板，包括：基板，所述基板的一侧表面上设有非贯穿的开孔，所述开孔包括第一开孔部和第二开孔部，所述第一开孔部与所述第二开孔部相连，所述第一开孔部位于所述第二开孔部远离所述表面的一侧，其中，所述第一开孔部的孔径小于所述第二开孔部的孔径。由此，可以对少量的细胞和较低密度的细胞悬液进行高密度细胞培养，还可以使得培养的微组织或者类器官形状更加规则和均一。

根据本发明的实施例，所述第一开孔部的孔径为1～5mm，自所述第一开孔部指向所述第二开孔部的方向上，所述第一开孔部的高度为0.2～2mm。由此，可以实现细胞的高密度培养，还有助于微组织和类器官的结构规则性、均一性的提高。

根据本发明的实施例，所述第二开孔部的孔径与所述第一开孔部的孔径的差值不小于1mm。由此，可以有效减少细胞培养过程中的外界干扰。

根据本发明的实施例，所述第二开孔部的孔径为4～10mm，自所述第一开孔部指向所述第二开孔部的方向上，所述第二开孔部的高度为3～10mm。由此，可以进一步减少细胞培养过程中的外界干扰。

根据本发明的实施例，所述第一开孔部的开孔形状为圆形或矩形，所述第二开孔部的开孔形状为圆形或矩形。由此，可以便于进行细胞培养操作。

根据本发明的实施例，所述基板的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙基乙烯中的至少之一。由此，可以适用于多种材质的细胞培养板。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种使用前述的细胞培养板进行细胞培养的方法，包括：将细胞悬液注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。由此，通过少量的细胞和较低密度的细胞悬液即可以实现高密度细胞培养。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种使用前述的细胞培养板进行组织培养的方法，包括：将细胞与生物材料混合后注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。由此，可以获得具有较高结构规则性、均一性的微组织和类器官。

根据本发明的实施例，所述生物材料包括天然生物材料和/或合成生物材料，所述天然生物材料包括基质胶、胶原、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少之一；所述合成生物材料包括聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少之一。由此，可以适用于多种生物材料。

根据本发明的实施例，在所述将所述细胞与所述生物材料混合后注入所述第一开孔部中之前进一步包括：对所述第一开孔部进行修饰处理，所述修饰处理包括：使用过碘酸钠、聚乙二醇甲醚丙烯酸酯和苯甲醇的水溶液的混合溶液浸泡所述第一开孔部，并进行紫外照射。由此，可以减少细胞贴壁现象的发生。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的细胞培养板的结构示意图；

图2显示了根据本发明又一个实施例的细胞培养板的结构示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的细胞培养板的俯视图；

图4显示了根据本发明一个实施例的细胞培养板的立体图；

图5显示了根据本发明一个实施例的向本申请中的细胞培养板注入胶原后的胶原纵切面图；

图6显示了根据本发明两个对比例的向常规96孔板注入胶原后的胶原纵切面图；

图7显示了根据本发明一个对比例的向U底孔板注入胶原后的胶原纵切面图；

图8显示了根据本发明多个实施例的采用本申请中的细胞培养板进行细胞收缩实验的细胞收缩图；

图9显示了根据本发明多个对比例的采用常规96孔板进行细胞收缩实验的细胞收缩图；

图10显示了根据本发明多个实施例的采用本申请中的细胞培养板进行类器官培养的类器官形态图；

图11显示了根据本发明多个对比例的采用U形底的低吸附96孔板进行类器官培养的类器官形态图；

图12显示了根据本发明对比例6-9的表面低吸附处理的96孔板进行类器官培养的类器官形态图。

附图标记说明：

10：基板；20：开孔；21：第一开孔部；22：第二开孔部。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明是基于发明人对于以下事实和问题的发现和认识做出的：

发明人发现，细胞的增殖速度和细胞起始的种植密度相关，当单位面积上的细胞数目过少时，细胞增殖速度慢，需要等待较长时间才能获得满足实验需求的足够细胞数。所以将同样数目的细胞种植到更小的孔板上时，可以起到促进细胞增殖的作用。虽然可以通过常规的384或者1536多孔板等小面积的孔板上种植细胞，来起到一定的扩增作用，但是由于培养体系小，容易受到蒸发的影响，换液时不仅因为孔面积太小，操作困难，也容易对细胞造成扰动。

发明人还发现，在采用96或者48孔板等较大的孔板作为培养板进行微组织培养时，由于生物材料在孔中沿着侧边的竖直孔壁有向上铺展的效应，形成的并不是一个规则的圆柱体，而是一个有着凹液面的不规则形状，影响后续的收缩实验定量，也给实验带来了不稳定性，对生物材料的消耗也较大。类似地，类器官培养虽然也可使用U底孔板进行辅助生物材料成型，但是得到的仍然是不规则的扁平状，影响最终得到的类器官形状，难以保证重复孔之间的均一性。

本发明旨在至少一定程度上缓解或解决上述提及问题中至少一个。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种细胞培养板，参考图1-图4，包括：基板10，基板10的一侧表面上设有非贯穿的开孔20，开孔20包括第一开孔部21和第二开孔部22，第一开孔部21与第二开孔部22相连，第一开孔部21位于第二开孔部22远离表面的一侧，其中，第一开孔部21的孔径小于第二开孔部22的孔径。本申请中的细胞培养板可以实现高密度培养少量细胞，在结合胶原蛋白等生物材料时，可以辅助微组织或类器官成形，使培养得到的微组织或者类器官的形状可控。

为了便于理解，下面对本申请中的细胞培养板具有前述有益效果的原理进行说明：

参考图1，本申请中的细胞培养板上的开孔具有两部分相连的开孔部，且第一开孔部21的孔径小于第二开孔部22的孔径，从而在进行细胞培养时，先将细胞重悬在培养基中，得到高密度细胞悬液，再将细胞种植在第一开孔部21的孔中，孵育一段时间等待细胞贴附；最后将培养基加入到第二开孔部22的孔中，给细胞提供营养支持。

发明人发现，由于第一开孔部21的孔径较小，故用较少数目的细胞就可以实现高密度培养，与传统的细胞培养多孔板相比，单位面积上的细胞数目更多，促进细胞更快增殖；在将细胞悬液注入第一开孔部21后，再在第二开孔部22的孔中加入培养基，能够维持细胞在长时间的扩增过程中的营养需求，并且在需要更换培养基时，可以仅吸取第二开孔部22中的旧培养基，并加入新鲜培养基即可，此时液体流动的剪切效应主要在第二开孔部22中，对于第一开孔部21中的细胞的扰动更少，有利于提高细胞生长环境的稳定性。因为更换培养基时针对第二开孔部的孔进行操作，相比于384或者1536等小面积孔板换液更加方便，便于人工操作，也便于和高通量操作仪器结合。

进一步地，发明人还发现，由于本申请中的培养基更换是针对于第二开孔部进行的，故即使通过将第二开孔部22中的旧培养基完全吸取，仍然会有少量的培养基存在于第一开孔部21的孔中，从而可以有效避免在吸取旧培养基和加入新鲜培养基的时间间断中，培养基的过度蒸发导致渗透压增大，影响细胞状态，进一步提高细胞生长环境的稳定性。

在进行组织培养，如微组织或者类器官组织培养时，由于生物材料和细胞的混合液通过第一开孔部限定了形状，故生长得到的组织结构形状与第一开孔部的形状相一致，如为圆柱体或长方体等，且由于第一开孔部的孔径和高度均较小，更易于被生物材料和细胞的混合液填满，使得培养得到的微组织或者类器官形状更加规则、均一。相比于传统的U底孔板和多孔板而言，不易出现组织结构具有不规则的凹面，或呈现为不规则扁形的缺陷。

根据本发明的一些实施例，第一开孔部的尺寸不受特别限制，例如，第一开孔部的孔径可以为1～5mm，自第一开孔部指向第二开孔部的方向上，第一开孔部的高度可以为0.2～2mm。

根据本发明的一些实施例，第二开孔部的孔径与第一开孔部的孔径关系不受特别限制，只要第二开孔部的孔径大于第一开孔部的孔径即可，例如，第二开孔部的孔径与第一开孔部的孔径的差值可不小于1mm，具体地，第二开孔部的孔径与第一开孔部的孔径的差值可以为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm或3mm。

根据本发明的一些实施例，第二开孔部的尺寸不受特别限制，只要其孔径大于第一开孔部的孔径即可，例如，第二开孔部的孔径可以为4～10mm，自第一开孔部指向第二开孔部的方向上，第二开孔部的高度可以为3～10mm。根据本发明的另一些实施例，第一开孔部与第二开孔部可以是同轴设置的，从而有利于提高基板的空间利用率和操作的便捷性。

根据本发明的一些实施例，第一开孔部的开孔形状和第二开孔部的开孔形状均不受特别限制，例如，第一开孔部的开孔形状可以为圆形或矩形，第二开孔部的开孔形状可以为圆形或矩形。当第一开孔部为圆形的孔时，培养得到的微组织形状更接近规则的圆柱体，当第一开孔部为矩形的孔时，培养得到的微组织形状更接近规则的长方体，从而可以提高重复孔之间的均一性。

根据本发明的一些实施例，形成基板的材料不受特别限制，例如，形成基板的材料可以包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙基乙烯中的至少之一。

根据本发明的一些实施例，本申请中的细胞培养板可以满足生物技术领域中的多种使用场景，例如，本申请中的细胞培养板可以用于细胞培养和扩增、微组织培养和扩增、类器官培养和扩增、细胞低吸附培养以及药物筛等应用中。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种使用前述的细胞培养板进行细胞培养的方法，包括：将细胞悬液注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。由此，通过少量的细胞和较低密度的细胞悬液即可以实现高密度细胞培养。具体地，可以包括以下步骤：将细胞重悬在培养基中，得到高密度细胞悬液；将细胞悬液种植在第一开孔部的孔中，孵育一段时间等待细胞贴附；再将培养基加入到第二开孔部的孔中，为细胞提供营养支持。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种使用前述的细胞培养板进行组织培养的方法，包括：将细胞与生物材料混合后注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。由此，可以获得具有较高结构规则性、均一性的微组织和类器官。具体地，可以包括以下步骤：将细胞与生物材料混合；将细胞与生物材料的混合液加入到第一开孔部的孔中，孵育一段时间等待生物材料形成凝胶；将培养基加入到第二开孔部的孔中，给细胞提供营养支持。

根据本发明的一些实施例，生物材料的种类不受特别限制，例如，生物材料可以包括天然生物材料和/或合成生物材料，具体地，天然生物材料可以包括基质胶、胶原、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少之一；合成生物材料可以包括聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少之一。

发明人还发现，在培养类器官组织时，如果使用相关技术中的细胞培养孔板，类器官中的细胞会贴附到孔板底部，细胞和生物材料的相互作用减弱，一些贴附能力强的细胞也更倾向于在孔板底面生长，从而影响类器官的形成。发明人发现，利用分支化聚乙二醇试剂对细胞培养板进行修饰后，可以有效防止类器官培养过程中细胞贴附现象的发生。

根据本发明的一些实施例，对孔板进行修饰的方法不受特别限制，例如，在将细胞与生物材料混合后注入第一开孔部中之前进一步包括：对第一开孔部进行修饰处理，修饰处理包括：使用过碘酸钠、聚乙二醇甲醚丙烯酸酯和苯甲醇的水溶液的混合溶液浸泡第一开孔部，并进行紫外照射。具体地，对孔板进行修饰处理的具体步骤可以包括：每500毫升去离子水中，加入54mg过碘酸钠，50g聚乙二醇甲醚丙烯酸酯，2.5g苯甲醇；使用50-100mW/cm²强度的紫外线照射3-6小时，每半小时充分震荡以去除气泡和保持溶液均匀。由此，可以减少细胞贴壁现象的发生。通过表面改性，可以使细胞无法在表面贴附，辅助类器官培养的效果。具体地，根据本发明的另一些实施例，为了减少修饰溶液对于细胞的毒性，可以在修饰完成后对细胞培养板进行充分清洗和消毒处理。

下面通过具体的实施例对本申请的方案进行说明，需要说明的是，下面的实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

参考图3，基板的材料为聚二甲基硅氧烷，长为59.5mm，宽为45.5mm。第一开孔部为直径2.8mm的圆形孔，相邻第一开孔部的圆心间距为7mm。第二开孔部为边长6mm的方形孔，相邻孔的中心间距为7mm。将使用罗丹明荧光染料标记的鼠尾一型胶原溶液调节到浓度为1.2mg/mL，pH调节至约7.2，在第一开孔部中加入4微升；37摄氏度孵育40分钟后加入培养基。使用共聚焦显微镜对孔中的胶原形状进行三维重构后，输出纵向切片照片。

实施例2：

采用与实施例1中相同的细胞培养板，在每个开孔中加入40微升5％的牛血清白蛋白溶液，充分填满第一开孔部和第二开孔部，37摄氏度孵育4小时，使得聚二甲基硅氧烷表面包被牛血清白蛋白。使用40微升去离子水清洗细胞培养板中的孔3次后，在冰上预冷。将细胞以每毫升2×106个的密度重悬在1.8mg/mL的胶原蛋白中，在每个第一开孔部的孔中加入4微升。37摄氏度孵育40分钟使得胶原蛋白成胶，在第二开孔部的孔中加入40微升培养基以支持细胞生长。12小时后观察细胞对胶原蛋白的收缩程度，作为表征细胞状态的表型。

实施例3：

采用与实施例1中相同的细胞培养板，在500毫升去离子水中溶解54mg过碘酸钠，50g聚乙二醇甲醚丙烯酸酯，2.5g苯甲醇。将混匀后的混合溶液细胞培养板的开孔中(至少填满第一开孔部)，紫外照射4小时，照射过程中每隔半小时摇晃细胞培养板以去除气泡。使用去离子水彻底清洗残余试剂后，使用医用酒精和紫外照射的方法灭菌。将生物材料和类器官所需要的细胞混合后，种植在第一开孔部的孔中，生物材料成胶后，在第二开孔部的孔中加入培养基，培养一段时间后观察类器官的生长状态。

对比例1：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的96孔板，胶原培养方法与实施例1保持一致，所不同的是，生物材料完全覆盖孔的底部。

对比例2：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的96孔板，胶原培养方法与实施例1保持一致，所不同的是，生物材料未完全覆盖孔的底部。

对比例3：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的U底96孔板，胶原培养方法与实施例1保持一致，所不同的是，生物材料完全覆盖孔的底部。

对比例4：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的96孔板，细胞培养方法与实施例2保持一致。

对比例5：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的U底96孔板，细胞培养方法与实施例3保持一致，所不同的是，使用的是标准的低吸附U底96孔板。

对比例6：

采用孔径为6.6mm，孔高为9mm的96孔板，细胞培养方法与实施例3保持一致，所不同的是，对孔内表面进行低吸附处理，低吸附处理溶液为：STEMCELL品牌的低吸附处理试剂，商品名：Anti-Adherence Rinsing Solution，货号07010。处理方法为：把该溶液直接加到紫外照射灭菌的多孔板上室温过夜孵育，第二天吸干溶液即可用。

需要说明的是，不同低吸附处理试剂的处理方法的差异是由于不同试剂自身的特性带来的，本领域技术人员可按照说明书或者通用的方法进行低吸附处理。

对比例7：

对比例7与对比例6保持一致，所不同的是，低吸附处理溶液为：聚乙烯吡络烷酮溶液。处理方法为：配制聚乙烯吡络烷酮溶液为2％的溶液，过滤保证无菌，在紫外照射灭菌的多孔板上室温过夜孵育，用之前吸干溶液，使用磷酸盐缓冲液洗两遍、培养基洗一遍，最后吸干所有残留液体。

对比例8：

对比例8与对比例6保持一致，所不同的是，低吸附处理溶液为：间断式聚醚F127溶液。处理方法为：配制间断式聚醚F12710％溶液，过滤保证无菌，在紫外照射灭菌的多孔板上室温过夜孵育，用之前吸干溶液并晾干。

对比例9：

对比例9与对比例6保持一致，所不同的是，低吸附处理溶液为：牛血清白蛋白溶液。处理方法为：配制10％牛血清白蛋白溶液，过滤保证无菌，在紫外照射灭菌的多孔板上37°孵育两个小时，吸干溶液即可用。

结果表明：参考图5，实施例1中的胶原由于生物材料和细胞的混合液被第一开孔部的孔限定了形状，故胶原的形状与第一开孔部的孔形状一致，表现为规则的圆柱体，上表面和下表面均没有明显弧度。

可以理解的是，实施例1中使用鼠尾一型胶原溶液进行细胞培养仅为示例，其他生物材料也可以在本细胞培养板中使用。

参考图6中的(a)，对比例2中的胶原的下表面是规则的平面，但是上表面为不规则的凹液面。参考图6中的(b)，对比例2中的胶原的下表面是规则的平面，但是上表面为不规则的凸液面。参考图7，对比例3中的胶原为不规则的扁形，上表面和下表面均为凹液面。本申请中的细胞培养板结构对于组织结构的可控性较高。

参考图8，实施例2中胶原蛋白与细胞的混合液在培养一段时间后收缩，收缩后的形态较为规则。参考图9，对比例4中的胶原蛋白和细胞的混合液在培养一段时间后收缩，但是收缩后的形态非常不规则，不具有重现性。本申请中的细胞培养板适用于通过观察孔内生物材料在细胞的作用下发生的收缩现象，可以通过定量分析生物材料收缩后的面积来作为细胞表型。

参考图10，实施例3中培养的类器官中的细胞不会贴附在孔板底部，培养后可以形成较为规则的圆形，形态和防贴附效果较好。参考图11，对比例5中的U底96孔板为类器官培养领域常用的系统，可以看到本申请实施例3中的细胞形态与对比例5中培养的类器官中的细胞形态接近，但是对比例5中的细胞均贴附在U底孔板底部，防贴附效果较差。参考图12的(a)、(c)和(d)可以看到，对比例6、对比例8和对比例9中的多孔板经低吸附处理后，虽然有一定的低吸附效果，但是会导致生物材料松散，并且生物材料和细胞的混合物对底部仍然有一定的吸附作用，无法形成致密的球状物。参考图12的(b)可以看到，对比例7中的多孔板经低吸附处理后，细胞和生物材料的混合物紧贴附在孔壁上，无法收缩。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。在本发明中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如1％、2％、3％、4％或5％的差异。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，“第一特征”、“第二特征”可以包括一个或者更多个该特征。

在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本发明的描述中，第一特征在第二特征“之上”或“之下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。

在本发明的描述中，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。

在本申请的描述中，“A和/或B”可以包括单独A的情况，单独B的情况，A和B的情况的任一种，其中A、B仅用于举例，其可以是本申请中使用“和/或”连接的任意技术特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“另一个实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。另外，需要说明的是，本说明书中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种细胞培养板，其特征在于，包括：

基板，

所述基板的一侧表面上设有非贯穿的开孔，所述开孔包括第一开孔部和第二开孔部，所述第一开孔部与所述第二开孔部相连，所述第一开孔部位于所述第二开孔部远离所述表面的一侧，

其中，所述第一开孔部的孔径小于所述第二开孔部的孔径。

2.根据权利要求1所述的细胞培养板，其特征在于，所述第一开孔部的孔径为1～5mm，自所述第一开孔部指向所述第二开孔部的方向上，所述第一开孔部的高度为0.2～2mm。

3.根据权利要求2所述的细胞培养板，其特征在于，所述第二开孔部的孔径与所述第一开孔部的孔径的差值不小于1mm。

4.根据权利要求3所述的细胞培养板，其特征在于，所述第二开孔部的孔径为4～10mm，自所述第一开孔部指向所述第二开孔部的方向上，所述第二开孔部的高度为3～10mm。

5.根据权利要求1所述的细胞培养板，其特征在于，所述第一开孔部的开孔形状为圆形或矩形，所述第二开孔部的开孔形状为圆形或矩形。

6.根据权利要求1-5任一项所述的细胞培养板，其特征在于，所述基板的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙基乙烯中的至少之一。

7.一种使用权利要求1-6任一项所述的细胞培养板进行细胞培养的方法，其特征在于，包括：将细胞悬液注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。

8.一种使用权利要求1-6任一项所述的细胞培养板进行组织培养的方法，其特征在于，包括：将细胞与生物材料混合后注入第一开孔部中，将培养基注入第二开孔部中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括天然生物材料和/或合成生物材料，所述天然生物材料包括基质胶、胶原、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少之一；所述合成生物材料包括聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少之一。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述将所述细胞与所述生物材料混合后注入所述第一开孔部中之前进一步包括：对所述第一开孔部进行修饰处理，所述修饰处理包括：使用过碘酸钠、聚乙二醇甲醚丙烯酸酯和苯甲醇的水溶液的混合溶液浸泡所述第一开孔部，并进行紫外照射。

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